用于测定样品中的分析对象物质的检查器具及使用其的分析对象物质的测定方法

摘要

本发明涉及用于将液状样品中的分析对象物质用贵金属胶体凝集测定法测定的检查器具；其至少具有使液状样品与试剂反应的反应室，试剂干燥附着于构成反应室的面的至少一部分，并且，试剂是可将分析对象物质用贵金属胶体凝集测定法测定的试剂；再者，具备用于供给液状样品的供给部；及用于将供给到该供给部的液状样品移送至反应室的流路；能在供给部与反应室之间产生压力差，所述供给部用于使供给到供给部的液状样品经由流路移送到反应室内，使干燥附着的试剂与液状样品接触而分散到液状样品中。通过使用这样的检查器具，能进行基于在可视部的吸光度的测定，可短时间内正确地测定分析对象物，适宜于POCT领域的测定成为可能。

说明书

【技术领域】

本发明涉及用于测定样品中的分析对象物质的检查器具及使用其 的分析对象物质的测定方法。更具体而言，本发明涉及主要在临床检 查领域中适用，特别是，适宜于可在患者的床侧或救急现场等的所有 的场所迅速简便地检查的所谓POCT领域的，用于将液状样品中的分 析对象物质用贵金属胶体凝集测定法测定的检查器具及使用其的分析 对象物质的测定方法。

【背景技术】

近年，通过分析技术的进步，测定各种各样的活体成分成为可能。 特别是，在临床检查领域中，通过基于称之为抗原与抗体特异性地反 应的的原理的免疫测定法的开发，与病态关联的体液中的各种活体成 分被测定。在那样的免疫测定法的领域中，近年，从可缩短从采集待 测样品至得到检查结果之时间的方面、另外，称之为装置简便的方面、 可简单地测定的方面，关注了床旁诊断化验测试（以下，也称之为 POCT）领域。

这样的免疫测定法的检查器具几乎是伴随BF分离的检查器具。

作为那样的检查器具，已知免疫层析检查器具（专利文献1）。 作为此检查器具，使用例如，在作为液体可通过毛细管现象移动的多 孔质材的片上，将针对可在样品溶液中存在的分析对象物质的第一抗 体固定到层析仪介质的检查器具。从该检查器具的色谱的末端展开含 针对该分析对象物质的标记化的第二抗体、例如用胶体金标记化的第 二抗体的该样品溶液，接下来，在固定化的第一抗体部位捕捉第一抗 体、分析对象物质和标记第二抗体的复合物。由于未反应的标记抗体 移动到了下游，在固定化抗体部位，仅当分析对象物质存在于样品中 时，观察到由胶体金等的着色。但是，此方法根本就是仅通过目测是 否有胶体金等的着色来判断分析对象物质的有无，具有无法定量测定 的问题。

另外，为了定量分析对象物质，也已知由泵吸引将样品经由空间 流路移送的检查器具（专利文献2）。此器具具有：样品供给口、具 备标记抗体的样品处理室、具备固定化抗体的测定室、废液室及泵连 接口，各自通过流路连通。将样品供应到样品供给口，将该样品通过 吸引移送到样品处理室，从而将标记抗体游离，同时使样品中的分析 对象物质和标记抗体反应，接下来，再吸引而将样品移送到测定室， 生成固定化抗体、分析对象物质和标记抗体的结合物，然后使停止一 定时间，吸引样品中的分析对象物以外的成分而移送到废液室。然后， 通过测光在测定室中的分析对象物质来源的结合物而可实施样品中含 的分析对象物质的定量测定。但是，此器具由于由泵的样品移送以多 个阶段进行，有控制比较难，测定结果依赖于条件受大影响的问题。

为了解决该问题，也已知在同样的测定原理中，组合流路开闭可 能的闭塞部件和泵加压的方法（专利文献3）。但是，此方法有检查 器具的结构变得复杂的问题。

另一方面，尽管开发例少，在POCT的领域也已知可基于不需要 BF分离的乳胶免疫凝集反应的定量测定对象物质的检查器具（专利文 献4）。此方法是将抗体致敏乳胶等干化（干燥）而组合到检查器具， 但在那样的情况中，预先仅将液体试剂通过简单的自然干燥还不够， 必需进行耗时间的烦琐的冷冻干燥而制备。另外，由于抗体致敏粒子 根本就是不完全溶于水而仅分散，干化的抗体致敏粒子有难再分散的 难点。但是，在乳胶免疫凝集反应的方法中，与伴随BF分离的方法 不同，有必要完全地再分散抗体致敏粒子。因此，在干燥化学中使用 乳胶免疫凝集测定法时，为了再分散乳胶，必需加旋转、振动等的空 间处理手段而进行免疫分析，结果，有检查器具易变得复杂的问题。

