治疗和预防无乳链球菌的免疫原性蛋白和组合物

摘要

本发明提供用于治疗和预防无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)(B型链球菌;GBS)的蛋白和组合物。

说明书

技术领域

本发明提供用于治疗和预防无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)(B型链 球菌;GBS)的蛋白和组合物。

背景技术

革兰氏阳性菌无乳链球菌（或“B型链球菌”，简称“GBS”）会在免疫受 损个体和新生儿中引起严重的疾病，菌血症和脑膜炎。有两种新生儿感染。第 一种（早发，通常在出生5天内）表现为菌血症和肺炎。婴儿穿过产道时发生 垂直收缩。GBS在约25％年轻女性的阴道中移生，通过有该菌移生的母亲阴 道分娩婴儿中约1％会受到感染。致死率50-70%。第二种是脑膜炎，出生后 10-60天发生。若怀孕女性用III型荚膜接种，则婴儿会被动免疫，迟发性脑膜 炎发病率会降低但不是完全消除。

“GBS”中的“B”表示兰氏分类法（Lancefield classification），其基于稀 酸中可溶性糖（称为C糖）的抗原性。兰氏分类鉴定到13种C糖，称为A-O， 其可在血清学上区分。最常感染人类的生物体在A、B、D和G群中。B群中 株系基于其多糖荚膜的结构被分为10个血清型（Ia、Ib、II、III、IV、V、VI、 VII、VIII和XI）。

已经进行研究开发基于蛋白和基于多糖的针对GBS的疫苗，但目前没有 市售可得的GBS疫苗。因此需要针对无乳链球菌（S.agalactiae）感染的有效 疫苗。

本发明目的是提供能用于开发所述疫苗的蛋白和免疫原性组合物。

发明内容

革兰氏阳性菌的菌毛结构被认为是感兴趣的疫苗候选物。GBS具有三种 菌毛变体，各由不同毒力岛（pathogenicity island）PI-1、PI-2a和PI-2b编码[1,2]。 各毒力岛由5种基因组成，所述基因编码：菌毛骨架蛋白(BP);2种辅助蛋白 (AP1和AP2);和2种涉及菌毛组装的分选酶蛋白。所有GBS株系载有这3 种毒力岛中至少一种且这些毒力岛编码的菌毛结构蛋白（BP、AP1和AP2） 的序列通常非常保守。然而，毒力岛2a(BP-2a)编码的骨架蛋白序列（本文称 为GBS59）在GBS株系中不同。所述GBS59菌毛亚基有至少7个进化支， 并且所述进化支之间的序列相同性低至48%。

所述7个GBS59进化支的参比氨基酸序列是SEQ ID NO:1(衍生自GBS 株2603)、SEQ ID NO:2(衍生自GBS株515)、SEQ ID NO:3(衍生自GBS株 CJB111)、SEQ ID NO:4(衍生自GBS株H36B)、SEQ ID NO:5(衍生自GBS株 CJB110)、SEQ ID NO:6(衍生自GBS株DK21)和SEQ ID NO:7(衍生自GBS NEM316)。

针对特定GBS59进化支产生的血清对表达该进化支的其他GBS菌株有活 性，但对表达其它五种进化支之一的菌株无活性，即进化支内有交叉保护，但 进化支间没有交叉保护。

因此，根据本发明，提供包含GBS59的至少两个不同进化支的免疫原性 组合物。GBS59的不同进化支可作为单独的多肽或融合成一条多肽存在于免 疫原性组合物内。包含多个GBS59进化支作为疫苗成分可提高针对GBS的免 疫原性组合物的菌株覆盖。

另外，本发明人鉴定出包含负责诱导免疫原性反应的表位的GBS59进化 支内的结构域。因此免疫原性组合物可以包含GBS59的至少两个不同进化支 的片段，所述片段含有一个或多个所述结构域或所述结构域的亚片段，而不 是所述全长GBS59蛋白。另外，GBS59的至少两个不同进化支的所述片段可 以作为单一多肽链融合。使用GBS59进化支片段而不是全长蛋白有助于制备 对GBS菌株覆盖提高的疫苗。

因此，本发明提供一种包含以下至少两个的免疫原性组合物：

a)包含第一氨基酸序列的第一多肽，其中所述第一氨基酸序列包含的氨 基酸序列(i)与SEQ ID NO:1有至少a%序列相同性，和/或(ii)由SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1有至少a%序列相同性的序列中至少t个连续氨基酸的 片段组成；

b)包含第二氨基酸序列的第二多肽，其中所述第二氨基酸序列包含的氨 基酸序列(i)与SEQ ID NO:2有至少b%序列相同性，和/或(ii)由SEQ ID NO:2或与SEQ ID NO:1有至少b%序列相同性的序列中至少u个连续氨基酸的 片段组成；

c)包含第三氨基酸序列的第三多肽，其中所述第三氨基酸序列包含的氨 基酸序列(i)与SEQ ID NO:3有至少c%序列相同性，和/或(ii)由SEQ ID NO:3或与SEQ ID NO:3有至少c%序列相同性的序列中至少v个连续氨基酸的 片段组成；

d)包含第四氨基酸序列的第四多肽，其中所述第四氨基酸序列包含的氨 基酸序列(i)与SEQ ID NO:4有至少d%序列相同性，和/或(ii)由SEQ ID NO:4或与SEQ ID NO:4有至少d%序列相同性的序列中至少w个连续氨基酸 的片段组成；

e)包含第五氨基酸序列的第五多肽，其中所述第五氨基酸序列包含的氨 基酸序列(i)与SEQ ID NO:5有至少e%序列相同性，和/或(ii)由SEQ ID NO:5或与SEQ ID NO:5有至少e%序列相同性的序列中至少x个连续氨基酸的 片段组成；和/或

f)包含第六氨基酸序列的第六多肽，其中所述第六氨基酸序列包含的氨 基酸序列(i)与SEQ ID NO:6有至少f％序列一致性，和/或(ii)由SEQ ID NO:6或与SEQ ID NO:6有至少f％序列相同性的序列中至少y个连续氨基酸的 片段组成；和/或

g)包含第七氨基酸序列的第七多肽，其中所述第七氨基酸序列包含的氨 基酸序列(i)与SEQ ID NO:7有至少g%序列相同性，和/或(ii)由SEQ ID NO:7或与SEQ ID NO:7有至少g%序列相同性的序列中至少z个连续氨基酸的 片段组成。

所述免疫原性组合物可以包含所述7个氨基酸序列中的2、3、4、5、6 或全部7个。

本发明也提供包含下列至少两个的多肽：

a)包含第一氨基酸序列的第一多肽，其中所述第一氨基酸序列包含的氨 基酸序列(i)与SEQ ID NO:1有至少a%序列相同性，和/或(ii)由SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1有至少a%序列相同性的序列中至少t个连续氨基酸的 片段组成；

b)包含第二氨基酸序列的第二多肽，其中所述第二氨基酸序列包含的氨 基酸序列(i)与SEQ ID NO:2有至少b%序列相同性，和/或(ii)由SEQ ID NO:2或与SEQ ID NO:1有至少b%序列相同性的序列中至少u个连续氨基酸的 片段组成；

c)包含第三氨基酸序列的第三多肽，其中所述第三氨基酸序列包含的氨 基酸序列(i)与SEQ ID NO:3有至少c%序列相同性，和/或(ii)由SEQ ID NO:3或与SEQ ID NO:3有至少c%序列相同性的序列中至少v个连续氨基酸的 片段组成；

d)包含第四氨基酸序列的第四多肽，其中所述第四氨基酸序列包含的氨 基酸序列(i)与SEQ ID NO:4有至少d%序列相同性，和/或(ii)由SEQ ID NO:4或与SEQ ID NO:4有至少d%序列相同性的序列中至少w个连续氨基酸 的片段组成；

e)包含第五氨基酸序列的第五多肽，其中所述第五氨基酸序列包含的氨 基酸序列(i)与SEQ ID NO:5有至少e%序列相同性，和/或(ii)由SEQ ID NO:5或与SEQ ID NO:5有至少e%序列相同性的序列中至少x个连续氨基酸的 片段组成；和/或

f)包含第六氨基酸序列的第六多肽，其中所述第六氨基酸序列包含的氨 基酸序列(i)与SEQ ID NO:6有至少f％序列相同性，和/或(ii)由SEQ ID NO:6或与SEQ ID NO:6有至少f％序列相同性的序列中至少y个连续氨基酸的 片段组成；和/或

g)包含第七氨基酸序列的第七多肽，其中所述第七氨基酸序列包含的氨 基酸序列(i)与SEQ ID NO:7有至少g%序列相同性，和/或(ii)由SEQ ID NO:7或与SEQ ID NO:7有至少g%序列相同性的序列中至少z个连续氨基酸的 片段组成，。

所述免疫原性多肽可以包含所述7个氨基酸序列中的2、3、4、5、6或全 部7个。

本发明还提供了包含以下氨基酸序列的多肽：

-A-{-X-L-}_n-B-

其中：X是如上面定义的第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽、 第五多肽、第六多肽或第七多肽的氨基酸序列；L是可选的接头氨基酸序列； A是可选的N末端氨基酸序列；B是可选的C末端氨基酸序列；n是2或更大 的整数。通常，n是2、3、4、5、6或7。多肽中的所述X部分不同，如下面 所讨论。

n是2时，X部分选自下列：

n X₁X₂2 第一多肽 第二多肽 2 第二多肽 第一多肽 2 第一多肽 第三多肽 2 第三多肽 第一多肽 2 第一多肽 第四多肽 2 第四多肽 第一多肽 2 第五多肽 第一多肽 2 第一多肽 第六多肽 2 第六多肽 第一多肽 2 第二多肽 第三多肽 2 第三多肽 第二多肽 2 第二多肽 第四多肽 2 第四多肽 第二多肽 2 第二多肽 第五多肽 2 第五多肽 第二多肽 2 第二多肽 第六多肽 2 第六多肽 第二多肽 2 第三多肽 第四多肽 2 第四多肽 第三多肽 2 第三多肽 第五多肽 2 第五多肽 第三多肽 2 第三多肽 第六多肽 2 第六多肽 第三多肽 2 第四多肽 第五多肽 2 第五多肽 第四多肽 2 第四多肽 第六多肽 2 第六多肽 第四多肽 2 第五多肽 第六多肽 2 第六多肽 第五多肽

n是3时，X部分选自下列：

n X₁X₂X₃3 第一多肽 第二多肽 第三多肽 3 第一多肽 第二多肽 第四多肽 3 第一多肽 第二多肽 第五多肽 3 第一多肽 第二多肽 第六多肽 3 第一多肽 第三多肽 第二多肽 3 第一多肽 第三多肽 第四多肽 3 第一多肽 第三多肽 第五多肽 3 第一多肽 第三多肽 第六多肽 3 第一多肽 第四多肽 第二多肽

3 第一多肽 第四多肽 第三多肽 3 第一多肽 第四多肽 第五多肽 3 第一多肽 第四多肽 第六多肽 3 第一多肽 第五多肽 第二多肽 3 第一多肽 第五多肽 第三多肽 3 第一多肽 第五多肽 第四多肽 3 第一多肽 第五多肽 第六多肽 3 第一多肽 第六多肽 第二多肽 3 第一多肽 第六多肽 第三多肽 3 第一多肽 第六多肽 第四多肽 3 第一多肽 第六多肽 第五多肽 3 第二多肽 第一多肽 第三多肽 3 第二多肽 第一多肽 第四多肽 3 第二多肽 第一多肽 第五多肽 3 第二多肽 第一多肽 第六多肽 3 第二多肽 第三多肽 第一多肽 3 第二多肽 第三多肽 第四多肽 3 第二多肽 第三多肽 第五多肽 3 第二多肽 第三多肽 第六多肽 3 第二多肽 第四多肽 第一多肽 3 第二多肽 第四多肽 第三多肽 3 第二多肽 第四多肽 第五多肽 3 第二多肽 第四多肽 第六多肽 3 第二多肽 第五多肽 第一多肽 3 第二多肽 第五多肽 第三多肽 3 第二多肽 第五多肽 第四多肽 3 第二多肽 第五多肽 第六多肽 3 第二多肽 第六多肽 第一多肽 3 第二多肽 第六多肽 第三多肽 3 第二多肽 第六多肽 第四多肽 3 第二多肽 第六多肽 第五多肽 3 第三多肽 第一多肽 第二多肽 3 第三多肽 第一多肽 第四多肽 3 第三多肽 第一多肽 第五多肽 3 第三多肽 第一多肽 第六多肽 3 第三多肽 第二多肽 第一多肽 3 第三多肽 第二多肽 第四多肽 3 第三多肽 第二多肽 第五多肽 3 第三多肽 第二多肽 第六多肽 3 第三多肽 第四多肽 第一多肽 3 第三多肽 第四多肽 第二多肽 3 第三多肽 第四多肽 第五多肽 3 第三多肽 第四多肽 第六多肽 3 第三多肽 第五多肽 第一多肽 3 第三多肽 第五多肽 第二多肽 3 第三多肽 第五多肽 第四多肽 3 第三多肽 第五多肽 第六多肽 3 第三多肽 第六多肽 第一多肽 3 第三多肽 第六多肽 第二多肽 3 第三多肽 第六多肽 第四多肽 3 第三多肽 第六多肽 第五多肽 3 第四多肽 第一多肽 第二多肽 3 第四多肽 第一多肽 第三多肽 3 第四多肽 第一多肽 第五多肽

3 第四多肽 第一多肽 第六多肽 3 第四多肽 第二多肽 第一多肽 3 第四多肽 第二多肽 第三多肽 3 第四多肽 第二多肽 第五多肽 3 第四多肽 第二多肽 第六多肽 3 第四多肽 第三多肽 第一多肽 3 第四多肽 第三多肽 第二多肽 3 第四多肽 第三多肽 第五多肽 3 第四多肽 第三多肽 第六多肽 3 第四多肽 第五多肽 第一多肽 3 第四多肽 第五多肽 第二多肽 3 第四多肽 第五多肽 第三多肽 3 第四多肽 第五多肽 第六多肽 3 第四多肽 第六多肽 第一多肽 3 第四多肽 第六多肽 第二多肽 3 第四多肽 第六多肽 第三多肽 3 第四多肽 第六多肽 第五多肽 3 第五多肽 第一多肽 第二多肽 3 第五多肽 第一多肽 第三多肽 3 第五多肽 第一多肽 第四多肽 3 第五多肽 第一多肽 第六多肽 3 第五多肽 第二多肽 第一多肽 3 第五多肽 第二多肽 第三多肽 3 第五多肽 第二多肽 第四多肽 3 第五多肽 第二多肽 第六多肽 3 第五多肽 第三多肽 第一多肽 3 第五多肽 第三多肽 第二多肽 3 第五多肽 第三多肽 第四多肽 3 第五多肽 第三多肽 第六多肽 3 第五多肽 第四多肽 第一多肽 3 第五多肽 第四多肽 第二多肽 3 第五多肽 第四多肽 第三多肽 3 第五多肽 第四多肽 第六多肽 3 第五多肽 第六多肽 第一多肽 3 第五多肽 第六多肽 第二多肽 3 第五多肽 第六多肽 第三多肽 3 第五多肽 第六多肽 第四多肽 3 第六多肽 第一多肽 第二多肽 3 第六多肽 第一多肽 第三多肽 3 第六多肽 第一多肽 第四多肽 3 第六多肽 第一多肽 第五多肽 3 第六多肽 第二多肽 第一多肽 3 第六多肽 第二多肽 第三多肽 3 第六多肽 第二多肽 第四多肽 3 第六多肽 第二多肽 第五多肽 3 第六多肽 第三多肽 第一多肽 3 第六多肽 第三多肽 第二多肽 3 第六多肽 第三多肽 第四多肽 3 第六多肽 第三多肽 第五多肽 3 第六多肽 第四多肽 第一多肽 3 第六多肽 第四多肽 第二多肽 3 第六多肽 第四多肽 第三多肽 3 第六多肽 第四多肽 第五多肽 3 第六多肽 第五多肽 第一多肽

3 第六多肽 第五多肽 第二多肽 3 第六多肽 第五多肽 第三多肽 3 第六多肽 第五多肽 第四多肽

n是4时，X部分选自下列：

n X₁X₂X₃X₄4 第一多肽 第二多肽 第三多肽 第四多肽 4 第一多肽 第二多肽 第三多肽 第五多肽 4 第一多肽 第二多肽 第三多肽 第六多肽 4 第一多肽 第二多肽 第四多肽 第三多肽 4 第一多肽 第二多肽 第四多肽 第五多肽 4 第一多肽 第二多肽 第四多肽 第六多肽 4 第一多肽 第二多肽 第五多肽 第三多肽 4 第一多肽 第二多肽 第五多肽 第四多肽 4 第一多肽 第二多肽 第五多肽 第六多肽 4 第一多肽 第二多肽 第六多肽 第三多肽 4 第一多肽 第二多肽 第六多肽 第四多肽 4 第一多肽 第二多肽 第六多肽 第五多肽 4 第一多肽 第三多肽 第二多肽 第四多肽 4 第一多肽 第三多肽 第二多肽 第五多肽 4 第一多肽 第三多肽 第二多肽 第六多肽 4 第一多肽 第三多肽 第四多肽 第二多肽 4 第一多肽 第三多肽 第四多肽 第五多肽 4 第一多肽 第三多肽 第四多肽 第六多肽 4 第一多肽 第三多肽 第五多肽 第二多肽 4 第一多肽 第三多肽 第五多肽 第四多肽 4 第一多肽 第三多肽 第五多肽 第六多肽 4 第一多肽 第三多肽 第六多肽 第二多肽 4 第一多肽 第三多肽 第六多肽 第四多肽 4 第一多肽 第三多肽 第六多肽 第五多肽 4 第一多肽 第四多肽 第二多肽 第三多肽 4 第一多肽 第四多肽 第二多肽 第五多肽 4 第一多肽 第四多肽 第二多肽 第六多肽 4 第一多肽 第四多肽 第三多肽 第二多肽 4 第一多肽 第四多肽 第三多肽 第五多肽 4 第一多肽 第四多肽 第三多肽 第六多肽 4 第一多肽 第四多肽 第五多肽 第二多肽 4 第一多肽 第四多肽 第五多肽 第三多肽 4 第一多肽 第四多肽 第五多肽 第六多肽 4 第一多肽 第四多肽 第六多肽 第二多肽 4 第一多肽 第四多肽 第六多肽 第三多肽 4 第一多肽 第四多肽 第六多肽 第五多肽 4 第一多肽 第五多肽 第二多肽 第三多肽 4 第一多肽 第五多肽 第二多肽 第四多肽 4 第一多肽 第五多肽 第二多肽 第六多肽 4 第一多肽 第五多肽 第三多肽 第二多肽 4 第一多肽 第五多肽 第三多肽 第四多肽 4 第一多肽 第五多肽 第三多肽 第六多肽 4 第一多肽 第五多肽 第四多肽 第二多肽 4 第一多肽 第五多肽 第四多肽 第三多肽 4 第一多肽 第五多肽 第四多肽 第六多肽 4 第一多肽 第五多肽 第六多肽 第二多肽 4 第一多肽 第五多肽 第六多肽 第三多肽 4 第一多肽 第五多肽 第六多肽 第四多肽

4 第一多肽 第六多肽 第二多肽 第三多肽 4 第一多肽 第六多肽 第二多肽 第四多肽 4 第一多肽 第六多肽 第二多肽 第五多肽 4 第一多肽 第六多肽 第三多肽 第二多肽 4 第一多肽 第六多肽 第三多肽 第四多肽 4 第一多肽 第六多肽 第三多肽 第五多肽 4 第一多肽 第六多肽 第四多肽 第二多肽 4 第一多肽 第六多肽 第四多肽 第三多肽 4 第一多肽 第六多肽 第四多肽 第五多肽 4 第一多肽 第六多肽 第五多肽 第二多肽 4 第一多肽 第六多肽 第五多肽 第三多肽 4 第一多肽 第六多肽 第五多肽 第四多肽 4 第二多肽 第一多肽 第三多肽 第四多肽 4 第二多肽 第一多肽 第三多肽 第五多肽 4 第二多肽 第一多肽 第三多肽 第六多肽 4 第二多肽 第一多肽 第四多肽 第三多肽 4 第二多肽 第一多肽 第四多肽 第五多肽 4 第二多肽 第一多肽 第四多肽 第六多肽 4 第二多肽 第一多肽 第五多肽 第三多肽 4 第二多肽 第一多肽 第五多肽 第四多肽 4 第二多肽 第一多肽 第五多肽 第六多肽 4 第二多肽 第一多肽 第六多肽 第三多肽 4 第二多肽 第一多肽 第六多肽 第四多肽 4 第二多肽 第一多肽 第六多肽 第五多肽 4 第二多肽 第三多肽 第一多肽 第四多肽 4 第二多肽 第三多肽 第一多肽 第五多肽 4 第二多肽 第三多肽 第一多肽 第六多肽 4 第二多肽 第三多肽 第四多肽 第一多肽 4 第二多肽 第三多肽 第四多肽 第五多肽 4 第二多肽 第三多肽 第四多肽 第六多肽 4 第二多肽 第三多肽 第五多肽 第一多肽 4 第二多肽 第三多肽 第五多肽 第四多肽 4 第二多肽 第三多肽 第五多肽 第六多肽 4 第二多肽 第三多肽 第六多肽 第一多肽 4 第二多肽 第三多肽 第六多肽 第四多肽 4 第二多肽 第三多肽 第六多肽 第五多肽 4 第二多肽 第四多肽 第一多肽 第三多肽 4 第二多肽 第四多肽 第一多肽 第五多肽 4 第二多肽 第四多肽 第一多肽 第六多肽 4 第二多肽 第四多肽 第三多肽 第一多肽 4 第二多肽 第四多肽 第三多肽 第五多肽 4 第二多肽 第四多肽 第三多肽 第六多肽 4 第二多肽 第四多肽 第五多肽 第一多肽 4 第二多肽 第四多肽 第五多肽 第三多肽 4 第二多肽 第四多肽 第五多肽 第六多肽 4 第二多肽 第四多肽 第六多肽 第一多肽 4 第二多肽 第四多肽 第六多肽 第三多肽 4 第二多肽 第四多肽 第六多肽 第五多肽 4 第二多肽 第五多肽 第一多肽 第三多肽 4 第二多肽 第五多肽 第一多肽 第四多肽 4 第二多肽 第五多肽 第一多肽 第六多肽 4 第二多肽 第五多肽 第三多肽 第一多肽 4 第二多肽 第五多肽 第三多肽 第四多肽 4 第二多肽 第五多肽 第三多肽 第六多肽

4 第二多肽 第五多肽 第四多肽 第一多肽 4 第二多肽 第五多肽 第四多肽 第三多肽 4 第二多肽 第五多肽 第四多肽 第六多肽 4 第二多肽 第五多肽 第六多肽 第一多肽 4 第二多肽 第五多肽 第六多肽 第三多肽 4 第二多肽 第五多肽 第六多肽 第四多肽 4 第二多肽 第六多肽 第一多肽 第三多肽 4 第二多肽 第六多肽 第一多肽 第四多肽 4 第二多肽 第六多肽 第一多肽 第五多肽 4 第二多肽 第六多肽 第三多肽 第一多肽 4 第二多肽 第六多肽 第三多肽 第四多肽 4 第二多肽 第六多肽 第三多肽 第五多肽 4 第二多肽 第六多肽 第四多肽 第一多肽 4 第二多肽 第六多肽 第四多肽 第三多肽 4 第二多肽 第六多肽 第四多肽 第五多肽 4 第二多肽 第六多肽 第五多肽 第一多肽 4 第二多肽 第六多肽 第五多肽 第三多肽 4 第二多肽 第六多肽 第五多肽 第四多肽 4 第三多肽 第一多肽 第二多肽 第四多肽 4 第三多肽 第一多肽 第二多肽 第五多肽 4 第三多肽 第一多肽 第二多肽 第六多肽 4 第三多肽 第一多肽 第四多肽 第二多肽 4 第三多肽 第一多肽 第四多肽 第五多肽 4 第三多肽 第一多肽 第四多肽 第六多肽 4 第三多肽 第一多肽 第五多肽 第二多肽 4 第三多肽 第一多肽 第五多肽 第四多肽 4 第三多肽 第一多肽 第五多肽 第六多肽 4 第三多肽 第一多肽 第六多肽 第二多肽 4 第三多肽 第一多肽 第六多肽 第四多肽 4 第三多肽 第一多肽 第六多肽 第五多肽 4 第三多肽 第二多肽 第一多肽 第四多肽 4 第三多肽 第二多肽 第一多肽 第五多肽 4 第三多肽 第二多肽 第一多肽 第六多肽 4 第三多肽 第二多肽 第四多肽 第一多肽 4 第三多肽 第二多肽 第四多肽 第五多肽 4 第三多肽 第二多肽 第四多肽 第六多肽 4 第三多肽 第二多肽 第五多肽 第一多肽 4 第三多肽 第二多肽 第五多肽 第四多肽 4 第三多肽 第二多肽 第五多肽 第六多肽 4 第三多肽 第二多肽 第六多肽 第一多肽 4 第三多肽 第二多肽 第六多肽 第四多肽 4 第三多肽 第二多肽 第六多肽 第五多肽 4 第三多肽 第四多肽 第一多肽 第二多肽 4 第三多肽 第四多肽 第一多肽 第五多肽 4 第三多肽 第四多肽 第一多肽 第六多肽 4 第三多肽 第四多肽 第二多肽 第一多肽 4 第三多肽 第四多肽 第二多肽 第五多肽 4 第三多肽 第四多肽 第二多肽 第六多肽 4 第三多肽 第四多肽 第五多肽 第一多肽 4 第三多肽 第四多肽 第五多肽 第二多肽 4 第三多肽 第四多肽 第五多肽 第六多肽 4 第三多肽 第四多肽 第六多肽 第一多肽 4 第三多肽 第四多肽 第六多肽 第二多肽 4 第三多肽 第四多肽 第六多肽 第五多肽

4 第三多肽 第五多肽 第一多肽 第二多肽 4 第三多肽 第五多肽 第一多肽 第四多肽 4 第三多肽 第五多肽 第一多肽 第六多肽 4 第三多肽 第五多肽 第二多肽 第一多肽 4 第三多肽 第五多肽 第二多肽 第四多肽 4 第三多肽 第五多肽 第二多肽 第六多肽 4 第三多肽 第五多肽 第四多肽 第一多肽 4 第三多肽 第五多肽 第四多肽 第二多肽 4 第三多肽 第五多肽 第四多肽 第六多肽 4 第三多肽 第五多肽 第六多肽 第一多肽 4 第三多肽 第五多肽 第六多肽 第二多肽 4 第三多肽 第五多肽 第六多肽 第四多肽 4 第三多肽 第六多肽 第一多肽 第二多肽 4 第三多肽 第六多肽 第一多肽 第四多肽 4 第三多肽 第六多肽 第一多肽 第五多肽 4 第三多肽 第六多肽 第二多肽 第一多肽 4 第三多肽 第六多肽 第二多肽 第四多肽 4 第三多肽 第六多肽 第二多肽 第五多肽 4 第三多肽 第六多肽 第四多肽 第一多肽 4 第三多肽 第六多肽 第四多肽 第二多肽 4 第三多肽 第六多肽 第四多肽 第五多肽 4 第三多肽 第六多肽 第五多肽 第一多肽 4 第三多肽 第六多肽 第五多肽 第二多肽 4 第三多肽 第六多肽 第五多肽 第四多肽 4 第四多肽 第一多肽 第二多肽 第三多肽 4 第四多肽 第一多肽 第二多肽 第五多肽 4 第四多肽 第一多肽 第二多肽 第六多肽 4 第四多肽 第一多肽 第三多肽 第二多肽 4 第四多肽 第一多肽 第三多肽 第五多肽 4 第四多肽 第一多肽 第三多肽 第六多肽 4 第四多肽 第一多肽 第五多肽 第二多肽 4 第四多肽 第一多肽 第五多肽 第三多肽 4 第四多肽 第一多肽 第五多肽 第六多肽 4 第四多肽 第一多肽 第六多肽 第二多肽 4 第四多肽 第一多肽 第六多肽 第三多肽 4 第四多肽 第一多肽 第六多肽 第五多肽 4 第四多肽 第二多肽 第一多肽 第三多肽 4 第四多肽 第二多肽 第一多肽 第五多肽 4 第四多肽 第二多肽 第一多肽 第六多肽 4 第四多肽 第二多肽 第三多肽 第一多肽 4 第四多肽 第二多肽 第三多肽 第五多肽 4 第四多肽 第二多肽 第三多肽 第六多肽 4 第四多肽 第二多肽 第五多肽 第一多肽 4 第四多肽 第二多肽 第五多肽 第三多肽 4 第四多肽 第二多肽 第五多肽 第六多肽 4 第四多肽 第二多肽 第六多肽 第一多肽 4 第四多肽 第二多肽 第六多肽 第三多肽 4 第四多肽 第二多肽 第六多肽 第五多肽 4 第四多肽 第三多肽 第一多肽 第二多肽 4 第四多肽 第三多肽 第一多肽 第五多肽 4 第四多肽 第三多肽 第一多肽 第六多肽 4 第四多肽 第三多肽 第二多肽 第一多肽 4 第四多肽 第三多肽 第二多肽 第五多肽 4 第四多肽 第三多肽 第二多肽 第六多肽

4 第四多肽 第三多肽 第五多肽 第一多肽 4 第四多肽 第三多肽 第五多肽 第二多肽 4 第四多肽 第三多肽 第五多肽 第六多肽 4 第四多肽 第三多肽 第六多肽 第一多肽 4 第四多肽 第三多肽 第六多肽 第二多肽 4 第四多肽 第三多肽 第六多肽 第五多肽 4 第四多肽 第五多肽 第一多肽 第二多肽 4 第四多肽 第五多肽 第一多肽 第三多肽 4 第四多肽 第五多肽 第一多肽 第六多肽 4 第四多肽 第五多肽 第二多肽 第一多肽 4 第四多肽 第五多肽 第二多肽 第三多肽 4 第四多肽 第五多肽 第二多肽 第六多肽 4 第四多肽 第五多肽 第三多肽 第一多肽 4 第四多肽 第五多肽 第三多肽 第二多肽 4 第四多肽 第五多肽 第三多肽 第六多肽 4 第四多肽 第五多肽 第六多肽 第一多肽 4 第四多肽 第五多肽 第六多肽 第二多肽 4 第四多肽 第五多肽 第六多肽 第三多肽 4 第四多肽 第六多肽 第一多肽 第二多肽 4 第四多肽 第六多肽 第一多肽 第三多肽 4 第四多肽 第六多肽 第一多肽 第五多肽 4 第四多肽 第六多肽 第二多肽 第一多肽 4 第四多肽 第六多肽 第二多肽 第三多肽 4 第四多肽 第六多肽 第二多肽 第五多肽 4 第四多肽 第六多肽 第三多肽 第一多肽 4 第四多肽 第六多肽 第三多肽 第二多肽 4 第四多肽 第六多肽 第三多肽 第五多肽 4 第四多肽 第六多肽 第五多肽 第一多肽 4 第四多肽 第六多肽 第五多肽 第二多肽 4 第四多肽 第六多肽 第五多肽 第三多肽 4 第五多肽 第一多肽 第二多肽 第三多肽 4 第五多肽 第一多肽 第二多肽 第四多肽 4 第五多肽 第一多肽 第二多肽 第六多肽 4 第五多肽 第一多肽 第三多肽 第二多肽 4 第五多肽 第一多肽 第三多肽 第四多肽 4 第五多肽 第一多肽 第三多肽 第六多肽 4 第五多肽 第一多肽 第四多肽 第二多肽 4 第五多肽 第一多肽 第四多肽 第三多肽 4 第五多肽 第一多肽 第四多肽 第六多肽 4 第五多肽 第一多肽 第六多肽 第二多肽 4 第五多肽 第一多肽 第六多肽 第三多肽 4 第五多肽 第一多肽 第六多肽 第四多肽 4 第五多肽 第二多肽 第一多肽 第三多肽 4 第五多肽 第二多肽 第一多肽 第四多肽 4 第五多肽 第二多肽 第一多肽 第六多肽 4 第五多肽 第二多肽 第三多肽 第一多肽 4 第五多肽 第二多肽 第三多肽 第四多肽 4 第五多肽 第二多肽 第三多肽 第六多肽 4 第五多肽 第二多肽 第四多肽 第一多肽 4 第五多肽 第二多肽 第四多肽 第三多肽 4 第五多肽 第二多肽 第四多肽 第六多肽 4 第五多肽 第二多肽 第六多肽 第一多肽 4 第五多肽 第二多肽 第六多肽 第三多肽 4 第五多肽 第二多肽 第六多肽 第四多肽

4 第五多肽 第三多肽 第一多肽 第二多肽 4 第五多肽 第三多肽 第一多肽 第四多肽 4 第五多肽 第三多肽 第一多肽 第六多肽 4 第五多肽 第三多肽 第二多肽 第一多肽 4 第五多肽 第三多肽 第二多肽 第四多肽 4 第五多肽 第三多肽 第二多肽 第六多肽 4 第五多肽 第三多肽 第四多肽 第一多肽 4 第五多肽 第三多肽 第四多肽 第二多肽 4 第五多肽 第三多肽 第四多肽 第六多肽 4 第五多肽 第三多肽 第六多肽 第一多肽 4 第五多肽 第三多肽 第六多肽 第二多肽 4 第五多肽 第三多肽 第六多肽 第四多肽 4 第五多肽 第四多肽 第一多肽 第二多肽 4 第五多肽 第四多肽 第一多肽 第三多肽 4 第五多肽 第四多肽 第一多肽 第六多肽 4 第五多肽 第四多肽 第二多肽 第一多肽 4 第五多肽 第四多肽 第二多肽 第三多肽 4 第五多肽 第四多肽 第二多肽 第六多肽 4 第五多肽 第四多肽 第三多肽 第一多肽 4 第五多肽 第四多肽 第三多肽 第二多肽 4 第五多肽 第四多肽 第三多肽 第六多肽 4 第五多肽 第四多肽 第六多肽 第一多肽 4 第五多肽 第四多肽 第六多肽 第二多肽 4 第五多肽 第四多肽 第六多肽 第三多肽 4 第五多肽 第六多肽 第一多肽 第二多肽 4 第五多肽 第六多肽 第一多肽 第三多肽 4 第五多肽 第六多肽 第一多肽 第四多肽 4 第五多肽 第六多肽 第二多肽 第一多肽 4 第五多肽 第六多肽 第二多肽 第三多肽 4 第五多肽 第六多肽 第二多肽 第四多肽 4 第五多肽 第六多肽 第三多肽 第一多肽 4 第五多肽 第六多肽 第三多肽 第二多肽 4 第五多肽 第六多肽 第三多肽 第四多肽 4 第五多肽 第六多肽 第四多肽 第一多肽 4 第五多肽 第六多肽 第四多肽 第二多肽 4 第五多肽 第六多肽 第四多肽 第三多肽 4 第六多肽 第一多肽 第二多肽 第三多肽 4 第六多肽 第一多肽 第二多肽 第四多肽 4 第六多肽 第一多肽 第二多肽 第五多肽 4 第六多肽 第一多肽 第三多肽 第二多肽 4 第六多肽 第一多肽 第三多肽 第四多肽 4 第六多肽 第一多肽 第三多肽 第五多肽 4 第六多肽 第一多肽 第四多肽 第二多肽 4 第六多肽 第一多肽 第四多肽 第三多肽 4 第六多肽 第一多肽 第四多肽 第五多肽 4 第六多肽 第一多肽 第五多肽 第二多肽 4 第六多肽 第一多肽 第五多肽 第三多肽 4 第六多肽 第一多肽 第五多肽 第四多肽 4 第六多肽 第二多肽 第一多肽 第三多肽 4 第六多肽 第二多肽 第一多肽 第四多肽 4 第六多肽 第二多肽 第一多肽 第五多肽 4 第六多肽 第二多肽 第三多肽 第一多肽 4 第六多肽 第二多肽 第三多肽 第四多肽 4 第六多肽 第二多肽 第三多肽 第五多肽

