一种指导华法林用药的多重基因检测试剂盒及其检测方法

摘要

本发明公开了一种指导华法林用药的多重基因检测试剂盒及其检测方法，包括超纯水，X溶液，10×PCR缓冲液，PCR引物，25mM氯化镁溶液，DNA聚合酶和阳性对照品，特点是PCR引物包括5个与华法林用药相关基因上的7个SNP位点上的不同基因型的正反向扩增引物、DNA内参的正反向扩增引物及反应内参的正反向扩增引物，其基因序列如SEQ ID NO.1～NO.32所示；其检测包括采集样本并提取核酸的步骤；以提取的核酸为模板进行PCR反应的步骤；最后GeXP遗传分析仪毛细电泳分离样品的步骤，优点是特异性强、准确性高、通量高、可靠性强、成本低、无假阴性结果。

说明书

技术领域

本发明涉及一种多重基因检测试剂盒及其检测方法，尤其是涉及一种指导华法林用 药的多重基因检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

华法林为香豆素类口服抗凝药，是临床上常用的抗凝药物，华法林通过抑制凝血因 子的活化抑制新的血栓形成，限制血栓的扩大和延展，抑制在血栓的基础上形成新的血 栓，抑制血栓脱落和栓塞的发生，有利于血栓的清除。临床上主要用于治疗房颤、心瓣 膜修复术、再发性的中风、深静脉血栓以及肺动脉栓塞。但是华法林治疗窗窄、剂量个 体差异大，在其治疗的开始阶段，大约有12%的患者发生出血性事件，其中2%发生致死 性出血。研究表明，人群对华法林的个体差异与单核苷酸多态性（SNP）密切相关。其 中华法林靶标VKORC1（维生素K环氧化物还原酶复合体亚单位1）和参与华法林代谢的 CYP2C9（细胞色素P450酶2C9）以及CYP4F2、CALU和GGCX等基因的遗传多态性与患者 的有效剂量和致出血剂量密切相关。对上述基因多态性的诊断能改善华法林抗凝的安全 性，减少抗凝初期剂量滴定时间，以求尽快达到治疗水平的INR（international normalizedratio，国际标准化比值）。

现有的用于指导华法林用药相关基因的诊断方法主要为基因芯片、荧光定量PCR。

（1）基因芯片利用目标DNA与支持物上所固定的密集的寡核苷酸探针阵列进行等 位基因特异性反应，根据反应后信号的有无和强弱确定SNP位点。基因芯片通量高，但 普遍准确度不够，易出现假阳性。

（2）荧光定量PCR方法通过设计特异性的探针可以准确得出样品基因型，操作简 单、快速。但其通量较低，每次反应仅能检测单个位点，对于上述基因的相关SNP位点 需要进行多个反应的检测，成本过高，不利于市场应用。

同时，目前的这些检测方法仅局限于检测VKORC1和CYP2C9两个基因上的3至4个 SNP位点，信息涵盖面不够，指导性不足。

GenomeLab^TMGeXP多重基因表达遗传分析系统基于贝克曼公司成熟的毛细管电泳分 离技术及高灵敏度的激光诱导荧光技术研发而成，一束8道的毛细管陈列设计充分利用 了96孔板的排列特性，降低了使用更大的陈列带来的花费和复杂性。采用多重PCR方 法，通过Beckman Coulter染色标记，在同一个EP管中同时分析多个基因的的等位基 因型，能快速有效地检测基因的表达状况，克服了上述方法存在的缺陷，具有以下优点：

1、高通量：本系统采用双（96孔）板、自动加样和样品追踪技术，实现单个反应 检测30-40个位点，可同时做192个反应（如192个患者样品，每个样品检测30种腹 泻病毒，30个位点），一天出结果；对于交叉感染患者，本方法可一次性给出准确报告， 避免漏检。

2、准确性强：GeXP采用毛细管电泳对PCR产物进行分离检测，可将非特异性扩增 产物、引物二聚体和特异性扩增产物分离，最大程度降低假阳性；

3、敏感性高，结果重复性好：GeXP系统克服了传统PCR扩增方法的不均等扩增造 成的偏差，提高了对一套目的基因进行定量的速度和敏感性，采用激光诱导荧光-PMT， 具有超高灵敏度；