【现有技术文献】

【专利文献】

专利文献1:特开平4-299262号公报

专利文献2:特开平9-196920号公报

专利文献3:特开2009-270878号公报

专利文献4:特开2007-114162号公报

【发明内容】

【发明要解决的技术课题】

本发明的课题是通过干燥化学可正确地测定样品中的分析对象物 质，并且简便的检查器具及使用其的可短时间测定的分析对象物质的 测定方法，在于提供适宜于POCT领域的检查器具及测定方法。而且， 由于可基于在可见光区的吸光度的测定，可适用于使用常用的可见光 光度计的装置，并且，在于提供可正确地测定分析对象物质的检查器 具及使用其的测定方法。

【解决课题的技术方案】

基于这样的状况，本发明人检查了可测定分析对象物质的简便的 检查器具的开发。结果发现，作为用于致敏抗体的粒子而使用贵金属 胶体，将其附着干燥到流路系统的检查器具的反应室，使用血球分离 膜以由全血除去血球的程度加压，则干燥试剂容易再分散，结果，不 加旋转操作或振动等的其他空间移动处理手段而可正确地测定分析对 象物质。本发明基于上述见解经重复再研究而完成。

即，本发明涉及：

［1］检查器具，其是用于将液状样品中的分析对象物质用贵金 属胶体凝集测定法测定的检查器具；至少具有使液状样品与试剂反应 的反应室，试剂干燥附着于构成反应室的面的至少一部分，并且，试 剂是可将分析对象物质用贵金属胶体凝集测定法测定的试剂；再者， 具备用于供给液状样品的供给部；及用于将供给到该供给部的液状样 品移送至反应室的流路；能在供给部与反应室之间产生压力差，所述 供给部用于使供给到供给部的液状样品经由流路移送到反应室内，使 干燥附着的试剂与液状样品接触而分散到液状样品中；

［2］上述［1］所述的检查器具，其中可将分析对象物质用贵 金属胶体凝集测定法测定的试剂是含与分析对象物质特异性地结合的 偶体致敏贵金属胶体的试剂、或者是含该偶体和与该分析对象物质相 同的物质致敏贵金属胶体的试剂；

［3］上述［1］或［2］所述的检查器具，其中反应室由第1平 面、面对所述第1平面的第2平面、及分别与第1平面及第2平面连 接而在第1平面和第2平面之间形成空间的第3面形成，含与分析对 象物质特异性地结合的偶体致敏贵金属胶体的试剂干燥附着于第1平 面或面对所述第1平面的第2平面，或者，在含该偶体和与该分析对 象物质相同的物质致敏贵金属胶体的试剂中，该偶体干燥附着于第1 平面或面对所述第1平面的第2平面之任何，与该分析对象物质相同 的物质致敏贵金属胶体干燥附着于另一平面；

［4］上述［1］～［3］之任一项所述的检查器具，其中贵金属 胶体是胶体金或钯胶体；

［5］上述［1］～［4］之任一项所述的检查器具，其中流路及 反应室经有通气性，并且非通液性的多孔性膜与检查器具外部连接；

［6］上述［1］～［5］之任一项所述的检查器具，其中通过加 压产生压力差；

［7］上述［1］～［6］之任一项所述的检查器具，其中能将供 给到供给部的液状样品由加压部加压而移送到反应室内；

［8］上述［1］～［7］之任一项所述的检查器具，其中液状样 品是活体样品，而分析对象物质是活体成分；

［9］上述［1］～［8］之任一项所述的检查器具，其中在供给 部和流路之间具有用于从液状样品分离固体的膜；

［10］液状样品中的分析对象物质的测定方法，将包括：疑似含 分析对象物质的液状样品供给到上述［1］～［9］之任一项所述的检 查器具的供给部，接下来，在供给部和反应室之间产生压力差而经由 流路将液状样品移送至反应室，使反应室中的试剂与液状样品接触而 将试剂分散到液状样品中，使液状样品中的分析对象物质与试剂反应， 向得到的混合液照射光，以及基于透射光或反射光来源的吸光度变化 测定液状样品中的分析对象物质；

［11］上述［10］所述的测定方法，其中向混合液照射光之时、 向反应室照射；

［12］上述［10］或［11］所述的测定方法，其中照射的光的波 长在340～800nm的范围内；

［13］上述［12］所述的测定方法，其中照射的光的波长在390～ 420nm的范围内；及

［14］用于测定液状样品中的分析对象物质的装置，其下列之组 合：上述［1］～［9］之任一项所述的检查器具，和用于向反应室照 射光而读取透射光或反射光的可见光光度计。