4 第六多肽 第二多肽 第四多肽 第一多肽 4 第六多肽 第二多肽 第四多肽 第三多肽 4 第六多肽 第二多肽 第四多肽 第五多肽 4 第六多肽 第二多肽 第五多肽 第一多肽 4 第六多肽 第二多肽 第五多肽 第三多肽 4 第六多肽 第二多肽 第五多肽 第四多肽 4 第六多肽 第三多肽 第一多肽 第二多肽 4 第六多肽 第三多肽 第一多肽 第四多肽 4 第六多肽 第三多肽 第一多肽 第五多肽 4 第六多肽 第三多肽 第二多肽 第一多肽 4 第六多肽 第三多肽 第二多肽 第四多肽 4 第六多肽 第三多肽 第二多肽 第五多肽 4 第六多肽 第三多肽 第四多肽 第一多肽 4 第六多肽 第三多肽 第四多肽 第二多肽 4 第六多肽 第三多肽 第四多肽 第五多肽 4 第六多肽 第三多肽 第五多肽 第一多肽 4 第六多肽 第三多肽 第五多肽 第二多肽 4 第六多肽 第三多肽 第五多肽 第四多肽 4 第六多肽 第四多肽 第一多肽 第二多肽 4 第六多肽 第四多肽 第一多肽 第三多肽 4 第六多肽 第四多肽 第一多肽 第五多肽 4 第六多肽 第四多肽 第二多肽 第一多肽 4 第六多肽 第四多肽 第二多肽 第三多肽 4 第六多肽 第四多肽 第二多肽 第五多肽 4 第六多肽 第四多肽 第三多肽 第一多肽 4 第六多肽 第四多肽 第三多肽 第二多肽 4 第六多肽 第四多肽 第三多肽 第五多肽 4 第六多肽 第四多肽 第五多肽 第一多肽 4 第六多肽 第四多肽 第五多肽 第二多肽 4 第六多肽 第四多肽 第五多肽 第三多肽 4 第六多肽 第五多肽 第一多肽 第二多肽 4 第六多肽 第五多肽 第一多肽 第三多肽 4 第六多肽 第五多肽 第一多肽 第四多肽 4 第六多肽 第五多肽 第二多肽 第一多肽 4 第六多肽 第五多肽 第二多肽 第三多肽 4 第六多肽 第五多肽 第二多肽 第四多肽 4 第六多肽 第五多肽 第三多肽 第一多肽 4 第六多肽 第五多肽 第三多肽 第二多肽 4 第六多肽 第五多肽 第三多肽 第四多肽 4 第六多肽 第五多肽 第四多肽 第一多肽 4 第六多肽 第五多肽 第四多肽 第二多肽 4 第六多肽 第五多肽 第四多肽 第三多肽

n是5时，X部分选自下列：

n X₁X₂X₃X₄X₅5 第一多肽 第二多肽 第三多肽 第四多肽 第五多肽 5 第一多肽 第二多肽 第三多肽 第四多肽 第六多肽 5 第一多肽 第二多肽 第三多肽 第五多肽 第四多肽 5 第一多肽 第二多肽 第三多肽 第五多肽 第六多肽 5 第一多肽 第二多肽 第三多肽 第六多肽 第四多肽 5 第一多肽 第二多肽 第三多肽 第六多肽 第五多肽 5 第一多肽 第二多肽 第四多肽 第三多肽 第五多肽 5 第一多肽 第二多肽 第四多肽 第三多肽 第六多肽

5 第一多肽 第二多肽 第四多肽 第五多肽 第三多肽 5 第一多肽 第二多肽 第四多肽 第五多肽 第六多肽 5 第一多肽 第二多肽 第四多肽 第六多肽 第三多肽 5 第一多肽 第二多肽 第四多肽 第六多肽 第五多肽 5 第一多肽 第二多肽 第五多肽 第三多肽 第四多肽 5 第一多肽 第二多肽 第五多肽 第三多肽 第六多肽 5 第一多肽 第二多肽 第五多肽 第四多肽 第三多肽 5 第一多肽 第二多肽 第五多肽 第四多肽 第六多肽 5 第一多肽 第二多肽 第五多肽 第六多肽 第三多肽 5 第一多肽 第二多肽 第五多肽 第六多肽 第四多肽 5 第一多肽 第二多肽 第六多肽 第三多肽 第四多肽 5 第一多肽 第二多肽 第六多肽 第三多肽 第五多肽 5 第一多肽 第二多肽 第六多肽 第四多肽 第三多肽 5 第一多肽 第二多肽 第六多肽 第四多肽 第五多肽 5 第一多肽 第二多肽 第六多肽 第五多肽 第三多肽 5 第一多肽 第二多肽 第六多肽 第五多肽 第四多肽 5 第一多肽 第三多肽 第二多肽 第四多肽 第五多肽 5 第一多肽 第三多肽 第二多肽 第四多肽 第六多肽 5 第一多肽 第三多肽 第二多肽 第五多肽 第四多肽 5 第一多肽 第三多肽 第二多肽 第五多肽 第六多肽 5 第一多肽 第三多肽 第二多肽 第六多肽 第四多肽 5 第一多肽 第三多肽 第二多肽 第六多肽 第五多肽 5 第一多肽 第三多肽 第四多肽 第二多肽 第五多肽 5 第一多肽 第三多肽 第四多肽 第二多肽 第六多肽 5 第一多肽 第三多肽 第四多肽 第五多肽 第二多肽 5 第一多肽 第三多肽 第四多肽 第五多肽 第六多肽 5 第一多肽 第三多肽 第四多肽 第六多肽 第二多肽 5 第一多肽 第三多肽 第四多肽 第六多肽 第五多肽 5 第一多肽 第三多肽 第五多肽 第二多肽 第四多肽 5 第一多肽 第三多肽 第五多肽 第二多肽 第六多肽 5 第一多肽 第三多肽 第五多肽 第四多肽 第二多肽 5 第一多肽 第三多肽 第五多肽 第四多肽 第六多肽 5 第一多肽 第三多肽 第五多肽 第六多肽 第二多肽 5 第一多肽 第三多肽 第五多肽 第六多肽 第四多肽 5 第一多肽 第三多肽 第六多肽 第二多肽 第四多肽 5 第一多肽 第三多肽 第六多肽 第二多肽 第五多肽 5 第一多肽 第三多肽 第六多肽 第四多肽 第二多肽 5 第一多肽 第三多肽 第六多肽 第四多肽 第五多肽 5 第一多肽 第三多肽 第六多肽 第五多肽 第二多肽 5 第一多肽 第三多肽 第六多肽 第五多肽 第四多肽 5 第一多肽 第四多肽 第二多肽 第三多肽 第五多肽 5 第一多肽 第四多肽 第二多肽 第三多肽 第六多肽 5 第一多肽 第四多肽 第二多肽 第五多肽 第三多肽 5 第一多肽 第四多肽 第二多肽 第五多肽 第六多肽 5 第一多肽 第四多肽 第二多肽 第六多肽 第三多肽 5 第一多肽 第四多肽 第二多肽 第六多肽 第五多肽 5 第一多肽 第四多肽 第三多肽 第二多肽 第五多肽 5 第一多肽 第四多肽 第三多肽 第二多肽 第六多肽 5 第一多肽 第四多肽 第三多肽 第五多肽 第二多肽 5 第一多肽 第四多肽 第三多肽 第五多肽 第六多肽 5 第一多肽 第四多肽 第三多肽 第六多肽 第二多肽 5 第一多肽 第四多肽 第三多肽 第六多肽 第五多肽 5 第一多肽 第四多肽 第五多肽 第二多肽 第三多肽 5 第一多肽 第四多肽 第五多肽 第二多肽 第六多肽

5 第一多肽 第四多肽 第五多肽 第三多肽 第二多肽 5 第一多肽 第四多肽 第五多肽 第三多肽 第六多肽 5 第一多肽 第四多肽 第五多肽 第六多肽 第二多肽 5 第一多肽 第四多肽 第五多肽 第六多肽 第三多肽 5 第一多肽 第四多肽 第六多肽 第二多肽 第三多肽 5 第一多肽 第四多肽 第六多肽 第二多肽 第五多肽 5 第一多肽 第四多肽 第六多肽 第三多肽 第二多肽 5 第一多肽 第四多肽 第六多肽 第三多肽 第五多肽 5 第一多肽 第四多肽 第六多肽 第五多肽 第二多肽 5 第一多肽 第四多肽 第六多肽 第五多肽 第三多肽 5 第一多肽 第五多肽 第二多肽 第三多肽 第四多肽 5 第一多肽 第五多肽 第二多肽 第三多肽 第六多肽 5 第一多肽 第五多肽 第二多肽 第四多肽 第三多肽 5 第一多肽 第五多肽 第二多肽 第四多肽 第六多肽 5 第一多肽 第五多肽 第二多肽 第六多肽 第三多肽 5 第一多肽 第五多肽 第二多肽 第六多肽 第四多肽 5 第一多肽 第五多肽 第三多肽 第二多肽 第四多肽 5 第一多肽 第五多肽 第三多肽 第二多肽 第六多肽 5 第一多肽 第五多肽 第三多肽 第四多肽 第二多肽 5 第一多肽 第五多肽 第三多肽 第四多肽 第六多肽 5 第一多肽 第五多肽 第三多肽 第六多肽 第二多肽 5 第一多肽 第五多肽 第三多肽 第六多肽 第四多肽 5 第一多肽 第五多肽 第四多肽 第二多肽 第三多肽 5 第一多肽 第五多肽 第四多肽 第二多肽 第六多肽 5 第一多肽 第五多肽 第四多肽 第三多肽 第二多肽 5 第一多肽 第五多肽 第四多肽 第三多肽 第六多肽 5 第一多肽 第五多肽 第四多肽 第六多肽 第二多肽 5 第一多肽 第五多肽 第四多肽 第六多肽 第三多肽 5 第一多肽 第五多肽 第六多肽 第二多肽 第三多肽 5 第一多肽 第五多肽 第六多肽 第二多肽 第四多肽 5 第一多肽 第五多肽 第六多肽 第三多肽 第二多肽 5 第一多肽 第五多肽 第六多肽 第三多肽 第四多肽 5 第一多肽 第五多肽 第六多肽 第四多肽 第二多肽 5 第一多肽 第五多肽 第六多肽 第四多肽 第三多肽 5 第一多肽 第六多肽 第二多肽 第三多肽 第四多肽 5 第一多肽 第六多肽 第二多肽 第三多肽 第五多肽 5 第一多肽 第六多肽 第二多肽 第四多肽 第三多肽 5 第一多肽 第六多肽 第二多肽 第四多肽 第五多肽 5 第一多肽 第六多肽 第二多肽 第五多肽 第三多肽 5 第一多肽 第六多肽 第二多肽 第五多肽 第四多肽 5 第一多肽 第六多肽 第三多肽 第二多肽 第四多肽 5 第一多肽 第六多肽 第三多肽 第二多肽 第五多肽 5 第一多肽 第六多肽 第三多肽 第四多肽 第二多肽 5 第一多肽 第六多肽 第三多肽 第四多肽 第五多肽 5 第一多肽 第六多肽 第三多肽 第五多肽 第二多肽 5 第一多肽 第六多肽 第三多肽 第五多肽 第四多肽 5 第一多肽 第六多肽 第四多肽 第二多肽 第三多肽 5 第一多肽 第六多肽 第四多肽 第二多肽 第五多肽 5 第一多肽 第六多肽 第四多肽 第三多肽 第二多肽 5 第一多肽 第六多肽 第四多肽 第三多肽 第五多肽 5 第一多肽 第六多肽 第四多肽 第五多肽 第二多肽 5 第一多肽 第六多肽 第四多肽 第五多肽 第三多肽 5 第一多肽 第六多肽 第五多肽 第二多肽 第三多肽 5 第一多肽 第六多肽 第五多肽 第二多肽 第四多肽

5 第一多肽 第六多肽 第五多肽 第三多肽 第二多肽 5 第一多肽 第六多肽 第五多肽 第三多肽 第四多肽 5 第一多肽 第六多肽 第五多肽 第四多肽 第二多肽 5 第一多肽 第六多肽 第五多肽 第四多肽 第三多肽 5 第二多肽 第一多肽 第三多肽 第四多肽 第五多肽 5 第二多肽 第一多肽 第三多肽 第四多肽 第六多肽 5 第二多肽 第一多肽 第三多肽 第五多肽 第四多肽 5 第二多肽 第一多肽 第三多肽 第五多肽 第六多肽 5 第二多肽 第一多肽 第三多肽 第六多肽 第四多肽 5 第二多肽 第一多肽 第三多肽 第六多肽 第五多肽 5 第二多肽 第一多肽 第四多肽 第三多肽 第五多肽 5 第二多肽 第一多肽 第四多肽 第三多肽 第六多肽 5 第二多肽 第一多肽 第四多肽 第五多肽 第三多肽 5 第二多肽 第一多肽 第四多肽 第五多肽 第六多肽 5 第二多肽 第一多肽 第四多肽 第六多肽 第三多肽 5 第二多肽 第一多肽 第四多肽 第六多肽 第五多肽 5 第二多肽 第一多肽 第五多肽 第三多肽 第四多肽 5 第二多肽 第一多肽 第五多肽 第三多肽 第六多肽 5 第二多肽 第一多肽 第五多肽 第四多肽 第三多肽 5 第二多肽 第一多肽 第五多肽 第四多肽 第六多肽 5 第二多肽 第一多肽 第五多肽 第六多肽 第三多肽 5 第二多肽 第一多肽 第五多肽 第六多肽 第四多肽 5 第二多肽 第一多肽 第六多肽 第三多肽 第四多肽 5 第二多肽 第一多肽 第六多肽 第三多肽 第五多肽 5 第二多肽 第一多肽 第六多肽 第四多肽 第三多肽 5 第二多肽 第一多肽 第六多肽 第四多肽 第五多肽 5 第二多肽 第一多肽 第六多肽 第五多肽 第三多肽 5 第二多肽 第一多肽 第六多肽 第五多肽 第四多肽 5 第二多肽 第三多肽 第一多肽 第四多肽 第五多肽 5 第二多肽 第三多肽 第一多肽 第四多肽 第六多肽 5 第二多肽 第三多肽 第一多肽 第五多肽 第四多肽 5 第二多肽 第三多肽 第一多肽 第五多肽 第六多肽 5 第二多肽 第三多肽 第一多肽 第六多肽 第四多肽 5 第二多肽 第三多肽 第一多肽 第六多肽 第五多肽 5 第二多肽 第三多肽 第四多肽 第一多肽 第五多肽 5 第二多肽 第三多肽 第四多肽 第一多肽 第六多肽 5 第二多肽 第三多肽 第四多肽 第五多肽 第一多肽 5 第二多肽 第三多肽 第四多肽 第五多肽 第六多肽 5 第二多肽 第三多肽 第四多肽 第六多肽 第一多肽 5 第二多肽 第三多肽 第四多肽 第六多肽 第五多肽 5 第二多肽 第三多肽 第五多肽 第一多肽 第四多肽 5 第二多肽 第三多肽 第五多肽 第一多肽 第六多肽 5 第二多肽 第三多肽 第五多肽 第四多肽 第一多肽 5 第二多肽 第三多肽 第五多肽 第四多肽 第六多肽 5 第二多肽 第三多肽 第五多肽 第六多肽 第一多肽 5 第二多肽 第三多肽 第五多肽 第六多肽 第四多肽 5 第二多肽 第三多肽 第六多肽 第一多肽 第四多肽 5 第二多肽 第三多肽 第六多肽 第一多肽 第五多肽 5 第二多肽 第三多肽 第六多肽 第四多肽 第一多肽 5 第二多肽 第三多肽 第六多肽 第四多肽 第五多肽 5 第二多肽 第三多肽 第六多肽 第五多肽 第一多肽 5 第二多肽 第三多肽 第六多肽 第五多肽 第四多肽 5 第二多肽 第四多肽 第一多肽 第三多肽 第五多肽 5 第二多肽 第四多肽 第一多肽 第三多肽 第六多肽

5 第二多肽 第四多肽 第一多肽 第五多肽 第三多肽 5 第二多肽 第四多肽 第一多肽 第五多肽 第六多肽 5 第二多肽 第四多肽 第一多肽 第六多肽 第三多肽 5 第二多肽 第四多肽 第一多肽 第六多肽 第五多肽 5 第二多肽 第四多肽 第三多肽 第一多肽 第五多肽 5 第二多肽 第四多肽 第三多肽 第一多肽 第六多肽 5 第二多肽 第四多肽 第三多肽 第五多肽 第一多肽 5 第二多肽 第四多肽 第三多肽 第五多肽 第六多肽 5 第二多肽 第四多肽 第三多肽 第六多肽 第一多肽 5 第二多肽 第四多肽 第三多肽 第六多肽 第五多肽 5 第二多肽 第四多肽 第五多肽 第一多肽 第三多肽 5 第二多肽 第四多肽 第五多肽 第一多肽 第六多肽 5 第二多肽 第四多肽 第五多肽 第三多肽 第一多肽 5 第二多肽 第四多肽 第五多肽 第三多肽 第六多肽 5 第二多肽 第四多肽 第五多肽 第六多肽 第一多肽 5 第二多肽 第四多肽 第五多肽 第六多肽 第三多肽 5 第二多肽 第四多肽 第六多肽 第一多肽 第三多肽 5 第二多肽 第四多肽 第六多肽 第一多肽 第五多肽 5 第二多肽 第四多肽 第六多肽 第三多肽 第一多肽 5 第二多肽 第四多肽 第六多肽 第三多肽 第五多肽 5 第二多肽 第四多肽 第六多肽 第五多肽 第一多肽 5 第二多肽 第四多肽 第六多肽 第五多肽 第三多肽 5 第二多肽 第五多肽 第一多肽 第三多肽 第四多肽 5 第二多肽 第五多肽 第一多肽 第三多肽 第六多肽 5 第二多肽 第五多肽 第一多肽 第四多肽 第三多肽 5 第二多肽 第五多肽 第一多肽 第四多肽 第六多肽 5 第二多肽 第五多肽 第一多肽 第六多肽 第三多肽 5 第二多肽 第五多肽 第一多肽 第六多肽 第四多肽 5 第二多肽 第五多肽 第三多肽 第一多肽 第四多肽 5 第二多肽 第五多肽 第三多肽 第一多肽 第六多肽 5 第二多肽 第五多肽 第三多肽 第四多肽 第一多肽 5 第二多肽 第五多肽 第三多肽 第四多肽 第六多肽 5 第二多肽 第五多肽 第三多肽 第六多肽 第一多肽 5 第二多肽 第五多肽 第三多肽 第六多肽 第四多肽 5 第二多肽 第五多肽 第四多肽 第一多肽 第三多肽 5 第二多肽 第五多肽 第四多肽 第一多肽 第六多肽 5 第二多肽 第五多肽 第四多肽 第三多肽 第一多肽 5 第二多肽 第五多肽 第四多肽 第三多肽 第六多肽 5 第二多肽 第五多肽 第四多肽 第六多肽 第一多肽 5 第二多肽 第五多肽 第四多肽 第六多肽 第三多肽 5 第二多肽 第五多肽 第六多肽 第一多肽 第三多肽 5 第二多肽 第五多肽 第六多肽 第一多肽 第四多肽 5 第二多肽 第五多肽 第六多肽 第三多肽 第一多肽 5 第二多肽 第五多肽 第六多肽 第三多肽 第四多肽 5 第二多肽 第五多肽 第六多肽 第四多肽 第一多肽 5 第二多肽 第五多肽 第六多肽 第四多肽 第三多肽 5 第二多肽 第六多肽 第一多肽 第三多肽 第四多肽 5 第二多肽 第六多肽 第一多肽 第三多肽 第五多肽 5 第二多肽 第六多肽 第一多肽 第四多肽 第三多肽 5 第二多肽 第六多肽 第一多肽 第四多肽 第五多肽 5 第二多肽 第六多肽 第一多肽 第五多肽 第三多肽 5 第二多肽 第六多肽 第一多肽 第五多肽 第四多肽 5 第二多肽 第六多肽 第三多肽 第一多肽 第四多肽 5 第二多肽 第六多肽 第三多肽 第一多肽 第五多肽

5 第二多肽 第六多肽 第三多肽 第四多肽 第一多肽 5 第二多肽 第六多肽 第三多肽 第四多肽 第五多肽 5 第二多肽 第六多肽 第三多肽 第五多肽 第一多肽 5 第二多肽 第六多肽 第三多肽 第五多肽 第四多肽 5 第二多肽 第六多肽 第四多肽 第一多肽 第三多肽 5 第二多肽 第六多肽 第四多肽 第一多肽 第五多肽 5 第二多肽 第六多肽 第四多肽 第三多肽 第一多肽 5 第二多肽 第六多肽 第四多肽 第三多肽 第五多肽 5 第二多肽 第六多肽 第四多肽 第五多肽 第一多肽 5 第二多肽 第六多肽 第四多肽 第五多肽 第三多肽 5 第二多肽 第六多肽 第五多肽 第一多肽 第三多肽 5 第二多肽 第六多肽 第五多肽 第一多肽 第四多肽 5 第二多肽 第六多肽 第五多肽 第三多肽 第一多肽 5 第二多肽 第六多肽 第五多肽 第三多肽 第四多肽 5 第二多肽 第六多肽 第五多肽 第四多肽 第一多肽 5 第二多肽 第六多肽 第五多肽 第四多肽 第三多肽 5 第三多肽 第一多肽 第二多肽 第四多肽 第五多肽 5 第三多肽 第一多肽 第二多肽 第四多肽 第六多肽 5 第三多肽 第一多肽 第二多肽 第五多肽 第四多肽 5 第三多肽 第一多肽 第二多肽 第五多肽 第六多肽 5 第三多肽 第一多肽 第二多肽 第六多肽 第四多肽 5 第三多肽 第一多肽 第二多肽 第六多肽 第五多肽 5 第三多肽 第一多肽 第四多肽 第二多肽 第五多肽 5 第三多肽 第一多肽 第四多肽 第二多肽 第六多肽 5 第三多肽 第一多肽 第四多肽 第五多肽 第二多肽 5 第三多肽 第一多肽 第四多肽 第五多肽 第六多肽 5 第三多肽 第一多肽 第四多肽 第六多肽 第二多肽 5 第三多肽 第一多肽 第四多肽 第六多肽 第五多肽 5 第三多肽 第一多肽 第五多肽 第二多肽 第四多肽 5 第三多肽 第一多肽 第五多肽 第二多肽 第六多肽 5 第三多肽 第一多肽 第五多肽 第四多肽 第二多肽 5 第三多肽 第一多肽 第五多肽 第四多肽 第六多肽 5 第三多肽 第一多肽 第五多肽 第六多肽 第二多肽 5 第三多肽 第一多肽 第五多肽 第六多肽 第四多肽 5 第三多肽 第一多肽 第六多肽 第二多肽 第四多肽 5 第三多肽 第一多肽 第六多肽 第二多肽 第五多肽 5 第三多肽 第一多肽 第六多肽 第四多肽 第二多肽 5 第三多肽 第一多肽 第六多肽 第四多肽 第五多肽 5 第三多肽 第一多肽 第六多肽 第五多肽 第二多肽 5 第三多肽 第一多肽 第六多肽 第五多肽 第四多肽 5 第三多肽 第二多肽 第一多肽 第四多肽 第五多肽 5 第三多肽 第二多肽 第一多肽 第四多肽 第六多肽 5 第三多肽 第二多肽 第一多肽 第五多肽 第四多肽 5 第三多肽 第二多肽 第一多肽 第五多肽 第六多肽 5 第三多肽 第二多肽 第一多肽 第六多肽 第四多肽 5 第三多肽 第二多肽 第一多肽 第六多肽 第五多肽 5 第三多肽 第二多肽 第四多肽 第一多肽 第五多肽 5 第三多肽 第二多肽 第四多肽 第一多肽 第六多肽 5 第三多肽 第二多肽 第四多肽 第五多肽 第一多肽 5 第三多肽 第二多肽 第四多肽 第五多肽 第六多肽 5 第三多肽 第二多肽 第四多肽 第六多肽 第一多肽 5 第三多肽 第二多肽 第四多肽 第六多肽 第五多肽 5 第三多肽 第二多肽 第五多肽 第一多肽 第四多肽 5 第三多肽 第二多肽 第五多肽 第一多肽 第六多肽

5 第三多肽 第二多肽 第五多肽 第四多肽 第一多肽 5 第三多肽 第二多肽 第五多肽 第四多肽 第六多肽 5 第三多肽 第二多肽 第五多肽 第六多肽 第一多肽 5 第三多肽 第二多肽 第五多肽 第六多肽 第四多肽 5 第三多肽 第二多肽 第六多肽 第一多肽 第四多肽 5 第三多肽 第二多肽 第六多肽 第一多肽 第五多肽 5 第三多肽 第二多肽 第六多肽 第四多肽 第一多肽 5 第三多肽 第二多肽 第六多肽 第四多肽 第五多肽 5 第三多肽 第二多肽 第六多肽 第五多肽 第一多肽 5 第三多肽 第二多肽 第六多肽 第五多肽 第四多肽 5 第三多肽 第四多肽 第一多肽 第二多肽 第五多肽 5 第三多肽 第四多肽 第一多肽 第二多肽 第六多肽 5 第三多肽 第四多肽 第一多肽 第五多肽 第二多肽 5 第三多肽 第四多肽 第一多肽 第五多肽 第六多肽 5 第三多肽 第四多肽 第一多肽 第六多肽 第二多肽 5 第三多肽 第四多肽 第一多肽 第六多肽 第五多肽 5 第三多肽 第四多肽 第二多肽 第一多肽 第五多肽 5 第三多肽 第四多肽 第二多肽 第一多肽 第六多肽 5 第三多肽 第四多肽 第二多肽 第五多肽 第一多肽 5 第三多肽 第四多肽 第二多肽 第五多肽 第六多肽 5 第三多肽 第四多肽 第二多肽 第六多肽 第一多肽 5 第三多肽 第四多肽 第二多肽 第六多肽 第五多肽 5 第三多肽 第四多肽 第五多肽 第一多肽 第二多肽 5 第三多肽 第四多肽 第五多肽 第一多肽 第六多肽 5 第三多肽 第四多肽 第五多肽 第二多肽 第一多肽 5 第三多肽 第四多肽 第五多肽 第二多肽 第六多肽 5 第三多肽 第四多肽 第五多肽 第六多肽 第一多肽 5 第三多肽 第四多肽 第五多肽 第六多肽 第二多肽 5 第三多肽 第四多肽 第六多肽 第一多肽 第二多肽 5 第三多肽 第四多肽 第六多肽 第一多肽 第五多肽 5 第三多肽 第四多肽 第六多肽 第二多肽 第一多肽 5 第三多肽 第四多肽 第六多肽 第二多肽 第五多肽 5 第三多肽 第四多肽 第六多肽 第五多肽 第一多肽 5 第三多肽 第四多肽 第六多肽 第五多肽 第二多肽 5 第三多肽 第五多肽 第一多肽 第二多肽 第四多肽 5 第三多肽 第五多肽 第一多肽 第二多肽 第六多肽 5 第三多肽 第五多肽 第一多肽 第四多肽 第二多肽 5 第三多肽 第五多肽 第一多肽 第四多肽 第六多肽 5 第三多肽 第五多肽 第一多肽 第六多肽 第二多肽 5 第三多肽 第五多肽 第一多肽 第六多肽 第四多肽 5 第三多肽 第五多肽 第二多肽 第一多肽 第四多肽 5 第三多肽 第五多肽 第二多肽 第一多肽 第六多肽 5 第三多肽 第五多肽 第二多肽 第四多肽 第一多肽 5 第三多肽 第五多肽 第二多肽 第四多肽 第六多肽 5 第三多肽 第五多肽 第二多肽 第六多肽 第一多肽 5 第三多肽 第五多肽 第二多肽 第六多肽 第四多肽 5 第三多肽 第五多肽 第四多肽 第一多肽 第二多肽 5 第三多肽 第五多肽 第四多肽 第一多肽 第六多肽 5 第三多肽 第五多肽 第四多肽 第二多肽 第一多肽 5 第三多肽 第五多肽 第四多肽 第二多肽 第六多肽 5 第三多肽 第五多肽 第四多肽 第六多肽 第一多肽 5 第三多肽 第五多肽 第四多肽 第六多肽 第二多肽 5 第三多肽 第五多肽 第六多肽 第一多肽 第二多肽 5 第三多肽 第五多肽 第六多肽 第一多肽 第四多肽

5 第三多肽 第五多肽 第六多肽 第二多肽 第一多肽 5 第三多肽 第五多肽 第六多肽 第二多肽 第四多肽 5 第三多肽 第五多肽 第六多肽 第四多肽 第一多肽 5 第三多肽 第五多肽 第六多肽 第四多肽 第二多肽 5 第三多肽 第六多肽 第一多肽 第二多肽 第四多肽 5 第三多肽 第六多肽 第一多肽 第二多肽 第五多肽 5 第三多肽 第六多肽 第一多肽 第四多肽 第二多肽 5 第三多肽 第六多肽 第一多肽 第四多肽 第五多肽 5 第三多肽 第六多肽 第一多肽 第五多肽 第二多肽 5 第三多肽 第六多肽 第一多肽 第五多肽 第四多肽 5 第三多肽 第六多肽 第二多肽 第一多肽 第四多肽 5 第三多肽 第六多肽 第二多肽 第一多肽 第五多肽 5 第三多肽 第六多肽 第二多肽 第四多肽 第一多肽 5 第三多肽 第六多肽 第二多肽 第四多肽 第五多肽 5 第三多肽 第六多肽 第二多肽 第五多肽 第一多肽 5 第三多肽 第六多肽 第二多肽 第五多肽 第四多肽 5 第三多肽 第六多肽 第四多肽 第一多肽 第二多肽 5 第三多肽 第六多肽 第四多肽 第一多肽 第五多肽 5 第三多肽 第六多肽 第四多肽 第二多肽 第一多肽 5 第三多肽 第六多肽 第四多肽 第二多肽 第五多肽 5 第三多肽 第六多肽 第四多肽 第五多肽 第一多肽 5 第三多肽 第六多肽 第四多肽 第五多肽 第二多肽 5 第三多肽 第六多肽 第五多肽 第一多肽 第二多肽 5 第三多肽 第六多肽 第五多肽 第一多肽 第四多肽 5 第三多肽 第六多肽 第五多肽 第二多肽 第一多肽 5 第三多肽 第六多肽 第五多肽 第二多肽 第四多肽 5 第三多肽 第六多肽 第五多肽 第四多肽 第一多肽 5 第三多肽 第六多肽 第五多肽 第四多肽 第二多肽 5 第四多肽 第一多肽 第二多肽 第三多肽 第五多肽 5 第四多肽 第一多肽 第二多肽 第三多肽 第六多肽 5 第四多肽 第一多肽 第二多肽 第五多肽 第三多肽 5 第四多肽 第一多肽 第二多肽 第五多肽 第六多肽 5 第四多肽 第一多肽 第二多肽 第六多肽 第三多肽 5 第四多肽 第一多肽 第二多肽 第六多肽 第五多肽 5 第四多肽 第一多肽 第三多肽 第二多肽 第五多肽 5 第四多肽 第一多肽 第三多肽 第二多肽 第六多肽 5 第四多肽 第一多肽 第三多肽 第五多肽 第二多肽 5 第四多肽 第一多肽 第三多肽 第五多肽 第六多肽 5 第四多肽 第一多肽 第三多肽 第六多肽 第二多肽 5 第四多肽 第一多肽 第三多肽 第六多肽 第五多肽 5 第四多肽 第一多肽 第五多肽 第二多肽 第三多肽 5 第四多肽 第一多肽 第五多肽 第二多肽 第六多肽 5 第四多肽 第一多肽 第五多肽 第三多肽 第二多肽 5 第四多肽 第一多肽 第五多肽 第三多肽 第六多肽 5 第四多肽 第一多肽 第五多肽 第六多肽 第二多肽 5 第四多肽 第一多肽 第五多肽 第六多肽 第三多肽 5 第四多肽 第一多肽 第六多肽 第二多肽 第三多肽 5 第四多肽 第一多肽 第六多肽 第二多肽 第五多肽 5 第四多肽 第一多肽 第六多肽 第三多肽 第二多肽 5 第四多肽 第一多肽 第六多肽 第三多肽 第五多肽 5 第四多肽 第一多肽 第六多肽 第五多肽 第二多肽 5 第四多肽 第一多肽 第六多肽 第五多肽 第三多肽 5 第四多肽 第二多肽 第一多肽 第三多肽 第五多肽 5 第四多肽 第二多肽 第一多肽 第三多肽 第六多肽