4、方法简便，使用经济：GeXP提供从试剂、多重PCR引物设计、结果及定量表达 谱分析等全套实验方案；每个样品的检测成本少于￥50，利于大规模推广；

5、精确定量、灵活性强：可精确定量病原体基因拷贝数，可随时根据需求调整检 测的靶基因。

6、易于实现自动化：就样品制备而言，Biomek系列自动液体处理仪可以与GeXP 分析仪和Ampligrid扩增仪完全匹配，集成的条形码阅读器保证了准确的样品追踪和结 果报告。

目前，国内外还没有关于基于GeXP多重基因表达遗传分析系统的指导华法林用药 的多重基因检测试剂盒及其检测方法的相关研究报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种特异性强、准确度高、通量高、可靠性强、 成本低、无假阴性结果的基于GeXP多重基因表达遗传分析系统的指导华法林用药的多 重基因检测试剂盒及其检测方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种指导华法林用药的多重基因检 测试剂盒，包括超纯水（ddH₂O），X溶液，10×PCR缓冲液，PCR引物，25mM氯化镁 溶液，DNA聚合酶和阳性对照品，所述的PCR引物包括以下5个与华法林用药相关基因上 的7个SNP位点上的不同基因型的正反向扩增引物、DNA内参的正反向扩增引物及反应内 参的正反向扩增引物，其核酸序列如下表1所示：

表1

上述CYP2C9基因上rs1799853片段的C型基因的反向扩增引物与T型基因的反向扩增 引物均采用核酸序列SEQ ID NO.3：GATAGTAGTCCAGTAAGGTCAGTGATATG；CYP2C9基因上 rs1057910片段的A型基因的正向扩增引物与C型基因的正向扩增引物均采用核酸序列 SEQ ID NO.4：CTATGAATTTGGGGACTTCGAA；上述VKORC1基因上rs9923231片段的C型基因 的反向扩增引物与T型基因的反向扩增引物均采用核酸序列SEQ ID NO.9：

ACAGACGCCAGAGGAAGAGA；上述VKORC1基因上rs9934438片段的G型基因的正向扩增引物与 A型基因的正向扩增引物均采用核酸序列SEQ ID NO.10：CAGGTTAGGACTGTCAACCCAGT；上 述CYP4F2基因上rs2108622片段的C型基因的反向扩增引物与T型基因的反向扩增引物均 采用核酸序列SEQ ID NO.15：GGTCATCTCCCGCCATGT；上述CALU基因上rs339097片段的A 型基因的正向扩增引物与G型基因的正向扩增引物均采用核酸序列SEQ ID NO.16：

CTGCACCCTGAGGAGTATGAC；上述GGCX基因上rs11676382片段的C型基因的反向扩增引物与T 型基因的反向扩增引物均采用核酸序列SEQ ID NO.21：TCCTTTCCATGAGCGATTCT。

所述的X溶液为包括三磷酸脱氧核苷酸（dNTPs）和通用引物，所述的通用引物正向 扩增引物序列为AGGTGACACTATAGAATA；反向扩增引物序列为GTACGACTCACTATAGGGA，所 述的通用引物正向扩增引物带荧光标记。

所述的阳性对照品为上述5个与华法林用药相关基因上的7个SNP位点上的不同基因 型的引物克隆所得DNA片段。

一种利用指导华法林用药的多重基因检测试剂盒的检测方法，具体包括以下步骤：

（1）采集样本并提取核酸

采集肿瘤患者口腔拭子或血液样品的分离培养物，从分离培养物中提取核酸；

（2）以提取的核酸为模板进行PCR反应

取DNA样品2μL，10×PCR缓冲液2μL，25mM的氯化镁3.4μL，PCR引物溶液2 μL，DNA聚合酶0.6μL，X溶液2μL，超纯水10μL混匀后加入到96孔样品板上进行PCR 反应，反应条件：95°C2分钟；94°C30秒钟，55°C30秒钟，70°C1分钟，循环35 次；70°C1分钟；4°C直至收取PCR产物；其中所述的X溶液为包括三磷酸脱氧核苷酸 （dNTPs）和通用引物，所述的通用引物正向扩增引物序列为AGGTGACACTATAGAATA；反 向扩增引物序列为GTACGACTCACTATAGGGA，所述的通用引物正向扩增引物带荧光标记； PCR引物溶液中各PCR引物浓度均为200nM，所述的PCR引物包括以下5个与华法林用 药相关基因上的7个SNP位点上的不同基因型的正反向扩增引物、DNA内参的正反向扩 增引物及反应内参的正反向扩增引物，基因序列如序列表中SEQ ID NO.1～NO.32所示；