【发明效果】

在本发明中，通过干燥化学使用简便的检查器具而可正确地测定 液状样品中的分析对象物质。而且，由于可基于在可见光区的吸光度 的测定，可适用于使用常用的可见光光度计的装置，并且，可短时间 内正确地测定分析对象物，本发明的检查器具及测定方法适宜于 POCT领域。

【附图说明】

【图1】是示本发明中使用的检查器具之一例的纵截面图。

【图2】是示本发明中使用的检查器具之一例的上面图。

【图3】是示本发明中使用的检查器具之一例的分解斜视图。

【图4】是示通过使用本发明的胶体金的干燥化学的测定方法和 由以往的液状试剂法的测定方法测定人CRP之时的相关性的图。

【图5】是示通过使用本发明的胶体金的干燥化学的测定方法和 由以往的液状试剂法的测定方法测定人半胱氨酸蛋白酶抑制物C之时 的相关性的图。

【图6】是示通过使用本发明的钯胶体的干燥化学的测定方法和 由以往的液状试剂法的测定方法测定人CRP之时的相关性的图。

【实施方式】

本发明的测定方法基于干燥化学技术。在本说明书中，干燥化学 是指，用于测定分析对象物质的试剂在干燥状态下在检查器具中利用， 该处添加液体状的样品，则以样品中的水分作为溶剂而试剂被分散， 液体状的样品和分散的试剂在检查器具的反应室中反应。

本发明的检查器具是如下检查器具，其是用于将液状样品中的分 析对象物质用贵金属胶体凝集测定法测定的检查器具；至少具有使液 状样品与试剂反应的反应室，试剂干燥附着于构成反应室的面的至少 一部分，并且，试剂是可将分析对象物质用贵金属胶体凝集测定法测 定的试剂、例如，该与分析对象物质特异性地结合的偶体致敏贵金属 胶体、或者含该偶体和与该分析对象物质相同的物质致敏贵金属胶体 的试剂；再者，具备用于供给液状样品的供给部；及用于将供给到该 供给部的液状样品移送至反应室的流路；能在供给部与反应室之间产 生压力差，所述供给部用于使供给到供给部的液状样品经由流路移送 到反应室内，使干燥附着的试剂与液状样品接触而分散到液状样品中。

本发明的检查器具是如下检查器具，其具备：例如，用于供给液 状样品的供给部；设置在检查器具内，使液状样品与试剂反应的反应 室；及用于将供给到供给部的液状样品移送至反应室的流路，

流路及反应室经有通气性、且非通液性的多孔性膜与检查器具外 部连接，

反应室由第1平面、面对所述第1平面的第2平面、及分别与第 1平面及第2平面连接而在第1平面和第2平面之间形成空间的第3 面形成，

流路和反应室通过在第3面形成连结孔而连结，

试剂干燥附着在平面的至少一个面，

将供给到供给部的液状样品由设置在供给部的加压部加压，移送 到反应室内。

在本发明中，液状样品只要含液体即可，但优选是活体样品，可 例示例如，血液样品、尿、髓液等。

作为血液样品，可例示血清、血浆、全血等。在本发明中，优选 在供给部和流路之间有用于从液状样品分离固体的膜。特别是在液状 样品是全血等，含血细胞等的固体成分时，为了进行固液分离，在本 发明中，在供给部和流路之间有用于从液状样品分离固体的膜是优选 的。

当使用膜时，将液状样品适用于供给部之后，压力差、优选利用 押压而膜分离、例如，分离除去血细胞等的固体分而，使仅液状样品 经由流路送入反应室。结果，通过使液状样品冲击干燥附着的试剂而 溶解，将贵金属胶体分散到液状样品中，可通过贵金属胶体凝集法测 定液状样品中的分析对象物质。一般而言，由于全血含大量的复杂的 活体成分或血细胞等的固体，正确地测定其中的仅分析对象物质通常 是困难的。但是，在本发明中，当使用由压力差的膜分离时，可简单 地从指尖等采集的全血不稀释而可测定全血中的分析对象物质。如此， 在本发明的检查器具中，有可不将液状样品用试剂等稀释而适用的长 处。即，当液状样品是血液样品等的活体样品时，即便该样品的粘性 变高而难以分散胶体，在本发明中，通过使用贵金属胶体等而不稀释 样品而可测定分析对象物质。

在本说明书中，贵金属胶体凝集测定法是指代替乳胶凝集测定法 的乳胶而使用贵金属胶体的方法，例如，将特定成分被致敏的贵金属 胶体试剂，和样品混合而引起凝集反应，从该凝集的程度测定该分析 对象物质的方法。