5 第四多肽 第二多肽 第一多肽 第五多肽 第三多肽 5 第四多肽 第二多肽 第一多肽 第五多肽 第六多肽 5 第四多肽 第二多肽 第一多肽 第六多肽 第三多肽 5 第四多肽 第二多肽 第一多肽 第六多肽 第五多肽 5 第四多肽 第二多肽 第三多肽 第一多肽 第五多肽 5 第四多肽 第二多肽 第三多肽 第一多肽 第六多肽 5 第四多肽 第二多肽 第三多肽 第五多肽 第一多肽 5 第四多肽 第二多肽 第三多肽 第五多肽 第六多肽 5 第四多肽 第二多肽 第三多肽 第六多肽 第一多肽 5 第四多肽 第二多肽 第三多肽 第六多肽 第五多肽 5 第四多肽 第二多肽 第五多肽 第一多肽 第三多肽 5 第四多肽 第二多肽 第五多肽 第一多肽 第六多肽 5 第四多肽 第二多肽 第五多肽 第三多肽 第一多肽 5 第四多肽 第二多肽 第五多肽 第三多肽 第六多肽 5 第四多肽 第二多肽 第五多肽 第六多肽 第一多肽 5 第四多肽 第二多肽 第五多肽 第六多肽 第三多肽 5 第四多肽 第二多肽 第六多肽 第一多肽 第三多肽 5 第四多肽 第二多肽 第六多肽 第一多肽 第五多肽 5 第四多肽 第二多肽 第六多肽 第三多肽 第一多肽 5 第四多肽 第二多肽 第六多肽 第三多肽 第五多肽 5 第四多肽 第二多肽 第六多肽 第五多肽 第一多肽 5 第四多肽 第二多肽 第六多肽 第五多肽 第三多肽 5 第四多肽 第三多肽 第一多肽 第二多肽 第五多肽 5 第四多肽 第三多肽 第一多肽 第二多肽 第六多肽 5 第四多肽 第三多肽 第一多肽 第五多肽 第二多肽 5 第四多肽 第三多肽 第一多肽 第五多肽 第六多肽 5 第四多肽 第三多肽 第一多肽 第六多肽 第二多肽 5 第四多肽 第三多肽 第一多肽 第六多肽 第五多肽 5 第四多肽 第三多肽 第二多肽 第一多肽 第五多肽 5 第四多肽 第三多肽 第二多肽 第一多肽 第六多肽 5 第四多肽 第三多肽 第二多肽 第五多肽 第一多肽 5 第四多肽 第三多肽 第二多肽 第五多肽 第六多肽 5 第四多肽 第三多肽 第二多肽 第六多肽 第一多肽 5 第四多肽 第三多肽 第二多肽 第六多肽 第五多肽 5 第四多肽 第三多肽 第五多肽 第一多肽 第二多肽 5 第四多肽 第三多肽 第五多肽 第一多肽 第六多肽 5 第四多肽 第三多肽 第五多肽 第二多肽 第一多肽 5 第四多肽 第三多肽 第五多肽 第二多肽 第六多肽 5 第四多肽 第三多肽 第五多肽 第六多肽 第一多肽 5 第四多肽 第三多肽 第五多肽 第六多肽 第二多肽 5 第四多肽 第三多肽 第六多肽 第一多肽 第二多肽 5 第四多肽 第三多肽 第六多肽 第一多肽 第五多肽 5 第四多肽 第三多肽 第六多肽 第二多肽 第一多肽 5 第四多肽 第三多肽 第六多肽 第二多肽 第五多肽 5 第四多肽 第三多肽 第六多肽 第五多肽 第一多肽 5 第四多肽 第三多肽 第六多肽 第五多肽 第二多肽 5 第四多肽 第五多肽 第一多肽 第二多肽 第三多肽 5 第四多肽 第五多肽 第一多肽 第二多肽 第六多肽 5 第四多肽 第五多肽 第一多肽 第三多肽 第二多肽 5 第四多肽 第五多肽 第一多肽 第三多肽 第六多肽 5 第四多肽 第五多肽 第一多肽 第六多肽 第二多肽 5 第四多肽 第五多肽 第一多肽 第六多肽 第三多肽 5 第四多肽 第五多肽 第二多肽 第一多肽 第三多肽 5 第四多肽 第五多肽 第二多肽 第一多肽 第六多肽

5 第四多肽 第五多肽 第二多肽 第三多肽 第一多肽 5 第四多肽 第五多肽 第二多肽 第三多肽 第六多肽 5 第四多肽 第五多肽 第二多肽 第六多肽 第一多肽 5 第四多肽 第五多肽 第二多肽 第六多肽 第三多肽 5 第四多肽 第五多肽 第三多肽 第一多肽 第二多肽 5 第四多肽 第五多肽 第三多肽 第一多肽 第六多肽 5 第四多肽 第五多肽 第三多肽 第二多肽 第一多肽 5 第四多肽 第五多肽 第三多肽 第二多肽 第六多肽 5 第四多肽 第五多肽 第三多肽 第六多肽 第一多肽 5 第四多肽 第五多肽 第三多肽 第六多肽 第二多肽 5 第四多肽 第五多肽 第六多肽 第一多肽 第二多肽 5 第四多肽 第五多肽 第六多肽 第一多肽 第三多肽 5 第四多肽 第五多肽 第六多肽 第二多肽 第一多肽 5 第四多肽 第五多肽 第六多肽 第二多肽 第三多肽 5 第四多肽 第五多肽 第六多肽 第三多肽 第一多肽 5 第四多肽 第五多肽 第六多肽 第三多肽 第二多肽 5 第四多肽 第六多肽 第一多肽 第二多肽 第三多肽 5 第四多肽 第六多肽 第一多肽 第二多肽 第五多肽 5 第四多肽 第六多肽 第一多肽 第三多肽 第二多肽 5 第四多肽 第六多肽 第一多肽 第三多肽 第五多肽 5 第四多肽 第六多肽 第一多肽 第五多肽 第二多肽 5 第四多肽 第六多肽 第一多肽 第五多肽 第三多肽 5 第四多肽 第六多肽 第二多肽 第一多肽 第三多肽 5 第四多肽 第六多肽 第二多肽 第一多肽 第五多肽 5 第四多肽 第六多肽 第二多肽 第三多肽 第一多肽 5 第四多肽 第六多肽 第二多肽 第三多肽 第五多肽 5 第四多肽 第六多肽 第二多肽 第五多肽 第一多肽 5 第四多肽 第六多肽 第二多肽 第五多肽 第三多肽 5 第四多肽 第六多肽 第三多肽 第一多肽 第二多肽 5 第四多肽 第六多肽 第三多肽 第一多肽 第五多肽 5 第四多肽 第六多肽 第三多肽 第二多肽 第一多肽 5 第四多肽 第六多肽 第三多肽 第二多肽 第五多肽 5 第四多肽 第六多肽 第三多肽 第五多肽 第一多肽 5 第四多肽 第六多肽 第三多肽 第五多肽 第二多肽 5 第四多肽 第六多肽 第五多肽 第一多肽 第二多肽 5 第四多肽 第六多肽 第五多肽 第一多肽 第三多肽 5 第四多肽 第六多肽 第五多肽 第二多肽 第一多肽 5 第四多肽 第六多肽 第五多肽 第二多肽 第三多肽 5 第四多肽 第六多肽 第五多肽 第三多肽 第一多肽 5 第四多肽 第六多肽 第五多肽 第三多肽 第二多肽 5 第五多肽 第一多肽 第二多肽 第三多肽 第四多肽 5 第五多肽 第一多肽 第二多肽 第三多肽 第六多肽 5 第五多肽 第一多肽 第二多肽 第四多肽 第三多肽 5 第五多肽 第一多肽 第二多肽 第四多肽 第六多肽 5 第五多肽 第一多肽 第二多肽 第六多肽 第三多肽 5 第五多肽 第一多肽 第二多肽 第六多肽 第四多肽 5 第五多肽 第一多肽 第三多肽 第二多肽 第四多肽 5 第五多肽 第一多肽 第三多肽 第二多肽 第六多肽 5 第五多肽 第一多肽 第三多肽 第四多肽 第二多肽 5 第五多肽 第一多肽 第三多肽 第四多肽 第六多肽 5 第五多肽 第一多肽 第三多肽 第六多肽 第二多肽 5 第五多肽 第一多肽 第三多肽 第六多肽 第四多肽 5 第五多肽 第一多肽 第四多肽 第二多肽 第三多肽 5 第五多肽 第一多肽 第四多肽 第二多肽 第六多肽

5 第五多肽 第一多肽 第四多肽 第三多肽 第二多肽 5 第五多肽 第一多肽 第四多肽 第三多肽 第六多肽 5 第五多肽 第一多肽 第四多肽 第六多肽 第二多肽 5 第五多肽 第一多肽 第四多肽 第六多肽 第三多肽 5 第五多肽 第一多肽 第六多肽 第二多肽 第三多肽 5 第五多肽 第一多肽 第六多肽 第二多肽 第四多肽 5 第五多肽 第一多肽 第六多肽 第三多肽 第二多肽 5 第五多肽 第一多肽 第六多肽 第三多肽 第四多肽 5 第五多肽 第一多肽 第六多肽 第四多肽 第二多肽 5 第五多肽 第一多肽 第六多肽 第四多肽 第三多肽 5 第五多肽 第二多肽 第一多肽 第三多肽 第四多肽 5 第五多肽 第二多肽 第一多肽 第三多肽 第六多肽 5 第五多肽 第二多肽 第一多肽 第四多肽 第三多肽 5 第五多肽 第二多肽 第一多肽 第四多肽 第六多肽 5 第五多肽 第二多肽 第一多肽 第六多肽 第三多肽 5 第五多肽 第二多肽 第一多肽 第六多肽 第四多肽 5 第五多肽 第二多肽 第三多肽 第一多肽 第四多肽 5 第五多肽 第二多肽 第三多肽 第一多肽 第六多肽 5 第五多肽 第二多肽 第三多肽 第四多肽 第一多肽 5 第五多肽 第二多肽 第三多肽 第四多肽 第六多肽 5 第五多肽 第二多肽 第三多肽 第六多肽 第一多肽 5 第五多肽 第二多肽 第三多肽 第六多肽 第四多肽 5 第五多肽 第二多肽 第四多肽 第一多肽 第三多肽 5 第五多肽 第二多肽 第四多肽 第一多肽 第六多肽 5 第五多肽 第二多肽 第四多肽 第三多肽 第一多肽 5 第五多肽 第二多肽 第四多肽 第三多肽 第六多肽 5 第五多肽 第二多肽 第四多肽 第六多肽 第一多肽 5 第五多肽 第二多肽 第四多肽 第六多肽 第三多肽 5 第五多肽 第二多肽 第六多肽 第一多肽 第三多肽 5 第五多肽 第二多肽 第六多肽 第一多肽 第四多肽 5 第五多肽 第二多肽 第六多肽 第三多肽 第一多肽 5 第五多肽 第二多肽 第六多肽 第三多肽 第四多肽 5 第五多肽 第二多肽 第六多肽 第四多肽 第一多肽 5 第五多肽 第二多肽 第六多肽 第四多肽 第三多肽 5 第五多肽 第三多肽 第一多肽 第二多肽 第四多肽 5 第五多肽 第三多肽 第一多肽 第二多肽 第六多肽 5 第五多肽 第三多肽 第一多肽 第四多肽 第二多肽 5 第五多肽 第三多肽 第一多肽 第四多肽 第六多肽 5 第五多肽 第三多肽 第一多肽 第六多肽 第二多肽 5 第五多肽 第三多肽 第一多肽 第六多肽 第四多肽 5 第五多肽 第三多肽 第二多肽 第一多肽 第四多肽 5 第五多肽 第三多肽 第二多肽 第一多肽 第六多肽 5 第五多肽 第三多肽 第二多肽 第四多肽 第一多肽 5 第五多肽 第三多肽 第二多肽 第四多肽 第六多肽 5 第五多肽 第三多肽 第二多肽 第六多肽 第一多肽 5 第五多肽 第三多肽 第二多肽 第六多肽 第四多肽 5 第五多肽 第三多肽 第四多肽 第一多肽 第二多肽 5 第五多肽 第三多肽 第四多肽 第一多肽 第六多肽 5 第五多肽 第三多肽 第四多肽 第二多肽 第一多肽 5 第五多肽 第三多肽 第四多肽 第二多肽 第六多肽 5 第五多肽 第三多肽 第四多肽 第六多肽 第一多肽 5 第五多肽 第三多肽 第四多肽 第六多肽 第二多肽 5 第五多肽 第三多肽 第六多肽 第一多肽 第二多肽 5 第五多肽 第三多肽 第六多肽 第一多肽 第四多肽

5 第五多肽 第三多肽 第六多肽 第二多肽 第一多肽 5 第五多肽 第三多肽 第六多肽 第二多肽 第四多肽 5 第五多肽 第三多肽 第六多肽 第四多肽 第一多肽 5 第五多肽 第三多肽 第六多肽 第四多肽 第二多肽 5 第五多肽 第四多肽 第一多肽 第二多肽 第三多肽 5 第五多肽 第四多肽 第一多肽 第二多肽 第六多肽 5 第五多肽 第四多肽 第一多肽 第三多肽 第二多肽 5 第五多肽 第四多肽 第一多肽 第三多肽 第六多肽 5 第五多肽 第四多肽 第一多肽 第六多肽 第二多肽 5 第五多肽 第四多肽 第一多肽 第六多肽 第三多肽 5 第五多肽 第四多肽 第二多肽 第一多肽 第三多肽 5 第五多肽 第四多肽 第二多肽 第一多肽 第六多肽 5 第五多肽 第四多肽 第二多肽 第三多肽 第一多肽 5 第五多肽 第四多肽 第二多肽 第三多肽 第六多肽 5 第五多肽 第四多肽 第二多肽 第六多肽 第一多肽 5 第五多肽 第四多肽 第二多肽 第六多肽 第三多肽 5 第五多肽 第四多肽 第三多肽 第一多肽 第二多肽 5 第五多肽 第四多肽 第三多肽 第一多肽 第六多肽 5 第五多肽 第四多肽 第三多肽 第二多肽 第一多肽 5 第五多肽 第四多肽 第三多肽 第二多肽 第六多肽 5 第五多肽 第四多肽 第三多肽 第六多肽 第一多肽 5 第五多肽 第四多肽 第三多肽 第六多肽 第二多肽 5 第五多肽 第四多肽 第六多肽 第一多肽 第二多肽 5 第五多肽 第四多肽 第六多肽 第一多肽 第三多肽 5 第五多肽 第四多肽 第六多肽 第二多肽 第一多肽 5 第五多肽 第四多肽 第六多肽 第二多肽 第三多肽 5 第五多肽 第四多肽 第六多肽 第三多肽 第一多肽 5 第五多肽 第四多肽 第六多肽 第三多肽 第二多肽 5 第五多肽 第六多肽 第一多肽 第二多肽 第三多肽 5 第五多肽 第六多肽 第一多肽 第二多肽 第四多肽 5 第五多肽 第六多肽 第一多肽 第三多肽 第二多肽 5 第五多肽 第六多肽 第一多肽 第三多肽 第四多肽 5 第五多肽 第六多肽 第一多肽 第四多肽 第二多肽 5 第五多肽 第六多肽 第一多肽 第四多肽 第三多肽 5 第五多肽 第六多肽 第二多肽 第一多肽 第三多肽 5 第五多肽 第六多肽 第二多肽 第一多肽 第四多肽 5 第五多肽 第六多肽 第二多肽 第三多肽 第一多肽 5 第五多肽 第六多肽 第二多肽 第三多肽 第四多肽 5 第五多肽 第六多肽 第二多肽 第四多肽 第一多肽 5 第五多肽 第六多肽 第二多肽 第四多肽 第三多肽 5 第五多肽 第六多肽 第三多肽 第一多肽 第二多肽 5 第五多肽 第六多肽 第三多肽 第一多肽 第四多肽 5 第五多肽 第六多肽 第三多肽 第二多肽 第一多肽 5 第五多肽 第六多肽 第三多肽 第二多肽 第四多肽 5 第五多肽 第六多肽 第三多肽 第四多肽 第一多肽 5 第五多肽 第六多肽 第三多肽 第四多肽 第二多肽 5 第五多肽 第六多肽 第四多肽 第一多肽 第二多肽 5 第五多肽 第六多肽 第四多肽 第一多肽 第三多肽 5 第五多肽 第六多肽 第四多肽 第二多肽 第一多肽 5 第五多肽 第六多肽 第四多肽 第二多肽 第三多肽 5 第五多肽 第六多肽 第四多肽 第三多肽 第一多肽 5 第五多肽 第六多肽 第四多肽 第三多肽 第二多肽 5 第六多肽 第一多肽 第二多肽 第三多肽 第四多肽 5 第六多肽 第一多肽 第二多肽 第三多肽 第五多肽

5 第六多肽 第一多肽 第二多肽 第四多肽 第三多肽 5 第六多肽 第一多肽 第二多肽 第四多肽 第五多肽 5 第六多肽 第一多肽 第二多肽 第五多肽 第三多肽 5 第六多肽 第一多肽 第二多肽 第五多肽 第四多肽 5 第六多肽 第一多肽 第三多肽 第二多肽 第四多肽 5 第六多肽 第一多肽 第三多肽 第二多肽 第五多肽 5 第六多肽 第一多肽 第三多肽 第四多肽 第二多肽 5 第六多肽 第一多肽 第三多肽 第四多肽 第五多肽 5 第六多肽 第一多肽 第三多肽 第五多肽 第二多肽 5 第六多肽 第一多肽 第三多肽 第五多肽 第四多肽 5 第六多肽 第一多肽 第四多肽 第二多肽 第三多肽 5 第六多肽 第一多肽 第四多肽 第二多肽 第五多肽 5 第六多肽 第一多肽 第四多肽 第三多肽 第二多肽 5 第六多肽 第一多肽 第四多肽 第三多肽 第五多肽 5 第六多肽 第一多肽 第四多肽 第五多肽 第二多肽 5 第六多肽 第一多肽 第四多肽 第五多肽 第三多肽 5 第六多肽 第一多肽 第五多肽 第二多肽 第三多肽 5 第六多肽 第一多肽 第五多肽 第二多肽 第四多肽 5 第六多肽 第一多肽 第五多肽 第三多肽 第二多肽 5 第六多肽 第一多肽 第五多肽 第三多肽 第四多肽 5 第六多肽 第一多肽 第五多肽 第四多肽 第二多肽 5 第六多肽 第一多肽 第五多肽 第四多肽 第三多肽 5 第六多肽 第二多肽 第一多肽 第三多肽 第四多肽 5 第六多肽 第二多肽 第一多肽 第三多肽 第五多肽 5 第六多肽 第二多肽 第一多肽 第四多肽 第三多肽 5 第六多肽 第二多肽 第一多肽 第四多肽 第五多肽 5 第六多肽 第二多肽 第一多肽 第五多肽 第三多肽 5 第六多肽 第二多肽 第一多肽 第五多肽 第四多肽 5 第六多肽 第二多肽 第三多肽 第一多肽 第四多肽 5 第六多肽 第二多肽 第三多肽 第一多肽 第五多肽 5 第六多肽 第二多肽 第三多肽 第四多肽 第一多肽 5 第六多肽 第二多肽 第三多肽 第四多肽 第五多肽 5 第六多肽 第二多肽 第三多肽 第五多肽 第一多肽 5 第六多肽 第二多肽 第三多肽 第五多肽 第四多肽 5 第六多肽 第二多肽 第四多肽 第一多肽 第三多肽 5 第六多肽 第二多肽 第四多肽 第一多肽 第五多肽 5 第六多肽 第二多肽 第四多肽 第三多肽 第一多肽 5 第六多肽 第二多肽 第四多肽 第三多肽 第五多肽 5 第六多肽 第二多肽 第四多肽 第五多肽 第一多肽 5 第六多肽 第二多肽 第四多肽 第五多肽 第三多肽 5 第六多肽 第二多肽 第五多肽 第一多肽 第三多肽 5 第六多肽 第二多肽 第五多肽 第一多肽 第四多肽 5 第六多肽 第二多肽 第五多肽 第三多肽 第一多肽 5 第六多肽 第二多肽 第五多肽 第三多肽 第四多肽 5 第六多肽 第二多肽 第五多肽 第四多肽 第一多肽 5 第六多肽 第二多肽 第五多肽 第四多肽 第三多肽 5 第六多肽 第三多肽 第一多肽 第二多肽 第四多肽 5 第六多肽 第三多肽 第一多肽 第二多肽 第五多肽 5 第六多肽 第三多肽 第一多肽 第四多肽 第二多肽 5 第六多肽 第三多肽 第一多肽 第四多肽 第五多肽 5 第六多肽 第三多肽 第一多肽 第五多肽 第二多肽 5 第六多肽 第三多肽 第一多肽 第五多肽 第四多肽 5 第六多肽 第三多肽 第二多肽 第一多肽 第四多肽 5 第六多肽 第三多肽 第二多肽 第一多肽 第五多肽

5 第六多肽 第三多肽 第二多肽 第四多肽 第一多肽 5 第六多肽 第三多肽 第二多肽 第四多肽 第五多肽 5 第六多肽 第三多肽 第二多肽 第五多肽 第一多肽 5 第六多肽 第三多肽 第二多肽 第五多肽 第四多肽 5 第六多肽 第三多肽 第四多肽 第一多肽 第二多肽 5 第六多肽 第三多肽 第四多肽 第一多肽 第五多肽 5 第六多肽 第三多肽 第四多肽 第二多肽 第一多肽 5 第六多肽 第三多肽 第四多肽 第二多肽 第五多肽 5 第六多肽 第三多肽 第四多肽 第五多肽 第一多肽 5 第六多肽 第三多肽 第四多肽 第五多肽 第二多肽 5 第六多肽 第三多肽 第五多肽 第一多肽 第二多肽 5 第六多肽 第三多肽 第五多肽 第一多肽 第四多肽 5 第六多肽 第三多肽 第五多肽 第二多肽 第一多肽 5 第六多肽 第三多肽 第五多肽 第二多肽 第四多肽 5 第六多肽 第三多肽 第五多肽 第四多肽 第一多肽 5 第六多肽 第三多肽 第五多肽 第四多肽 第二多肽 5 第六多肽 第四多肽 第一多肽 第二多肽 第三多肽 5 第六多肽 第四多肽 第一多肽 第二多肽 第五多肽 5 第六多肽 第四多肽 第一多肽 第三多肽 第二多肽 5 第六多肽 第四多肽 第一多肽 第三多肽 第五多肽 5 第六多肽 第四多肽 第一多肽 第五多肽 第二多肽 5 第六多肽 第四多肽 第一多肽 第五多肽 第三多肽 5 第六多肽 第四多肽 第二多肽 第一多肽 第三多肽 5 第六多肽 第四多肽 第二多肽 第一多肽 第五多肽 5 第六多肽 第四多肽 第二多肽 第三多肽 第一多肽 5 第六多肽 第四多肽 第二多肽 第三多肽 第五多肽 5 第六多肽 第四多肽 第二多肽 第五多肽 第一多肽 5 第六多肽 第四多肽 第二多肽 第五多肽 第三多肽 5 第六多肽 第四多肽 第三多肽 第一多肽 第二多肽 5 第六多肽 第四多肽 第三多肽 第一多肽 第五多肽 5 第六多肽 第四多肽 第三多肽 第二多肽 第一多肽 5 第六多肽 第四多肽 第三多肽 第二多肽 第五多肽 5 第六多肽 第四多肽 第三多肽 第五多肽 第一多肽 5 第六多肽 第四多肽 第三多肽 第五多肽 第二多肽 5 第六多肽 第四多肽 第五多肽 第一多肽 第二多肽 5 第六多肽 第四多肽 第五多肽 第一多肽 第三多肽 5 第六多肽 第四多肽 第五多肽 第二多肽 第一多肽 5 第六多肽 第四多肽 第五多肽 第二多肽 第三多肽 5 第六多肽 第四多肽 第五多肽 第三多肽 第一多肽 5 第六多肽 第四多肽 第五多肽 第三多肽 第二多肽 5 第六多肽 第五多肽 第一多肽 第二多肽 第三多肽 5 第六多肽 第五多肽 第一多肽 第二多肽 第四多肽 5 第六多肽 第五多肽 第一多肽 第三多肽 第二多肽 5 第六多肽 第五多肽 第一多肽 第三多肽 第四多肽 5 第六多肽 第五多肽 第一多肽 第四多肽 第二多肽 5 第六多肽 第五多肽 第一多肽 第四多肽 第三多肽 5 第六多肽 第五多肽 第二多肽 第一多肽 第三多肽 5 第六多肽 第五多肽 第二多肽 第一多肽 第四多肽 5 第六多肽 第五多肽 第二多肽 第三多肽 第一多肽 5 第六多肽 第五多肽 第二多肽 第三多肽 第四多肽 5 第六多肽 第五多肽 第二多肽 第四多肽 第一多肽 5 第六多肽 第五多肽 第二多肽 第四多肽 第三多肽 5 第六多肽 第五多肽 第三多肽 第一多肽 第二多肽 5 第六多肽 第五多肽 第三多肽 第一多肽 第四多肽

5 第六多肽 第五多肽 第三多肽 第二多肽 第一多肽 5 第六多肽 第五多肽 第三多肽 第二多肽 第四多肽 5 第六多肽 第五多肽 第三多肽 第四多肽 第一多肽 5 第六多肽 第五多肽 第三多肽 第四多肽 第二多肽 5 第六多肽 第五多肽 第四多肽 第一多肽 第二多肽 5 第六多肽 第五多肽 第四多肽 第一多肽 第三多肽 5 第六多肽 第五多肽 第四多肽 第二多肽 第一多肽 5 第六多肽 第五多肽 第四多肽 第二多肽 第三多肽 5 第六多肽 第五多肽 第四多肽 第三多肽 第一多肽 5 第六多肽 第五多肽 第四多肽 第三多肽 第二多肽

n是6时，X部分选自下列：

n X₁X₂X₃X₄X₅X₆6 第一多肽 第二多肽 第三多肽 第四多肽 第五多肽 第六多肽 6 第一多肽 第二多肽 第三多肽 第四多肽 第六多肽 第五多肽 6 第一多肽 第二多肽 第三多肽 第五多肽 第四多肽 第六多肽 6 第一多肽 第二多肽 第三多肽 第五多肽 第六多肽 第四多肽 6 第一多肽 第二多肽 第三多肽 第六多肽 第四多肽 第五多肽 6 第一多肽 第二多肽 第三多肽 第六多肽 第五多肽 第四多肽 6 第一多肽 第二多肽 第四多肽 第三多肽 第五多肽 第六多肽 6 第一多肽 第二多肽 第四多肽 第三多肽 第六多肽 第五多肽 6 第一多肽 第二多肽 第四多肽 第五多肽 第三多肽 第六多肽 6 第一多肽 第二多肽 第四多肽 第五多肽 第六多肽 第三多肽 6 第一多肽 第二多肽 第四多肽 第六多肽 第三多肽 第五多肽 6 第一多肽 第二多肽 第四多肽 第六多肽 第五多肽 第三多肽 6 第一多肽 第二多肽 第五多肽 第三多肽 第四多肽 第六多肽 6 第一多肽 第二多肽 第五多肽 第三多肽 第六多肽 第四多肽 6 第一多肽 第二多肽 第五多肽 第四多肽 第三多肽 第六多肽 6 第一多肽 第二多肽 第五多肽 第四多肽 第六多肽 第三多肽 6 第一多肽 第二多肽 第五多肽 第六多肽 第三多肽 第四多肽 6 第一多肽 第二多肽 第五多肽 第六多肽 第四多肽 第三多肽 6 第一多肽 第二多肽 第六多肽 第三多肽 第四多肽 第五多肽 6 第一多肽 第二多肽 第六多肽 第三多肽 第五多肽 第四多肽 6 第一多肽 第二多肽 第六多肽 第四多肽 第三多肽 第五多肽 6 第一多肽 第二多肽 第六多肽 第四多肽 第五多肽 第三多肽 6 第一多肽 第二多肽 第六多肽 第五多肽 第三多肽 第四多肽 6 第一多肽 第二多肽 第六多肽 第五多肽 第四多肽 第三多肽 6 第一多肽 第三多肽 第二多肽 第四多肽 第五多肽 第六多肽 6 第一多肽 第三多肽 第二多肽 第四多肽 第六多肽 第五多肽 6 第一多肽 第三多肽 第二多肽 第五多肽 第四多肽 第六多肽 6 第一多肽 第三多肽 第二多肽 第五多肽 第六多肽 第四多肽 6 第一多肽 第三多肽 第二多肽 第六多肽 第四多肽 第五多肽 6 第一多肽 第三多肽 第二多肽 第六多肽 第五多肽 第四多肽 6 第一多肽 第三多肽 第四多肽 第二多肽 第五多肽 第六多肽 6 第一多肽 第三多肽 第四多肽 第二多肽 第六多肽 第五多肽 6 第一多肽 第三多肽 第四多肽 第五多肽 第二多肽 第六多肽 6 第一多肽 第三多肽 第四多肽 第五多肽 第六多肽 第二多肽 6 第一多肽 第三多肽 第四多肽 第六多肽 第二多肽 第五多肽 6 第一多肽 第三多肽 第四多肽 第六多肽 第五多肽 第二多肽 6 第一多肽 第三多肽 第五多肽 第二多肽 第四多肽 第六多肽

6 第一多肽 第三多肽 第五多肽 第二多肽 第六多肽 第四多肽 6 第一多肽 第三多肽 第五多肽 第四多肽 第二多肽 第六多肽 6 第一多肽 第三多肽 第五多肽 第四多肽 第六多肽 第二多肽 6 第一多肽 第三多肽 第五多肽 第六多肽 第二多肽 第四多肽 6 第一多肽 第三多肽 第五多肽 第六多肽 第四多肽 第二多肽 6 第一多肽 第三多肽 第六多肽 第二多肽 第四多肽 第五多肽 6 第一多肽 第三多肽 第六多肽 第二多肽 第五多肽 第四多肽 6 第一多肽 第三多肽 第六多肽 第四多肽 第二多肽 第五多肽 6 第一多肽 第三多肽 第六多肽 第四多肽 第五多肽 第二多肽 6 第一多肽 第三多肽 第六多肽 第五多肽 第二多肽 第四多肽 6 第一多肽 第三多肽 第六多肽 第五多肽 第四多肽 第二多肽 6 第一多肽 第四多肽 第二多肽 第三多肽 第五多肽 第六多肽 6 第一多肽 第四多肽 第二多肽 第三多肽 第六多肽 第五多肽 6 第一多肽 第四多肽 第二多肽 第五多肽 第三多肽 第六多肽 6 第一多肽 第四多肽 第二多肽 第五多肽 第六多肽 第三多肽 6 第一多肽 第四多肽 第二多肽 第六多肽 第三多肽 第五多肽 6 第一多肽 第四多肽 第二多肽 第六多肽 第五多肽 第三多肽 6 第一多肽 第四多肽 第三多肽 第二多肽 第五多肽 第六多肽 6 第一多肽 第四多肽 第三多肽 第二多肽 第六多肽 第五多肽 6 第一多肽 第四多肽 第三多肽 第五多肽 第二多肽 第六多肽 6 第一多肽 第四多肽 第三多肽 第五多肽 第六多肽 第二多肽 6 第一多肽 第四多肽 第三多肽 第六多肽 第二多肽 第五多肽 6 第一多肽 第四多肽 第三多肽 第六多肽 第五多肽 第二多肽 6 第一多肽 第四多肽 第五多肽 第二多肽 第三多肽 第六多肽 6 第一多肽 第四多肽 第五多肽 第二多肽 第六多肽 第三多肽 6 第一多肽 第四多肽 第五多肽 第三多肽 第二多肽 第六多肽 6 第一多肽 第四多肽 第五多肽 第三多肽 第六多肽 第二多肽 6 第一多肽 第四多肽 第五多肽 第六多肽 第二多肽 第三多肽 6 第一多肽 第四多肽 第五多肽 第六多肽 第三多肽 第二多肽 6 第一多肽 第四多肽 第六多肽 第二多肽 第三多肽 第五多肽 6 第一多肽 第四多肽 第六多肽 第二多肽 第五多肽 第三多肽 6 第一多肽 第四多肽 第六多肽 第三多肽 第二多肽 第五多肽 6 第一多肽 第四多肽 第六多肽 第三多肽 第五多肽 第二多肽 6 第一多肽 第四多肽 第六多肽 第五多肽 第二多肽 第三多肽 6 第一多肽 第四多肽 第六多肽 第五多肽 第三多肽 第二多肽 6 第一多肽 第五多肽 第二多肽 第三多肽 第四多肽 第六多肽 6 第一多肽 第五多肽 第二多肽 第三多肽 第六多肽 第四多肽 6 第一多肽 第五多肽 第二多肽 第四多肽 第三多肽 第六多肽 6 第一多肽 第五多肽 第二多肽 第四多肽 第六多肽 第三多肽 6 第一多肽 第五多肽 第二多肽 第六多肽 第三多肽 第四多肽 6 第一多肽 第五多肽 第二多肽 第六多肽 第四多肽 第三多肽 6 第一多肽 第五多肽 第三多肽 第二多肽 第四多肽 第六多肽 6 第一多肽 第五多肽 第三多肽 第二多肽 第六多肽 第四多肽 6 第一多肽 第五多肽 第三多肽 第四多肽 第二多肽 第六多肽 6 第一多肽 第五多肽 第三多肽 第四多肽 第六多肽 第二多肽 6 第一多肽 第五多肽 第三多肽 第六多肽 第二多肽 第四多肽 6 第一多肽 第五多肽 第三多肽 第六多肽 第四多肽 第二多肽 6 第一多肽 第五多肽 第四多肽 第二多肽 第三多肽 第六多肽 6 第一多肽 第五多肽 第四多肽 第二多肽 第六多肽 第三多肽 6 第一多肽 第五多肽 第四多肽 第三多肽 第二多肽 第六多肽 6 第一多肽 第五多肽 第四多肽 第三多肽 第六多肽 第二多肽 6 第一多肽 第五多肽 第四多肽 第六多肽 第二多肽 第三多肽 6 第一多肽 第五多肽 第四多肽 第六多肽 第三多肽 第二多肽 6 第一多肽 第五多肽 第六多肽 第二多肽 第三多肽 第四多肽

