焦磷酸测序技术检测结核分枝杆菌利福平耐药性的方法

摘要

本发明提供一种焦磷酸测序技术检测结核分枝杆菌利福平耐药性的方法，包括以下顺序步骤：对rpoB基因进行PCR扩增；对PCR扩增产物进行焦磷酸测序，判断rpoB基因是否具有突变位点；其中焦磷酸测序采用SQA模式、核苷酸加样顺序为AGCT。本发明提供的焦磷酸测序技术检测结核分枝杆菌利福平耐药性的方法可以从患者痰标本直接进行耐药性检测，无需再做分离培养结核分枝杆菌菌株，相比现在常用检测方法可以缩短检测时间，减少焦磷酸序列测定所需要的反应次数和检测试剂用量。

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测结核分枝杆菌耐药性的方法，尤其涉及一种使用焦磷酸测序方法从痰标本中直接检测结核分枝杆菌对利福平耐药突变的引物和检测方法。

背景技术

利福平是抗结核联合化疗中主要的一线药物，利福平耐药性是MDR-TB的标志物。利福平通过与RNA聚合酶的β亚单位结合阻碍了RNA的转录和延伸。rpoB基因编码RNA聚合酶的β亚单位。90%以上结核分枝杆菌利福平耐药菌株rpoB基因的利福平耐药确定区域（Rifampin Resistance Retermining Region，RRDR）内存在遗传变异。突变类型包括单个核苷酸、缺失和插入变异。通过大量研究表明，利福平耐药结核分枝杆菌临床分离株有87种不同类型的点突变或短核苷酸的插入与缺失，突变位于507~533密码子处、编码27个氨基酸、长度为81bp的RRDR。

目前，前期建立的焦磷酸测序结核杆菌利福平耐药性检测方法是从结核分枝杆菌痰标本培养物中进行检测，但结核杆菌分离培养的过程至少需时1月，严重制约了分子生物学检测手段快速的优越性，如果能从痰标本中直接进行耐药性检测，则可以大大缩短药敏结果的时间，对临床指导价值更大。但由于痰标本中所含菌量远远低于痰标本纯培养物，用以前的方法仅进行一轮PCR扩增，所得PCR产物浓度过低，远远达不到焦磷酸测序检测的要求，无法实现在痰标本中的检测。

中国专利CN1311435A披露了一种结核分枝杆菌耐药性检测芯片，其中在一经修饰的载玻片上，固定有一系列寡核苷酸点阵探针。在检测芯片中所说的探针是针对rpoB基因、katG基因、inhA基因、kasA基因，每个探针长度至少为10个碱基，并且各个探针长度相同；突变点尽可能位于探针中间。

郑瑞娟等人在《中华检验医学杂志》2011年 第2期中刊登了“焦磷酸测序技术检测结核分枝杆菌四种药物耐药性”一文，其中利用焦磷酸测序技术以10株已知药敏结果和经直接测序已知耐药基因突变情况的MTB为试验菌株，摸索焦磷酸测序检测MTB的rpoB、katG、gyrA、rrs耐药基因的最佳模式，并用该条件检测89株MTB临床分离株，并将检测结果与BACTEC 960药敏法进行比较，以便得到最佳的检测方法。

在现有常规检测结核分枝杆菌耐药性的方法中，都不可以避免需要事先对患者痰标本进行分离培养结核分枝杆菌菌株，这就使得检测时间增长，检测中需要进行反应的次数也比较多，使得不能快速得出耐药性的结果。

发明内容

本发明目的在于提供一种利用焦磷酸测序方法从痰标本中直接检测结核分枝杆菌对利福平耐药突变的引物和检测条件。

为了实现上述本发明提供一种焦磷酸测序技术检测结核分枝杆菌利福平耐药性的方法，包括以下顺序步骤：

步骤1，对rpoB基因进行PCR扩增；

步骤2，对PCR扩增产物进行焦磷酸测序，判断rpoB基因是否具有突变位点；其中焦磷酸测序采用SQA模式、核苷酸加样顺序为AGCT。

在上述提供的焦磷酸测序技术检测结核分枝杆菌利福平耐药性的方法中，其中对rpoB基因RRDR区进行焦磷酸测序。在焦磷酸测序过程中，针对rpoB基因507~515位点和516~531位点设计引物。

在上述提供的焦磷酸测序技术检测结核分枝杆菌利福平耐药性的方法中，其中核苷酸以A、G、C、T顺序循环加样16次。

在上述提供的焦磷酸测序技术检测结核分枝杆菌利福平耐药性的方法中，其中所述对rpoB基因进行PCR扩增进行两次PCR扩增，其中第一次扩增以痰标本结核杆菌DNA提取物为模板，第二次扩增以第一次扩增PCR产物为模板。