在本发明中，试剂只要是可将分析对象物质用贵金属胶体凝集测 定法测定的试剂，就不特别限定。

作为那样的试剂，可例示含与分析对象物质特异性地结合的偶体 致敏贵金属胶体的试剂、含该偶体和与该分析对象物质相同的物质致 敏贵金属胶体的试剂。作为与分析对象物质特异性地结合的偶体，在 分析对象物质是抗原的情况中，可例示针对该抗原的抗体，在分析对 象物质是抗体的情况中，可例示针对抗体的抗原。作为分析对象物质 和与其特异性地结合的偶体的其他组合，可举出例如，生物素和亲和 素或链霉亲和素、凝集素和凝集素结合性糖类、激素和激素受体、细 胞因子和细胞因子受体、蛋白A和IgG、DNA或RNA和与它们互补 的DNA或RNA等的组合。

以下，以分析对象物质是CRP或半胱氨酸蛋白酶抑制物C等的 抗原、其偶体是抗CRP抗体或抗半胱氨酸蛋白酶抑制物C抗体等的 抗体的情况为例对试剂进行说明。再有，在分析对象物质是抗体的情 况中，则在说明中，将抗原和抗体倒过来即可。

作为试剂使用与分析对象物质（抗原）特异性地结合的偶体（抗 体）致敏贵金属胶体时，反应中生成的免疫凝集复合物（抗原抗体复 合物）随着分析对象物质（抗原）的量而变大。可从该变大的程度测 定分析对象物质（抗原）的浓度。

另一方面，作为试剂使用含该偶体（抗体）和与该分析对象物质 （抗原）相同的物质（抗原）致敏贵金属胶体二者的试剂时，反应中 生成的免疫凝集复合物（抗原抗体复合物）随着分析对象物质（抗原） 的量而变小。这也一般被称为免疫凝集阻止法，是使对于作为试剂的 贵金属胶体致敏的抗原，和试剂的抗体凝集反应的方法。在此方法中， 如果样品的抗原进入测定系统内，则试剂的抗原致敏贵金属胶体和试 剂的抗体的凝集反应被抑制，结果凝集变小，其量减少。

作为分析对象物质和与其特异性地结合的偶体，在使用例如，生 物素和亲和素或链霉亲和素、凝集素和凝集素结合性糖类、激素和激 素受体、细胞因子和细胞因子受体、蛋白A和IgG、DNA或RNA和 与它们互补的DNA或RNA等的组合时，与上述的抗原或抗体和抗体 或抗原的组合同样，可通过贵金属胶体凝集测定法测定。

在本发明中使用的试剂中，加赋形剂、稳定化剂、缓冲剂、表面 活性剂也可。

作为上述赋形剂，可例示例如，白蛋白等的蛋白质、甘氨酸等的 氨基酸、甘露糖醇等的醇类、葡萄糖等的烃化合物。

作为稳定化剂，易将水保持在分子中的物质、山梨糖醇等的糖类 一般是优选的。

作为试剂的抗体致敏贵金属胶体或抗原致敏贵金属胶体等的物质 致敏贵金属胶体试剂，例如，可如以下一样制备。向贵金属胶体溶液 加抗体等的致敏对象物质而在缓冲液中制备而于室温静置之后，加 BSA包被溶液。接下来，进行离心分离，废弃上清而回收沉淀物。向 此沉淀物加BSA包被溶液而悬浮沉淀物，进行超声波处理而完全地分 散。接下来向进行离心分离而得到的沉淀物加悬浮液而悬浮，得到物 质致敏贵金属胶体。接下来，向得到的物质致敏贵金属胶体加山梨糖 醇、表面活性剂等，通过根据情况加其他必要的成分而可制备可将分 析对象物质用贵金属胶体凝集测定法测定的试剂。

为了制备本发明的检查器具，可将分析对象物质用贵金属胶体凝 集测定法测定的试剂干燥附着于构成反应室的面的至少一部分。此时， 例如，将液状的该试剂涂布于构成反应室的面的至少一部分，接下来 使干燥即可。作为该液状试剂的干燥，可举出例如，自然干燥或冷冻 干燥，但在本发明中，与乳胶试剂不同，从试剂稳定性来看自然干燥 法是优选的。

将用于测定分析对象物质的试剂作为一个整体试剂，干燥附着于 构成检查器具的反应室的面也可，但考虑到试剂的稳定性等，分成二 试剂而各自附着于第1平面及第2平面也可。作为试剂而使用含针对 分析对象物质的偶体和与分析对象物质相同的物质致敏贵金属胶体的 试剂时，将各自分别干燥附着于第1平面和第2平面是优选的。