（4）GeXP遗传分析仪毛细电泳分离样品

取PCR产物0.1-1μL，Beckman GeXP系统配套的上样缓冲液38.75μL，DNA Marker 0.5μL，矿物油一滴混合均匀后加入到96孔分离液板上进行毛细电泳分离样品，将GeXP 遗传分析仪的软件获得的图谱与标准图谱对比，获得指导华法林用药相关基因的SNP位 点的等位基因型。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明一种指导华法林用药的多重基因检测 试剂盒及其检测方法，本试剂盒及检测方法基于多重PCR和毛细电泳技术，利用不同长 度的PCR特异性扩增片段来鉴定区分不同的基因，创立了一种同步检测VKORC1、CYP2C9、 CYP4F2、CALU和GGCX五个基因的7个SNP位点上的不同基因型的检测方案，以指导华 法林的临床用药，本方法优化多重PCR反应体系，对待测DNA样品进行特异性扩增，再 用毛细电泳方法分离PCR扩增产物以鉴别不同的基因和基因型，其一天之内可完成192 个患者样品的检测，既节约了生产成本和检测成本，又提高了检测效率及缩短了时间； DNA内参基因的使用可用于监测整个反应系统以及评估DNA模板的质量，避免假阴性； 反应内参的使用可用于监测整个反应系统、PCR反应的效率，避免假阴性。

综上所述，本发明基于GeXP多重基因表达遗传分析系统的指导华法林用药的多重 基因检测试剂盒及其检测方法，同步对5个与华法林用药相关基因上的7个SNP位点上 的不同基因型进行检测，检测敏感性高，特异性好，降低了常规PCR扩增的假阳性率， 还能够有效解决常规PCR的易污染问题；具有非竞争性内对照体系，可靠性强，无假阴 性结果，本发明应用多重PCR和毛细电泳的方法，具有通量大、准确度高、灵敏度好等 技术优势，以单个反应即可快速准确地检测出样品中所有相关基因的多态性，为临床提 供一种优越的低成本的分子诊断方法，有助于华法林安全有效地使用。

附图说明

图1为GeXP遗传分析仪的毛细电泳分离样品结果标准图谱。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

本发明一种指导华法林用药的多重基因检测试剂盒，该试剂盒中包括以下试剂：

1)PCR引物（PCR Primer Mix）

2)25mM氯化镁（MgCl2）

3)DNA聚合酶（Taq DNA Polymerase）

4)X溶液（Solution X）

5)PCR缓冲液（PCR Buffer）

6)阳性对照（Positive Control）

7)超纯水（ddH2O）

上述PCR引物包括以下5个与华法林用药相关基因上的7个SNP位点上的不同基因 型的正反向扩增引物、DNA内参的正反向扩增引物及反应内参的正反向扩增引物，其核 酸序列如表1所示：

表1华法林用药指导多重基因检测寡核苷酸序列

上述CYP2C9基因上rs1799853片段的C型基因的反向扩增引物与T型基因的反向扩增 引物均采用核酸序列SEQ ID NO.3：GATAGTAGTCCAGTAAGGTCAGTGATATG；CYP2C9基因上 rs1057910片段的A型基因的正向扩增引物与C型基因的正向扩增引物均采用核酸序列 SEQ ID NO.4：CTATGAATTTGGGGACTTCGAA；上述VKORC1基因上rs9923231片段的C型基因 的反向扩增引物与T型基因的反向扩增引物均采用核酸序列SEQ ID NO.9：

ACAGACGCCAGAGGAAGAGA；上述VKORC1基因上rs9934438片段的G型基因的正向扩增引物与 A型基因的正向扩增引物均采用核酸序列SEQ ID NO.10：CAGGTTAGGACTGTCAACCCAGT；上 述CYP4F2基因上rs2108622片段的C型基因的反向扩增引物与T型基因的反向扩增引物均 采用核酸序列SEQ ID NO.15：GGTCATCTCCCGCCATGT；上述CALU基因上rs339097片段的A 型基因的正向扩增引物与G型基因的正向扩增引物均采用核酸序列SEQ ID NO.16：

CTGCACCCTGAGGAGTATGAC；上述GGCX基因上rs11676382片段的C型基因的反向扩增引物与 T型基因的反向扩增引物均采用核酸序列SEQ ID NO.21：TCCTTTCCATGAGCGATTCT。

