一种甘草多糖的提取方法及应用

摘要

本发明公开一种甘草多糖的提取方法及应用。本发明采用高温有机酸法提取结合超滤膜处理制备甘草多糖。甘草粉碎后，通过高温有机酸提取、超滤截流、浓缩和乙醇沉淀分离获得甘草多糖。将本发明制备的甘草多糖以烟丝重量0.05%~0.2%加入到卷烟中，所得卷烟的烟草凝集物对人支气管上皮BEAS-2B细胞存活率显著高于空白样品，具有正面作用。

说明书

技术领域

本发明涉及甘草渣深加工技术，具体是甘草多糖的提取方法及应用。

背景技术

随着人们生活水平和生活质量的不断提高，卷烟消费已经向品牌消费转变，尤其是高档卷烟市场，消费者对卷烟的健康、风味也提出越来越高的要求。生产低焦油、低危害的卷烟已成为我国乃至世界卷烟行业发展的重要方向之一。目前，降低卷烟危害采用的主要技术路线有两条：一种是“降焦”，即通过降低卷烟焦油的释放量使有害成分同时降低，即协同性降低卷烟烟气有害成分；另一种是“减害”，即采用特殊技术和添加功能性因子以达到降低卷烟烟气中部分有害成分，而对其他成分作用较小的目的，即选择性降低卷烟烟气中有害成分。烟草凝集物（CSC）对人支气管上皮BEAS-2B细胞的细胞毒性是评价卷烟安全性的一项重要指标。目前已有多篇文献报道CSC诱导人支气管上皮BEAS-2B细胞凋亡并探讨了其作用途径和机理。目前尚未见降低烟草凝集物（CSC）对人支气管上皮BEAS-2B细胞的细胞毒性的方法。

甘草为多年生草本，主要分布于新疆、青海、甘肃等地。甘草具有益气补中、缓急止痛、润肺止咳、泻火解毒和调和诸药的作用，广泛应用于医药和食品行业。目前我国甘草主要用于生产甘草浸提物、甘草酸及其衍生物，甘草渣是甘草加工的副产物。长期以来,工业化生产只对甘草中的甘草甜素(又名甘草酸)作为主要有效成分进行提取,而提取甘草酸后的甘草渣则被当作废弃物遗弃,造成了环境污染和资源浪费。由于加工技术手段限制，目前我国甘草渣还没有得到充分利用，或用于养殖饲料，或作为肥料直接填埋回土地。近年来，甘草渣的深加工利用成为国内研究的热点和重点。授权专利（专利号201010242200.X）采用甘草渣为原料制备烟草薄片，并发现烟草薄片添加到烟草中具有无焦油含量、一氧化碳释放量较低、明显增香和减少卷烟刺激感的作用。授权专利（专利号201010111656.2）公开了一种从甘草废渣中提取降血糖活性成分的方法。发明（申请号200510119580.7）公开了一种从甘草废渣中提取甘草酸的方法。发明（申请号02109474.8）公开了一种从甘草废渣中提取甘草黄酮的方法。目前尚未见以甘草渣或甘草为原料，制备具有降低卷烟的烟草凝集物(CSC)细胞毒性功能性甘草多糖的报道。

发明内容

本发明的目的是填补目前关于应用甘草多糖降低卷烟烟草凝集物（CSC）对人支气管上皮BEAS-2B细胞的细胞毒性方法的空白，提供一种甘草多糖的提取方法及应用。将本发明制备的甘草多糖加入到卷烟中，所得卷烟的烟草凝集物对人支气管上皮BEAS-2B细胞存活率显著高于空白样品，具有正面作用。