凝集测定法，通常，作为粒子使用乳胶，但在本发明中，使用贵 金属胶体。作为贵金属胶体中使用的贵金属，可例示金、银、铂、钯 等，但金、银或钯是优选的，金或钯更优选，金再优选。这是因为， 在使用胶体金或钯胶体、特别是胶体金时，可使用本发明的检查器具 非常正确地测定分析对象物质。胶体金的吸收波长的极大波长是 500nm以上，但在本发明中，作为贵金属胶体使用胶体金时，在免疫 凝集反应等的凝集反应后，向得到的混合液照射光，基于透射光或反 射光来源的吸光度变化测定液状样品中的物质之时，在波长是390～ 420nm，也可测定。另外，钯胶体的吸收波长的极大波长是250nm以 下，但在本发明中，作为贵金属胶体而使用钯胶体时，在免疫凝集反 应等的凝集反应后，向得到的混合液照射光，基于透射光或反射光来 源的吸光度变化测定液状样品中的物质之时，在波长是390～420nm 也可测定。此时，用于照射光的光源（LED）容易得到是优选的。

在本发明中，贵金属胶体的粒径通常是1～200nm、优选是20～ 150nm。作为贵金属胶体，由压力差与液状样品接触或冲击之时，容 易分散的贵金属胶体是优选的，贵金属微粒子被保护成分保护也可。

作为那样的贵金属胶体，只要由本发明的压力差与液状样品接触 之时分散可能就不特别限定，但可例示：季铵盐型贵金属络合物化合 物（特开2001-192712号公报）、被高分子染料分散剂保护的贵金属 胶体（特开平11-76800号公报、特开平11-80647号公报）、作为分 散剂使用柠檬酸钠的贵金属胶体（特开平10-66861号公报）、被肽的 氧化物或葡萄糖胺化合物的氧化物保护的贵金属胶体（国际公开 WO2005/023468号单行本）、被如氨基酸一样的具有氨基和羧基的化 合物保护的贵金属胶体（特开2002-245854号公报）。

在本发明中，为了实现压力差，流路及反应室经有通气性、且非 通液性的多孔性膜与检查器具外部连接是优选的。

在本发明中，作为用于产生压力差的手段，只要是可在反应室和 供给部之间产生压力差，结果，液状样品从供给部经由流路送入反应 室而将干燥试剂分散的程度的手段即可。具体而言，可例示加压手段、 引压手段，但为了使检查器具成为简单的结构，使用加压手段是优选 的。即，将供给到供给部的样品由设置在供给部的加压部加压，使得 可移送到反应室内是优选的。

在本发明中，在使用引压手段之时，可经过例如，向反应室通气 体，不通液体的膜或物质，通过用泵吸引来产生压力差。

在本发明中，向混合液照射光之时，向反应室照射是优选的。因 此，反应室之上下的面是透明是优选的。即，反应室兼用测定室是优 选的。

此时，向混合液照射光之时，为了向反应室照射，使用可见光光 度计是优选的。因此，反应室之上下的面的至少一部分是透明是优选 的。此时，可使用从上照射光而读取透射光或反射光来源的吸光度变 化的可见光光度计，测定反应后的吸光度变化，基于其变化的增减定 量分析对象物质。

本发明的测定方法使用组合了本发明的检查器具和用于向反应室 照射光而读取透射光或反射光的可见光光度计的2者的装置也可。在 此装置中，例如，具备构成对供给部加压的加压手段的泵也可。

本发明的测定方法是如下液状样品中的分析对象物质的测定方 法，其使用以上详细地说明的本发明的检查器具，将液状样品供给到 本发明的检查器具的供给部，接下来，在供给部和反应室之间产生压 力差而经由流路移送到反应室，使反应室中的试剂与液状样品接触而 将试剂分散到液状试剂中，使液状样品中的分析对象物质与试剂反应， 向得到的混合液照射光，以及基于透射光或反射光来源的吸光度变化 测定液状样品中的分析对象物质。

在本发明中，致敏贵金属胶体的状态随着抗原抗体反应等而状态 发生变化，结果，在反应前后照射光时，透射光或反射光来源的吸光 度发生变化。反应前的数据，作为样品而可使用不含分析对象物质的 样品来测定，可从反应前后的吸光度的差求出分析对象物质的浓度。

在本发明的测定方法中，照射的光的波长是340～800nm是优选 的，390～420nm是再优选的。这是由于在390～420nm，可作为在干 燥化学中使用的光源有常用性。