6 第一多肽 第五多肽 第六多肽 第二多肽 第四多肽 第三多肽 6 第一多肽 第五多肽 第六多肽 第三多肽 第二多肽 第四多肽 6 第一多肽 第五多肽 第六多肽 第三多肽 第四多肽 第二多肽 6 第一多肽 第五多肽 第六多肽 第四多肽 第二多肽 第三多肽 6 第一多肽 第五多肽 第六多肽 第四多肽 第三多肽 第二多肽 6 第一多肽 第六多肽 第二多肽 第三多肽 第四多肽 第五多肽 6 第一多肽 第六多肽 第二多肽 第三多肽 第五多肽 第四多肽 6 第一多肽 第六多肽 第二多肽 第四多肽 第三多肽 第五多肽 6 第一多肽 第六多肽 第二多肽 第四多肽 第五多肽 第三多肽 6 第一多肽 第六多肽 第二多肽 第五多肽 第三多肽 第四多肽 6 第一多肽 第六多肽 第二多肽 第五多肽 第四多肽 第三多肽 6 第一多肽 第六多肽 第三多肽 第二多肽 第四多肽 第五多肽 6 第一多肽 第六多肽 第三多肽 第二多肽 第五多肽 第四多肽 6 第一多肽 第六多肽 第三多肽 第四多肽 第二多肽 第五多肽 6 第一多肽 第六多肽 第三多肽 第四多肽 第五多肽 第二多肽 6 第一多肽 第六多肽 第三多肽 第五多肽 第二多肽 第四多肽 6 第一多肽 第六多肽 第三多肽 第五多肽 第四多肽 第二多肽 6 第一多肽 第六多肽 第四多肽 第二多肽 第三多肽 第五多肽 6 第一多肽 第六多肽 第四多肽 第二多肽 第五多肽 第三多肽 6 第一多肽 第六多肽 第四多肽 第三多肽 第二多肽 第五多肽 6 第一多肽 第六多肽 第四多肽 第三多肽 第五多肽 第二多肽 6 第一多肽 第六多肽 第四多肽 第五多肽 第二多肽 第三多肽 6 第一多肽 第六多肽 第四多肽 第五多肽 第三多肽 第二多肽 6 第一多肽 第六多肽 第五多肽 第二多肽 第三多肽 第四多肽 6 第一多肽 第六多肽 第五多肽 第二多肽 第四多肽 第三多肽 6 第一多肽 第六多肽 第五多肽 第三多肽 第二多肽 第四多肽 6 第一多肽 第六多肽 第五多肽 第三多肽 第四多肽 第二多肽 6 第一多肽 第六多肽 第五多肽 第四多肽 第二多肽 第三多肽 6 第一多肽 第六多肽 第五多肽 第四多肽 第三多肽 第二多肽 6 第二多肽 第一多肽 第三多肽 第四多肽 第五多肽 第六多肽 6 第二多肽 第一多肽 第三多肽 第四多肽 第六多肽 第五多肽 6 第二多肽 第一多肽 第三多肽 第五多肽 第四多肽 第六多肽 6 第二多肽 第一多肽 第三多肽 第五多肽 第六多肽 第四多肽 6 第二多肽 第一多肽 第三多肽 第六多肽 第四多肽 第五多肽 6 第二多肽 第一多肽 第三多肽 第六多肽 第五多肽 第四多肽 6 第二多肽 第一多肽 第四多肽 第三多肽 第五多肽 第六多肽 6 第二多肽 第一多肽 第四多肽 第三多肽 第六多肽 第五多肽 6 第二多肽 第一多肽 第四多肽 第五多肽 第三多肽 第六多肽 6 第二多肽 第一多肽 第四多肽 第五多肽 第六多肽 第三多肽 6 第二多肽 第一多肽 第四多肽 第六多肽 第三多肽 第五多肽 6 第二多肽 第一多肽 第四多肽 第六多肽 第五多肽 第三多肽 6 第二多肽 第一多肽 第五多肽 第三多肽 第四多肽 第六多肽 6 第二多肽 第一多肽 第五多肽 第三多肽 第六多肽 第四多肽 6 第二多肽 第一多肽 第五多肽 第四多肽 第三多肽 第六多肽 6 第二多肽 第一多肽 第五多肽 第四多肽 第六多肽 第三多肽 6 第二多肽 第一多肽 第五多肽 第六多肽 第三多肽 第四多肽 6 第二多肽 第一多肽 第五多肽 第六多肽 第四多肽 第三多肽 6 第二多肽 第一多肽 第六多肽 第三多肽 第四多肽 第五多肽 6 第二多肽 第一多肽 第六多肽 第三多肽 第五多肽 第四多肽 6 第二多肽 第一多肽 第六多肽 第四多肽 第三多肽 第五多肽 6 第二多肽 第一多肽 第六多肽 第四多肽 第五多肽 第三多肽 6 第二多肽 第一多肽 第六多肽 第五多肽 第三多肽 第四多肽 6 第二多肽 第一多肽 第六多肽 第五多肽 第四多肽 第三多肽 6 第二多肽 第三多肽 第一多肽 第四多肽 第五多肽 第六多肽

6 第二多肽 第三多肽 第一多肽 第四多肽 第六多肽 第五多肽 6 第二多肽 第三多肽 第一多肽 第五多肽 第四多肽 第六多肽 6 第二多肽 第三多肽 第一多肽 第五多肽 第六多肽 第四多肽 6 第二多肽 第三多肽 第一多肽 第六多肽 第四多肽 第五多肽 6 第二多肽 第三多肽 第一多肽 第六多肽 第五多肽 第四多肽 6 第二多肽 第三多肽 第四多肽 第一多肽 第五多肽 第六多肽 6 第二多肽 第三多肽 第四多肽 第一多肽 第六多肽 第五多肽 6 第二多肽 第三多肽 第四多肽 第五多肽 第一多肽 第六多肽 6 第二多肽 第三多肽 第四多肽 第五多肽 第六多肽 第一多肽 6 第二多肽 第三多肽 第四多肽 第六多肽 第一多肽 第五多肽 6 第二多肽 第三多肽 第四多肽 第六多肽 第五多肽 第一多肽 6 第二多肽 第三多肽 第五多肽 第一多肽 第四多肽 第六多肽 6 第二多肽 第三多肽 第五多肽 第一多肽 第六多肽 第四多肽 6 第二多肽 第三多肽 第五多肽 第四多肽 第一多肽 第六多肽 6 第二多肽 第三多肽 第五多肽 第四多肽 第六多肽 第一多肽 6 第二多肽 第三多肽 第五多肽 第六多肽 第一多肽 第四多肽 6 第二多肽 第三多肽 第五多肽 第六多肽 第四多肽 第一多肽 6 第二多肽 第三多肽 第六多肽 第一多肽 第四多肽 第五多肽 6 第二多肽 第三多肽 第六多肽 第一多肽 第五多肽 第四多肽 6 第二多肽 第三多肽 第六多肽 第四多肽 第一多肽 第五多肽 6 第二多肽 第三多肽 第六多肽 第四多肽 第五多肽 第一多肽 6 第二多肽 第三多肽 第六多肽 第五多肽 第一多肽 第四多肽 6 第二多肽 第三多肽 第六多肽 第五多肽 第四多肽 第一多肽 6 第二多肽 第四多肽 第一多肽 第三多肽 第五多肽 第六多肽 6 第二多肽 第四多肽 第一多肽 第三多肽 第六多肽 第五多肽 6 第二多肽 第四多肽 第一多肽 第五多肽 第三多肽 第六多肽 6 第二多肽 第四多肽 第一多肽 第五多肽 第六多肽 第三多肽 6 第二多肽 第四多肽 第一多肽 第六多肽 第三多肽 第五多肽 6 第二多肽 第四多肽 第一多肽 第六多肽 第五多肽 第三多肽 6 第二多肽 第四多肽 第三多肽 第一多肽 第五多肽 第六多肽 6 第二多肽 第四多肽 第三多肽 第一多肽 第六多肽 第五多肽 6 第二多肽 第四多肽 第三多肽 第五多肽 第一多肽 第六多肽 6 第二多肽 第四多肽 第三多肽 第五多肽 第六多肽 第一多肽 6 第二多肽 第四多肽 第三多肽 第六多肽 第一多肽 第五多肽 6 第二多肽 第四多肽 第三多肽 第六多肽 第五多肽 第一多肽 6 第二多肽 第四多肽 第五多肽 第一多肽 第三多肽 第六多肽 6 第二多肽 第四多肽 第五多肽 第一多肽 第六多肽 第三多肽 6 第二多肽 第四多肽 第五多肽 第三多肽 第一多肽 第六多肽 6 第二多肽 第四多肽 第五多肽 第三多肽 第六多肽 第一多肽 6 第二多肽 第四多肽 第五多肽 第六多肽 第一多肽 第三多肽 6 第二多肽 第四多肽 第五多肽 第六多肽 第三多肽 第一多肽 6 第二多肽 第四多肽 第六多肽 第一多肽 第三多肽 第五多肽 6 第二多肽 第四多肽 第六多肽 第一多肽 第五多肽 第三多肽 6 第二多肽 第四多肽 第六多肽 第三多肽 第一多肽 第五多肽 6 第二多肽 第四多肽 第六多肽 第三多肽 第五多肽 第一多肽 6 第二多肽 第四多肽 第六多肽 第五多肽 第一多肽 第三多肽 6 第二多肽 第四多肽 第六多肽 第五多肽 第三多肽 第一多肽 6 第二多肽 第五多肽 第一多肽 第三多肽 第四多肽 第六多肽 6 第二多肽 第五多肽 第一多肽 第三多肽 第六多肽 第四多肽 6 第二多肽 第五多肽 第一多肽 第四多肽 第三多肽 第六多肽 6 第二多肽 第五多肽 第一多肽 第四多肽 第六多肽 第三多肽 6 第二多肽 第五多肽 第一多肽 第六多肽 第三多肽 第四多肽 6 第二多肽 第五多肽 第一多肽 第六多肽 第四多肽 第三多肽 6 第二多肽 第五多肽 第三多肽 第一多肽 第四多肽 第六多肽

6 第二多肽 第五多肽 第三多肽 第一多肽 第六多肽 第四多肽 6 第二多肽 第五多肽 第三多肽 第四多肽 第一多肽 第六多肽 6 第二多肽 第五多肽 第三多肽 第四多肽 第六多肽 第一多肽 6 第二多肽 第五多肽 第三多肽 第六多肽 第一多肽 第四多肽 6 第二多肽 第五多肽 第三多肽 第六多肽 第四多肽 第一多肽 6 第二多肽 第五多肽 第四多肽 第一多肽 第三多肽 第六多肽 6 第二多肽 第五多肽 第四多肽 第一多肽 第六多肽 第三多肽 6 第二多肽 第五多肽 第四多肽 第三多肽 第一多肽 第六多肽 6 第二多肽 第五多肽 第四多肽 第三多肽 第六多肽 第一多肽 6 第二多肽 第五多肽 第四多肽 第六多肽 第一多肽 第三多肽 6 第二多肽 第五多肽 第四多肽 第六多肽 第三多肽 第一多肽 6 第二多肽 第五多肽 第六多肽 第一多肽 第三多肽 第四多肽 6 第二多肽 第五多肽 第六多肽 第一多肽 第四多肽 第三多肽 6 第二多肽 第五多肽 第六多肽 第三多肽 第一多肽 第四多肽 6 第二多肽 第五多肽 第六多肽 第三多肽 第四多肽 第一多肽 6 第二多肽 第五多肽 第六多肽 第四多肽 第一多肽 第三多肽 6 第二多肽 第五多肽 第六多肽 第四多肽 第三多肽 第一多肽 6 第二多肽 第六多肽 第一多肽 第三多肽 第四多肽 第五多肽 6 第二多肽 第六多肽 第一多肽 第三多肽 第五多肽 第四多肽 6 第二多肽 第六多肽 第一多肽 第四多肽 第三多肽 第五多肽 6 第二多肽 第六多肽 第一多肽 第四多肽 第五多肽 第三多肽 6 第二多肽 第六多肽 第一多肽 第五多肽 第三多肽 第四多肽 6 第二多肽 第六多肽 第一多肽 第五多肽 第四多肽 第三多肽 6 第二多肽 第六多肽 第三多肽 第一多肽 第四多肽 第五多肽 6 第二多肽 第六多肽 第三多肽 第一多肽 第五多肽 第四多肽 6 第二多肽 第六多肽 第三多肽 第四多肽 第一多肽 第五多肽 6 第二多肽 第六多肽 第三多肽 第四多肽 第五多肽 第一多肽 6 第二多肽 第六多肽 第三多肽 第五多肽 第一多肽 第四多肽 6 第二多肽 第六多肽 第三多肽 第五多肽 第四多肽 第一多肽 6 第二多肽 第六多肽 第四多肽 第一多肽 第三多肽 第五多肽 6 第二多肽 第六多肽 第四多肽 第一多肽 第五多肽 第三多肽 6 第二多肽 第六多肽 第四多肽 第三多肽 第一多肽 第五多肽 6 第二多肽 第六多肽 第四多肽 第三多肽 第五多肽 第一多肽 6 第二多肽 第六多肽 第四多肽 第五多肽 第一多肽 第三多肽 6 第二多肽 第六多肽 第四多肽 第五多肽 第三多肽 第一多肽 6 第二多肽 第六多肽 第五多肽 第一多肽 第三多肽 第四多肽 6 第二多肽 第六多肽 第五多肽 第一多肽 第四多肽 第三多肽 6 第二多肽 第六多肽 第五多肽 第三多肽 第一多肽 第四多肽 6 第二多肽 第六多肽 第五多肽 第三多肽 第四多肽 第一多肽 6 第二多肽 第六多肽 第五多肽 第四多肽 第一多肽 第三多肽 6 第二多肽 第六多肽 第五多肽 第四多肽 第三多肽 第一多肽 6 第三多肽 第一多肽 第二多肽 第四多肽 第五多肽 第六多肽 6 第三多肽 第一多肽 第二多肽 第四多肽 第六多肽 第五多肽 6 第三多肽 第一多肽 第二多肽 第五多肽 第四多肽 第六多肽 6 第三多肽 第一多肽 第二多肽 第五多肽 第六多肽 第四多肽 6 第三多肽 第一多肽 第二多肽 第六多肽 第四多肽 第五多肽 6 第三多肽 第一多肽 第二多肽 第六多肽 第五多肽 第四多肽 6 第三多肽 第一多肽 第四多肽 第二多肽 第五多肽 第六多肽 6 第三多肽 第一多肽 第四多肽 第二多肽 第六多肽 第五多肽 6 第三多肽 第一多肽 第四多肽 第五多肽 第二多肽 第六多肽 6 第三多肽 第一多肽 第四多肽 第五多肽 第六多肽 第二多肽 6 第三多肽 第一多肽 第四多肽 第六多肽 第二多肽 第五多肽 6 第三多肽 第一多肽 第四多肽 第六多肽 第五多肽 第二多肽 6 第三多肽 第一多肽 第五多肽 第二多肽 第四多肽 第六多肽

6 第三多肽 第一多肽 第五多肽 第二多肽 第六多肽 第四多肽 6 第三多肽 第一多肽 第五多肽 第四多肽 第二多肽 第六多肽 6 第三多肽 第一多肽 第五多肽 第四多肽 第六多肽 第二多肽 6 第三多肽 第一多肽 第五多肽 第六多肽 第二多肽 第四多肽 6 第三多肽 第一多肽 第五多肽 第六多肽 第四多肽 第二多肽 6 第三多肽 第一多肽 第六多肽 第二多肽 第四多肽 第五多肽 6 第三多肽 第一多肽 第六多肽 第二多肽 第五多肽 第四多肽 6 第三多肽 第一多肽 第六多肽 第四多肽 第二多肽 第五多肽 6 第三多肽 第一多肽 第六多肽 第四多肽 第五多肽 第二多肽 6 第三多肽 第一多肽 第六多肽 第五多肽 第二多肽 第四多肽 6 第三多肽 第一多肽 第六多肽 第五多肽 第四多肽 第二多肽 6 第三多肽 第二多肽 第一多肽 第四多肽 第五多肽 第六多肽 6 第三多肽 第二多肽 第一多肽 第四多肽 第六多肽 第五多肽 6 第三多肽 第二多肽 第一多肽 第五多肽 第四多肽 第六多肽 6 第三多肽 第二多肽 第一多肽 第五多肽 第六多肽 第四多肽 6 第三多肽 第二多肽 第一多肽 第六多肽 第四多肽 第五多肽 6 第三多肽 第二多肽 第一多肽 第六多肽 第五多肽 第四多肽 6 第三多肽 第二多肽 第四多肽 第一多肽 第五多肽 第六多肽 6 第三多肽 第二多肽 第四多肽 第一多肽 第六多肽 第五多肽 6 第三多肽 第二多肽 第四多肽 第五多肽 第一多肽 第六多肽 6 第三多肽 第二多肽 第四多肽 第五多肽 第六多肽 第一多肽 6 第三多肽 第二多肽 第四多肽 第六多肽 第一多肽 第五多肽 6 第三多肽 第二多肽 第四多肽 第六多肽 第五多肽 第一多肽 6 第三多肽 第二多肽 第五多肽 第一多肽 第四多肽 第六多肽 6 第三多肽 第二多肽 第五多肽 第一多肽 第六多肽 第四多肽 6 第三多肽 第二多肽 第五多肽 第四多肽 第一多肽 第六多肽 6 第三多肽 第二多肽 第五多肽 第四多肽 第六多肽 第一多肽 6 第三多肽 第二多肽 第五多肽 第六多肽 第一多肽 第四多肽 6 第三多肽 第二多肽 第五多肽 第六多肽 第四多肽 第一多肽 6 第三多肽 第二多肽 第六多肽 第一多肽 第四多肽 第五多肽 6 第三多肽 第二多肽 第六多肽 第一多肽 第五多肽 第四多肽 6 第三多肽 第二多肽 第六多肽 第四多肽 第一多肽 第五多肽 6 第三多肽 第二多肽 第六多肽 第四多肽 第五多肽 第一多肽 6 第三多肽 第二多肽 第六多肽 第五多肽 第一多肽 第四多肽 6 第三多肽 第二多肽 第六多肽 第五多肽 第四多肽 第一多肽 6 第三多肽 第四多肽 第一多肽 第二多肽 第五多肽 第六多肽 6 第三多肽 第四多肽 第一多肽 第二多肽 第六多肽 第五多肽 6 第三多肽 第四多肽 第一多肽 第五多肽 第二多肽 第六多肽 6 第三多肽 第四多肽 第一多肽 第五多肽 第六多肽 第二多肽 6 第三多肽 第四多肽 第一多肽 第六多肽 第二多肽 第五多肽 6 第三多肽 第四多肽 第一多肽 第六多肽 第五多肽 第二多肽 6 第三多肽 第四多肽 第二多肽 第一多肽 第五多肽 第六多肽 6 第三多肽 第四多肽 第二多肽 第一多肽 第六多肽 第五多肽 6 第三多肽 第四多肽 第二多肽 第五多肽 第一多肽 第六多肽 6 第三多肽 第四多肽 第二多肽 第五多肽 第六多肽 第一多肽 6 第三多肽 第四多肽 第二多肽 第六多肽 第一多肽 第五多肽 6 第三多肽 第四多肽 第二多肽 第六多肽 第五多肽 第一多肽 6 第三多肽 第四多肽 第五多肽 第一多肽 第二多肽 第六多肽 6 第三多肽 第四多肽 第五多肽 第一多肽 第六多肽 第二多肽 6 第三多肽 第四多肽 第五多肽 第二多肽 第一多肽 第六多肽 6 第三多肽 第四多肽 第五多肽 第二多肽 第六多肽 第一多肽 6 第三多肽 第四多肽 第五多肽 第六多肽 第一多肽 第二多肽 6 第三多肽 第四多肽 第五多肽 第六多肽 第二多肽 第一多肽 6 第三多肽 第四多肽 第六多肽 第一多肽 第二多肽 第五多肽

6 第三多肽 第四多肽 第六多肽 第一多肽 第五多肽 第二多肽 6 第三多肽 第四多肽 第六多肽 第二多肽 第一多肽 第五多肽 6 第三多肽 第四多肽 第六多肽 第二多肽 第五多肽 第一多肽 6 第三多肽 第四多肽 第六多肽 第五多肽 第一多肽 第二多肽 6 第三多肽 第四多肽 第六多肽 第五多肽 第二多肽 第一多肽 6 第三多肽 第五多肽 第一多肽 第二多肽 第四多肽 第六多肽 6 第三多肽 第五多肽 第一多肽 第二多肽 第六多肽 第四多肽 6 第三多肽 第五多肽 第一多肽 第四多肽 第二多肽 第六多肽 6 第三多肽 第五多肽 第一多肽 第四多肽 第六多肽 第二多肽 6 第三多肽 第五多肽 第一多肽 第六多肽 第二多肽 第四多肽 6 第三多肽 第五多肽 第一多肽 第六多肽 第四多肽 第二多肽 6 第三多肽 第五多肽 第二多肽 第一多肽 第四多肽 第六多肽 6 第三多肽 第五多肽 第二多肽 第一多肽 第六多肽 第四多肽 6 第三多肽 第五多肽 第二多肽 第四多肽 第一多肽 第六多肽 6 第三多肽 第五多肽 第二多肽 第四多肽 第六多肽 第一多肽 6 第三多肽 第五多肽 第二多肽 第六多肽 第一多肽 第四多肽 6 第三多肽 第五多肽 第二多肽 第六多肽 第四多肽 第一多肽 6 第三多肽 第五多肽 第四多肽 第一多肽 第二多肽 第六多肽 6 第三多肽 第五多肽 第四多肽 第一多肽 第六多肽 第二多肽 6 第三多肽 第五多肽 第四多肽 第二多肽 第一多肽 第六多肽 6 第三多肽 第五多肽 第四多肽 第二多肽 第六多肽 第一多肽 6 第三多肽 第五多肽 第四多肽 第六多肽 第一多肽 第二多肽 6 第三多肽 第五多肽 第四多肽 第六多肽 第二多肽 第一多肽 6 第三多肽 第五多肽 第六多肽 第一多肽 第二多肽 第四多肽 6 第三多肽 第五多肽 第六多肽 第一多肽 第四多肽 第二多肽 6 第三多肽 第五多肽 第六多肽 第二多肽 第一多肽 第四多肽 6 第三多肽 第五多肽 第六多肽 第二多肽 第四多肽 第一多肽 6 第三多肽 第五多肽 第六多肽 第四多肽 第一多肽 第二多肽 6 第三多肽 第五多肽 第六多肽 第四多肽 第二多肽 第一多肽 6 第三多肽 第六多肽 第一多肽 第二多肽 第四多肽 第五多肽 6 第三多肽 第六多肽 第一多肽 第二多肽 第五多肽 第四多肽 6 第三多肽 第六多肽 第一多肽 第四多肽 第二多肽 第五多肽 6 第三多肽 第六多肽 第一多肽 第四多肽 第五多肽 第二多肽 6 第三多肽 第六多肽 第一多肽 第五多肽 第二多肽 第四多肽 6 第三多肽 第六多肽 第一多肽 第五多肽 第四多肽 第二多肽 6 第三多肽 第六多肽 第二多肽 第一多肽 第四多肽 第五多肽 6 第三多肽 第六多肽 第二多肽 第一多肽 第五多肽 第四多肽 6 第三多肽 第六多肽 第二多肽 第四多肽 第一多肽 第五多肽 6 第三多肽 第六多肽 第二多肽 第四多肽 第五多肽 第一多肽 6 第三多肽 第六多肽 第二多肽 第五多肽 第一多肽 第四多肽 6 第三多肽 第六多肽 第二多肽 第五多肽 第四多肽 第一多肽 6 第三多肽 第六多肽 第四多肽 第一多肽 第二多肽 第五多肽 6 第三多肽 第六多肽 第四多肽 第一多肽 第五多肽 第二多肽 6 第三多肽 第六多肽 第四多肽 第二多肽 第一多肽 第五多肽 6 第三多肽 第六多肽 第四多肽 第二多肽 第五多肽 第一多肽 6 第三多肽 第六多肽 第四多肽 第五多肽 第一多肽 第二多肽 6 第三多肽 第六多肽 第四多肽 第五多肽 第二多肽 第一多肽 6 第三多肽 第六多肽 第五多肽 第一多肽 第二多肽 第四多肽 6 第三多肽 第六多肽 第五多肽 第一多肽 第四多肽 第二多肽 6 第三多肽 第六多肽 第五多肽 第二多肽 第一多肽 第四多肽 6 第三多肽 第六多肽 第五多肽 第二多肽 第四多肽 第一多肽 6 第三多肽 第六多肽 第五多肽 第四多肽 第一多肽 第二多肽 6 第三多肽 第六多肽 第五多肽 第四多肽 第二多肽 第一多肽 6 第四多肽 第一多肽 第二多肽 第三多肽 第五多肽 第六多肽

6 第四多肽 第一多肽 第二多肽 第三多肽 第六多肽 第五多肽 6 第四多肽 第一多肽 第二多肽 第五多肽 第三多肽 第六多肽 6 第四多肽 第一多肽 第二多肽 第五多肽 第六多肽 第三多肽 6 第四多肽 第一多肽 第二多肽 第六多肽 第三多肽 第五多肽 6 第四多肽 第一多肽 第二多肽 第六多肽 第五多肽 第三多肽 6 第四多肽 第一多肽 第三多肽 第二多肽 第五多肽 第六多肽 6 第四多肽 第一多肽 第三多肽 第二多肽 第六多肽 第五多肽 6 第四多肽 第一多肽 第三多肽 第五多肽 第二多肽 第六多肽 6 第四多肽 第一多肽 第三多肽 第五多肽 第六多肽 第二多肽 6 第四多肽 第一多肽 第三多肽 第六多肽 第二多肽 第五多肽 6 第四多肽 第一多肽 第三多肽 第六多肽 第五多肽 第二多肽 6 第四多肽 第一多肽 第五多肽 第二多肽 第三多肽 第六多肽 6 第四多肽 第一多肽 第五多肽 第二多肽 第六多肽 第三多肽 6 第四多肽 第一多肽 第五多肽 第三多肽 第二多肽 第六多肽 6 第四多肽 第一多肽 第五多肽 第三多肽 第六多肽 第二多肽 6 第四多肽 第一多肽 第五多肽 第六多肽 第二多肽 第三多肽 6 第四多肽 第一多肽 第五多肽 第六多肽 第三多肽 第二多肽 6 第四多肽 第一多肽 第六多肽 第二多肽 第三多肽 第五多肽 6 第四多肽 第一多肽 第六多肽 第二多肽 第五多肽 第三多肽 6 第四多肽 第一多肽 第六多肽 第三多肽 第二多肽 第五多肽 6 第四多肽 第一多肽 第六多肽 第三多肽 第五多肽 第二多肽 6 第四多肽 第一多肽 第六多肽 第五多肽 第二多肽 第三多肽 6 第四多肽 第一多肽 第六多肽 第五多肽 第三多肽 第二多肽 6 第四多肽 第二多肽 第一多肽 第三多肽 第五多肽 第六多肽 6 第四多肽 第二多肽 第一多肽 第三多肽 第六多肽 第五多肽 6 第四多肽 第二多肽 第一多肽 第五多肽 第三多肽 第六多肽 6 第四多肽 第二多肽 第一多肽 第五多肽 第六多肽 第三多肽 6 第四多肽 第二多肽 第一多肽 第六多肽 第三多肽 第五多肽 6 第四多肽 第二多肽 第一多肽 第六多肽 第五多肽 第三多肽 6 第四多肽 第二多肽 第三多肽 第一多肽 第五多肽 第六多肽 6 第四多肽 第二多肽 第三多肽 第一多肽 第六多肽 第五多肽 6 第四多肽 第二多肽 第三多肽 第五多肽 第一多肽 第六多肽 6 第四多肽 第二多肽 第三多肽 第五多肽 第六多肽 第一多肽 6 第四多肽 第二多肽 第三多肽 第六多肽 第一多肽 第五多肽 6 第四多肽 第二多肽 第三多肽 第六多肽 第五多肽 第一多肽 6 第四多肽 第二多肽 第五多肽 第一多肽 第三多肽 第六多肽 6 第四多肽 第二多肽 第五多肽 第一多肽 第六多肽 第三多肽 6 第四多肽 第二多肽 第五多肽 第三多肽 第一多肽 第六多肽 6 第四多肽 第二多肽 第五多肽 第三多肽 第六多肽 第一多肽 6 第四多肽 第二多肽 第五多肽 第六多肽 第一多肽 第三多肽 6 第四多肽 第二多肽 第五多肽 第六多肽 第三多肽 第一多肽 6 第四多肽 第二多肽 第六多肽 第一多肽 第三多肽 第五多肽 6 第四多肽 第二多肽 第六多肽 第一多肽 第五多肽 第三多肽 6 第四多肽 第二多肽 第六多肽 第三多肽 第一多肽 第五多肽 6 第四多肽 第二多肽 第六多肽 第三多肽 第五多肽 第一多肽 6 第四多肽 第二多肽 第六多肽 第五多肽 第一多肽 第三多肽 6 第四多肽 第二多肽 第六多肽 第五多肽 第三多肽 第一多肽 6 第四多肽 第三多肽 第一多肽 第二多肽 第五多肽 第六多肽 6 第四多肽 第三多肽 第一多肽 第二多肽 第六多肽 第五多肽 6 第四多肽 第三多肽 第一多肽 第五多肽 第二多肽 第六多肽 6 第四多肽 第三多肽 第一多肽 第五多肽 第六多肽 第二多肽 6 第四多肽 第三多肽 第一多肽 第六多肽 第二多肽 第五多肽 6 第四多肽 第三多肽 第一多肽 第六多肽 第五多肽 第二多肽 6 第四多肽 第三多肽 第二多肽 第一多肽 第五多肽 第六多肽

6 第四多肽 第三多肽 第二多肽 第一多肽 第六多肽 第五多肽 6 第四多肽 第三多肽 第二多肽 第五多肽 第一多肽 第六多肽 6 第四多肽 第三多肽 第二多肽 第五多肽 第六多肽 第一多肽 6 第四多肽 第三多肽 第二多肽 第六多肽 第一多肽 第五多肽 6 第四多肽 第三多肽 第二多肽 第六多肽 第五多肽 第一多肽 6 第四多肽 第三多肽 第五多肽 第一多肽 第二多肽 第六多肽 6 第四多肽 第三多肽 第五多肽 第一多肽 第六多肽 第二多肽 6 第四多肽 第三多肽 第五多肽 第二多肽 第一多肽 第六多肽 6 第四多肽 第三多肽 第五多肽 第二多肽 第六多肽 第一多肽 6 第四多肽 第三多肽 第五多肽 第六多肽 第一多肽 第二多肽 6 第四多肽 第三多肽 第五多肽 第六多肽 第二多肽 第一多肽 6 第四多肽 第三多肽 第六多肽 第一多肽 第二多肽 第五多肽 6 第四多肽 第三多肽 第六多肽 第一多肽 第五多肽 第二多肽 6 第四多肽 第三多肽 第六多肽 第二多肽 第一多肽 第五多肽 6 第四多肽 第三多肽 第六多肽 第二多肽 第五多肽 第一多肽 6 第四多肽 第三多肽 第六多肽 第五多肽 第一多肽 第二多肽 6 第四多肽 第三多肽 第六多肽 第五多肽 第二多肽 第一多肽 6 第四多肽 第五多肽 第一多肽 第二多肽 第三多肽 第六多肽 6 第四多肽 第五多肽 第一多肽 第二多肽 第六多肽 第三多肽 6 第四多肽 第五多肽 第一多肽 第三多肽 第二多肽 第六多肽 6 第四多肽 第五多肽 第一多肽 第三多肽 第六多肽 第二多肽 6 第四多肽 第五多肽 第一多肽 第六多肽 第二多肽 第三多肽 6 第四多肽 第五多肽 第一多肽 第六多肽 第三多肽 第二多肽 6 第四多肽 第五多肽 第二多肽 第一多肽 第三多肽 第六多肽 6 第四多肽 第五多肽 第二多肽 第一多肽 第六多肽 第三多肽 6 第四多肽 第五多肽 第二多肽 第三多肽 第一多肽 第六多肽 6 第四多肽 第五多肽 第二多肽 第三多肽 第六多肽 第一多肽 6 第四多肽 第五多肽 第二多肽 第六多肽 第一多肽 第三多肽 6 第四多肽 第五多肽 第二多肽 第六多肽 第三多肽 第一多肽 6 第四多肽 第五多肽 第三多肽 第一多肽 第二多肽 第六多肽 6 第四多肽 第五多肽 第三多肽 第一多肽 第六多肽 第二多肽 6 第四多肽 第五多肽 第三多肽 第二多肽 第一多肽 第六多肽 6 第四多肽 第五多肽 第三多肽 第二多肽 第六多肽 第一多肽 6 第四多肽 第五多肽 第三多肽 第六多肽 第一多肽 第二多肽 6 第四多肽 第五多肽 第三多肽 第六多肽 第二多肽 第一多肽 6 第四多肽 第五多肽 第六多肽 第一多肽 第二多肽 第三多肽 6 第四多肽 第五多肽 第六多肽 第一多肽 第三多肽 第二多肽 6 第四多肽 第五多肽 第六多肽 第二多肽 第一多肽 第三多肽 6 第四多肽 第五多肽 第六多肽 第二多肽 第三多肽 第一多肽 6 第四多肽 第五多肽 第六多肽 第三多肽 第一多肽 第二多肽 6 第四多肽 第五多肽 第六多肽 第三多肽 第二多肽 第一多肽 6 第四多肽 第六多肽 第一多肽 第二多肽 第三多肽 第五多肽 6 第四多肽 第六多肽 第一多肽 第二多肽 第五多肽 第三多肽 6 第四多肽 第六多肽 第一多肽 第三多肽 第二多肽 第五多肽 6 第四多肽 第六多肽 第一多肽 第三多肽 第五多肽 第二多肽 6 第四多肽 第六多肽 第一多肽 第五多肽 第二多肽 第三多肽 6 第四多肽 第六多肽 第一多肽 第五多肽 第三多肽 第二多肽 6 第四多肽 第六多肽 第二多肽 第一多肽 第三多肽 第五多肽 6 第四多肽 第六多肽 第二多肽 第一多肽 第五多肽 第三多肽 6 第四多肽 第六多肽 第二多肽 第三多肽 第一多肽 第五多肽 6 第四多肽 第六多肽 第二多肽 第三多肽 第五多肽 第一多肽 6 第四多肽 第六多肽 第二多肽 第五多肽 第一多肽 第三多肽 6 第四多肽 第六多肽 第二多肽 第五多肽 第三多肽 第一多肽 6 第四多肽 第六多肽 第三多肽 第一多肽 第二多肽 第五多肽

6 第四多肽 第六多肽 第三多肽 第一多肽 第五多肽 第二多肽 6 第四多肽 第六多肽 第三多肽 第二多肽 第一多肽 第五多肽 6 第四多肽 第六多肽 第三多肽 第二多肽 第五多肽 第一多肽 6 第四多肽 第六多肽 第三多肽 第五多肽 第一多肽 第二多肽 6 第四多肽 第六多肽 第三多肽 第五多肽 第二多肽 第一多肽 6 第四多肽 第六多肽 第五多肽 第一多肽 第二多肽 第三多肽 6 第四多肽 第六多肽 第五多肽 第一多肽 第三多肽 第二多肽 6 第四多肽 第六多肽 第五多肽 第二多肽 第一多肽 第三多肽 6 第四多肽 第六多肽 第五多肽 第二多肽 第三多肽 第一多肽 6 第四多肽 第六多肽 第五多肽 第三多肽 第一多肽 第二多肽 6 第四多肽 第六多肽 第五多肽 第三多肽 第二多肽 第一多肽 6 第五多肽 第一多肽 第二多肽 第三多肽 第四多肽 第六多肽 6 第五多肽 第一多肽 第二多肽 第三多肽 第六多肽 第四多肽 6 第五多肽 第一多肽 第二多肽 第四多肽 第三多肽 第六多肽 6 第五多肽 第一多肽 第二多肽 第四多肽 第六多肽 第三多肽 6 第五多肽 第一多肽 第二多肽 第六多肽 第三多肽 第四多肽 6 第五多肽 第一多肽 第二多肽 第六多肽 第四多肽 第三多肽 6 第五多肽 第一多肽 第三多肽 第二多肽 第四多肽 第六多肽 6 第五多肽 第一多肽 第三多肽 第二多肽 第六多肽 第四多肽 6 第五多肽 第一多肽 第三多肽 第四多肽 第二多肽 第六多肽 6 第五多肽 第一多肽 第三多肽 第四多肽 第六多肽 第二多肽 6 第五多肽 第一多肽 第三多肽 第六多肽 第二多肽 第四多肽 6 第五多肽 第一多肽 第三多肽 第六多肽 第四多肽 第二多肽 6 第五多肽 第一多肽 第四多肽 第二多肽 第三多肽 第六多肽 6 第五多肽 第一多肽 第四多肽 第二多肽 第六多肽 第三多肽 6 第五多肽 第一多肽 第四多肽 第三多肽 第二多肽 第六多肽 6 第五多肽 第一多肽 第四多肽 第三多肽 第六多肽 第二多肽 6 第五多肽 第一多肽 第四多肽 第六多肽 第二多肽 第三多肽 6 第五多肽 第一多肽 第四多肽 第六多肽 第三多肽 第二多肽 6 第五多肽 第一多肽 第六多肽 第二多肽 第三多肽 第四多肽 6 第五多肽 第一多肽 第六多肽 第二多肽 第四多肽 第三多肽 6 第五多肽 第一多肽 第六多肽 第三多肽 第二多肽 第四多肽 6 第五多肽 第一多肽 第六多肽 第三多肽 第四多肽 第二多肽 6 第五多肽 第一多肽 第六多肽 第四多肽 第二多肽 第三多肽 6 第五多肽 第一多肽 第六多肽 第四多肽 第三多肽 第二多肽 6 第五多肽 第二多肽 第一多肽 第三多肽 第四多肽 第六多肽 6 第五多肽 第二多肽 第一多肽 第三多肽 第六多肽 第四多肽 6 第五多肽 第二多肽 第一多肽 第四多肽 第三多肽 第六多肽 6 第五多肽 第二多肽 第一多肽 第四多肽 第六多肽 第三多肽 6 第五多肽 第二多肽 第一多肽 第六多肽 第三多肽 第四多肽 6 第五多肽 第二多肽 第一多肽 第六多肽 第四多肽 第三多肽 6 第五多肽 第二多肽 第三多肽 第一多肽 第四多肽 第六多肽 6 第五多肽 第二多肽 第三多肽 第一多肽 第六多肽 第四多肽 6 第五多肽 第二多肽 第三多肽 第四多肽 第一多肽 第六多肽 6 第五多肽 第二多肽 第三多肽 第四多肽 第六多肽 第一多肽 6 第五多肽 第二多肽 第三多肽 第六多肽 第一多肽 第四多肽 6 第五多肽 第二多肽 第三多肽 第六多肽 第四多肽 第一多肽 6 第五多肽 第二多肽 第四多肽 第一多肽 第三多肽 第六多肽 6 第五多肽 第二多肽 第四多肽 第一多肽 第六多肽 第三多肽 6 第五多肽 第二多肽 第四多肽 第三多肽 第一多肽 第六多肽 6 第五多肽 第二多肽 第四多肽 第三多肽 第六多肽 第一多肽 6 第五多肽 第二多肽 第四多肽 第六多肽 第一多肽 第三多肽 6 第五多肽 第二多肽 第四多肽 第六多肽 第三多肽 第一多肽 6 第五多肽 第二多肽 第六多肽 第一多肽 第三多肽 第四多肽