本发明同时提供了在卷烟中添加甘草多糖降低卷烟烟草凝集物（CSC）对人支气管上皮BEAS-2B细胞的细胞毒性的应用。

本发明的目的通过如下技术方案予以实现：

一种甘草多糖的提取方法，其包括如下步骤：

（1）甘草渣除沙洗净，晾干后粉碎得甘草渣原料；

（2）在甘草渣原料中加入有机酸溶液，于110-120℃下提取2-5小时，过滤，分离甘草渣提取液，用氢氧化钾调节提取液pH值至6.5-7.0；

（3）将步骤（2）所得的提取液用截留分子量5000道尔顿的膜进行超滤，收集截流液部分；

（4）将超滤透过液进行真空浓缩，至原来体积的1/7~1/3，得浓缩液；

（5）在浓缩液中加入乙醇，混合均匀后，在0-4℃下静置1-3小时，过滤，除去上层清液部分，得多糖沉淀；

（6）收集沉淀物，冷冻干燥，获得甘草多糖。

进一步改进的，步骤（1）所述甘草渣粉碎至40-100目。

进一步改进的，步骤（2）所述有机酸溶液为柠檬酸或苹果酸中任意一种，且溶液的pH值为1.0-3.0。

进一步改进的，步骤（2）所述有机酸溶液的用量按甘草渣原料重量的20-40倍加入。

进一步改进的，步骤（5）所述乙醇添加量满足混合均匀后乙醇最终浓度为75-90%（v/v）。

进一步改进的，步骤（5）所述多糖沉淀用乙醇浸洗2-3次。

进一步改进的，步骤（6）所得沉淀物进行冷冻干燥，得浅黄色甘草多糖。

上述方法得到的甘草多糖在卷烟中的应用，具体是按照烟丝质量的0.05-0.2%的比例，通过喷洒方式将其添加到烟丝或过滤嘴中。

本发明采用了以上技术方案，具有如下的优点和有益效果：

1、本发明提供了一种甘草多糖的提取分离方法，将本发明制备的甘草多糖以烟丝重量0.05%~0.2%加入到卷烟中，所得卷烟的烟草凝集物对人支气管上皮BEAS-2B细胞存活率显著高于空白样品，具有正面作用。此外，本发明制备的甘草多糖对卷烟的吸食品质无影响。

2、本发明以低值的甘草渣为原料，制备具有功能活性的甘草多糖，实现了甘草渣资源的高值化利用。所公开的甘草多糖提取方法具有工艺流程简单、易于产业化的特点。

具体实施方式

烟草凝集物细胞毒性试验：按标准吸烟条件（GB/T 16450-1996，常规分析用吸烟机定义的标准条件）收集卷烟烟气，制备烟气凝集物，用细胞培养液配制成1支烟/ml的溶液，液氮储存备用。实验时，稀释到实验设计浓度。人支气管上皮BEAS-2B细胞采用无血清的LHC-8培养基，在37度、5%二氧化碳和95%湿度条件下培养。

将指数生长期的细胞，以适当密度接种于96孔板中，24h后加入不同浓度的烟草凝集物，每种条件设6个平行洋，培养基总体积为200ul，在在37度、5%二氧化碳和95%湿度条件下继续培养72h。培养结束前4h，每孔加入5mg/ml MTT溶液20ul。培养结束后，取上清液，加入150ulDMSO，吹打混匀，待紫色结晶全部溶解后，用酶标仪测定490nm波长的OD值，计算细胞存活分数。

下面结合实施例和附表对本发明的具体实施作进一步说明。

 

实施例1

（1）甘草渣除沙洗净，晾干后粉碎，过40目筛得甘草渣原料；

（2）按甘草渣原料重量的35倍加入水，于110℃下提取5小时，过滤，分离甘草渣，得提取液，用氢氧化钾调节提取液pH值至7.0；

（3）将步骤（2）所得的提取液用截留分子量5000道尔顿的膜进行超滤，收集截流液部分；

（4）将提取液进行真空浓缩，至原来体积的1/5，得浓缩液；

（5）在浓缩液中加入乙醇，混合均匀后乙醇最终浓度为70%（v/v），在2℃下静置3小时，过滤，除去上层清液部分，得多糖沉淀；

（5）收集沉淀物，冷冻干燥，获得浅黄色甘草渣多糖1#。

 