以下，为了作为分析对象物质测定抗原，以使用抗体致敏贵金属 胶体时为例进行说明（在抗体测定的情况中，将抗原和抗体倒过来即 可）。在贵金属胶体是胶体金的情况中，通常，试剂的抗体致敏胶体 金溶液的极大吸收波长是500nm以上。抗体致敏胶体金溶液在极大吸 收波长附近与其抗原（分析对象物质）反应，则吸光度发生大的变化。 另一方面，在390～420nm，抗体致敏胶体金溶液与抗原反应，则也 发生吸光度的变化。另外，在贵金属胶体是钯胶体的情况中，抗体致 敏钯胶体溶液的极大吸收波长是通常250nm以下，在与其抗原反应之 时，在此极大吸收波长附近发生吸光度的大的变化，但在390～420nm， 抗体致敏钯胶体溶液和抗原反应，则也发生吸光度的变化。在本发明 中，可从由抗原抗体反应等的液状样品和试剂的反应的吸光度的变化 的程度定量抗原的浓度。

作为分析对象物质和与其特异性地结合的偶体，在使用其他组合 时，也与上述同样，可用贵金属胶体凝集测定法测定。

在反应室中，由液状样品溶解该试剂而使反应之时，可通过例如， 在20～40℃、优选在37℃附近反应而实施。

在本发明的测定方法中，可不对检查器具加旋转操作或振动操作， 即，不特别进行空间移动而实施。即，在本发明中，除了在检查器具 的供给部和反应室之间产生压力差以外，可不特别加自外部的物理移 动或操作而不移动检查器具自体而分散干燥试剂，从而实施免疫反应 等的反应。另外，在本发明的测定方法中，无必要进行BF分离。结 果，可使用极其简单的检查器具正确地测定样品中的分析对象物质。

接下来，基于附图，对本发明的测定方法及其中使用的检查器具 再进行具体说明。

作为本发明中涉及的检查器具的优选的一实施方式，将检查器具 基于附图进行说明。图1示检查器具的纵截面图、图2示检查器具之 上面图、图3示检查器具的分解斜视图。

检查器具是，如图1～3所示，第1板1、印刷面1（图中符号2）、 由多孔性膜形成的中间板6、印刷面2（图中符号3）及第2板4以上 下方向积层而具有一体化的结构。在上层侧的第1板1上形成圆形的 样品供给部7。再有，印刷面是被涂黑的层，但设定成在用于涂干试 剂的部分，为了不是印刷面而形成凹陷，可在该凹陷涂布干试剂。印 刷面1（印刷面2）在第1板1（第2板4）或中间板6之一面由包被 或丝网印刷等形成也可，作为与这些板独立的膜形成之后，积层在这 些板间也可。在样品供给部7之上部周围，以可连离的方式设置有底 圆筒形状的栓体8。在第1板1及第2板4，使用容易加工的树脂材料， 例如，使用苯乙烯－丙烯腈树脂（ABS树脂）等。在中间板6使用非 通液性而通气性的多孔质材、例如，四氟化乙烯树脂（PTFE树脂） 等。

在第1板1和第2板4之间设置中间板6，经印刷面1（2）及印 刷面2（3）附着。在中间板6设置液状试剂的流路10，通过流路10 设置反应室11。在样品供给部7和流路10之间设置有通气性、且通 液性的多孔性的膜9。

试剂以指定量涂布在反应室11的第1平面及第2平面之任何，或 者两者而干燥附着，形成干试剂1（图中符号5）及/或干试剂2（图中 符号12）。

在实际进行测定时，从样品供给部7供给液状样品。然后，用栓 体8盖住样品供给部7，例如，用指对栓体8加压。由此，反应室11 或流路10内的空气从中间板6排出到外部，液状样品被送入反应室 11内。试剂干燥附着到反应室11的第1平面及第2平面之任何，或 者两者，液状样品被搬送到反应室11的空间内，则试剂分散到液状样 品中，开始液状样品和试剂的反应。由于在一个空间内样品和试剂互 相混合，从而被均一地混合。

在反应室11的液状样品和试剂的反应后的混合液的测定可使用 透射光或反射光来测定。使用透射光或反射光的光学测定是，使第1 板1及第2板4的全体由有光透过性的树脂形成，在反应室11使试剂 和液状样品的反应后，向混合液，例如，从第2板4之下方向第1板 1，照射例如，波长405nm的透射光，通过在反应室11的透射光的吸 收测定即可。