6 第五多肽 第二多肽 第六多肽 第一多肽 第四多肽 第三多肽 6 第五多肽 第二多肽 第六多肽 第三多肽 第一多肽 第四多肽 6 第五多肽 第二多肽 第六多肽 第三多肽 第四多肽 第一多肽 6 第五多肽 第二多肽 第六多肽 第四多肽 第一多肽 第三多肽 6 第五多肽 第二多肽 第六多肽 第四多肽 第三多肽 第一多肽 6 第五多肽 第三多肽 第一多肽 第二多肽 第四多肽 第六多肽 6 第五多肽 第三多肽 第一多肽 第二多肽 第六多肽 第四多肽 6 第五多肽 第三多肽 第一多肽 第四多肽 第二多肽 第六多肽 6 第五多肽 第三多肽 第一多肽 第四多肽 第六多肽 第二多肽 6 第五多肽 第三多肽 第一多肽 第六多肽 第二多肽 第四多肽 6 第五多肽 第三多肽 第一多肽 第六多肽 第四多肽 第二多肽 6 第五多肽 第三多肽 第二多肽 第一多肽 第四多肽 第六多肽 6 第五多肽 第三多肽 第二多肽 第一多肽 第六多肽 第四多肽 6 第五多肽 第三多肽 第二多肽 第四多肽 第一多肽 第六多肽 6 第五多肽 第三多肽 第二多肽 第四多肽 第六多肽 第一多肽 6 第五多肽 第三多肽 第二多肽 第六多肽 第一多肽 第四多肽 6 第五多肽 第三多肽 第二多肽 第六多肽 第四多肽 第一多肽 6 第五多肽 第三多肽 第四多肽 第一多肽 第二多肽 第六多肽 6 第五多肽 第三多肽 第四多肽 第一多肽 第六多肽 第二多肽 6 第五多肽 第三多肽 第四多肽 第二多肽 第一多肽 第六多肽 6 第五多肽 第三多肽 第四多肽 第二多肽 第六多肽 第一多肽 6 第五多肽 第三多肽 第四多肽 第六多肽 第一多肽 第二多肽 6 第五多肽 第三多肽 第四多肽 第六多肽 第二多肽 第一多肽 6 第五多肽 第三多肽 第六多肽 第一多肽 第二多肽 第四多肽 6 第五多肽 第三多肽 第六多肽 第一多肽 第四多肽 第二多肽 6 第五多肽 第三多肽 第六多肽 第二多肽 第一多肽 第四多肽 6 第五多肽 第三多肽 第六多肽 第二多肽 第四多肽 第一多肽 6 第五多肽 第三多肽 第六多肽 第四多肽 第一多肽 第二多肽 6 第五多肽 第三多肽 第六多肽 第四多肽 第二多肽 第一多肽 6 第五多肽 第四多肽 第一多肽 第二多肽 第三多肽 第六多肽 6 第五多肽 第四多肽 第一多肽 第二多肽 第六多肽 第三多肽 6 第五多肽 第四多肽 第一多肽 第三多肽 第二多肽 第六多肽 6 第五多肽 第四多肽 第一多肽 第三多肽 第六多肽 第二多肽 6 第五多肽 第四多肽 第一多肽 第六多肽 第二多肽 第三多肽 6 第五多肽 第四多肽 第一多肽 第六多肽 第三多肽 第二多肽 6 第五多肽 第四多肽 第二多肽 第一多肽 第三多肽 第六多肽 6 第五多肽 第四多肽 第二多肽 第一多肽 第六多肽 第三多肽 6 第五多肽 第四多肽 第二多肽 第三多肽 第一多肽 第六多肽 6 第五多肽 第四多肽 第二多肽 第三多肽 第六多肽 第一多肽 6 第五多肽 第四多肽 第二多肽 第六多肽 第一多肽 第三多肽 6 第五多肽 第四多肽 第二多肽 第六多肽 第三多肽 第一多肽 6 第五多肽 第四多肽 第三多肽 第一多肽 第二多肽 第六多肽 6 第五多肽 第四多肽 第三多肽 第一多肽 第六多肽 第二多肽 6 第五多肽 第四多肽 第三多肽 第二多肽 第一多肽 第六多肽 6 第五多肽 第四多肽 第三多肽 第二多肽 第六多肽 第一多肽 6 第五多肽 第四多肽 第三多肽 第六多肽 第一多肽 第二多肽 6 第五多肽 第四多肽 第三多肽 第六多肽 第二多肽 第一多肽 6 第五多肽 第四多肽 第六多肽 第一多肽 第二多肽 第三多肽 6 第五多肽 第四多肽 第六多肽 第一多肽 第三多肽 第二多肽 6 第五多肽 第四多肽 第六多肽 第二多肽 第一多肽 第三多肽 6 第五多肽 第四多肽 第六多肽 第二多肽 第三多肽 第一多肽 6 第五多肽 第四多肽 第六多肽 第三多肽 第一多肽 第二多肽 6 第五多肽 第四多肽 第六多肽 第三多肽 第二多肽 第一多肽 6 第五多肽 第六多肽 第一多肽 第二多肽 第三多肽 第四多肽

6 第五多肽 第六多肽 第一多肽 第二多肽 第四多肽 第三多肽 6 第五多肽 第六多肽 第一多肽 第三多肽 第二多肽 第四多肽 6 第五多肽 第六多肽 第一多肽 第三多肽 第四多肽 第二多肽 6 第五多肽 第六多肽 第一多肽 第四多肽 第二多肽 第三多肽 6 第五多肽 第六多肽 第一多肽 第四多肽 第三多肽 第二多肽 6 第五多肽 第六多肽 第二多肽 第一多肽 第三多肽 第四多肽 6 第五多肽 第六多肽 第二多肽 第一多肽 第四多肽 第三多肽 6 第五多肽 第六多肽 第二多肽 第三多肽 第一多肽 第四多肽 6 第五多肽 第六多肽 第二多肽 第三多肽 第四多肽 第一多肽 6 第五多肽 第六多肽 第二多肽 第四多肽 第一多肽 第三多肽 6 第五多肽 第六多肽 第二多肽 第四多肽 第三多肽 第一多肽 6 第五多肽 第六多肽 第三多肽 第一多肽 第二多肽 第四多肽 6 第五多肽 第六多肽 第三多肽 第一多肽 第四多肽 第二多肽 6 第五多肽 第六多肽 第三多肽 第二多肽 第一多肽 第四多肽 6 第五多肽 第六多肽 第三多肽 第二多肽 第四多肽 第一多肽 6 第五多肽 第六多肽 第三多肽 第四多肽 第一多肽 第二多肽 6 第五多肽 第六多肽 第三多肽 第四多肽 第二多肽 第一多肽 6 第五多肽 第六多肽 第四多肽 第一多肽 第二多肽 第三多肽 6 第五多肽 第六多肽 第四多肽 第一多肽 第三多肽 第二多肽 6 第五多肽 第六多肽 第四多肽 第二多肽 第一多肽 第三多肽 6 第五多肽 第六多肽 第四多肽 第二多肽 第三多肽 第一多肽 6 第五多肽 第六多肽 第四多肽 第三多肽 第一多肽 第二多肽 6 第五多肽 第六多肽 第四多肽 第三多肽 第二多肽 第一多肽 6 第六多肽 第一多肽 第二多肽 第三多肽 第四多肽 第五多肽 6 第六多肽 第一多肽 第二多肽 第三多肽 第五多肽 第四多肽 6 第六多肽 第一多肽 第二多肽 第四多肽 第三多肽 第五多肽 6 第六多肽 第一多肽 第二多肽 第四多肽 第五多肽 第三多肽 6 第六多肽 第一多肽 第二多肽 第五多肽 第三多肽 第四多肽 6 第六多肽 第一多肽 第二多肽 第五多肽 第四多肽 第三多肽 6 第六多肽 第一多肽 第三多肽 第二多肽 第四多肽 第五多肽 6 第六多肽 第一多肽 第三多肽 第二多肽 第五多肽 第四多肽 6 第六多肽 第一多肽 第三多肽 第四多肽 第二多肽 第五多肽 6 第六多肽 第一多肽 第三多肽 第四多肽 第五多肽 第二多肽 6 第六多肽 第一多肽 第三多肽 第五多肽 第二多肽 第四多肽 6 第六多肽 第一多肽 第三多肽 第五多肽 第四多肽 第二多肽 6 第六多肽 第一多肽 第四多肽 第二多肽 第三多肽 第五多肽 6 第六多肽 第一多肽 第四多肽 第二多肽 第五多肽 第三多肽 6 第六多肽 第一多肽 第四多肽 第三多肽 第二多肽 第五多肽 6 第六多肽 第一多肽 第四多肽 第三多肽 第五多肽 第二多肽 6 第六多肽 第一多肽 第四多肽 第五多肽 第二多肽 第三多肽 6 第六多肽 第一多肽 第四多肽 第五多肽 第三多肽 第二多肽 6 第六多肽 第一多肽 第五多肽 第二多肽 第三多肽 第四多肽 6 第六多肽 第一多肽 第五多肽 第二多肽 第四多肽 第三多肽 6 第六多肽 第一多肽 第五多肽 第三多肽 第二多肽 第四多肽 6 第六多肽 第一多肽 第五多肽 第三多肽 第四多肽 第二多肽 6 第六多肽 第一多肽 第五多肽 第四多肽 第二多肽 第三多肽 6 第六多肽 第一多肽 第五多肽 第四多肽 第三多肽 第二多肽 6 第六多肽 第二多肽 第一多肽 第三多肽 第四多肽 第五多肽 6 第六多肽 第二多肽 第一多肽 第三多肽 第五多肽 第四多肽 6 第六多肽 第二多肽 第一多肽 第四多肽 第三多肽 第五多肽 6 第六多肽 第二多肽 第一多肽 第四多肽 第五多肽 第三多肽 6 第六多肽 第二多肽 第一多肽 第五多肽 第三多肽 第四多肽 6 第六多肽 第二多肽 第一多肽 第五多肽 第四多肽 第三多肽 6 第六多肽 第二多肽 第三多肽 第一多肽 第四多肽 第五多肽

6 第六多肽 第二多肽 第三多肽 第一多肽 第五多肽 第四多肽 6 第六多肽 第二多肽 第三多肽 第四多肽 第一多肽 第五多肽 6 第六多肽 第二多肽 第三多肽 第四多肽 第五多肽 第一多肽 6 第六多肽 第二多肽 第三多肽 第五多肽 第一多肽 第四多肽 6 第六多肽 第二多肽 第三多肽 第五多肽 第四多肽 第一多肽 6 第六多肽 第二多肽 第四多肽 第一多肽 第三多肽 第五多肽 6 第六多肽 第二多肽 第四多肽 第一多肽 第五多肽 第三多肽 6 第六多肽 第二多肽 第四多肽 第三多肽 第一多肽 第五多肽 6 第六多肽 第二多肽 第四多肽 第三多肽 第五多肽 第一多肽 6 第六多肽 第二多肽 第四多肽 第五多肽 第一多肽 第三多肽 6 第六多肽 第二多肽 第四多肽 第五多肽 第三多肽 第一多肽 6 第六多肽 第二多肽 第五多肽 第一多肽 第三多肽 第四多肽 6 第六多肽 第二多肽 第五多肽 第一多肽 第四多肽 第三多肽 6 第六多肽 第二多肽 第五多肽 第三多肽 第一多肽 第四多肽 6 第六多肽 第二多肽 第五多肽 第三多肽 第四多肽 第一多肽 6 第六多肽 第二多肽 第五多肽 第四多肽 第一多肽 第三多肽 6 第六多肽 第二多肽 第五多肽 第四多肽 第三多肽 第一多肽 6 第六多肽 第三多肽 第一多肽 第二多肽 第四多肽 第五多肽 6 第六多肽 第三多肽 第一多肽 第二多肽 第五多肽 第四多肽 6 第六多肽 第三多肽 第一多肽 第四多肽 第二多肽 第五多肽 6 第六多肽 第三多肽 第一多肽 第四多肽 第五多肽 第二多肽 6 第六多肽 第三多肽 第一多肽 第五多肽 第二多肽 第四多肽 6 第六多肽 第三多肽 第一多肽 第五多肽 第四多肽 第二多肽 6 第六多肽 第三多肽 第二多肽 第一多肽 第四多肽 第五多肽 6 第六多肽 第三多肽 第二多肽 第一多肽 第五多肽 第四多肽 6 第六多肽 第三多肽 第二多肽 第四多肽 第一多肽 第五多肽 6 第六多肽 第三多肽 第二多肽 第四多肽 第五多肽 第一多肽 6 第六多肽 第三多肽 第二多肽 第五多肽 第一多肽 第四多肽 6 第六多肽 第三多肽 第二多肽 第五多肽 第四多肽 第一多肽 6 第六多肽 第三多肽 第四多肽 第一多肽 第二多肽 第五多肽 6 第六多肽 第三多肽 第四多肽 第一多肽 第五多肽 第二多肽 6 第六多肽 第三多肽 第四多肽 第二多肽 第一多肽 第五多肽 6 第六多肽 第三多肽 第四多肽 第二多肽 第五多肽 第一多肽 6 第六多肽 第三多肽 第四多肽 第五多肽 第一多肽 第二多肽 6 第六多肽 第三多肽 第四多肽 第五多肽 第二多肽 第一多肽 6 第六多肽 第三多肽 第五多肽 第一多肽 第二多肽 第四多肽 6 第六多肽 第三多肽 第五多肽 第一多肽 第四多肽 第二多肽 6 第六多肽 第三多肽 第五多肽 第二多肽 第一多肽 第四多肽 6 第六多肽 第三多肽 第五多肽 第二多肽 第四多肽 第一多肽 6 第六多肽 第三多肽 第五多肽 第四多肽 第一多肽 第二多肽 6 第六多肽 第三多肽 第五多肽 第四多肽 第二多肽 第一多肽 6 第六多肽 第四多肽 第一多肽 第二多肽 第三多肽 第五多肽 6 第六多肽 第四多肽 第一多肽 第二多肽 第五多肽 第三多肽 6 第六多肽 第四多肽 第一多肽 第三多肽 第二多肽 第五多肽 6 第六多肽 第四多肽 第一多肽 第三多肽 第五多肽 第二多肽 6 第六多肽 第四多肽 第一多肽 第五多肽 第二多肽 第三多肽 6 第六多肽 第四多肽 第一多肽 第五多肽 第三多肽 第二多肽 6 第六多肽 第四多肽 第二多肽 第一多肽 第三多肽 第五多肽 6 第六多肽 第四多肽 第二多肽 第一多肽 第五多肽 第三多肽 6 第六多肽 第四多肽 第二多肽 第三多肽 第一多肽 第五多肽 6 第六多肽 第四多肽 第二多肽 第三多肽 第五多肽 第一多肽 6 第六多肽 第四多肽 第二多肽 第五多肽 第一多肽 第三多肽 6 第六多肽 第四多肽 第二多肽 第五多肽 第三多肽 第一多肽 6 第六多肽 第四多肽 第三多肽 第一多肽 第二多肽 第五多肽

6 第六多肽 第四多肽 第三多肽 第一多肽 第五多肽 第二多肽 6 第六多肽 第四多肽 第三多肽 第二多肽 第一多肽 第五多肽 6 第六多肽 第四多肽 第三多肽 第二多肽 第五多肽 第一多肽 6 第六多肽 第四多肽 第三多肽 第五多肽 第一多肽 第二多肽 6 第六多肽 第四多肽 第三多肽 第五多肽 第二多肽 第一多肽 6 第六多肽 第四多肽 第五多肽 第一多肽 第二多肽 第三多肽 6 第六多肽 第四多肽 第五多肽 第一多肽 第三多肽 第二多肽 6 第六多肽 第四多肽 第五多肽 第二多肽 第一多肽 第三多肽 6 第六多肽 第四多肽 第五多肽 第二多肽 第三多肽 第一多肽 6 第六多肽 第四多肽 第五多肽 第三多肽 第一多肽 第二多肽 6 第六多肽 第四多肽 第五多肽 第三多肽 第二多肽 第一多肽 6 第六多肽 第五多肽 第一多肽 第二多肽 第三多肽 第四多肽 6 第六多肽 第五多肽 第一多肽 第二多肽 第四多肽 第三多肽 6 第六多肽 第五多肽 第一多肽 第三多肽 第二多肽 第四多肽 6 第六多肽 第五多肽 第一多肽 第三多肽 第四多肽 第二多肽 6 第六多肽 第五多肽 第一多肽 第四多肽 第二多肽 第三多肽 6 第六多肽 第五多肽 第一多肽 第四多肽 第三多肽 第二多肽 6 第六多肽 第五多肽 第二多肽 第一多肽 第三多肽 第四多肽 6 第六多肽 第五多肽 第二多肽 第一多肽 第四多肽 第三多肽 6 第六多肽 第五多肽 第二多肽 第三多肽 第一多肽 第四多肽 6 第六多肽 第五多肽 第二多肽 第三多肽 第四多肽 第一多肽 6 第六多肽 第五多肽 第二多肽 第四多肽 第一多肽 第三多肽 6 第六多肽 第五多肽 第二多肽 第四多肽 第三多肽 第一多肽 6 第六多肽 第五多肽 第三多肽 第一多肽 第二多肽 第四多肽 6 第六多肽 第五多肽 第三多肽 第一多肽 第四多肽 第二多肽 6 第六多肽 第五多肽 第三多肽 第二多肽 第一多肽 第四多肽 6 第六多肽 第五多肽 第三多肽 第二多肽 第四多肽 第一多肽 6 第六多肽 第五多肽 第三多肽 第四多肽 第一多肽 第二多肽 6 第六多肽 第五多肽 第三多肽 第四多肽 第二多肽 第一多肽 6 第六多肽 第五多肽 第四多肽 第一多肽 第二多肽 第三多肽 6 第六多肽 第五多肽 第四多肽 第一多肽 第三多肽 第二多肽 6 第六多肽 第五多肽 第四多肽 第二多肽 第一多肽 第三多肽 6 第六多肽 第五多肽 第四多肽 第二多肽 第三多肽 第一多肽 6 第六多肽 第五多肽 第四多肽 第三多肽 第一多肽 第二多肽 6 第六多肽 第五多肽 第四多肽 第三多肽 第二多肽 第一多肽

n是7时，可以任意顺序包含第一、第二、第三、第四、第五、第六 和第七多肽的任意组合，当n是2、3、4、5或6时如上面所讨论。

本发明也提供表达下列至少两个的细胞（通常是细菌）：

a)包含第一氨基酸序列的第一多肽，其中所述第一氨基酸序列包含的 氨基酸序列(i)与SEQ ID NO:1有至少a%序列相同性，和/或(ii)由SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1有至少a%序列相同性的序列中至少t个连续氨 基酸的片段组成；

b)包含第二氨基酸序列的第二多肽，其中所述第二氨基酸序列包含的 氨基酸序列(i)与SEQ ID NO:2有至少b%序列相同性，和/或(ii)由SEQ ID NO:2或与SEQ ID NO:1有至少b%序列相同性的序列中至少u个连续氨 基酸的片段组成；

c)包含第三氨基酸序列的第三多肽，其中所述第三氨基酸序列包含的 氨基酸序列(i)与SEQ ID NO:3有至少c%序列相同性，和/或(ii)由SEQ ID NO:3或与SEQ ID NO:3有至少c%序列相同性的序列中至少v个连续氨 基酸的片段组成；

d)包含第四氨基酸序列的第四多肽，其中所述第四氨基酸序列包含的 氨基酸序列(i)与SEQ ID NO:4有至少d%序列相同性，和/或(ii)由SEQ ID NO:4或与SEQ ID NO:4有至少d%序列相同性的序列中至少w个连续氨 基酸的片段组成；

e)包含第五氨基酸序列的第五多肽，其中所述第五氨基酸序列包含的 氨基酸序列(i)与SEQ ID NO:5有至少e%序列相同性，和/或(ii)由SEQ ID NO:5或与SEQ ID NO:5有至少e%序列相同性的序列中至少x个连续氨 基酸的片段组成；和/或

f)包含第六氨基酸序列的第六多肽，其中所述第六氨基酸序列包含的 氨基酸序列(i)与SEQ ID NO:6有至少f％序列相同性，和/或(ii)由SEQ ID NO:6或与SEQ ID NO:6有至少f％序列相同性的序列中至少y个连续氨 基酸的片段组成；和/或

g)包含第六氨基酸序列的第七多肽，其中所述第六氨基酸序列包含的 氨基酸序列(i)与SEQ ID NO:7有至少g%序列相同性，和/或(ii)由SEQ ID NO:6或与SEQ ID NO:7有至少g%序列相同性的序列中至少z个连续氨 基酸的片段组成。

所述细胞可以表达所述7个氨基酸序列中的2、3、4、5、6或全部7 个。

第一、第二、第三、第四、第五、第六和第七氨基酸序列

a值是至少75，例如80、85、90、92、94、95、96、97、98、99或更 大。b值是至少75，例如80、85、90、92、94、95、96、97、98、99或更 大。c值是至少75，例如80、85、90、92、94、95、96、97、98、99或更 大。d值是至少75，例如80、85、90、92、94、95、96、97、98、99或更 大。e值是至少75，例如80、85、90、92、94、95、96、97、98、99或更 大。f值是至少75，例如80、85、90、92、94、95、96、97、98、99或更 大。g值是至少75，例如80、85、90、92、94、95、96、97、98、99或更 大。a、b、c、d、e、f和g值可以相同或不同。在一些实施方式中，a、b、 c、d、e和f是相同的。通常a、b、c、d、e和f至少是90，例如至少95。

t值至少为7，例如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、 20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、 70、80、90、100、120、140、160、180、200、225、250。u值至少为7， 例如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、 24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、 120、140、160、180、200、225、250。v值至少为7，例如8、9、10、11、 12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、 28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、 180、200、225、250。w值至少为7，例如8、9、10、11、12、13、14、 15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、 35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、225、 250。x值至少为7，例如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、 19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、 60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、225、250。y值至少为 7，例如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、 23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、 100、120、140、160、180、200、225、250。z值至少为7，例如8、9、10、 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、 27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、 180、200、225、250。t、u、v、w、x、y和z值可以相同或不同。在一些 实施方式中，t、u、v、w、x、y和z是相同的。

片段优选包含来自各SEQ ID NO:序列的表位。其他有用片段缺少各 SEQ ID NO:C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10、15、20、25或更多个)和/或SEQ ID NO:N末端的一个或多个氨基酸(如 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)，而保留其至少 一个表位。N-末端截短20-25个氨基酸是方便的，例如除去任意SEQ ID NO:1-7中构成前导肽的氨基酸1-29，和/或除去任意SEQ ID NO:1-7中构成 LPXTG锚的C末端35个氨基酸。

所述GBS59蛋白在其前导肽末端和其LPXTG锚起始处之间，能分成 4个结构域（D1-D4）。这4个结合域如下面SEQ ID NO:1-7，并且对应 于这些残基的更多GBS59序列中的位置能通过比对容易鉴定：

基于保护研究，GBS59的可用片段可以保持来自至少结构域D3的表 位。因此，用于本发明免疫原性组合物和多肽的第一、第二、第三、第四、 第五、第六或第七氨基酸序列可以由包含如上面所鉴定结构域D3的SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6或7的片段组成。

除了结构域D3的表位外，GBS59的片段可以保留结构域D4、D2和/ 或D1。因此，用于本发明免疫原性组合物和多肽的第一、第二、第三、第 四、第五、第六或第七氨基酸序列可以由SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6 或7的片段组成，所述序列片段包含如上面鉴定的i)结构域D2和D3；ii) 结构域D3和D4；iii)结构域D1、D2和D3；或iv)结构域D2、D3和D4。

保留免疫原性所需表位的这些结构域的亚片段可以代替所述完整结构 域使用。因此，用于本发明免疫原性组合物和多肽的第一、第二、第三、 第四、第五、第六或第七氨基酸序列可以由SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6 或7的片段组成，所述序列片段包含保留免疫原性所需表位的结构域D3 的亚片段（并且可选结构域D1、D3和/或D4）。下面鉴定了用于本发明免 疫原性组合物和多肽的所述第一、第二、第三、第四、第五、第六或第七 氨基酸序列中出现的结构域D3和D4的亚片段的示例。下面鉴定的结构域 D3的亚片段(SEQ ID NO:36、38、40、42、44、46和48)是表面暴露的片 段。在这些表面暴露的片段中的更小表位能由技术人员容易鉴定，并且用 于本发明的组合物。例如，发现两个单克隆抗体(17C4/A3和4H11/B7，SEQ ID NO:262-269)结合包含来自515进化支(SEQ ID NO:38，SEQ ID NO:2 的片段)的D3亚片段内氨基酸411-436(SEQ ID NO:270)的表位。下面鉴定 的结构域D4的亚片段包含在结构域D4的N末端处存在但不是所述D4结 构域剩余部分的两个螺旋（本文中称为D4H）。预测这些螺旋是表面暴露。

SEQ ID NO:1的合适片段是SEQ ID NO:50-53。

SEQ ID NO:2的合适片段是SEQ ID NO:54-57。

SEQ ID NO:3的合适片段是SEQ ID NO:58-61。

SEQ ID NO:4的合适片段是SEQ ID NO:62-65。

SEQ ID NO:5的合适片段是SEQ ID NO:66-69。

SEQ ID NO:6的合适片段是SEQ ID NO:70-73。

SEQ ID NO:7的合适片段是SEQ ID NO:74-77。

这些片段包含下述结构域D2、D3和D4(或D4H)的组合。

在一些示例中，可以使用甚至更小的片段。例如，本发明的第三氨基酸序 列可以由包含SEQ ID NO:78(SEQ ID NO:3的氨基酸411-436)的SEQ ID NO:3 的片段组成。

当使用片段时，来自SEQ ID NO:1的至少t个连续氨基酸的片段也不应出 现在SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6 以及SEQ ID NO:7中。类似地，来自SEQ ID NO:2的至少u个连续氨基酸的 片段也不应出现在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、 SEQ ID NO:6以及SEQ ID NO:7中。类似地，来自SEQ ID NO:3的至少v个连 续氨基酸的片段也不应出现在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、 SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6以及SEQ ID NO:7中。类似地，来自SEQ ID NO:4 的至少w个连续氨基酸的片段也不应出现在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、 SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6以及SEQ ID NO:7中。类似地， 来自SEQ ID NO:5的至少x个连续氨基酸的片段也不应出现在SEQ ID NO:1、 SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6以及SEQ ID NO:7 中。类似地，来自SEQ ID NO:6的至少y个连续氨基酸的片段也不应出现在 SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5以 及SEQ ID NO:7中。类似地，来自SEQ ID NO:7的至少z个连续氨基酸的片段 也不应出现在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、 SEQ ID NO:5以及SEQ ID NO:6中。在一些实施方式中，当来自SEQ ID NO:1-7 之一的片段针对其他6个SEQ ID NO排列成连续序列时，该片段和其他6个 SEQ ID NO之间的相同性少于75%，例如少于60%、少于50%、少于40%、 少于30%。

包含第一氨基酸序列的多肽在给予对象时，能引起包含抗体的抗体反应， 该抗体与具有氨基酸序列SEQ ID NO:1(菌株2603)的野生型GBS蛋白结合。在 一些实施方式中，这些抗体不结合具有氨基酸序列SEQ ID NO:2的野生型GBS 蛋白、具有氨基酸序列SEQ ID NO:3的野生型GBS蛋白、具有氨基酸序列SEQ ID NO:4的野生型GBS蛋白、具有氨基酸序列SEQ ID NO:5的野生型GBS 蛋白、具有氨基酸序列SEQ ID NO:6的野生型GBS蛋白或具有氨基酸序列 SEQ ID NO:7的野生型GBS蛋白。

包含第二氨基酸序列的多肽在给予对象时，能引起包含抗体的抗体反应， 该抗体与具有氨基酸序列SEQ ID NO:2(菌株515)的野生型GBS蛋白结合。在 一些实施方式中，这些抗体不结合具有氨基酸序列SEQ ID NO:1的野生型GBS 蛋白、具有氨基酸序列SEQ ID NO:3的野生型GBS蛋白、具有氨基酸序列SEQ ID NO:4的野生型GBS蛋白、具有氨基酸序列SEQ ID NO:5的野生型GBS 蛋白、具有氨基酸序列SEQ ID NO:6的野生型GBS蛋白或具有有氨基酸序列 SEQ ID NO:7的野生型GBS蛋白。

包含第三氨基酸序列的多肽在给予对象时，能引起包含抗体的抗体反应， 该抗体与具有氨基酸序列SEQ ID NO:3(菌株cjb111)的野生型GBS蛋白结合。 在一些实施方式中，这些抗体不结合具有氨基酸序列SEQ ID NO:1的野生型 GBS蛋白、具有氨基酸序列SEQ ID NO:2的野生型GBS蛋白、具有氨基酸序 列SEQ ID NO:4的野生型GBS蛋白、具有氨基酸序列SEQ ID NO:5的野生型 GBS蛋白、具有氨基酸序列SEQ ID NO:6的野生型GBS蛋白或具有氨基酸序 列SEQ ID NO:7的野生型GBS蛋白。

包含第四氨基酸序列的多肽在给予对象时，能引起包含抗体的抗体反应， 该抗体与具有氨基酸序列SEQ ID NO:4(菌株h36b)的野生型GBS蛋白结合。在 一些实施方式中，这些抗体不结合具有氨基酸序列SEQ ID NO:1的野生型GBS 蛋白、具有氨基酸序列SEQ ID NO:2的野生型GBS蛋白、具有氨基酸序列SEQ ID NO:3的野生型GBS蛋白、具有氨基酸序列SEQ ID NO:5的野生型GBS 蛋白、具有氨基酸序列SEQ ID NO:6的野生型GBS蛋白或具有氨基酸序列 SEQ ID NO:7的野生型GBS蛋白。

包含第五氨基酸序列的多肽在给予对象时，能引起包含抗体的抗体反应， 该抗体与具有氨基酸序列SEQ ID NO:5(菌株CJB110)的野生型GBS蛋白结合。 在一些实施方式中，这些抗体不结合具有氨基酸序列SEQ ID NO:1的野生型 GBS蛋白、具有氨基酸序列SEQ ID NO:2的野生型GBS蛋白、具有氨基酸序 列SEQ ID NO:3的野生型GBS蛋白、具有氨基酸序列SEQ ID NO:4的野生型 GBS蛋白、具有氨基酸序列SEQ ID NO:6的野生型GBS蛋白或具有氨基酸序 列SEQ ID NO:7的野生型GBS蛋白。

包含第六氨基酸序列的多肽在给予对象时，能引起包含抗体的抗体反应， 该抗体与具有氨基酸序列SEQ ID NO:6(菌株DK21)的野生型GBS蛋白结合。 在一些实施方式中，这些抗体不结合具有氨基酸序列SEQ ID NO:1的野生型 GBS蛋白、具有氨基酸序列SEQ ID NO:2的野生型GBS蛋白、具有氨基酸序 列SEQ ID NO:3的野生型GBS蛋白、具有氨基酸序列SEQ ID NO:4的野生型 GBS蛋白、具有氨基酸序列SEQ ID NO:5的野生型GBS蛋白或具有氨基酸序 列SEQ ID NO:7的野生型GBS蛋白。

包含第七氨基酸序列的多肽在给予对象时，能引起包含抗体的抗体反应， 该抗体与具有氨基酸序列SEQ ID NO:7(菌株NEM316)的野生型GBS蛋白结 合。在一些实施方式中，这些抗体不结合具有氨基酸序列SEQ ID NO:1的野 生型GBS蛋白、具有氨基酸序列SEQ ID NO:2的野生型GBS蛋白、具有氨 基酸序列SEQ ID NO:3的野生型GBS蛋白、具有氨基酸序列SEQ ID NO:4 的野生型GBS蛋白、具有氨基酸序列SEQ ID NO:5的野生型GBS蛋白或具 有氨基酸序列SEQ ID NO:6的野生型GBS蛋白。

虽然第一、第二、第三、第四、第五、第六和第七氨基酸序列可能共有一 些序列，但总体上它们具有不同的氨基酸序列。

与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6或7或其片段相比，本发明使用的氨基 酸序列可包含一个或多个(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等)保守氨基酸 取代，即用另一具有相关侧链的氨基酸取代一个氨基酸。遗传编码的氨基酸通 常分为四类：(1)酸性，即天冬氨酸、谷氨酸；(2)碱性，即赖氨酸、精氨酸、 组氨酸；(3)非极性，即丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨 酸、甲硫氨酸、色氨酸；和(4)极性不带电，即甘氨酸、天冬酰胺、谷胺酰胺、 胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。有时将苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸一起分 类为芳族氨基酸。通常，这些家族中的单个氨基酸的取代不会对生物活性产生 重要影响。相对于参比序列，该多肽也可包含一个或多个(如1、2、3、4、5、 6、7、8、9、10个等)单一氨基酸缺失。相对于参比序列，该多肽也可包含一 个或多个(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个等)插入(如1、2、3、4或5 个)。