在上述提供的焦磷酸测序技术检测结核分枝杆菌利福平耐药性的方法中，其中所述第一次扩增使用的第一PCR引物具有SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示序列，所述第二次扩增使用的第二PCR引物具有SEQ ID NO.3所示序列或带有生物素标记的具有SEQ ID NO.2所示序列。

在上述提供的焦磷酸测序技术检测结核分枝杆菌利福平耐药性的方法中，其中所述第一PCR引物和第二PCR引物的浓度为0.4μmol/L。

在上述提供的焦磷酸测序技术检测结核分枝杆菌利福平耐药性的方法中，其中在焦磷酸测序中用的测序引物具有SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示序列。

在上述提供的焦磷酸测序技术检测结核分枝杆菌利福平耐药性的方法中，其中所述扩增反应过程包括下列顺序步骤：

步骤1：在94℃下进行预热5分钟；

步骤2：在95℃下保持30秒进行变性、65℃下保持30秒进行退火、72℃下保持30秒进行扩增和延伸，循环该过程40次；

步骤3：在72℃下保持10分钟。

本发明提供的焦磷酸测序技术检测结核分枝杆菌利福平耐药性的方法可以从患者痰标本直接进行耐药性检测，无需再做分离培养结核分枝杆菌菌株，相比现在常用检测方法可以缩短检测时间，减少焦磷酸序列测定所需要的反应次数和检测试剂用量。

附图说明

图1是本发明中对利福平rpoB基因第一轮PCR扩增检测结果。

图2是本发明中对利福平rpoB基因第二轮PCR扩增检测结果。

图3是用SQA模式测序利福平rpoB基因511及516位点标准株焦磷酸结果。

图4是本发明中用SQA模式检测利福平rpoB基因511及516位点痰标本焦磷酸结果。

具体实施方式

由于rpoB基因的突变主要集中于RRDR区，在RRDR区内突变位点较多，在本发明主要针对利福平rpoB耐药基因RRDR区进行焦磷酸测序检测方法。本发明提供的一种检测结核分枝杆菌对利福平耐药性的方法，先对rpoB基因进行PCR扩增，再对PCR扩增产物采用SQA模式进行焦磷酸测序，判断rpoB基因是否具有突变位点，其中核苷酸加样顺序为AGCT。

焦磷酸测序技术

焦磷酸测序（Pyrosequencing）技术是全新的一种DNA序列分析技术，可以快速、准确地测定一段较短的目标片段。该技术无须进行电泳，DNA片段也无须荧光标记，操作极为简便。由于焦磷酸测序技术操作简单，且结果准确可靠，可应用于SNP位点检测、等位基因频率测定、细菌和病毒分型等领域。

焦磷酸测序技术是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，基本原理如下：将1个特异性的测序引物和单链DNA模板结合，然后加入酶混合物（包括DNA Polymerase、ATP Sulfurylase、Luciferase和Apyrase）和底物混合物（包括APS和Luciferin）。 向反应体系中加入1种dNTP，如果它刚好能和DNA模板的下一个碱基配对，则会在DNA 聚合酶的作用下，添加到测序引物的3’末端，同时释放出摩尔数的焦磷酸基团。在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以和APS结合形成ATP；在荧光素酶的催化下，生成的ATP又可以和荧光素结合形成氧化荧光素，同时产生可见光。通过CCD光学系统即可获得一个特异的检测峰，峰值的高低则和相匹配的碱基数成正比。反应体系中剩余的dNTP和残留的少量ATP在Apyrase的作用下发生降解。加入另一种dNTP，使第2－4步反应重复进行，根据获得的峰值图即可读取准确的DNA序列信息。每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比。然后加入下一种dNTP，继续DNA链的合成。

焦磷酸测序操作系统中共有2个模式能进行碱基突变的检测，即序列分析模式（Sequence Analysis，SQA）和单核苷酸多态性模式（Single Nucleotide polymorphism，SNP）。其中SQA模式的核苷酸加样顺序为循环顺序加样法，即通过循环反复的加入A、G、C、T四种核苷酸以检测出待检样品的序列，该法一次能准确判读40bp左右的碱基，将所测定序列与已知序列比对后自行判读突变情况。SNP模式的核苷酸加样顺序为特定顺序加样法，即系统根据设定的待检位点及位点周围的序列自动生成核苷酸的加样顺序，仅对单个位点的碱基变化进行检测，不对整个序列进行测定。针对不同的检测对象，需要摸索不同的焦磷酸测序检测方法。