【实施例】

以下，使用实施例及比较例再详细地说明本发明，但本发明不限 于这些例。

【实施例1】

【使用根据本发明的胶体金的人CRP的测定方法】

【1.方法】

【（1）抗人CRP抗体致敏胶体金的制备】

如以下一样进行向胶体金的抗人CRP抗体的致敏。

向平均粒径50nm的胶体金溶液（Nacalai公司销售、保护胶体金 溶液）10mL加将抗人CRP抗体在Tris缓冲液中调节到0.2mg/mL的 溶液10mL，于室温静置15分钟之后，加10mL BSA包被溶液。其后， 以15,000rpm进行10分钟离心分离，废弃上清而回收沉淀物。向此 沉淀物加20mL的BSA包被溶液而悬浮沉淀物，进行30秒钟超声波 处理而使完全地分散。接下来进行离心分离，向得到的沉淀物加1mL 悬浮液而悬浮，得到抗人CRP抗体致敏胶体金。

【（2）干试剂的制备】

向上述（1）中得到的抗人CRP抗体致敏胶体金添加山梨糖醇至 终浓度2%、添加表面活性剂至终浓度0.1%。

【（3）检查器具的制备及其操作】

将如上所述制备的试剂向2个PET片上各涂布至0.375μL、0.5μL， 通过自然放置干燥。干燥后，涂布的片与含待测样品流路的片夹合， 制备如图1～3所示构成的检查器具。将样品导入供给部至成为反应池 体积2.5容积中的1容积，通过押压经由流路导入反应室，溶解试剂。 测定是在样品导入后，于37℃反应10分钟，对涂布试剂的部分以波 长405nm测光，求出反应后的吸光度。

使用的试剂、及样品具体而言如下。

胶体金制备用试剂：

BSA包被溶液

Tris 10mM pH9.2 BSA（牛血清白蛋白） 1.0% PEG（平均分子量20，000） 0.1%

Tris缓冲液

Tris 10mM pH9.2

悬浮液

Tris 100mM pH9.2

样品：

使用得到知情同意的人血清（n=30）。

【（4）由检查器具的测定】

与以往方法的相关性是使用得到知情同意的人血清（n=30）确认 与以往方法（乳胶法）的相关性。

在相关性的确认中，作为以往方法，使用N-分析LACRPD-型 （NITTOBO MEDICAL公司制），用日立7180型自动分析装置进行 测定。另外，干试剂的标准曲线使用CRP浓度已知的管理血清制成。

【2.结果】

将以往方法作为X、本发明法作为Y来确认相关性。如图4所示， 得到Y=0.9849X+0.007、相关系数0.9925的良好的结果。因此认为本 发明的测定方法使用胶体金可正确地测定人CRP。

【实施例2】

【使用根据本发明的胶体金的人半胱氨酸蛋白酶抑制物C的测定 方法】

【1.方法】

【（1）抗人半胱氨酸蛋白酶抑制物C抗体致敏胶体金的制 备】

向胶体金的抗人半胱氨酸蛋白酶抑制物C抗体的致敏如以下一样 进行。向平均粒径50nm的胶体金溶液（WINERED CHEMICAL公 司制）9mL加3mL将抗人半胱氨酸蛋白酶抑制物C抗体在Tris缓冲 液中调节到150μg/mL的溶液，于室温静置15分钟之后，加9mL的 BSA包被溶液。其后，以15,000rpm进行10分钟离心分离，废弃上 清而回收沉淀物。向此沉淀物加9mL的BSA包被溶液而悬浮沉淀物， 进行30秒钟超声波处理而使完全地分散。接下来进行离心分离，向得 到的沉淀物加705μL的悬浮液而悬浮，得到抗人半胱氨酸蛋白酶抑制 物C抗体致敏胶体金。

【（2）干试剂的制备】

向上述（1）中得到的抗人半胱氨酸蛋白酶抑制物C抗体致敏胶 体金添加山梨糖醇至终浓度2%、添加表面活性剂至终浓度0.1%。

【（3）检查器具的制备及其操作】

将如上所述制备的试剂向2个PET片上各涂布至0.375μL、0.5μL 而干燥。干燥后，涂布的片夹合含待测样品流路的片。导入样品至成 为反应池体积2.5容积中的1容积，溶解试剂。测定是在样品导入后， 于37℃反应7分钟，对涂布试剂的部分在波长405nm、800nm进行测 光，求出反应后的吸光度。

使用的试剂、及样品具体而言如下。

胶体金制备用试剂：

BSA包被溶液

Tris 10mM pH9.2 BSA（牛血清白蛋白） 1.0% PEG（平均分子量20，000） 0.1%

Tris缓冲液

Tris 10mM pH9.2

悬浮液

Tris 100mM pH9.2

样品：

使用得到知情同意的人血清（n=28）。

【（4）由检查器具的测定】

与以往方法的相关性是使用得到知情同意的人血清（n=28）确认 与以往方法（乳胶法）的相关性。

在相关性的确认中，作为以往方法，使用N-分析LA半胱氨酸蛋 白酶抑制物C（NITTOBO MEDICAL公司制），用日立7180型自动 分析装置进行测定。另外，干试剂的标准曲线使用半胱氨酸蛋白酶抑 制物C浓度已知的管理血清制成。