特别地，本发明的氨基酸序列可以包含涉及GBS59内异肽键形成的取代 氨基酸残基，由下表鉴定。

实施例中的数据显示这些残基破坏异肽键形成的突变不会不利地影响所 述多肽的免疫原性。因此，所述多肽可以包含在上表引用的赖氨酸残基或天 冬酰胺残基处的一个或多个取代。在一些实施方式中，所述赖氨酸残基可以 由丙氨酸残基取代。

本发明所用多肽可包含某一氨基酸序列，所述序列：

(a)与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6或7相同(即100%相同性)，或与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6或7相同；

(b)与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6或7共有序列相同性，或与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6或7的片段共有相同性；

(c)与(a)或(b)的序列相比，含有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个(或 更多个)单氨基酸改变(缺失、插入、取代)，这些改变可以位于不同位置或连续 出现；和

(d)用逐对比对算法与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6或7比对时，每个 从N-末端到C-末端的x个氨基酸的各移动窗口(从而就延伸至p个氨基酸的比 对而言，p>x时，存在p-x+1个所述窗口)具有至少x·y个相同的比对氨基酸， 其中：x 选自20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200； y选自0.50、0.60、0.70、0.75、0.80、0.85、0.90、0.91、0.92、0.93、0.94、0.95、 0.96、0.97、0.98、0.99；并且如果x·y不是整数，则四舍五入成最接近的整数。 优选的逐对比对算法是Needleman-Wunsch全局比对算法[3]，使用默认参数(如 缺口开放罚分=10.0，缺口延伸罚分=0.5，使用EBLOSUM62积分矩阵)。用 EMBOSS软件包中的needle工具能方便地实施这种算法[4]。

在(c)组内，缺失或取代可发生在N末端和/或C末端，或者可以出现在两 个末端之间。因此，截短是缺失的一个例子。截短可包括在N末端和/或C末 端多达40个(或更多个)氨基酸的缺失。

杂交多肽

用于本发明的不同的GBS59进化支不必定显示为单独多肽，但是能替代 地表述为单个多肽链(‘杂交’多肽或‘嵌合体’)。杂交多肽提供以下两个主要优 点：首先，本身不稳定或者表达较差的多肽可以通过加入能够克服该问题的合 适杂交伴侣而得到改善；其次，商业生产得以简化，因为只需利用一次表达和 纯化以生产抗原性方面都有用的两种多肽。

杂交多肽能包含仅来自GBS59抗原的序列，但是在其他实施方式中能包 含非GBS59抗原(通常来自GBS的非GBS59抗原)，例如其他菌毛亚基。如果 出现非GBS59抗原，这些可以是任何2、3、4、5、6或7个GBS59序列的N 末端，是任何2、3、4、5、6或7个GBS59序列的C末端，或可以是在包含 2、3、4、5、6或7个GBS59序列的杂交多肽中两个GBS59序列之间。

不同的杂交多肽可以在单一制剂中混合在一起。杂交体可以与非杂交 GBS59抗原或其他非GBS59抗原联合。

杂交多肽可以式NH₂-A-{-X-L-}_n-B-COOH表示。

如果-X-部分具有野生型形式的前导肽序列，那么其可在杂交蛋白中包含 或者略去。在一些实施方式中，前导肽可缺失，除了位于杂合蛋白N-末端的-X- 部分的前导肽，即保留X₁的前导肽，但略去X₂…X_n的前导肽。这相当于删 除所有前导肽并使用X₁的前导肽作为-A-部分。

就{-X-L-}的各n示例而言，接头氨基酸序列-L-可存在或不存在。例如， 当n=2时，杂交体可以是NH₂-X₁-L₁-X₂-L₂-COOH、NH₂-X₁-X₂-COOH、 NH₂-X₁-L₁-X₂-COOH、NH₂-X₁-X₂-L₂-COOH等。接头氨基酸序列-L-一般较短(如 20个或更少的氨基酸，即20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、 8、7、6、5、4、3、2、1)。例子包括有利于克隆的短肽序列，聚甘氨酸接头 （即包含Gly_n，其中n 2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多），组氨酸标签 （即His_n，其中n=3、4、5、6、7、8、9、10或更多，例如SEQ ID NO:79）。 本领域技术人员显然了解其它合适的接头氨基酸序列。有用的接头是GSGS (SEQ ID NO：80)、GSGGGG(SEQ ID NO:81)或GSGSGGGG(SEQ ID NO:82)， Gly-Ser二肽由BamHI限制位点形成，因而有助于克隆和操作，(Gly)₄四肽是 常用的多聚甘氨酸接头。其他合适接头尤其用作最后一个L_n的接头是Leu-Glu 二肽或Gly-Ser。接头通常含至少一种甘氨酸残基以促进结构柔性，如-L-部分 可含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多甘氨酸残基。所述甘氨酸可排列 为在Gly-Gly二肽序列或更长的寡Gly序列（即Gly_n，其中n=2、3、4、5、 6、7、8、9、10或更多）中包括至少2个连续甘氨酸。

-A-是任选的N末端氨基酸序列。其一般较短(如40个或更少的氨基酸， 即40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、 23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、 5、4、3、2、1个)。例子包括指导蛋白运输的前导序列，或有利于克隆或纯化 的短肽序列(如组氨酸标签，即His_n，其中n=3、4、5、6、7、8、9、10或更 多)。其它合适的N末端氨基酸序列对本领域技术人员显而易见。如果X₁缺少 其自身的N-末端甲硫氨酸，-A-优选是提供N-末端甲硫氨酸的寡肽(例如，具 有1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸)，如Met-Ala-Ser或单个Met残基。在 新生多肽中，-A-部分可提供多肽的N末端甲硫氨酸（细菌中为甲酰甲硫氨酸， fMet）。然而，可从新生-A-部分的N末端切割一种或多种氨基酸，从而本发 明的成熟多肽中所述-A-部分不必需包括N末端甲硫氨酸。

-B-是任选的C末端氨基酸序列。其一般较短(如40个或更少的氨基酸， 即39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、 22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、 3、2、1个)。例子包括指导蛋白质运输的序列，有利于克隆或纯化的短肽序列 (如包含组氨酸标签，即His_n，其中n 3、4、5、6、7、8、9、10或更多，如 SEQ ID NO:79)，或能提高蛋白质稳定性的序列。其他合适的C末端氨基酸序 列对本领域技术人员显而易见，如谷胱甘肽S转移酶、硫氧还蛋白、金黄色葡 萄球菌（S.aureus）蛋白A的14kDa片段、生物素化肽、麦芽糖结合蛋白、肠 激酶标签等。

-A-、-B-和-L-序列优选不包括与人多肽序列共有10个或更多连续氨基酸 的序列。

在一些实施方式中，-L-部分包含非GBS59抗原。在一些实施方式中，-A- 部分包含非GBS59抗原，且在一些实施方式中，-B-部分包含非GBS59抗原。

本发明也提供编码本发明杂合多肽的核酸。

对多种X和L部分而言，可用的组合包括但不限于：

*数字指示SEQ ID NO:

因此，本发明杂交体的示例包括包含选自下组的氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO:83;SEQ ID NO:84;SEQ ID NO:85;SEQ ID NO:86;或SEQ ID NO: 87。

本发明提供包含与SEQ ID NO:83、84、85、86或87中任一个有至少i％ 序列相同性的氨基酸序列的多肽。i值可以选自50、60、70、80、85、90、95、 96、97、98、99或更大。

在一些实施方式中，所述多肽包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:83; SEQ ID NO:84;SEQ ID NO:85;SEQ ID NO:86;或SEQ ID NO:87，或与SEQ ID NO:83;SEQ ID NO:84;SEQ ID NO:85;SEQ ID NO:86;或SEQ ID NO:87 中任一个有至少i％序列相同性，该多肽可以包含单个N末端甲硫氨酸残基（例 如A=Met）。

多肽

可以多种方式制备本发明所用多肽，例如化学合成(全部或部分)，用蛋白 酶消化较长多肽，由RNA翻译，由细胞培养物纯化(如通过重组表达)，由生物 体本身制备(如细菌培养后，或直接来自患者制)等。产生长度<40个氨基酸的 肽的优选方法包括体外化学合成[5,6]。尤其优选固相肽合成，例如基于tBoc 或Fmoc[7]化学的方法。也可部分或完全利用酶促合成[8]。作为化学合成的替 代方式，可利用生物合成，例如可通过翻译产生多肽。这一过程可以在体外或 体内进行。生物学方法通常仅限于产生基于L-氨基酸的多肽，但可通过操作翻 译机制(如氨基酰基tRNA分子的翻译机制)引入D-氨基酸(或其它非天然氨基 酸，如碘化酪氨酸或甲基苯丙氨酸、叠氮基高丙氨酸等)[9]。然而，包含D氨 基酸时，优选使用化学合成。多肽的C末端和/或N末端上可能有共价修饰。

多肽可采取各种形式(如天然多肽、融合多肽、糖基化多肽、非糖基化多 肽、脂化多肽、非脂化多肽、磷酸化多肽、非磷酸化多肽、肉豆蔻酰化多肽、 非肉豆蔻酰化多肽、单体多肽、多聚体多肽、颗粒多肽、变性多肽等)。

多肽优选以纯化或基本纯化的形式提供，即基本不含其它多肽(如不含天 然产生的多肽)、特别是不含其它肺炎球菌或宿主细胞多肽，多肽的纯度通常 为至少约50重量%，通常至少约90%，即组合物中少于约50%，更优选少于 约10%(如5%或以下)由其它表达多肽构成。

多肽可与固体支持物结合。多肽可包含可检测标记(如放射性或荧光标记， 或生物素标记)。

术语“多肽”指任何长度的氨基酸聚合物。所述聚合物可以是线形或支链 聚合物，可以包含经修饰的氨基酸，可以被非氨基酸打断。该术语也包括天然 修饰或通过人工介入修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、 乙酰化、磷酸化或任何其它操作或修饰，如与标记组分偶联。该定义也包括， 例如，含有一个或多个氨基酸类似物（包括例如，非天然氨基酸等），以及本 领域已知其它修饰的多肽。多肽可以以单链或结合链的形式产生。多肽可以是 天然或非天然糖基化的(即该多肽的糖基化模式不同于相应天然产生多肽的糖 基化模式)。

本发明提供产生本发明多肽的方法，该方法包括在诱导多肽表达的条件下 培养本发明宿主细胞。虽然可以在链球菌(Streptococcus)中表达多肽，但本发明 通常使用异源宿主进行表达。异源宿主可以是原核(例如细菌)或真核生物。所 述宿主通常可以是大肠杆菌(E.coli)，其他合适的宿主包括枯草杆菌(Bacillus subtilis)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、伤寒沙门菌(Salmonella typhi)、鼠伤寒沙 门菌(Salmonella typhimurium)、乳酰胺奈瑟菌(Neisseria lactamica)、灰色奈瑟菌 (Neisseria cinerea)、分枝杆菌(Mycobacteria)(例如结核分支杆菌(M. tuberculosis))、酵母等。

本发明还提供产生本发明多肽的方法，其中所述多肽部分或完全用化学方 式合成。

本发明还提供含有两种或多种本发明多肽的组合物。

核酸

本发明还提供包含编码本发明杂交多肽的核苷酸序列的核酸。例如，本发 明提供包含核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列编码包含选自下组的氨基酸序 列的杂交多肽：SEQ ID NO:83;SEQ ID NO:84;SEQ ID NO:85;SEQ ID NO:86; 或SEQ ID NO:87。本发明因此提供包含选自下组的核苷酸序列的核酸：SEQ ID NO:88(编码SEQ ID NO:83的多肽),SEQ ID NO:89(编码SEQ ID NO:84的多 肽);SEQ ID NO:90(编码SEQ ID NO:85的多肽);SEQ ID NO:91(编码SEQ ID NO:86的多肽);或SEQ ID NO:92(编码SEQ ID NO:87的多肽)。

本发明也提供所含核苷酸序列与这些核苷酸序列有序列相同性的核酸。这 类核酸包括使用替代密码子编码相同氨基酸的核酸。具体地，核酸可包括为了 在特定微生物中表达而优化的替代密码子。本发明提供包含核苷酸序列的核 酸，所述核苷酸序列编码包含选自下组的氨基酸序列的杂交多肽：SEQ ID NO: 83;SEQ ID NO:84;SEQ ID NO:85;SEQ ID NO:86;或SEQ ID NO:87（已经就 在大肠杆菌（E.coli）中表达而优化）。本发明因此提供包含选自下组的核苷 酸序列的核酸：SEQ ID NO:93(编码SEQ ID NO:83多肽的大肠杆菌优化序列), SEQ ID NO:94(编码SEQ ID NO:84多肽的大肠杆菌优化序列);SEQ ID NO:95 (编码SEQ ID NO:85多肽的大肠杆菌优化序列);SEQ ID NO:96(编码SEQ ID NO:86多肽的大肠杆菌优化序列);或SEQ ID NO:97(编码SEQ ID NO:87多肽 的大肠杆菌优化序列)。

本发明也提供可与这些核酸杂交的核酸。可以在不同“严谨性”的条件下 进行杂交反应。增加杂交反应严谨性的条件在本领域众所周知且已发表。相关 条件的例子包括(按严谨性提高的顺序)：孵育温度25°C、37°C、50°C、55°C 和68°C；缓冲液浓度10x SSC、6x SSC、1x SSC、0.1x SSC (其中SSC是0.15 M NaCl和15mM柠檬酸盐缓冲液)和使用其它缓冲液体系的等同条件；甲酰胺 浓度0%、25%、50%和75%；孵育时间5分钟至24小时；1、2或更多个洗涤 步骤；洗涤孵育时间1、2或15分钟；以及洗涤溶液6x SSC、1x SSC、0.1x SSC或去离子水。杂交技术和其优化方法为本领域熟知（例如，参见参考文献 10和223等）。

本发明包括含有这些序列的互补序列的核酸(例如，用于反义或检测，或 用作引物)。

本发明所述核酸可采取各种形式(如单链、双链、载体、引物、探针、标 记等)。本发明核酸可以是环状或分枝状核酸，但通常是线性核酸。除非另有 说明或要求，利用核酸的本发明任何实施方式可采用双链形式和构成该双链形 式的两条互补单链形式中的每条链。引物、探针以及反义核酸通常是单链。

本发明核酸优选以纯化或基本纯化的形式提供，即基本不含其它核酸(如 不含天然产生的核酸)，特别是不含其它GBS或宿主细胞核酸，通常其纯度至 少为约50重量%，通常至少为约90%。本发明核酸优选为GBS核酸。

可以多种方式制备本发明的核酸，例如，完全或部分化学合成（例如DNA 的亚磷酰胺合成）、利用核酸酶（例如限制性酶）消化较长核酸、连接较短核 酸或核苷酸（例如使用连接酶或聚合酶）、由基因组或cDNA文库制备等。

本发明核酸可连接于固体支持物(如珠、平板、滤器、膜、玻片、微阵列 支持物、树脂等)。可用例如放射性或荧光标记、或生物素标记来标记本发明 核酸。这在将核酸用于检测技术时（例如核酸是引物或作为探针时）特别有用。

术语“核酸”通常包括任何长度的核苷酸聚合形式，其包含脱氧核糖核苷 酸、核糖核苷酸和/或其类似物。它包括DNA、RNA、DNA/RNA杂交体。它 也包括DNA或RNA类似物，如含有经修饰主链(如肽核酸(PNA)或硫代磷酸酯) 或经修饰碱基的类似物。因此，本发明包括mRNA、tRNA、rRNA、核酶、DNA、 cDNA、重组核酸、分枝核酸、质粒、载体、探针、引物等。本发明核酸采取 RNA形式时，它可能具有或不具有5'帽。

本发明核酸可以是载体的一部分，即设计用于转导/转染一种或多种细胞 类型的核酸构建物的一部分。载体可以是，例如，设计用于分离、增殖和复制 所插入核苷酸的“克隆载体”，设计用于在宿主细胞中表达核苷酸序列的“表达 载体”，设计用于产生重组病毒或病毒样颗粒的“病毒载体”，或具有一种以上 载体类型的属性的“穿梭载体”。优选的载体是质粒。“宿主细胞”包括单个细胞 或细胞培养物，其可能是或已经是外源核酸的受体。宿主细胞包括单个宿主细 胞的后代，由于天然、偶然或有意的突变和/或改变，这些后代与原始亲本细胞 不必需完全相同(形态或总DNA互补方面)。宿主细胞包括用本发明核酸体内 或体外转染或感染的细胞。

应理解，核酸是DNA时，RNA序列中的“U”被DNA中的“T”所替代。相 似地，应理解核酸是RNA时，DNA中的“T”被RNA序列中的“U”所替代。

涉及核酸使用的术语“互补”或“互补的”指沃森克里克碱基配对。因此， C的互补物是G，G的互补物是C，A的互补物是T(或U)，T(或U)的互补物 是A。也能使用诸如I（嘌呤肌苷）等碱基，例如与嘧啶(C或T)互补。

本发明的核酸可用于例如：体外或体内产生多肽；作为检测生物样品中核 酸的杂交探针；产生额外的核酸拷贝；产生核酶或反义寡核苷酸；作为单链 DNA引物或探针；或作为形成三链的寡核苷酸。

本发明提供产生本发明核酸的方法，其中所述核酸部分或完全用化学方式 合成。

本发明提供包含本发明核苷酸序列的载体(如克隆或表达载体)和用这种 载体转化的宿主细胞。

免疫原性组合物

本发明的混合物和杂交多肽可用作免疫原性组合物的活化组分。该免疫原 性组合物可用作疫苗。这些疫苗可以是预防性(即预防感染)或治疗性(即治疗感 染)疫苗，但一般是预防性疫苗。

因此，组合物可以是药学上可接受的。它们通常还包含抗原以外的组分， 例如它们一般包含一种或多种药物载体和/或赋形剂。对这类组分的充分讨论参 见参考文献[218]。

组合物通常以水性形式给予哺乳动物。然而在给药前，该组合物可以是非 水性形式。例如，虽然一些疫苗制备成水性形式然后以水性形式填装、分销和 给药，但其他疫苗在制备过程中冻干，并在使用时重建成水性形式。因此，本 发明组合物可被干燥，例如冻干制剂。

该组合物可含有防腐剂，如硫柳汞或2-苯氧乙醇。然而，疫苗优选应基本 不含(即小于5μg/ml)含汞物质，如不含硫柳汞。更优选无汞的疫苗。特别优选 不含防腐剂的疫苗。

为了控制张度，优选包含生理盐如钠盐。优选氯化钠(NaCl)，其可以1-20 mg/ml存在，例如约10±2mg/ml NaCl。可以存在的其它盐包括氯化钾、磷酸二 氢钾、无水磷酸氢二钠、氯化镁、氯化钙等。

组合物的渗透压通常为200mOsm/kg-400mOsm/kg，优选为240-360 mOsm/kg，更优选为290-310mOsm/kg。

组合物可含有一种或多种缓冲液。常用缓冲液包括：磷酸盐缓冲液；Tris 缓冲液；硼酸盐缓冲液；琥珀酸盐缓冲液；组氨酸缓冲液(特定有氢氧化铝佐 剂)；或柠檬酸盐缓冲液。包含的缓冲液一般是5-20mM。

组合物的pH通常为5.0-8.1，更常为6.0-8.0，例如6.5-7.5，或者7.0-7.8。

该组合物优选无菌。该组合物优选无热原，如每剂量含有<1EU(内毒素单 位，标准量度)，优选每剂量<0.1EU。该组合物优选不含谷蛋白。

所述组合物可含有用于一次免疫的物质，或者可含有用于多次免疫的物质 (即‘多剂量’药盒)。多剂量配置优选含有防腐剂。作为多剂量组合物中包含 防腐剂的替代方案(或补充方案)，所述组合物可包含在装有无菌接头以取出物 质的容器中。

人疫苗的给药剂量体积一般为约0.5ml，但可将一半剂量(即约0.25ml)给 予儿童。

本发明免疫原性组合物也可包含一种或多种免疫调节剂。优选地，一种或 多种免疫调节剂包括一种或多种佐剂。佐剂可包括TH1佐剂和/或TH2佐剂， 详述见下。

可用于本发明组合物的佐剂包括但不限于：

A.含有矿物质的组合物

适用作本发明佐剂的含有矿物质的组合物包括矿物盐，例如铝盐和钙盐。 本发明包括矿物盐，如氢氧化物（例如羟基氧化物）、磷酸盐（例如，羟基磷 酸盐、正磷酸盐）、硫酸盐等[参见，例如参考文献11的第8章和第9章]，或 不同矿物化合物的混合物，所述化合物可采取任何合适形式(例如凝胶、晶体、 无定形等)，优选吸附。也可将含有矿物质的组合物制成金属盐的颗粒。

称为"氢氧化铝"的佐剂一般是羟基氧化铝盐(通常至少部分为晶体)。可采 用红外(IR)光谱将式AlO(OH)表示的羟基氧化铝与其它铝化合物如氢氧化铝 Al(OH)₃相区分，具体区别是1070cm^-1处存在吸收条带和3090-3100cm^-1处存在 强肩[参考文献11的第9章]。衍射带半高宽(WHH)反映了氢氧化铝佐剂的结晶 程度，结晶不佳的颗粒因晶体尺寸较小而显示更强的谱线增宽。表面积随WHH 的增加而增加，WHH值较大的佐剂显示吸附抗原的能力较强。氢氧化铝佐剂 通常呈纤维形态(例如，如透射电子显微图中所见)。氢氧化铝佐剂的pI通常约 11，即在生理pH下佐剂本身具有表面正电荷。据报道，pH 7.4时氢氧化铝佐 剂的吸附容量为1.8-2.6毫克蛋白质/毫克Al⁺⁺⁺。

称为"磷酸铝"的佐剂一般是羟基磷酸铝，也常常含有少量硫酸盐(即羟基 磷酸硫酸铝)。可通过沉淀获得这些佐剂，沉淀期间的反应条件和浓度影响磷 酸根取代所述盐中羟基的程度。羟基磷酸盐的PO₄/Al摩尔比通常为0.3-1.2。 羟基磷酸盐因存在羟基而有别于严格的AlPO₄。例如，3164cm^-1的IR光谱带(例 如，当加热至200℃时)表明存在结构性羟基[参考文献11的第9章]。

磷酸铝佐剂的PO₄/Al³⁺摩尔比通常为0.3-1.2，优选为0.8-1.2，更优选为 0.95±0.1。磷酸铝通常是无定形的，尤其是羟基磷酸盐。典型的佐剂是PO₄/Al 摩尔比为0.84-0.92的无定形羟基磷酸铝，包含0.6mg Al³⁺/ml。磷酸铝通常是 颗粒(如在透射电子显微图上观察到的板状形态)。抗原吸附后颗粒直径一般是 0.5-20μm(如约5-10μm)。据报道，pH 7.4时磷酸铝佐剂的吸附容量为0.7-1.5 毫克蛋白质/毫克Al⁺⁺⁺。

磷酸铝的零电点(PZC)与磷酸根取代羟基的程度逆相关，且这种取代程度 可根据用于通过沉淀制备盐的反应条件和反应物浓度而变化。也通过改变溶液 中游离磷酸根离子的浓度(更多磷酸根=更酸性PZC)或加入缓冲剂如组氨酸缓 冲剂(使PZC碱性更强)来改变PZC。本发明所用的磷酸铝的PZC通常为4.0-7.0， 更优选为5.0-6.5，例如约为5.7。

用于制备本发明组合物的铝盐悬浮液可以但不必定含有缓冲液(如磷酸盐 或组氨酸或Tris缓冲液)。该悬浮液优选无菌且无热原。悬浮液可含有游离的 水性磷酸根离子，如存在浓度为1.0-20mM，优选5-15mM，更优选约10mM。 该悬浮液也可含有氯化钠。

在一个实施方式中，佐剂组分包括氢氧化铝和磷酸铝的混合物。在这种情 况下，磷酸铝多于氢氧化铝，例如重量比为至少2:1，例如，≥5:1、≥6:1、≥7:1、 ≥8:1、≥9:1等。

给予患者的组合物中Al⁺⁺⁺的浓度优选小于10mg/ml，例如≤5mg/ml、≤4 mg/ml、≤3mg/ml、≤2mg/ml、≤1mg/ml等。优选范围是0.3-1mg/ml。优选最 大值<0.85mg/剂。

B.油乳剂

适用作本发明佐剂的油乳剂组合物包含鲨烯-水乳剂，如MF59[参考文献 11的第10章；也参见参考文献12](5%鲨烯、0.5%吐温80和0.5%司盘85， 用微流化床配制成亚微米颗粒)。也可以使用完全弗氏佐剂（CFA）和不完全弗 氏佐剂（IFA）。

已知各种合适的水包油乳剂，它们通常包括至少一种油和至少一种表面活 性剂，所述油和表面活性剂是可生物降解(可代谢)和生物相容的。乳剂中的油 滴直径通常小于5μm，乳剂宜包含具有亚微米直径的油滴，通过微流化床实现 这种小尺寸以提供稳定乳剂。优选尺寸小于220nm的液滴，因为其可进行过 滤灭菌。

本发明可使用诸如来自动物(如鱼)或植物来源的油。植物油的来源包括坚 果、种籽和谷物。最常见的花生油、大豆油、椰子油和橄榄油是坚果油的示例。 也可使用获自(例如)霍霍巴豆的霍霍巴油。种籽油包括红花油、棉花籽油、葵 花籽油、芝麻籽油等。在谷物油中，最常见的是玉米油，但也可以使用其它谷 类的油，如小麦、燕麦、黑麦、稻、画眉草、黑小麦等。可从坚果和种籽油开 始，通过水解、分离和酯化合适物质制备甘油和1,2-丙二醇的6-10碳脂肪酸酯， 其不是种籽油中天然产生。来自哺乳动物乳汁的脂肪和油类是可代谢的，因此 可以用于实施本发明。获得动物来源纯油所必需的分离、纯化、皂化和其它方 法的过程为本领域熟知。大多数鱼类含有容易回收的可代谢油。例如，鳕鱼肝 油、鲨鱼肝油和诸如鲸蜡的鲸油是可以用于本发明的几种鱼油的示例。通过生 化途径用5-碳异戊二烯单位合成许多支链油，其总称为萜类。鲨鱼肝油含有称 为鲨烯的支链不饱和萜类化合物，即2,6,10,15,19,23-六甲基-2,6,10,14,18,22- 十四碳六烯。其它优选油是生育酚（见下）。特别优选包含鲨烯的水包油乳液。 可以使用油的混合物。

表面活性剂可以按其‘HLB’(亲水/亲脂平衡)分类。本发明优选的表面活性 剂的HLB为至少10，优选至少15，更优选至少16。可以与本发明一起使用的 表面活性剂包括但不限于：聚氧乙烯去水山梨糖醇酯表面活性剂(通常称为吐 温)，特别是聚山梨酯20和聚山梨酯80；以商品名DOWFAX^TM出售的环氧乙 烷(EO)、环氧丙烷(PO)和/或环氧丁烷(BO)的共聚物，如直链EP/PO嵌段共聚 物；重复的乙氧基(氧-1,2-乙二基)数量不同的辛苯聚醇，特别感兴趣的是辛苯 聚醇9(曲通(Triton)X-100，或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)；(辛基苯氧基)聚乙 氧基乙醇(IGEPAL CA-630/NP-40)；磷脂如磷脂酰胆碱(卵磷脂)；衍生自十二烷 醇、十六烷醇、十八烷醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚(称为苄泽表面活性剂)，如 三乙二醇单月桂基醚(苄泽30)；以及去水山梨糖醇酯(总称为司盘)，如去水山 梨糖醇三油酸酯(司盘85)和去水山梨糖醇单月桂酸酯。乳液中包含的优选表面 活性剂是吐温80（聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯）、司盘85（脱水山梨糖 醇三油酸酯）、卵磷脂和曲通X100。如上所述，诸如吐温80等去污剂可提供 下文实施例所见的热稳定性。

可使用表面活性剂的混合物，如吐温80/司盘85混合物。聚氧乙烯去水山 梨糖醇酯如聚氧乙烯去水山梨糖醇单油酸酯(吐温80)和辛苯聚醇如叔辛基苯氧 基聚乙氧基乙醇(曲通X-100)的组合也适合。另一种有用的组合包含月桂醇聚 醚-9加聚氧乙烯去水山梨糖醇酯和/或辛苯聚醇。

优选的表面活性剂含量（重量%）为：聚氧乙烯去水山梨糖醇酯（如吐温 80）0.01-1%，特别是约0.1%；辛基-或壬基-苯氧基聚氧乙醇（如曲通X100或 曲通系列的其它去污剂）0.001-0.1%，特别是0.005-0.02%；聚氧乙烯醚（如月 桂醇聚醚9）0.1-20%，优选0.1-10%，特别是0.1-1%或约0.5%。

本发明所用的具体水包油乳液佐剂包括但不限于：

·鲨烯、吐温80(Tween 80)和司盘(Span)85的亚微米乳液。所述乳液的体 积组成可以是约5%鲨烯、约0.5%聚山梨酯80和约0.5%司盘85。以重量计， 这些比例为4.3%鲨烯、0.5%聚山梨酯80和0.48%司盘85。这种佐剂称为‘MF59’ [13-15]，参考文献16的第10章和参考文献17的第12章更详细地描述了该佐 剂。MF59乳液宜包含柠檬酸根离子，如10mM柠檬酸钠缓冲液。

·包含鲨烯、α生育酚和聚山梨酯80的乳液。这些乳液可含有2-10%鲨 烯、2-10%生育酚和0.3-3%吐温80，鲨烯:生育酚的重量比优选≤1(例如0.90)， 因为这能使乳液更稳定。鲨烯和吐温80存在的体积比可以约为5:2，或者重量 比约为11:5。可通过将吐温80溶解于PBS产生2%溶液，然后将90ml该溶液 与5g DL-α-生育酚和5ml鲨烯的混合物相混合，随后使该混合物微流体化来 制备一种这类乳液。得到的乳液可含有如平均直径为100-250nm，优选约180nm 的亚微米油滴。

·鲨烯、生育酚和曲通去污剂(如曲通X-100)的乳液。该乳液也可包含 3d-MPL(见下)。所述乳液可包含磷酸盐缓冲液。

·含有聚山梨酯(如聚山梨酯80)、曲通去污剂(如曲通X-100)和生育酚(如 α-生育酚琥珀酸盐)的乳液。该乳液可包含这三种组分，其质量比约为75:11:10 (如750μg/ml聚山梨酯80、110μg/ml曲通X-100和100μg/ml琥珀酸α-生育酚)， 这些浓度应包括抗原中这些组分的贡献。所述乳液还可包含鲨烯。该乳液也可 包含3d-MPL(见下)。所述水相可包含磷酸盐缓冲液。

·鲨烷、聚山梨酯80和泊洛沙姆401(“普流罗尼克^TML121”(″Pluronic^TML121″))的乳液。所述乳液可用pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水配制。该乳液是一种 有用的胞壁酰二肽递送载体，且已与含苏氨酰基-MDP的“SAF-1”佐剂[18] (0.05-1%Thr-MDP、5%鲨烯、2.5%普流罗尼克L121和0.2%聚山梨酸酯80)一 起使用。也可不与Thr-MDP一起使用，例如用“AF”佐剂[19](5%鲨烯、1.25% 普流罗尼克L121和0.2%聚山梨酸酯80)。优选微流体化。

·含有鲨烯、水溶剂、聚氧乙烯烷基醚亲水性非离子型表面活性剂(如聚 氧乙烯(12)十六十八醚)和疏水性非离子型表面活性剂(如去水山梨糖醇酯或二 缩甘露醇酯，如去水山梨糖醇单油酸酯或‘司盘80’)的乳液。该乳液优选为热可 逆的和/或其中至少90%油滴(以体积计)的尺寸小于200nm[20]。该乳液也可含 有以下一种或多种以下物质：糖醇；低温保护剂(例如，糖，如十二烷基麦芽 苷和/或蔗糖)；和/或烷基聚糖苷。这类乳液可冻干。

·含有0.5-50%油、0.1-10%磷脂和0.05-5%非离子型表面活性剂的乳液。 如参考文献21所述，优选的磷脂组分是磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰 丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、鞘磷脂和心磷脂。优选亚微米液 滴尺寸。

·不可代谢油(如轻质矿物油)和至少一种表面活性剂(如卵磷脂、吐温80 或司盘80)的亚微米水包油乳液。可包含添加剂，例如QuilA皂苷、胆固醇、 皂苷-亲脂偶联物(如通过葡糖醛酸的羧基将脂族胺加到脱酰基皂苷上而产生的 GPI-0100，如参考文献22所述)、二甲基双十八烷基溴化铵和/或N,N-双十八 烷基-N,N-双(2-羟乙基)丙二胺。

·包含矿物油、非离子亲脂性乙氧基化脂肪醇和非离子亲水性表面活性剂 (例如，乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液[23]。

·包含矿物油、非离子亲水性乙氧基化脂肪醇和非离子亲脂性表面活性剂 (例如，乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液[23]。

·皂苷(如QuilA或QS21)和固醇(如胆固醇)结合成螺旋胶束的乳液[24]。

通常在传递给病人时混合组合物中的抗原和佐剂。可以在生产时或在递送 时将该乳液与抗原临时混合。因此，在包装或出售的疫苗中该佐剂和抗原可分 开保存，使用时能配制成最终制剂。所述抗原通常是水性形式，从而最终通过 混合两种液体制备疫苗。所述两种液体的混合体积比可变(例如5:1-1:5)，但通 常约为1:1。

C.皂苷制剂[参考文献11的第22章]

皂苷制剂也可以用作本发明的佐剂。皂苷是在许多植物物种的树皮、叶、 茎干、根甚至花中发现的甾醇糖苷和三萜糖苷的异质群体。已广泛研究了作为 佐剂的得自皂皮树（Quillaia saponaria Molina）树皮的皂苷。皂苷也可市售获 自丽花菝葜（Smilax ornata）（墨西哥菝葜）、满天星（Gypsophillapaniculata） （婚纱花）和肥皂草（Saponaria officianalis）（皂根）。皂苷佐剂制剂包括纯 化制剂如QS21，以及脂质制剂如ISCOM。QS21以商标Stimulon^TM出售。

已采用HPLC和RP-HPLC纯化皂苷组合物。已鉴定了用这些技术纯化的 特定组分，包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B和QH-C。所述皂 苷优选QS21。制备QS21的方法公开于参考文献25。皂苷制剂也可包含甾醇， 如胆固醇[26]。

皂苷和胆固醇的组合可用于形成称为免疫刺激复合物（ISCOM）的独特 颗粒[参考文献11第23章]。ISCOM通常还包含磷脂，如磷脂酰乙醇胺或磷脂 酰胆碱。任何已知的皂苷均可用于ISCOM中。ISCOM优选包含QuilA、QHA 和QHC中的一种或多种。参考文献26-28中进一步描述了ISCOM。任选地， ISCOM可不含其它去污剂[29]。