以下通过实施例对本发明内容作进一步的详细说明，以便更好理解本发明创造的内容，但是下述实施例并不限制本发明创造的保护范围。 

采集检测物

收集病人晨痰并存放在无菌样本保存管内，痰量以3~5mL为宜，密封后送检。

检测物预处理和DNA提取

取适量被检测物，加入等量N-乙酰-L-半胱氨酸-NaOH消化液，震荡30秒，置于室温下15分钟，如果标本粘稠可适当延长消化时间。检测物中加入PBS缓冲液20mL，混匀并离心，离心条件为20分钟3000g。去除上层清液，加入PBS缓冲液20mL用于洗涤沉淀。洗涤2次后，将沉淀重悬于50 μL TB裂解液中（TB裂解液为含有0.04%NaOH，0.1% SDS和15% Chelex100溶液），在50℃下水浴1小时，后沸水浴10分钟。再次离心分离，取上层清液并在-20℃环境下保存备用，即得到到结核杆菌DNA提取物。

利福平rpoB耐药基因的PCR扩增

用具有SEQ ID NO.1所示序列的PCR第一引物和具有SEQ ID NO.2所示序列的PCR第一引物进行第一轮扩增，模板为病人痰检测物的结核杆菌DNA提取物。在50μL反应体系中，第一引物最佳的浓度为0.4μmol/L。PCR反应过程如下：先在94℃下进行预热5分钟；在95℃下保持30秒进行变性、65℃下保持30秒进行退火、72℃下保持30 秒进行扩增和延伸，并循环该过程40次；最后在72℃下保持10分钟。

用具有SEQ ID NO.3所示序列的PCR第二引物和带有生物素（BIO）标记的具有SEQ ID NO.2所示序列的PCR第二引物进行第二轮扩增，模板为第一轮扩增的PCR产物。在50μL反应体系中，第二引物最佳的浓度为0.4μmol/L。PCR反应过程如下：先在94℃下进行预热5分钟；在95℃下保持30秒进行变性、65℃下保持30秒进行退火、72℃下保持30 秒进行扩增和延伸，并循环该过程40次；最后在72℃下保持10分钟。

取2 μL的PCR产物进行1.5~2％琼脂糖凝胶电泳检测，在12V/cm电位梯度下电泳20分钟，后在紫外灯下检查扩增效果。图1和图2是对利福平rpoB基因进行PCR扩增结果，其中M为标准带，1~5为结核病人痰标本。图中可以看到存在一条单一信号较强的条带，并且没有剩余的引物，也没有引物二聚体或其他非特异的条带存在。

具有SEQ ID NO.1所示序列扩增引物、具有SEQ ID NO.2所示序列扩增引物和具有SEQ ID NO.3所示序列扩增引物的序列表如下所示。

SEQ ID NO.1：    CCGGTGGAAACCGACGACATCGACC 

SEQ ID NO.2：    GGCACGCTCACGTGACAGAC

SEQ ID NO.3：    GGAGCGGATGACCACCCAGGAC 

具有SEQ ID NO.1所示序列的PCR第一引物和具有SEQ ID NO.3所示序列的PCR第二引物为两条正向引物。具有SEQ ID NO.2所示序列的PCR第一引物和带有生物素（BIO）标记的具有SEQ ID NO.2所示序列的PCR第二引物为两条反向引物，具有SEQ ID NO.2所示序列的PCR第一引物与带有生物素（BIO）标记的具有SEQ ID NO.2所示序列的PCR第二引物序列一致。由此具有相同的退火温度，可以共用同样的PCR扩增条件。带有生物素标记的引物在检测中起到标记作用。

焦磷酸测序

1.检测试剂配制

结合缓冲液：将10mmol/L Tris-HCl、2mol/L NaCl、1mmol/L EDTA和0.1% Tween20去离子水溶解，用1 mol/L HCl调pH至7.6。

变性缓冲液（denatureation buffer）：0.5 mol/L NaOH。

退火缓冲液：将20 mmol/L Tris-Acetate、2mmol/L MgAc₂溶液混合，用4mol/L乙酸调pH至7.6。

洗涤缓冲液（washing buffer）：用4mol/L乙酸将10 mmol/L Tris-Acetate溶液调pH至7.6。

70%乙醇：在70mL无水乙醇中加入高纯水20mL，充分混匀后定容至100mL。

2.检测仪器及配套试剂

（1）PSQ?96全自动焦磷酸测序仪、PSQ96单链制备工具台（Vacuum prep workstation）、真空样品转移器（Vacuum prep tool）、真空泵、涡旋振荡器、PCR仪。

（2）瑞典PYROSEQUENCING AB公司生产的焦磷酸微测序试剂盒（PSQ 96MA SQA Upgrade Kit）和链亲和素包被的磁珠（Sepharose beads）。