【2.结果】

将以往方法作为X、本发明法作为Y来确认相关性。如图5所示， 得到Y=0.9429X+0.0635、相关系数0.9710的良好的结果。因此认为本 发明的测定方法使用胶体金可正确地测定人半胱氨酸蛋白酶抑制物 C。

【实施例3】

【使用根据本发明的钯胶体的人CRP的测定方法】

【1.方法】

【（1）抗人CRP抗体致敏钯胶体的制备】

向钯胶体的抗人CRP抗体的致敏如以下一样进行。

向平均粒径76nm的钯胶体溶液（WINERED CHEMICAL公司 制）8mL加8mL的在Tris缓冲液中调节到蛋白浓度0.2mg/dL的抗人 CRP抗体溶液，于室温静置15分钟之后，加8mL的BSA包被溶液， 静置15分钟。其后，以15,000rpm进行20分钟离心分离，废弃上清 而回收沉淀物。向此沉淀物加16mL的BSA包被溶液而悬浮沉淀物， 进行60秒钟超声波处理而完全地分散。接下来，以15,000rpm进行 20分钟离心分离，向得到的沉淀物加600μL的悬浮液而悬浮，得到抗 人CRP抗体致敏钯胶体。

【（2）干试剂的制备】

向上述（1）中得到的抗人CRP抗体致敏钯胶体添加葡萄糖至终 浓度2%、添加表面活性剂至终浓度0.6%。

【（3）检查器具的制备及其操作】

将如上所述制备的试剂向1个PET片上涂布至0.5μL而干燥。干 燥后，在涂布试剂的PET片和未涂布试剂的另一个PET片夹合含待 测样品流路的片。导入样品至成为反应池体积2.5容积中的1容积， 溶解试剂。测定是在样品导入后，于37℃反应10分钟，对涂布试剂 的部分在波长405nm进行测光，求出反应后的吸光度。

使用的试剂、及样品具体而言如下。

钯胶体制备用试剂：

BSA包被溶液

Tris 10mM pH9.2 BSA（牛血清白蛋白） 1.0%

PEG（平均分子量20，000） 0.1%

Tris缓冲液

Tris 10mM pH9.2

悬浮液

Tris 200mM pH9.2

样品：

使用得到知情同意的人血浆（n=21）。

【（4）由检查器具的测定】

与以往方法的相关性是使用得到知情同意的人血清（n=21）确认 与以往方法（乳胶法）的相关性。

在相关性的确认中，作为以往方法，使用N-分析LACRPD-型 （NITTOBO MEDICAL公司制），用日立7180型自动分析装置进行 测定。另外，干试剂的标准曲线使用CRP浓度已知的管理血浆制成。

【2.结果】

将以往方法作为X、本发明法作为Y来确认相关性。如图6所示， 得到Y=1.0207X+0.252、相关系数0.9817的良好的结果。因此认为本 发明的测定方法使用钯胶体可正确地测定人CRP。

【比较例1】

【使用贵金属胶体以外的人CRP的测定】

制备代替贵金属胶体而使用乳胶的抗人CRP抗体致敏乳胶（聚苯 乙烯聚合物）试剂，进行与实施例1同样的实验。

乳胶试剂中，由测光时的浊度，产生的吸光度由乳胶的散射光抑 制，无法浓度依赖性地得到吸光度。而且，乳胶试剂缺乏分散、扩散 性，待测样品供给后，不可能完全地分散、扩散干燥状态的粒子。

分散、扩散性的问题在使用难发生散射光的着色乳胶粒子时也同 样，无法作为干试剂适应。

另外，在使用TIA法的干试剂的检查中，得到的吸光度变化极小， 无法定量如CRP一样的低浓度的蛋白质。

【工业实用性】

在本发明的检查器具及使用其的分析对象物质的测定方法中，通 过干燥化学使用简便的检查器具可正确地测定液状样品中的分析对象 物质。而且，由于可基于在可见光区的吸光度的测定，可适用于使用 常用的可见光光度计的装置，并且，可短时间内正确地测定分析对象 物，本发明的检查器具及测定方法适宜于POCT领域。

【符号的说明】

1第1板

2印刷面1

3印刷面2

4第2板

5干试剂1

6中间板

7供给部

8栓体

9膜

10流路

11反应室

12干试剂2