实施例2

（1）甘草渣除沙洗净，晾干后粉碎，过40目筛得甘草渣原料；

（2）按甘草渣原料重量的35倍加入pH值为2的柠檬酸溶液，于110℃下提取5小时，过滤，分离甘草渣，得提取液，用氢氧化钾调节提取液pH值至7.0；

（3）将步骤（2）所得的提取液用截留分子量5000道尔顿的膜进行超滤，收集截流液部分；

（4）将截流液进行真空浓缩，至原来体积的1/5，得浓缩液；

（5）在浓缩液中加入乙醇，混合均匀后乙醇最终浓度为70%（v/v），在2℃下静置3小时，过滤，除去上层清液部分，得多糖沉淀；

（5）收集沉淀物，冷冻干燥，获得浅黄色甘草渣多糖2#。

 

实施例3

（1）甘草渣除沙洗净，晾干后粉碎，过80目筛得甘草渣原料；

（2）按甘草渣干粉重量的20倍加入pH值为1的柠檬酸溶液，于120℃下提取2小时，过滤，分离甘草渣渣得提取液，用氢氧化钾调节提取液pH值至6.5；

（3）将步骤（2）所得的提取液用截留分子量5000道尔顿的膜进行超滤，收集截流液部分；

（4）将超滤透过液进行真空浓缩，至原来体积的1/5，得浓缩液；

（5）在浓缩液中加入乙醇，混合均匀后乙醇最终浓度为85%（v/v），在4℃下静置12小时，过滤，除去上层清液部分，得多糖沉淀，并用乙醇和丙酮浸洗2-3次；

（6）收集沉淀物，冷冻干燥，获得浅黄色甘草渣多糖3#。

 

实施例4

（1）甘草渣除沙洗净，晾干后粉碎，过100目筛得甘草渣原料；

（2）按甘草渣干粉重量的25倍加入pH值为2.5的苹果酸溶液，于115℃下提取4小时，过滤，分离甘草渣渣得提取液，用氢氧化钾调节提取液pH值至6.7；

（3）将步骤（2）所得的提取液用截留分子量5000道尔顿的膜进行超滤，收集截流液部分；

（4）将超滤透过液进行真空浓缩，至原来体积的1/7，得浓缩液；

（5）在浓缩液中加入乙醇，混合均匀后乙醇最终浓度为80%（v/v），在3℃下静置10小时，过滤，除去上层清液部分，得多糖沉淀，用乙醇浸洗2-3次；

（6）收集沉淀物，冷冻干燥，获得浅黄色甘草渣多糖4#。

 

实施例5

（1）甘草渣除沙洗净，晾干后粉碎，过80目筛得甘草渣原料；

（2）按甘草渣干粉重量的25倍加入pH值为3.0的柠檬酸溶液，于110℃下提取5小时，过滤，分离甘草渣渣得提取液，用氢氧化钾调节提取液pH值至6.8；

（3）将步骤（2）所得的提取液用截留分子量5000道尔顿的膜进行超滤，收集截流液部分；

（4）将超滤透过液进行真空浓缩，至原来体积的1/3，得浓缩液；

（5）在浓缩液中加入乙醇，混合均匀后乙醇最终浓度为90%（v/v），在4℃下静置3小时，过滤，除去上层清液部分，得多糖沉淀，用乙醇浸洗3次；

（6）收集沉淀物，冷冻干燥，获得浅黄色的甘草渣多糖5#，。

卷烟CSC对人支气管上皮BEAS-2B细胞增殖的影响

产品添加量IC50甘草多糖1#0.1%0.00299支烟/ml甘草多糖2#0.1%0.00485支烟/ml甘草多糖3#0.1%0.00496支烟/ml甘草多糖4#0.1%0.00499支烟/ml甘草多糖5#0.1%VC空白 0.00295支烟/ml

由表1可见，用去离子水溶解甘草多糖，通过喷洒方式在卷烟中添加0.1%的甘草多糖，其卷烟CSC对人支气管上皮BEAS-2B细胞增殖的IC50值是空白样品的1.74倍。采用常规的热水提取得到的甘草多糖其卷烟CSC对人支气管上皮BEAS-2B细胞增殖的IC50值与空白样品相当。这表明，本发明所制备的甘草多糖可以显著提高卷烟CSC对人支气管上皮BEAS-2B细胞增殖的IC50值，即添加了甘草多糖的卷烟安全性更高。