3.焦磷酸测序检测步骤

（1）PCR产物固定：在PCR板中放入40μL的具有PCR扩增产物，再分别加入36μL的结合缓冲液和4μL链亲和素包被的磁珠。将PCR板放在涡旋振荡器上常温振荡20分钟，使PCR产物固定在磁珠上。

（2）单链模板的纯化：打开真空泵，将真空样品转移器移到PCR板中，抓取结合PCR产物的磁珠，检查是否大部分磁珠都被吸附在了真空样品转移器上。再将真空样品转移器放入70%乙醇中轻微振荡5秒，然后移到变性缓冲液中抽吸5秒，使DNA变性以得到纯化的单链DNA模板，最后移到洗涤缓冲液中清洗5~10秒，洗涤未固定的单链DNA，从而得到作为测序模板的单链DNA。

（3）引物杂交：先在焦磷酸测序微孔板各孔中加入退火缓冲液50μL，再加入具有SEQ ID NO.4所示序列测序引物和具有SEQ ID NO.5所示序列的测序引物。测序引物的最低要求浓度为1μmol/L，最高浓度为0.2mmol/L。再将真空样品转移器从PCR板移入焦磷酸测序微孔板，关闭真空泵，将已纯化好的单链DNA模板与具有SEQ ID NO.4所示序列测序物和具有SEQ ID NO.5所示序列测序引物混和，在80℃下变性2分钟，然后冷却至室温，使引物与模板退火杂交。

具有SEQ ID NO.4所示序列测序引物和具有SEQ ID NO.5所示序列测序引物的序列表如下所示。

SEQ ID NO.4：    GCGATCAAGGAGTTC 

SEQ ID NO.5：    ATGGACCAGAACAACC

（4）焦磷酸测序：利用由瑞典Pyrosequencing AB公司生产的PSQ96MA测序仪和试剂盒，依次在试剂仓中加入酶、底物和4种dNTPs，选用SQA检测模式、以A、G、C、T顺序循环加样16次的碱基加入顺序进行测序反应。通过CCD光学系统对每次加样后产物进行检测，以获得特异的检测峰，根据获得的峰值图即可读取准确的DNA序列信息。

图4是采用SQA模式利福平rpoB基因511及516位点痰标本焦磷酸测序结果，检测得出的序列为TTCGGCACCAGCCAGCCGAGCCAATTCATGGGCCAGAA。将其与图3的利福平rpoB基因511及516位点标准株焦磷酸测序结果得到序列为TTCGGCACCAGCCAGCTGAGCCAATTCATGGACCAGAA的结果相比，可得出图中方框内为突变的基因序列。

通过将多次检验结果与利福平rpoB基因511及516位点标准株焦磷酸测序结果相比较，具有SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示序列的测试引物能高度准确的检测出利福平耐药突变位点，在临床研究中可以方便将其应用在检测之中。

由于通常痰标本中所含菌量远远低于痰标本纯培养物，用以前的方法仅进行一轮PCR扩增，得到的PCR产物浓度过低，远远达不到焦磷酸测序检测的要求，无法实现在痰标本中的检测。在本发明中利用三条引物进行两次PCR扩增，使得约95%的痰标本均能获得高质量的耐药基因目的片段，满足焦磷酸测序检测的需求，实现从痰标本直接进行结核杆菌耐药性测定，满足临床快速诊断耐药结核病的需求，为临床合理用药提供实验室依据。

本发明提出的焦磷酸测序技术检测耐药性的方法，同样也可以应用在胸水、脑脊液血液等体液标本的检测中、检测速度快、准确性高。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

SEQUENCE LISTING

 

<110>  上海市肺科医院

 

<120>  焦磷酸测序技术检测结核分枝杆菌利福平耐药性的方法

   

<160>  5    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  25

<212>  DNA

<213>  Artificial

 

<220>

<223>  扩增利福平目的片段的PCR引物

 

<400>  1

ccggtggaaa ccgacgacat cgacc                                    25

 

 

<210>  2

<211>  20

<212>  DNA

<213>  Artificial

 

<220>

<223>  扩增利福平目的片段的PCR引物

 

<400>  2

ggcacgctca cgtgacagac                                          20

 

 

<210>  3

<211>  22

<212>  DNA

<213>  Artificial

 

<220>

<223>  扩增利福平目的片段的PCR引物

 

<400>  3

ggagcggatg accacccagg ac                                      22

 

 

<210>  4

<211>  15

<212>  DNA

<213>  Artificial

 

<220>

<223>  检测利福平耐药突变位点的测序引物

 

<400>  4

gcgatcaagg agttc                                               15

 

 

<210>  5

<211>  16

<212>  DNA

<213>  Artificial

 

<220>

<223>  检测利福平耐药突变位点的测序引物

 

<400>  5

atggaccaga acaacc                                             16