上述试剂盒可同步对5个与华法林用药相关基因上的7个SNP位点（7个SNP位点 分别为rs1799853、rs1057910、rs9923231、rs9934438、rs2108622、rs339097和 rs11676382）上的不同基因型进行检测，利用不同长度的PCR特异性扩增片段来鉴定区 分SNP位点的等位基因型，以指导华法林的临床用药，具体如表2所示：

表2华法林用药指导多重基因检测检测靶标位点

上述X溶液为包括三磷酸脱氧核苷酸（dNTPs）和通用引物，所述的通用引物正向扩 增引物序列为AGGTGACACTATAGAATA；反向扩增引物序列为GTACGACTCACTATAGGGA，所述 的通用引物正向扩增引物带荧光标记。

上述试剂盒设置了一个针对人DNA的内参，用于监测DNA样品的质量；同时设置了 一个以质粒pcDNA3.1为模板的反应内参，用于监测PCR反应的正常进行（表1）。

上述试剂盒设置一个由质粒构建的阳性对照品，涵盖所有靶标，用于监测PCR反应 体系和核苷酸引物的质量。上述阳性对照品为上述5个与华法林用药相关基因上的7个 SNP位点上的不同基因型的引物克隆所得DNA片段。

具体实施例二

本发明一种指导华法林用药的多重基因检测方法，采集患者肿瘤组织提取核酸，以 肿瘤患者核酸为模板进PCR反应，最终用毛细电泳方法分离样品，具体步骤如下：

1、生产基于GeXP多重基因表达遗传分析系统的指导华法林用药的多重基因检测试 剂盒，试剂盒中包括的组分同上述实施例1；

2、采集样本并提取核酸

采集肿瘤患者口腔拭子或血液样品的分离培养物，从分离培养物中提取核酸；

3、以提取的患者核酸为模板进行PCR反应

1）按以下比例在96孔样品板/八连管上加入试剂和样品（PCR板），并设置一个阳 性对照反应：

PCR反应试剂 量/孔 ddH₂O 8 25mM MgCl₂3.4 10×PCR缓冲液 2 PCR引物溶液 2 X溶液 2 DNA样品 2 DNA聚合酶 0.6 Total 20μL

注：由本试剂盒各靶基因核苷酸引物克隆所得DNA片段，用量为1μL/反应；

X溶液为包括三磷酸脱氧核苷酸（dNTPs）和通用引物，通用引物正向扩增引物序列为 AGGTGACACTATAGAATA；反向扩增引物序列为GTACGACTCACTATAGGGA，通用引物正向扩增 引物带荧光标记。阳性对照品为上述实施例1中5个与华法林用药相关基因上的7个SNP 位点上的不同基因型的引物克隆所得DNA片段。

2）混匀后按以下温度进行热循环反应：

步骤 温度 时间 1 95°C 2分钟 2 94°C 30秒钟 3 55°C 30秒钟 4 70°C 1分钟 5 N/A 重复2-4步骤34次（共35次） 6 70°C 1分钟 7 4°C 持续:直至收取PCR产物

4、GeXP遗传分析仪毛细电泳分离样品

1）制备GeXP样品（见表6）：

表6GeXP样品混合比例

GeXP样品 量/孔 上样缓冲液（Beckman GeXP系统配套试剂） 38.75μL DNA大小标准400 0.5μL PCR产物 0.1-1μL 矿物油 1滴

2）毛细电泳分离样品

将GeXP样品加入96孔毛细管电泳分离板上适当数目的孔中；毛细管电泳分离是一类 以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型液相分离技术，具体程序为90 ℃变性120秒，进样电压2kv，30秒，分离电压6kv，35分钟。

5、结果分析（见GenomeLab GeXP遗传分析仪说明书）

根据GeXP遗传分析仪自有软件上默认的参数对结果进行片段大小分析，其横坐标 表示片段大小，纵坐标为信号强弱。将GeXP遗传分析仪的软件获得的图谱与标准图谱 对比，获得5个与华法林用药相关基因上的7个SNP位点的等位基因型，以指导华法林 的临床用药。标准图谱如图1所示，其结果如图1所示，其结果能准确检测出样品7个 SNP的基因型，其检测型号不至于过饱和。

具体实施例三

检测试剂特异性分析：单重PCR扩增经毛细管电泳检测为目标片段大小的单峰。

上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技 术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保 护范围。