开发基于皂苷的佐剂的综述可参见参考文献30和31。

D．病毒体和病毒样颗粒

病毒体和病毒样颗粒（VLP）也可以用作本发明的佐剂。这些结构通常包 含一种或多种任选与磷脂组合或一起配制的病毒蛋白质。其通常无病原性，不 能复制，且通常不含任何天然病毒基因组。所述病毒蛋白可重组生成或分离自 全病毒。这些适用于病毒体或VLP的病毒蛋白包括衍生自流感病毒（例如HA 或NA）、乙肝病毒（例如核心蛋白或衣壳蛋白）、戊肝病毒、麻疹病毒、辛 德比斯病毒、轮状病毒、口蹄疫病毒、逆转录病毒、诺沃克病毒、人乳头状瘤 病毒、HIV、RNA-噬菌体、Qβ-噬菌体（如外壳蛋白）、GA-噬菌体、fr-噬菌 体、AP205噬菌体和Ty（如反转录转座子Ty蛋白p1）的蛋白。参考文献32-37 进一步描述了VLP。例如参考文献38进一步描述了病毒体。

E.细菌或微生物衍生物

适用于本发明的佐剂包括细菌或微生物衍生物，如肠细菌脂多糖（LPS） 的无毒衍生物、脂质A衍生物、免疫刺激性寡核苷酸和ADP-核糖基化毒素及 其脱毒衍生物。

LPS的无毒衍生物包括单磷酰脂质A（MPL）和3-O-脱酰基MPL（3dMPL）。 3dMPL是3脱-O-酰基单磷酰脂质A与4、5或6条酰化链的混合物。3脱-O- 酰基单磷酰脂质A的优选“小颗粒”形式公开于参考文献39。3dMPL的这种“小 颗粒”小到足以通过0.22μm膜过滤除菌[39]。其它无毒LPS衍生物包括单磷 酰脂质A模拟物，如氨基烷基氨基葡萄糖苷磷酸盐衍生物，例如RC 529[40， 41]。

脂质A衍生物包括大肠杆菌的脂质A衍生物，如OM-174。例如参考文 献42和43中描述了OM-174。

适用作本发明佐剂的免疫刺激性寡核苷酸包括含CpG基序的核苷酸序列 （含有通过磷酸键与鸟苷连接的非甲基化胞嘧啶的二核苷酸序列）。含回文结 构或聚(dG)序列的双链RNA和寡核苷酸也显示具有免疫刺激性。

CpG可以包含核苷酸修饰/类似物，如硫代磷酸酯修饰，且可以是双链或 单链。参考文献44、45和46公开了可能的类似物取代，例如用2’-脱氧-7-脱 氮鸟苷取代鸟苷。参考文献47-52中进一步讨论了CpG寡核苷酸的佐剂作用。

CpG序列可针对TLR9，例如基序GTCGTT或TTCGTT[53]。CpG序列可 特异性诱导Th1免疫反应，如CpG-A ODN，或更特异地诱导B细胞反应，如 CpG-B ODN。参考文献54-56中讨论了CpG-A和CpG-B ODN。优选CpG为 CpG-A ODN。

CpG寡核苷酸优选构建成5’末端可被受体识别。任选将两个CpG寡核苷 酸序列的3’端相连接形成“免疫聚体”。参见例如参考文献53和57-59。

基于免疫刺激性寡核苷酸的特别有用的佐剂被称为IC-31^TM[60]。因此， 本发明使用的佐剂可以包含(i)和(ii)的混合物：(i)含有至少一个（优选多个）CpI 基序（即胞嘧啶与肌苷相连形成二核苷酸）的寡核苷酸（例如15-40个核苷酸）， 和(ii)聚阳离子聚合物，如含有至少一个（优选多个）Lys-Arg-Lys三肽序列的 寡肽（如5-20个氨基酸）。所述寡核苷酸可以是包含26聚体序列5'-(IC)₁₃-3' （SEQ ID NO:98）的脱氧核苷酸。聚阳离子聚合物可以是含有11聚体氨基酸 序列KLKLLLLLKLK(SEQ ID NO:99)的肽。

细菌ADP-核糖基化毒素及其去毒衍生物可以用作本发明的佐剂。优选所 述蛋白衍生自大肠杆菌（大肠杆菌不耐热肠毒素“LT”）、霍乱菌（“CT”） 或百日咳菌（“PT”）。参考文献61中描述了脱毒的ADP-核糖基化毒素作为 粘膜佐剂的应用，参考文献62中描述了其作为胃肠外佐剂的应用。所述毒素 或类毒素优选全毒素形式，包含A和B亚基。A亚基优选含有脱毒突变；B 亚基优选不突变。所述佐剂优选为脱毒的LT突变体，如LT-K63、LT-R72和 LT-G192。参考文献63-70中描述了将ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物，尤 其是LT-K63和LT-R72用作佐剂。一种有用的CT突变体是CT-E29H[71]。 氨基酸取代的数字基准优选是根据参考文献72所示ADP-核糖基化毒素的A 和B亚基排列，该参考文献特定通过引用全文纳入本文。

F.人免疫调节剂

适合用作本发明佐剂的人免疫调节剂包括细胞因子，如白介素（例如， IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12[73]等）[74]、干扰素（例如干扰 素-γ）、巨噬细胞集落刺激因子和肿瘤坏死因子。优选的免疫调节剂是IL-12。

G.生物粘着剂和粘膜粘着剂

生物粘着剂和粘膜粘着剂也可以用作本发明的佐剂。合适的生物粘着剂包 括酯化透明质酸微球[75]或粘膜粘着剂如聚(丙烯酸)交联衍生物、聚乙烯醇、 聚乙烯吡咯烷酮、多糖和羧甲基纤维素。壳聚糖及其衍生物也可用作本发明的 佐剂[76]。

H.微粒

微粒也可以用作本发明的佐剂。微粒（即直径为~100nm至~150μm，更优 选直径~200nm至~30μm，最优选直径~500nm至~10μm的颗粒）由生物可降解 的无毒材料（例如，聚(α-羟酸)、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚酐、聚己内酯等） 形成，优选聚丙交酯乙交酯共聚物，并任选经处理而具有带负电表面（例如用 SDS处理）或带正电表面（例如用阳离子去污剂如CTAB处理）。

I.脂质体（参考文献11的第13和14章）

适用作佐剂的脂质体制剂的例子描述于参考文献77-79。

J.聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯制剂

适用于本发明的佐剂包括聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯[80]。这种制剂还包括 聚氧乙烯去水山梨糖醇酯表面活性剂和辛苯糖醇[81]以及聚氧乙烯烷基醚或酯 表面活性剂和至少一种其它非离子表面活性剂如辛苯糖醇[82]的组合。优选的 聚氧乙烯醚选自下组：聚氧乙烯-9-月桂醚（月桂醇聚醚9）、聚氧乙烯-9-硬脂 醚、聚氧乙烯-8-硬脂醚、聚氧乙烯-4-月桂醚、聚氧乙烯-35-月桂醚和聚氧乙烯 -23-月桂醚。

K.聚磷腈（PCPP）

PCPP制剂描述于例如参考文献83和84。

L.胞壁酰肽

适用作本发明佐剂的胞壁酰肽的例子包括N-乙酰基-胞壁酰-L-苏氨酰-D- 异谷酰胺（thr-MDP）、N-乙酰基-正胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷酰胺（去甲-MDP） 和N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1'-2'-二棕榈酰-sn-甘 油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺MTP-PE）。

M.咪唑并喹诺酮（Imidazoquinolone）化合物

适用作本发明佐剂的咪唑并喹诺酮化合物的例子包括咪喹莫特及其同系 物(例如，"瑞喹莫德3M")，其进一步描述于参考文献85和86。

本发明也可包含以上鉴定的一种或多种佐剂各方面的组合。例如，可将以 下佐剂组合物用于本发明：(1)皂苷和水包油乳剂[87]；(2)皂苷(如QS21)+无毒 LPS衍生物(如3dMPL)[88]；(3)皂苷(如QS21)+无毒LPS衍生物(如3dMPL)+ 胆固醇；(4)皂苷(如QS21)+3dMPL+IL12(任选+固醇)[89]；(5)3dMPL与(例 如)QS21和/或水包油乳剂的组合[90]；(6)SAF，含有10%鲨烯、0.4%吐温80^TM、 5%普朗尼克-嵌段聚合物L121和thr-MDP，或微流体化成为亚微米乳液或涡旋 振荡产生粒度较大的乳液，(7)Ribi^TM佐剂系统(RAS)（RI公司（Ribi Immunochem）），含有2%鲨烯、0.2%吐温80和一种或多种细菌细胞壁组分， 所述组分选自单磷酰脂质A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)和细胞壁骨架 (CWS)，优选MPL+CWS(Detox^TM)；和(8)一种或多种矿物盐(如铝盐)+LPS的 无毒衍生物(如3dMPL)。

用作免疫刺激剂的其它物质公开于参考文献11的第7章。

使用氢氧化铝和/或磷酸铝佐剂特定在儿童中有效，且抗原通常吸附于这 些盐。也优选水包鲨烯乳液，特定在老年人中。有用的佐剂组合包括Th1和 Th2佐剂的组合，如CpG和明矾或雷西莫特和明矾。可以使用磷酸铝和3dMPL 的组合。

本发明组合物可引起细胞介导的免疫反应以及体液免疫反应。

通常认为两种T细胞类型CD4和CD8细胞是启动和/或增强细胞介导免 疫和体液免疫所必需的。CD8T细胞可表达CD8共受体，通常称为细胞毒性T 淋巴细胞(CTL)。CD8T细胞能够识别MHC I型分子上展示的抗原或与之相互 作用。

CD4T细胞可表达CD4共受体，通常称为T辅助细胞。CD4T细胞能够 识别结合MHC II型分子的抗原性肽。与MHC II型分子相互作用后，CD4细 胞可分泌诸如细胞因子等因子。这些分泌的细胞因子可激活B细胞、细胞毒性 T细胞、巨噬细胞和参与免疫反应的其它细胞。辅助T细胞或CD4+细胞可进 一步分为两个功能不同的亚组：即细胞因子和效应功能不同的TH1表型和TH2 表型。

活化的TH1细胞能增强细胞免疫(包括抗原特异性CTL生成增加)，因而 对响应胞内感染具有特定价值。活化的TH1细胞可分泌IL-2、IFN-γ和TNF-β 中的一种或多种。TH1免疫反应可通过激活巨噬细胞、NK(自然杀伤)细胞和 CD8细胞毒性T细胞(CTL)导致局部炎症反应。通过用IL-12刺激B和T细胞 的生长，TH1免疫反应也可用于放大免疫反应。TH1刺激的B细胞可分泌 IgG2a。

活化的TH2细胞提高抗体生成，因此对响应胞外感染具有价值。活化的 TH2细胞可分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL10中的一种或多种。TH2免疫反应可 引起产生IgG1、IgE、IgA和用于未来保护的记忆B细胞。

增强的免疫反应可包括增强的TH1免疫反应和TH2免疫反应中的一种或 多种。

TH1免疫反应可包括以下一种或多种：CTL增加，与TH1免疫反应相关 的一种或多种细胞因子（如IL-2、IFN-γ和TNF-β）增加，活化巨噬细胞增加， NK活性增加，或者IgG2a生成增加。增强的TH1免疫反应优选包括IgG2a生 成增加。

可使用TH1佐剂引发TH1免疫反应。相对于不用佐剂的抗原免疫，TH1 佐剂通常引起IgG2a生成水平增加。适用于本发明的TH1佐剂可包括例如， 皂苷制剂、病毒体和病毒样颗粒、肠细菌脂多糖(LPS)的无毒衍生物、免疫刺 激性寡核苷酸。免疫刺激性寡核苷酸，如含有CpG基序的寡核苷酸是本发明 所用的优选TH1佐剂。

TH2免疫反应可包括以下一种或多种：与TH2免疫反应相关的一种或多 种细胞因子（如IL-4，IL-5，IL-6和IL-10）增加，或者IgG1、IgE、IgA和记 忆B细胞生成增加。增强的TH2免疫反应优选包括IgG1生成增加。

可使用TH2佐剂引发TH2免疫反应。相对于不用佐剂的抗原免疫，TH2 佐剂通常引起IgG1生成水平增加。适用于本发明的TH2佐剂包括例如，含矿 物质组合物、油乳剂和ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物。含矿物质组合物 如铝盐是本发明使用的优选TH2佐剂。

组合物可包括TH1佐剂和TH2佐剂的组合。这种组合物优选引起增强的 TH1和增强的TH2反应，即IgG1和IgG2a的生成相对于不用佐剂的免疫均有 增加。更优选地，相对于用单一佐剂的免疫(即，相对于只用TH1佐剂的免疫 或只用TH2佐剂的免疫)，包含TH1和TH2佐剂组合的组合物引起TH1增加 和/或TH2免疫反应增强。

所述免疫反应可以是TH1免疫反应和TH2免疫反应之一或两种。免疫反 应优选提供增强的TH1反应和增强的TH2反应之一或两种。

增强的免疫反应可以是全身免疫反应和粘膜免疫反应之一或两种。该免疫 反应优选提供增强的全身免疫反应和增强的粘膜免疫反应之一或两种。优选粘 膜免疫反应为TH2免疫反应。粘膜免疫反应优选包括IgA生成增加。

链球菌（Streptococcal）感染可影响机体的各个部分，因此可将本发明组 合物制备成各种形式。例如，可将所述组合物制备为液体溶液或悬浮液形式的 注射剂。也可制备适合在注射前溶解或悬浮于液体载剂的固体形式(如冻干组 合物或喷雾冻干组合物)。可制备所述组合物用于局部给药，例如作为油膏、 乳膏或粉剂。该组合物可制备用于口服给药，如作为片剂或胶囊，喷雾剂，或 糖浆剂(任选调味)。可将所述组合物制备为采用细粉或喷雾进行肺部给药，例 如作为吸入剂。可将所述组合物制备为栓剂或阴道栓。所述组合物可以制备用 于鼻部、耳部或眼部给药，例如作为滴剂。组合物可采用药盒形式，设计成在 临给予患者之前重建合并组合物。这种药盒可包含一种或多种液体形式的抗原 以及一种或多种冻干抗原。

组合物在使用前临时制备(例如，以冻干形式提供组分)和以药盒形式提供 时，该药盒可包括两个药瓶，或者可包括一个已填充的注射器和一个药瓶，所 述注射器内容物用于在注射前再次激活药瓶内容物。

用作疫苗的免疫原性组合物包含免疫有效量的抗原，以及需要的任何其它 组分。“免疫有效量”指在一次剂量或一系列剂量的一部分中给予个体的对治 疗或预防有效的量。该量根据待治疗个体的健康和身体状况、年龄、待治疗个 体的分类群（例如，非人灵长类、灵长类等)、个体免疫系统合成抗体的能力、 所需的保护程度、疫苗配方、治疗医生对医学情况的评估和其它相关因素而变 化。预计所述量将落入可通过常规试验测定的相对较宽范围内。

核酸免疫

上述免疫原性组合物包括来自GBS的多肽抗原。然而，在所有情况下， 可用编码这些多肽的核酸(通常是DNA)替换多肽抗原，以得到基于核酸免疫的 组合物、方法和用途[91-98]。

编码免疫原的核酸在递送给病人后体内表达，然后所表达的免疫原刺激免 疫系统。活性成分通常采用核酸载体形式，其包含：(i)启动子；(ii)可操作连接 于启动子的免疫原编码序列；以及任选(iii)选择标记物。优选的载体还可包含 (iv)复制起点；以及(v)位于(ii)下游并与其可操作连接的转录终止子。通常，(i) 和(v)为真核的，(iii)和(iv)为原核的。

优选的启动子是病毒启动子，如来自巨细胞病毒(CMV)的启动子。除了启 动子，载体还可以包含与启动子功能性相互作用的转录调节序列(如增强子)。 优选的载体包含立即早期CMV增强子/启动子，更优选的载体还包含CMV内 含子A。将该启动子可操作连接于编码免疫原的下游序列，从而使免疫原编码 序列的表达在该启动子的控制之下。

当使用标记物时，优选其在微生物宿主中(如原核生物、细菌、酵母中)具 有功能。标记物优选原核选择标记物(如在原核启动子控制之下转录)。方便起 见，典型的标记物为抗生素抗性基因。

所述载体优选自主复制附加体或染色体外载体，如质粒。

所述载体优选包括复制起点。该复制起点优选在原核生物中有活性而在真 核生物中无活性。

因此优选的载体包含用于选择载体的原核标记物、原核复制起点以及驱动 免疫原编码序列转录的真核启动子。因此载体(a)在原核宿主中扩增并选择，但 不进行多肽表达，而(b)在真核宿主中表达，但不进行扩增。这种配置对于核酸 免疫载体来说是理想的。

所述载体可以在编码序列下游包含真核转录终止序列。这能增强转录水 平。当编码序列本身不包含聚腺苷酸化序列时，所述载体优选包含聚腺苷酸化 序列。优选的聚腺苷酸化序列来自于牛生长激素。

所述载体可包括多克隆位点。

除免疫原和标记物的编码序列外，载体可以包含第二个真核编码序列。载 体还可在所述第二序列上游包含IRES，以从与该免疫原相同的转录物中翻译 第二条真核多肽。或者，免疫原编码序列可以在IRES的下游。

所述载体可以包含非甲基化CpG基序，如非甲基化DNA序列，它们都在 鸟苷之前有一个胞嘧啶，侧接有两个5'嘌呤和两个3'嘧啶。已证明非甲基化形 式的这些DNA基序是多种类型免疫细胞的强效刺激因子。

载体可以靶向方式进行递送。例如，参考文献99-104中描述了受体介导 的DNA递送技术。在基因治疗方案中，以约100ng-200mg DNA的范围局部 给予包含核酸的治疗性组合物。在基因治疗方案中也能使用浓度范围为约500 ng-50mg，约1μg-2mg，约5μg-500μg以及约20μg-100μg的DNA。诸如 作用方法(如提高或抑制编码基因产物的水平)以及转化和表达效力等因素是影 响最终功效所需剂量的考虑因素。当需要在更大面积组织上更强表达时，可能 需要更大量的载体或在连续给药方案中重复给予相同量，或对不同相邻或紧密 组织部分多次给药，以达到阳性治疗效果。在所有情况下，临床试验中的常规 实验方法可确定最优治疗效果的特定范围。

可用基因递送载剂来递送载体。基因递送载剂可以是病毒或非病毒来源 (通常参见参考文献105-108)。

本领域熟知用于递送所需核酸并在所需细胞中表达的基于病毒的载体。基 于病毒的示例性载体包括但不限于：重组逆转录病毒(例如参考文献 109-119)，基于α病毒的载体(如辛德毕斯病毒载体、西门利克森林病毒 (ATCC VR-67；ATCC VR-1247)、罗斯河病毒(ATCC VR-373；ATCC VR-1246)和委内瑞拉马脑炎病毒(ATCC VR-923；ATCC VR-1250；ATCC VR 1249；ATCC VR-532)；还可以使用这些病毒的杂交体或嵌合体)、痘病 毒载体(如牛痘、鸟痘、金丝雀痘、改性的安卡拉牛痘等)、腺病毒载体和腺 伴随病毒(AAV)载体(例如参见参考文献120-125)。还能给予连接已灭活腺病 毒的DNA[126]。

还能使用非病毒递送载剂和方法，包括但不限于：连接或不连接单独灭活 腺病毒的聚阳离子浓缩DNA[如126]，配体连接的DNA[127]，真核细胞递送 运载体细胞[如参考文献128-132]和核电荷中和或与细胞膜融合。还能使用裸露 DNA。参考文献133和134中描述了引入裸露DNA的示例性方法。参考文献 135-139中描述了可作为基因递送载剂的脂质体(如免疫脂质体)。参考文献140 和141中描述了其它方法。

其它适用的非病毒递送包括机械递送系统，如参考文献141所述方法。而 且，可通过光聚合水凝胶材料沉积或使用电离辐射来递送此编码序列和其表达 产物[如参考文献142和143]。其它可用于递送编码序列的常规基因递送方法 包括例如，使用手持式基因转移颗粒枪[144]或使用离子辐射激活转移的基因 [142和143]。

使用PLG(聚丙交酯乙交酯共聚物)微粒递送DNA是一个尤其优选的方法， 如吸附于微粒上，微粒任选处理成表面带负电(如用SDS处理)或带正电(如用 阳离子去垢剂如CTAB处理)。

治疗方法和所述疫苗给予

本发明还提供了使哺乳动物产生免疫反应的方法，包括给予有效量的本发 明免疫原性组合物的步骤。所述免疫反应优选为保护性，并优选涉及抗体和/ 或细胞介导免疫。该方法可以引起增强的反应。

本发明还提供联合用作药物的至少两个不同的GBS59进化支，例如用于 使哺乳动物产生免疫反应。

本发明还提供至少两个不同的GBS59进化支在制备使哺乳动物产生免疫 反应的药物中的应用。

借助这些应用和方法在哺乳动物中产生免疫反应后，能保护该哺乳动物抵 御GBS引起的疾病和/或感染，例如抵御脑膜炎。

本发明还提供了一种预填充本发明免疫原性组合物的递送装置。

所述哺乳动物优选人。所述人可以是小孩（如幼童或婴儿），青少年或 成人。准备给予儿童的疫苗也可给予成年人，例如用以评估安全性、剂量、免 疫原性等。

检测治疗性处理功效的一种方式包括在给予本发明组合物后监测肺炎球 菌感染。一种检查预防性处理功效的方法包括用标准试验来测试免疫后血清； 例如，可在调理吞噬细胞杀伤实验(OPKA)中测试血清，其调理细菌的能力指 示了保护效力。另一种检查预防性处理功效的方法涉及在GBS感染的动物模 型，例如豚鼠或小鼠中的免疫后攻击。参考文献145中描述了一种此类模型。 另一评价本发明组合物免疫原性的方法是重组表达多肽，通过免疫印迹和/或微 阵列筛查患者血清或粘膜分泌物。多肽和患者样品间的阳性反应表明患者已经 产生对受试多肽的免疫反应。该方法也可用于鉴定免疫显性抗原和/或抗原中的 表位。

本发明的组合物通常直接给予患者。可通过胃肠外注射(如皮下、腹膜内、 静脉内、肌肉内或组织间隙)，或通过粘膜，如经直肠、口腔(如片剂、喷雾)、 阴道、局部、透皮或经皮、鼻内、眼、耳、肺或其它粘膜途径给药来完成直接 递送。

本发明可用于引起全身和/或粘膜免疫，优选引起增强的全身和/或粘膜免 疫。

增强的全身和/或粘膜免疫优选表现为提高的TH1和/或TH2免疫反应。 增强的免疫反应优选包括IgG1和/或IgG2a和/或IgA生成增加。

可以通过单剂量方案或多剂量方案进行给药。多剂量可以用于初次免疫方 案和/或加强免疫方案。在多剂量方案中，可通过相同或不同途径给予各剂量， 例如采用胃肠外初次免疫和粘膜加强免疫、粘膜初次免疫和胃肠外加强免疫 等。一般以至少1周（例如约2周、约3周、约4周、约6周、约8周、约10 周、约12周、约16周等）的间隔给予多个剂量。

可用按照本发明制备的疫苗治疗儿童和成年人。因此，人患者可以小于1 岁、小于5岁、1-5岁、5-15岁、15-55岁或至少55岁。接受疫苗的患者优选 老年人(如≥50岁，≥60岁并优选≥65岁)，儿童(如≤5岁)，住院病人、保健护理 人员、武装人员和军人、孕妇、慢性病人或免疫缺陷病人。通常，所述疫苗可 以用于治疗怀孕妇女和青少年。然而所述疫苗不仅适用于这些人群，还可用 于更广泛的群体。

可将本发明产生的疫苗与其它疫苗基本上同时(在健康护理专业人员或疫 苗接种中心的同一用药咨询或就诊期间)给予患者，例如与风疹疫苗、水痘疫 苗、白喉疫苗、破伤风疫苗、百日咳疫苗、DTP疫苗、脊髓灰质炎病毒灭活疫 苗、乙型肝炎病毒疫苗、脑膜炎球菌偶联疫苗(如四价A-C-W135-Y疫苗)、呼 吸道合胞病毒疫苗、人乳头瘤病毒疫苗、流感病毒疫苗（包括流行性流感病毒 疫苗）等基本上同时给药。

还可将本发明疫苗与抗病毒化合物，具体是对流感病毒有活性的抗病毒化 合物(如奥塞米韦和/或扎那米韦)基本上同时给予患者(如在健康护理专业人员 的同一用药咨询或就诊期间)。这些抗病毒化合物包括神经氨酸酶抑制剂，如 (3R,4R,5S)-4-乙酰基氨基-5-氨基-3(1-乙基丙氧基)-1-环己烯-1-羧酸或5-(乙酰 基氨基)-4-[(氨基亚氨基甲基)-氨基]-2,6-脱水-3,4,5-三脱氧-D-甘油-D-半乳糖壬 -2-烯酮酸，包括它们的酯(如乙酯)和盐(如磷酸盐)。优选的抗病毒物是 (3R,4R,5S)-4-乙酰基氨基-5-氨基-3(1-乙基丙氧基)-1-环己烯-1-羧酸，乙酯和磷 酸盐(1:1)，也称为磷酸奥塞米韦(达菲(TAMIFLU)^TM)。

组合

用于免疫的组合物包含至少两个GBS59进化支，作为杂交多肽或分离的 多肽。另外，组合物可以包含：(i)针对GBS蛋白，特别是针对GBS59以外 的GBS蛋白引发抗体反应的一种或多种其他多肽;(ii)GBS的荚膜糖;和/或 (iii)引发识别非GBS生物体上表位的抗体反应的一种或多种其他免疫原。

与其他多肽抗原的组合[146]

来自两个或多个进化支的GBS多肽可与选自下组的一种或多种(即1、2、 3、4、5、6、7、8、9或所有10种)多肽抗原组合：(1)(GBS80)抗原;(2)GBS67 抗原;(3)GBS1523抗原;(4)GBS 104抗原;(5)GBS1524抗原;(6)GBS3抗 原;(7)SAN1483抗原;(8)GBS147抗原;(9)GBS328抗原;和/或(10)GBS84 抗原。

这些其他抗原可作为单独多肽加入。作为替代，其可作为杂交物加入，如 GBS80-GBS 1523杂交体。作为另一种替代，其可融合GBS59多肽序列以提供 杂交多肽，如GBS59-GBS80杂交体。

任意这些组合也可包括一种或多种GBS荚膜糖，其通常偶联载体蛋白。 下面提供所述糖和偶联的进一步信息。

GBS80

原始'GBS80'(SAG0645)序列在参考文献147注释为细胞壁表面锚定家 族蛋白(参见GI:22533660)。出于参比目的，2603菌株中发现的全长GBS80 的氨基酸序列在本文中作为SEQ ID NO:177。本发明所用的优选GBS80多肽 包含某一氨基酸序列，该序列：(a)与SEQ ID NO：177具有60%或更高的相同 性(如60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：177 的至少'n'个连续氨基酸的片段，其中'n'是7或更高(如8、10、12、14、16、18、 20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更高)。 这些GBS80蛋白包括SEQ ID NO：177的变体。

(b)的优选片段包括SEQ ID NO：177的表位。其他优选片段缺少SEQ ID NO:177C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、 20、25或更多个)和/或N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、 8、9、10、15、20、25或更多个)，而保留SEQ ID NO:177的至少一个表位。 其它片段省去一个或多个蛋白结构域。

野生型GBS80在SEQ ID NO:177的氨基酸1-37包含N-末端前导或信号 序列区域。GBS80前导或信号序列区域的一个或多个氨基酸可被移除，如 SEQ ID NO:178。野生型序列还在SEQ ID NO:177的氨基酸526-543处包含 C-末端跨膜区域。跨膜区域和/或胞质区域的一个或多个氨基酸可被移除，如 SEQ ID NO:179。野生型GBS80在SEQ ID NO:177的氨基酸521-525处包含指 示细胞壁锚定的氨基酸基序。在一些重组宿主细胞系统中，移除该基序有助于 重组GBS80多肽从所述宿主细胞中分泌。因此所述跨膜和/或胞质区域和细胞 壁锚定基序可从GBS80中移除，如SEQ ID NO:180。或者，在一些重组宿主 细胞系统中，用所述细胞壁锚定基序将重组表达多肽锚定在细胞壁上是有用 的。表达多肽的胞外结构域在纯化中可被切割，或所述重组多肽可结合灭活的 宿主细胞或最终组合物中的细胞膜，如SEQ ID NO:181。野生型GBS80的特 定免疫原性片段位于所述多肽的N末端方向，为SEQ ID NO:182。

GBS67

原始'GBS67'(SAG1408)序列在参考文献147中注释为细胞壁表面锚定 家族蛋白(参见GI:22534437)。出于参比目的，2603菌株中发现的全长GBS67 的氨基酸序列在本文中作为SEQ ID NO:183。本发明所用的优选GBS67多肽 包含某一氨基酸序列，该序列：(a)与SEQ ID NO：183具有60%或更高的相同 性(如60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：183 的至少'n'个连续氨基酸的片段，其中'n'是7或更高(如8、10、12、14、16、18、 20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更高)。 这些GBS67蛋白包括SEQ ID NO：183的变体。(b)的优选片段包括SEQ ID NO：183的表位。其他优选片段缺少SEQ ID NO:183C末端的一个或多个氨 基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)和/或N末端 的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更 多个)，而保留SEQ ID NO:183的至少一个表位。其它片段省去一个或多个蛋 白结构域。

野生型GBS67包含C末端跨膜区，其可以移除跨膜区以例如得到SEQ ID NO:184。也包含指示细胞壁锚定的氨基酸基序(LPXTG和IPMTG)。在一些重 组宿主细胞系统中，优选移除该基序以有助于从所述宿主细胞中分泌。因此， 在本发明使用的一个GBS67的优选片段中，除去所述跨膜和所述细胞壁锚定 基序(SEQ ID NO:185)。或者，在一些重组宿主细胞系统中，优选用所述细胞 壁锚定基序将重组表达多肽锚定在细胞壁上。表达多肽的胞外结构域可在纯化 中进行切割，或所述重组多肽可结合灭活的宿主细胞或最终组合物中的细胞 膜。

GBS67中鉴定了三个包含保守的赖氨酸残基的菌毛蛋白（pilin）基序。 保守的赖氨酸残基位于氨基酸残基478和488，氨基酸残基340和342，和 氨基酸残基703和717。认为所述菌毛蛋白序列特别是所述保守的赖氨酸残 基，对GBS67的寡聚、菌毛样结构的形成重要。优选的GBS67片段包含至 少一个保守的赖氨酸残基。GBS67中鉴定了两个包含保守谷氨酸残基的E盒。 优选的GBS67片段包含至少一个保守的谷氨酸残基。GBS67包含预测形成α 螺旋结构的几个区。这种α螺旋区很可能形成卷曲螺旋结构，并且可以涉及 GBS67的寡聚化。GBS67也包含与金黄色葡萄球菌（S.aureus）胶原结合表 面蛋白(pfam05738)的Cna B结构域同源的区。这可以形成β夹心结构。GBS67 包含与血管性血友病因子（von Willebrand factor(vWF)）A型结构域(也保留 在GBS67片段中)同源的区。

来自2603菌株的野生型GBS67的特定免疫原性片段定位朝向多肽的N 末端，并且是SEQ ID NO:186和SEQ ID NO:187。

H36B株系中存在GBS67(SAI1512)变体。该'GBS67'(SAG1408)序列变 体在参考文献148中注释为细胞壁表面锚定家族蛋白(参见GI:77405751)。出 于参比目的，H36B菌株中发现的全长GBS67的氨基酸序列在本文中作为SEQ ID NO:188。本发明所用的优选GBS67多肽包含某一氨基酸序列，该序列：(a) 与SEQ ID NO：188具有60%或更高的相同性(如60%、65%、70%、75%、80%、 85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5% 或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：188的至少'n'个连续氨基酸的片段，其中'n' 是7或更高(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、 80、90、100、150、200、250或更高)。(b)的优选片段包括SEQ ID NO：188 的表位。其他优选片段缺少SEQ ID NO:188C末端的一个或多个氨基酸(如1、 2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)和/或N末端的一个或多 个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)，而保 留SEQ ID NO:188的至少一个表位。其它片段省去一个或多个蛋白结构域。

本发明包含使用与来自上面详细讨论的2603菌株的GBS67片段类似的 H36B株的GBS67片段，如缺乏C末端跨膜区，缺乏跨膜区和/或细胞壁锚定 基序(LPXTG和IPMTG)，包含保守的菌毛蛋白基序或菌毛蛋白基序内的赖 氨酸残基，包含保守的谷氨酸残基、α螺旋区、Cna B结构域和/或(vWF)A 型结构域。来自H36B菌株的野生型GBS67的特定免疫原性片段定位所述多 肽的N末端，并且是SEQ ID NO:189和SEQ ID NO:190。

GBS67变体存在于株系CJB111、515、NEM316、DK21和CJB110中。 出于参比目的，CJB111、515、NEM316、DK21和CJB110菌株中发现的全长 GBS67的氨基酸序列在本文中作为SEQ ID NO:191、194、197、200和203。 本发明所用的优选GBS67多肽包含某一氨基酸序列，该序列：(a)与SEQ ID NO：191、192、193、194或195具有60%或更高的相同性(如60%、65%、70%、 75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、 99%、99.5%或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：191、194、197、200或203 的至少'n'个连续氨基酸的片段，其中'n'是7或更高(如8、10、12、14、16、18、 20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更高)。 (b)的优选片段包含来自SEQ ID NO:191、194、197、200或203的表位。其他 优选片段缺少SEQ ID NO:191、194、197、200或203C末端的一个或多个氨 基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)和/或N末端 的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更 多个)，而保留SEQ ID NO:191、194、197、200或203的至少一个表位。其它 片段省去一个或多个蛋白结构域。

本发明包含使用与来自上面详细讨论的2603菌株的GBS67片段类似的来 自CJB111、515、NEM316、DK21和CJB110菌株的GBS67片段，如缺乏C 末端跨膜区，缺乏跨膜区和/或细胞壁锚定基序(LPXTG和IPMTG)，包含保守 的菌毛蛋白基序或菌毛蛋白基序内的赖氨酸残基，包含保守的谷氨酸残基、α 螺旋区、Cna B结构域和/或(vWF)A型结构域。来自CJB111、515、NEM316、 DK21和CJB110的野生型GBS67的特定免疫原性片段定位所述多肽的N末端， 并且是SEQ ID NO:192和SEQ ID NO:193(CJB111)、SEQ ID NO:195和SEQ ID NO:196(515)、SEQ ID NO:198和SEQ ID NO:199(NEM316)、SEQ ID NO:201 和SEQ ID NO:202(DK21)、以及SEQ ID NO:204和SEQ ID NO:205(CJB110)。

GBS1523

原始'GBS1523'(SAN1518;SpbI)序列在参考文献148中注释为细胞壁表 面锚定家族蛋白(参见GI:77408651)。出于参比目的，COH1菌株中发现的全 长GBS1523的氨基酸序列在本文中作为SEQ ID NO:206。本发明所用的优选 GBS1523多肽包含某一氨基酸序列，该序列：(a)与SEQ ID NO：206具有60% 或更高的相同性(如60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、 93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：206的至少'n'个连续氨基酸的片段，其中'n'是7或更高(如8、10、12、 14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、 250或更高)。这些GBS1523蛋白包括SEQ ID NO：206的变体。(b)的优选片 段包括SEQ ID NO：206的表位。其他优选片段缺少SEQ ID NO:206C末端的 一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多 个)和/或N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、 20、25或更多个)，而保留SEQ ID NO:206的至少一个表位。其它片段省去一 个或多个蛋白结构域。

野生型GBS1523在SEQ ID NO:206的氨基酸1-29处包含N-末端前导或 信号序列区域，其可从片段中移除，如SEQ ID NO:207。野生型序列在SEQ ID NO:206的氨基酸468-472处包含指示细胞壁锚定的氨基酸基序（LPSTG）。 在一些重组宿主细胞系统中，优选移除该基序以有助于重组多肽从所述细胞中 分泌。或者优选使用所述细胞壁锚定基序将重组表达多肽锚定在细胞壁上。表 达多肽的胞外结构域可在纯化中进行切割，或所述重组多肽可结合灭活的宿主 细胞或最终组合物中的细胞膜。还在SEQ ID NO:206的氨基酸419-429鉴定到 含保守谷氨酸残基的E盒，在残基423处具有保守的谷氨酸。所述E盒基序 可能对寡聚菌毛样结构的形成很重要，且因此GBS 1523的有用片段可包括该 保守谷氨酸残基。鉴定到GBS1523的突变，其中SEQ ID NO:206位置41处的 谷氨酰胺(Q)替换为赖氨酸(K)，这是由于编码核苷酸序列中的密码子从CAA 突变为AAA。该替代可存在于GBS1523序列和GBS1523片段中（如SEQ ID NO:208）。

所述组合物包括GBS80和GBS 1523时，可使用杂交多肽。GBS80-GBS 1523 杂交体的示例见参考文献149且包括SEQ ID NO:209-212的多肽。

GBS104

原始'GBS104'(SAG0649)序列在参考文献147中注释为‘细胞壁表面锚 定家族蛋白’(参见GI:22533664)。出于参比目的，2603菌株中发现的全长 GBS104的氨基酸序列在本文中作为SEQ ID NO:213。本发明所用的优选 GBS104多肽包含某一氨基酸序列，该序列：(a)与SEQ ID NO：213具有60% 或更高的相同性(如60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、 93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：213的至少'n'个连续氨基酸的片段，其中'n'是7或更高(如8、10、12、 14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、 250或更高)。这些GBS104蛋白包括SEQ ID NO：213的变体。(b)的优选片 段包括SEQ ID NO：213的表位。其他优选片段缺少SEQ ID NO:213C末端的 一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多 个)和/或N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、 20、25或更多个)，而保留SEQ ID NO:213的至少一个表位。其它片段省去一 个或多个蛋白结构域。

GBS1524

出于参比目的，全长GBS1524的氨基酸序列在本文中作为SEQ ID NO: 214。本发明所用的优选GBS1524多肽包含某一氨基酸序列，该序列：(a)与 SEQ ID NO：214具有60%或更高的相同性(如60%、65%、70%、75%、80%、 85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5% 或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：214的至少'n'个连续氨基酸的片段，其中'n' 是7或更高(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、 80、90、100、150、200、250或更高)。这些GBS1524蛋白包括SEQ ID NO： 214的变体。(b)的优选片段包括SEQ ID NO：214的表位。其他优选片段缺 少SEQ ID NO:214C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、 9、10、15、20、25或更多个)和/或N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、 5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)，而保留SEQ ID NO:214的至少一 个表位。其它片段省去一个或多个蛋白结构域。

GBS3

原始'GBS3'(SAG2603;BibA)序列在参考文献147中标注为'毒力蛋白'(参 见GI:22535109)。出于参比目的，2603菌株中发现的全长GBS3的氨基酸序列 在本文中作为SEQ ID NO:215。本发明所用的优选GBS3多肽包含某一氨基酸 序列，该序列：(a)与SEQ ID NO：215具有60%或更高的相同性(如60%、65%、 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、 98%、99%、99.5%或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：215的至少'n'个连续氨 基酸的片段，其中'n'是7或更高(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、 40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更高)。这些GBS3蛋白包 括SEQ ID NO：215的变体。(b)的优选片段包括SEQ ID NO：215的表位。 其他优选片段缺少SEQ ID NO:215C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、 5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)和/或N末端的一个或多个氨基酸(如 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)，而保留SEQ ID NO:215 的至少一个表位。其它片段省去一个或多个蛋白结构域。

野生型GBS3在SEQ ID NO:215的氨基酸1-36处包含N-末端前导或信号 序列区域，其可从片段中移除，如SEQ ID NO:216。GBS3还包括指示细胞壁 锚定的氨基酸基序(LPXTG)、跨膜区域和胞质结构域(参见参考文献150)。前 导或信号序列区域、跨膜区域和胞质结构域、和细胞壁锚定基序都可从GBS3 中移除，留下如下所示的包括卷曲螺旋和富含脯氨酸的区段（SEQ ID NO:217）。 GBS3的替代区段可包括：信号序列区域和卷曲螺旋区段(SEQ ID NO:218);卷 曲螺旋区段(SEQ ID NO:219);或信号序列区域、卷曲螺旋区段和富含脯氨酸 的区段(SEQ ID NO:220)。

GBS3变体存在于515株系(SAL2118)、CJB111株系(SAM1974)和 COH1株系(SAN2207)中。515株系、CJB111株系和COH1株系中全长GBS3 的参比氨基酸序列在本文中分别作为SEQ ID NO:221、SEQ ID NO:222和 SEQ ID NO:223。因此，本发明所用的GBS3多肽还可包含某一氨基酸序列， 该序列：(a)与SEQ ID NO：221、SEQ ID NO：222或SEQ ID NO：223具有 60%或更高的相同性(如60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、 93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：221、SEQ ID NO：222或SEQ ID NO：223的至少'n'个连续氨基酸的 片段，其中'n'是7或更高(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、 50、60、70、80、90、100、150、200、250或更高)。这些GBS3蛋白包括SEQ ID NO:221、SEQ ID NO:222或SEQ ID NO:223的变体。(b)的优选片段包含 来自SEQ ID NO:221、SEQ ID NO:222或SEQ ID NO:223的表位。其他优选 片段缺少SEQ ID NO:221、SEQ ID NO:222或SEQ ID NO:223C末端的一个 或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)和/ 或N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、 25或更多个)，而保留SEQ ID NO:221、SEQ ID NO:222或SEQ ID NO:223的 至少一个表位。其它片段省去一个或多个蛋白结构域。

本发明包括使用与以上详细讨论的2603株系中GBS3片段类似的515、 cjb111和coh1株系中的GBS3片段，如缺少N-末端前导或信号序列区域;包 括卷曲螺旋和富含脯氨酸的区段;包括信号序列区域和卷曲螺旋区段;包括卷 曲螺旋区段;或包括信号序列区域、卷曲螺旋和富含脯氨酸的区段。

SAN1485

原始'SAN1485'序列在参考文献148中注释为‘细胞壁表面锚定家族蛋 白’(参见GI:77408233)。出于参比目的，COH1菌株中发现的全长SAN1485 的氨基酸序列在本文中作为SEQ ID NO:224。本发明所用的优选SAN1485多 肽包含某一氨基酸序列，该序列：(a)与SEQ ID NO：224具有60%或更高的相 同性(如60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：224 的至少'n'个连续氨基酸的片段，其中'n'是7或更高(如8、10、12、14、16、18、 20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更高)。 这些SAN1485蛋白包括SEQ ID NO：224的变体。(b)的优选片段包括SEQ ID NO：224的表位。其他优选片段缺少SEQ ID NO:224C末端的一个或多个氨 基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)和/或N末端 的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更 多个)，而保留SEQ ID NO:224的至少一个表位。其它片段省去一个或多个蛋 白结构域。

GBS147

原始'GBS147'(SAG0416)序列在参考文献147中标注为'推定蛋白酶'(参 见GI:22533435)。出于参比目的，2603菌株中发现的全长GBS147的氨基酸序 列在本文中作为SEQ ID NO:225。本发明所用的优选GBS147多肽包含某一氨 基酸序列，该序列：(a)与SEQ ID NO：225具有60%或更高的相同性(如60%、 65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、 97%、98%、99%、99.5%或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：225的至少'n'个 连续氨基酸的片段，其中'n'是7或更高(如8、10、12、14、16、18、20、25、 30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更高)。这些GBS147 蛋白包括SEQ ID NO：225的变体。(b)的优选片段包括SEQ ID NO：225的 表位。其他优选片段缺少SEQ ID NO:225C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、 3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)和/或N末端的一个或多个 氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)，而保留 SEQ ID NO:225的至少一个表位。

GBS328

原始'GBS328'(SAG1333)序列在参考文献147中标注为'5'-核苷酸酶家族 蛋白'(参见GI:22534359)。出于参比目的，2603菌株中发现的全长GBS328的 氨基酸序列在本文中作为SEQ ID NO:226。本发明所用的优选GBS328多肽包 含某一氨基酸序列，该序列：(a)与SEQ ID NO：226具有60%或更高的相同性 (如60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、 96%、97%、98%、99%、99.5%或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：226的至 少'n'个连续氨基酸的片段，其中'n'是7或更高(如8、10、12、14、16、18、20、 25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更高)。这些 GBS328蛋白包括SEQ ID NO：226的变体。(b)的优选片段包括SEQ ID NO： 226的表位。其他优选片段缺少SEQ ID NO:226C末端的一个或多个氨基酸(如 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)和/或N末端的一个 或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)， 而保留SEQ ID NO:226的至少一个表位。其它片段省去一个或多个蛋白结构 域。

GBS84

原始'GBS84'(SAG0907)序列在参考文献147中标注为'推定脂蛋白'(参见 GI:22533929)。出于参比目的，2603菌株中发现的全长GBS84的氨基酸序列 在本文中作为SEQ ID NO:227。本发明所用的优选GBS84多肽包含某一氨基 酸序列，该序列：(a)与SEQ ID NO：227具有60%或更高的相同性(如60%、 65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、 97%、98%、99%、99.5%或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：227的至少'n'个 连续氨基酸的片段，其中'n'是7或更高(如8、10、12、14、16、18、20、25、 30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更高)。这些GBS84 蛋白包括SEQ ID NO：227的变体。(b)的优选片段包括SEQ ID NO：227的 表位。其他优选片段缺少SEQ ID NO:227C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、 3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)和/或N末端的一个或多个 氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)，而保留 SEQ ID NO:227的至少一个表位。其它片段省去一个或多个蛋白结构域。

与GBS糖的组合

GBS59多肽可与通常偶联载体蛋白的一种或多种GBS荚膜糖组合。因此， 本发明提供一种包含以下组合的免疫原性组合物：

(1)上面讨论的GBS59多肽；和

(2)一种或多种GBS荚膜糖。

该组合的组分(2)所用的糖理想上作为含有糖部分和载体蛋白部分的偶联 物存在。偶联物中的载体部分可为单一GBS59多肽、杂交GBS59多肽、非 GBS59GBS多肽或非GBS多肽。

所述糖来自GBS的荚膜糖。所述糖可以是多糖，其大小是在从细菌纯化 该糖期间形成，或者可以是这种多糖片段化产生的寡糖。

组合物可包含来自以下一种或多种链球菌血清型的荚膜糖：Ia、Ib、Ia/c、 II、III、IV、V、VI、VII和VIII。组合物可包括多种血清型如2、3、4、5、 6、7或8种血清型。包括来自一种或多种血清型Ia、Ib、II、III和V的糖有 用。这5种血清型的荚膜糖各包括：(a)末端N-乙酰基-神经氨酸(NeuNAc)残基 (一般称为唾液酸)，在所有情况下2→3连接至半乳糖残基；和(b)三糖核心内 的N-乙酰基-葡糖胺残基(GlcNAc)。

本发明所用糖可为天然形式，或也可被修饰。例如，糖可以比天然荚膜糖 短，或可被化学修饰。例如，所述糖可去-O-乙酰化(部分或全部)、去-N-乙酰 化(部分或全部)、N-丙酰化(部分或全部)等。可在偶联之前、期间或之后进行 去乙酰化，但优选在偶联前进行。根据具体的糖，去乙酰化可影响或不影响免 疫原性。参考文献151讨论了各种血清型中GBS糖上O-乙酰化的关联，且在 一些实施方式中，位置7、8和/或9的唾液酸残基的O-乙酰化在偶联前、中和 后都保留，例如通过保护/去保护、通过再乙酰化等。然而，本发明所用的GBS 糖通常基本在位置7、8和/或9没有唾液酸残基的O-乙酰化。可通过常规试验 评价去乙酰化等的效果。另一可能修饰是从糖中移除唾液酸残基如侧链末端的 唾液酸[152]。具体地，血清型V荚膜糖用于本发明时，其可如参考文献[152] 所述通过去唾液酸苷化修饰。脱唾液酸化的GBS血清型V荚膜糖可通过 以下方式制备：在温和酸性条件下(例如0.1M硫酸，80℃持续60分钟)处 理纯化的GBS血清型V荚膜糖或者用神经氨酸酶处理，如参考文献[152] 所述。在另一实例中，可解聚全长多糖以提供用于本发明的较短片段，例如， 通过在温和酸中水解、通过加热、通过尺寸选择色谱等。已报道链长影响GBS 糖在兔子中的免疫原性[153]。具体地，血清型II和/或III荚膜糖用于本发明时， 其可如参考文献154所述解聚。该文献描述了通过温和去氨基切割为含还原末 端2,5-脱水-D-甘露糖残基的抗原片段来部分解聚II型和III型荚膜糖。

可通过已知技术纯化荚膜糖，如本文引用的参考文献所述，如参考文献 155。典型的方法包括碱提取、离心、过滤、RNA酶/DNA酶处理、蛋白酶处 理、浓缩、尺寸排阻色谱、超滤、阴离子交换色谱和进一步超滤。作为替代， 可使用参考文献156所述的纯化过程。该过程涉及碱提取、乙醇/CaCl₂处理、 CTAB沉淀和再溶。

本发明不限于纯化自天然来源的糖，然而，可通过其它方法如全合成或部 分合成获得所述糖。

糖通常可与载体蛋白偶联。一般，与载体的共价偶联增强糖的免疫原性， 因为这将糖由T-非依赖性抗原转变为T-依赖性抗原，由此能够引发免疫记忆。

已广泛报道GBS糖的偶联，例如参见参考文献157-164。GBS糖偶联的 典型现有技术方法涉及将纯化的糖还原性胺化到载体蛋白，例如破伤风类毒素 (TT)或CRM197[158]。还原胺化涉及载体氨基酸侧链上的胺基与糖上的醛基。 由于GBS荚膜糖在其天然形式中不包括醛基，通常是在偶联之前通过糖唾液 酸残基的一部分发生氧化（如高碘酸盐氧化）而产生醛基[158，165]。已显示 此方法制备的偶联疫苗就各GBS血清型Ia、Ib、II、III和V而言在人体中安 全且具有免疫原性[166]。

优选的载体蛋白是细菌毒素，如白喉或破伤风毒素、或其类毒素或突变体。 这些常用于偶联疫苗。偶联物中的载体蛋白可以是或不是(1)中GBS59抗原之 一。若不是GBS59抗原，其可为不同的GBS抗原。在一些实施方式中，尽管 载体不是GBS抗原，其可以是例如细菌毒素或类毒素。

常用载体蛋白是白喉或破伤风类毒素，或其突变物。还可使用毒素或类毒 素的片段，例如破伤风类毒素的片段C[167]。白喉毒素的CRM197突变体 [168-170]对本发明特别有用。其他合适的载体蛋白包括，脑膜炎奈瑟球菌 （N.meningitidis）外膜蛋白复合物[171]、合成肽[172,173]、热激蛋白[174,175]、 百日咳蛋白[176,177]、细胞因子[178]、淋巴因子[188]、激素[188]、生长因子、 含有来自各种病原体衍生抗原的多种人CD4⁺T细胞表位的人造蛋白[179]如 N19[180]、流感嗜血杆菌（H.influenzae）的D蛋白[181-183]、铁摄取蛋白[184]、 艰难梭菌(C.difficile)的毒素A或B[185]、重组铜绿假单胞菌（P.aeruginosa） 胞外蛋白A(rEPA)[186]等等。

当组合物包含一种以上偶联物时，每种偶联物可使用相同的载体蛋白或不 同的载体蛋白。

在一些实施方式中，一种偶联物可携带来自多种血清型的糖[187]。然而， 每种偶联物通常包含来自一种血清型的糖。

偶联物可包含过量载体(w/w)或过量糖(w/w)。在一些实施方式中，偶联物 可包含相同重量的载体和糖。例如，可使用糖：蛋白比(w/w)为1:5-5:1的偶联 物，特定是1:5-2:1的比例。

载体分子可直接与载体共价偶联，或通过接头偶联。可通过(例如)糖和载 体之间的还原性胺化(如参考文献188和189所述)，实现与蛋白质的直接连接。 首先需要通过，例如氧化来激活糖。可用任何已知方法，如参考文献190和191 所述的过程通过接头基团进行连接。优选的连接类型是己二酸接头，这种连接 可通过以下方式形成：将游离-NH₂基团(如通过胺化引入葡聚糖中)与己二酸偶 联(例如，利用二酰亚胺活化)，然后将蛋白质偶联于所得的糖-己二酸中间体 [192,193]。另一种优选连接形式是羰基接头，这种连接可通过以下方式形成： 使糖CDI的游离羟基发生反应[194,195]，然后与蛋白质反应形成氨基甲酸酯连 接。其它接头包括β-丙酰胺基[196]、硝基苯基-乙胺[197]、卤代酰基卤化物[198]、 糖苷键[199]、6-氨基己酸[200]、ADH[201]、C₄-C₁₂部分[202]等。也可采用碳 二亚胺缩合反应[203]。

与非GBS抗原组合

GBS59进化支组合可与非GBS抗原联用。因此，本发明提供一种包含以 下组合的免疫原性组合物：

(1)如上面讨论的至少两个GBS59进化支的组合，作为混合物或杂交体; 和

(2)一种或多种选自下组的抗原：白喉类毒素；破伤风类毒素；一种或多 种百日咳抗原；乙型肝炎病毒表面抗原；灭活的脊髓灰质炎病毒抗原；C血清 组脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)荚膜糖抗原的偶联物；Y血清组脑膜 炎奈瑟球菌荚膜糖抗原的偶联物；W135血清组脑膜炎奈瑟球菌荚膜糖抗原的 偶联物；A血清组脑膜炎奈瑟球菌荚膜糖抗原的偶联物；一种或多种流感抗原； 和一种或多种人乳头状瘤病毒抗原。

可通过处理(例如用甲醛)来自白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae) 的白喉毒素获得白喉类毒素。例如，参考文献204的第13章更详细地公开了 白喉类毒素。

可通过处理(例如用甲醛)来自破伤风梭菌(Clostridium tetani)的破伤风毒 素获得破伤风类毒素。参考文献204的第27章更详细地公开了破伤风类毒素。

疫苗中的百日咳抗原是细胞（全细胞，Pw）或无细胞（Pa）。本发明可 用于分选百日咳抗原。已经详尽记载了细胞百日咳抗原的制备(参见例如参考 文献204的第21章)，例如，可通过热灭活百日咳博德特菌（B.pertussis）的I 期培养物获得该抗原。非细胞百日咳抗原包含特定的纯化百日咳博德特菌(B. pertussis)抗原，它们或是由天然细菌纯化或是在重组宿主中表达后纯化。通常 使用一种以上非细胞抗原，因此组合物可包含以下熟知和已良好鉴定的百日咳 博德特菌抗原中的一种、两种或三种：(1)脱毒的百日咳毒素(百日咳类毒素或 “PT”)；(2)丝状血细胞凝集素(“FHA”)；(3)百日咳杆菌粘附素(也称为“69千道 尔顿外膜蛋白”)。在根据本发明使用之前，可用甲醛处理FHA和百日咳杆菌粘 附素。可通过甲醛和/或戊二醛处理对PT脱毒，但是，作为此种化学脱毒方法 的替代方案，其可以是酶活性经诱变降低的突变PT[205]。可以使用的其他非 细胞百日咳抗原包括菌毛(如凝集原2和3)。

乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)是乙型肝炎病毒衣壳的主要组分。可通过 在酵母如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中重组表达，方便地产生该抗原。

脊髓灰质炎灭活病毒(IPV)抗原由细胞培养物上生长的病毒制备并随后灭 活(例如用甲醛)。因为脊髓灰质炎可由三类脊髓灰质炎病毒之一引起(如参考文 献204的第24章所述)，所以组合物可包含以下三种脊髓灰质炎病毒抗原：1 型脊髓灰质炎病毒(例如Mahoney毒株)、2型脊髓灰质炎病毒(例如MEF-1毒 株)和3型脊髓灰质炎病毒(例如Saukett毒株)。

组合物的组分(2)中包含白喉类毒素、破伤风类毒素或非细胞百日咳抗原 之一时，它通常包含所有这三种抗原，即组分(2)包含D-T-Pa组合。

组合物的组分(2)中包含白喉类毒素、破伤风类毒素或细胞百日咳抗原之 一时，它通常包含所有这三种抗原，即组分(2)包含D-T-Pw组合。

人乳头瘤病毒抗原包括L1衣壳蛋白，其可装配形成称作病毒样颗粒(VLP) 的结构。可通过在酵母细胞(例如酿酒酵母(S.cerevisiae))或昆虫细胞(例如夜蛾 (Spodoptera)细胞，如草地贪夜蛾(S.frugiperda)，或果蝇(Drosophila)细胞)中重 组表达L1来产生VLP。对于酵母细胞，质粒载体可携带L1基因；对于昆虫 细胞，杆状病毒载体可携带L1基因。更优选地，该组合物包含来自HPV-16 和HPV-18毒株的L1VLP。已证明这种二价组合非常有效[206]。除了HPV-16 和HPV-18毒株外，也可能包含来自HPV-6和HPV-11毒株的L1VLP，产生 四价组合。

流感抗原可为当前流感病毒疫苗的形式。目前可以获得各种形式的流感病 毒疫苗(例如参见参考文献[204]的第17和18章)。疫苗通常基于活病毒、灭活 病毒、重组血细胞凝集素或病毒体。灭活疫苗可基于全病毒颗粒、裂解病毒颗 粒或基于纯化的表面抗原。本发明疫苗中的抗原可以采取活病毒的形式，或者 更优选采取灭活病毒的形式。疫苗可为例如，三价疫苗（如包括来自A/H1N1菌 株、A/H3N2菌株和B菌株的血细胞凝集素）。在其他实施方式中，所述疫苗 是单价疫苗(如包括来自A/H1N1菌株或A/H5N1菌株的血细胞凝集素)。所述 疫苗可为含佐剂（如水包油乳液）或不含佐剂。

抗体

GBS抗原的抗体可用于被动免疫[207]。因此本发明提供同时、分别或依 次给予的抗体组合，其中所述组合包括以下至少两种：(a)识别上述定义的第 一氨基酸序列的抗体;(b)识别上述定义的第二氨基酸序列的抗体;和/或(c) 识别上述定义的第三氨基酸序列的抗体。

本发明还提供此类抗体组合在治疗中的应用。本发明还提供此类抗体组合 在药物制造中的应用。本发明还提供一种治疗哺乳动物的方法，其包括给予哺 乳动物有效量该组合的步骤。如上就免疫原性组合物所述，这些方法和应用能 够保护哺乳动物抵御GBS感染。

与本发明联用的单克隆抗体包含在氨基酸411-436(SEQ ID NO:270)结合 D3(515进化支)的表面暴露片段的17C4/A3和4H11/B7。4H11/B7的重链包含 SEQ ID NO:263中提供的氨基酸，并且由包含SEQ ID NO:262的核酸分子编 码。4H11/B7的轻链包含SEQ ID NO:265中提供的氨基酸，并且由包含SEQ ID NO:264的核酸分子编码。17C4/A3的重链包含SEQ ID NO:267中提供的氨基 酸，并且由包含SEQ ID NO:266的核酸分子编码。17C4/A3的轻链包含SEQ ID NO:269中提供的氨基酸，并且由包含SEQ ID NO:268的核酸分子编码。

本发明提供与17C4/A3和4H11/B7和编码这些抗体的核酸分子有显著序 列相同性的抗体。例如，本发明包含某些抗体，所述抗体具有与4H11/B7(SEQ ID NO:263)的重链序列相同性大于60、70、80、90、95、96、97、98或99% 的重链和/或与4H11/B7(SEQ ID NO:265)的轻链序列相同性大于60、70、80、 90、95、96、97、98或99%的轻链。本发明也包含某些抗体，所述抗体具有 与17C4/A3(SEQ ID NO:267)的重链序列相同性大于60、70、80、90、95、96、 97、98或99%的重链和/或与17C4/A3(SEQ ID NO:269)的轻链序列相同性大于 60、70、80、90、95、96、97、98或99%的轻链。本发明也包含与SEQ ID NO: 262、264、266或268有大于60、70、80、90、95、96、97、98或99%序列 相同性的核酸分子。

这些抗体序列是全长序列。技术人员可以使用这些抗体的可变区或特定 CDR区生产替代抗体如人源化抗体。本发明包含这种抗体。

术语“抗体”包括完整的免疫球蛋白分子及其能结合抗原的片段。它们包 括杂交(嵌合)抗体分子[208,209]；F(ab′)₂和F(ab)片段和Fv分子；非共价异源 二聚体[210,211]；单链Fv分子(sFv)[212]；二聚和三聚抗体片段构建物；微型 抗体[213,214]；人源化抗体分子[215-217]；任何获自此类分子的功能片段，以 及通过非常规工艺，如噬菌体展示获得的抗体。优选所述抗体为单克隆抗体。 获取单克隆抗体的方法为本领域熟知。优选人源化或完全人抗体。

概述

除非另有说明，本发明的实施将采用化学、生物化学、分子生物学、免疫 学和药理学的常规方法，这些方法在本领域技术范围内。这些技术在文献中已 有充分描述。参见例如参考文献218-225等。

上文使用“GI”编号。GI编号，或者“基因信息识别号”（GenInfo Identifier） 是NCBI将序列加入其数据库时，连续对每一序列记录指定的一串数字。GI 编号与序列记录登录号没有相似之处。序列更新(如纠正或加入更多注释或信 息)后，将接受新GI编号。因此与给定GI编号相关的序列是不变的。

当本发明涉及“表位”时，该表位可以是B细胞表位和/或T细胞表位。 可凭经验鉴定此类表位(如使用PEPSCAN[226，227]或相似方法)，或可对其进 行预测(如使用詹姆森-沃尔夫抗原性指数(Jameson-Wolfantigenic index)[228]、 基于矩阵的方法[229]、MAPITOPE[230]、TEPITOPE[231,232]、神经网络[233]、 OptiMer和EpiMer[234，235]、ADEPT[236]、T位点[237]、亲水性[238]、抗原 性指数[239]或参考文献240-244等公开的方法)。表位是由抗体或T细胞受体 的抗原结合位点识别并与之结合的抗原某部分，它们也称作“抗原决定簇”。

术语“包含”涵盖“包括”以及“由……组成”，例如，“包含”X的组合物可以 仅由X组成或可以包括其它物质，例如X+Y。

词语“基本上”不排除“完全”，如“基本上不含”Y的组合物可能完全不含Y。 需要时，词语“基本上”可从本发明的定义中略去。

与数值x相关的术语“约”是可选的并表示例如x±10%。

除非另有明确说明，包括混合两种或多种组分的步骤的工艺不要求任何特 定的混合顺序。因此，组分可以任何顺序混合。有三种组分时，可将两种组分 相互合并，然后可将该组合再与第三种组分混合等。

抗体通常对于其靶标是特异性的。因此，其对靶标的亲和性高于无关对照 蛋白，例如牛血清白蛋白。

两个氨基酸序列间的序列相同性百分数表示进行比对时所比较的两条序 列中相同氨基酸的百分数。利用本领域所知软件程序，例如参考文献245的 7.7.18部分所述的软件程序，可进行比对并确定同源性百分数或序列相同性百 分数。优选的比对通过史密斯-沃特曼（Smith-Waterman）同源性搜索算法使用 仿射缺口搜索确定，其中缺口开放罚12分，缺口延伸罚2分，BLOSUM矩阵 计62分。参考文献246中公开了史密斯-沃特曼同源性搜索算法。

附图简要说明

图1：(A)肺炎链球菌（S.pneumoniae）RrgB和无乳链球菌（S.agalactiae） BP-2a 515变体之间的逐对比对;(B)BP-2a 515变体的模型

图2：MALDI TOF质谱鉴定内部异肽键。重组蛋白BP-2a 515变体进行 4-12%丙烯酰胺SDS-PAGE。所述蛋白在“胶中”用Lys-C消化。消化生成的肽 或者直接通过MALDI TOF质谱分析(上图)或者在分析前用O-甲基异脲修饰 (下图)。观察到结构域D4(A)、D2(B)和D3(C)中异肽键肽的信号。(◆)胰蛋 白酶自体消化产物。(*)没有鉴定的峰。

图3：(A)有(野生型（WT）)和没有异肽键(ΔIB)的纯化重组BP-2a 515 变体的SDS-PAGE。(B)针对有(WT)和没有异肽键(ΔIB)的BP-2a 515变体产生 的小鼠抗血清的调理吞噬作用试验。

图4：(A)BP-2a-515变体的四个结构域的示意图；(B)用针对每个BP-2a 结构域所产生小鼠血清的515GBS菌株的FACS分析；(C)用针对每个 BP-2a-515变体结构域产生的小鼠血清的调理吞噬作用试验。

图5：(A)变体515和H36B的迭合。环精细化（loop refinement）后H36B 变体(SAI 1511)的最佳模型报告了验证评分165.3，与期望的高评分值215和 低评分值96.8相比较；(B)BP-2a H36B变体结构域的示意图。

图6：(A)与结构域D3以及有BP-2a等位基因变体的结构域D4的2个螺 旋对应的氨基酸序列的多重比对;(B)融合蛋白的示意图;(C)考马斯染色检 测的纯化重组融合蛋白的SDS-PAGE;(D)表达不同BP-2a变体的GBS菌株的 FACS分析，用针对融合蛋白6xD3产生的小鼠抗血清;(E)用针对融合蛋白 6xD3和4xD3H产生的小鼠抗血清的调理吞噬作用试验。

图7：通过分子取代在分辨率解析和精细（refined）的BP-2a-515 的晶体结构。数据的收集和精细化（refinement）统计示于表2。所述晶体不 对称单位包含两个独立链的二聚体(A:残基192-640和B:残基190-641)，各 由三个不同的结构域组成:D2(残基190-332)、D3(残基333-455)和D4(残基 456-641)

具体实施方式

无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）(B型链球菌[GBS])是新生儿中 脓血症和脑膜炎的最常见病因，并且也是健康妇女的肛门生殖器黏膜的主 要移生菌（colonizer）。最近，在GBS中发现了三种菌毛类型作为重要的毒 力因子。涉及菌毛组装的基因在特征性基因座中聚集(称为PI-1、PI-2a和 PI-2b)，各编码包含代表菌毛结构成分的LPXTG基序的三个蛋白和催化蛋白 多聚化的两个分选酶。所述三种菌毛类型各有两个保护抗原。其中，菌毛类 型2a(BP-2a)的骨架蛋白显示最高的基因可变性程度，并且能显著调节调理吞 噬细胞活性和在小鼠中仅针对表达同源等位基因的品系提供保护。为了对 BP-2a等位基因变体的优势免疫和保护表位作图，通过同源比较建模和基于 此结构信息进行蛋白的结构定性，对应于鉴定的四个IgG样折叠结构域生成主 要变体的缺失突变体。体外和体内研究显示只有蛋白的C末端部分高度表面暴 露并能引起赋予小鼠中保护的调理吞噬细胞抗体。特别地，结构域D3似乎对 分析的四个主要等位基因变体的保护免疫最为重要。最终，显示能用包含来自 不同BP-2a变体的D3结构域的融合蛋白生成针对GBS感染的广泛保护疫苗。

材料和方法

同源比较建模

使用来自美国阿克赛勒里公司(Accelerys)的Discovery Studio 2.5软件进 行所有分子刺激。BP-2a的氨基酸序列(515变体、TIGR注释SAL 1486和H36B 变体、TIGR注释SAI 1511)用于通过BLAST程序工具针对蛋白数据库（Protein Data Bank）(PDB)检索[247]。同源建模的两个蛋白序列的最佳模板结构产生 RrgB(PDB代码:650)的晶体部分(残基187-627)，获自PDB数据库的肺炎链 球菌（S.pneumoniae）菌毛的骨架蛋白。使用DS 2.5中多重序列比对工具然 后人工修饰以提高比对质量来完成SAL 1486和RrgB之间和SAI 1115和RrgB 之间的逐对序列比对。用来自DS 2.5的蛋白建模模块的MODELER[248]生成 所述模型，进行蛋白的同源建模和环精细化（loop refining）。生成了10个模 型，并且选择在模板晶体结构的踪迹（trace）（Cα原子）方面有最小RMS 偏差的模型以用于进一步精细化（refinement）和确证。用DS 2.5中的验证概 况（verify Profile）-3D模块检查就SAL 1486获得的精细（refined）结构质 量，并且使用DS 2.5通过拉氏图（Ramachandran）检测其立体化学质量。为 了在就SAI 1511生成的结构中优化特环区域，使用基于CHARMm和Looper 分子机制的DS 2.5环精细化（loop refinement）模块。最终，使用DS 2.5的 比对结构模块叠合生成的所述模型结构。

蛋白质结晶

在96孔微批量板(格雷纳公司（Greiner）)使用Orxy 8.0结晶化机器人(道 格拉斯仪器公司（Douglas Instruments）)设定结晶化试验。BP-2a-515的晶体 在0.5μl滴中20°C 1-2周后生长，所述滴由10mM HEPES pH 7.0中的0.3μl 蛋白(180mg/ml)和0.2μl结晶溶液(25%(w/v)PEG 4000、0.1M HEPES pH 7.0和90mM酒石酸钾钠四水合物)组成，用以1:1比率混合的硅油和石蜡分 层。在包含沉淀剂浓度增加(40%(w/v)PEG4000)的结晶溶液中冷冻保护晶 体。晶体属于正交晶系P2₁2₁2₁空间群，具有不对称单位中出现的两条BP-2a 515链，和预测的53%溶剂含量。

结构解析与精细化(refinement)

来自单个结晶的衍射数据用欧洲同步辐射装置（European Synchrotron Radiation Facility）(法国格勒诺布尔;束线ID23-1)以分辨率收集。使 用从CCP4程序组(34)可用的imosflm(32)和SCALA(33)处理数据。通过使用 程序Molrep(35)和来自肺炎链球菌的菌毛骨架蛋白(RrgB)结构(15)(PDB 2X9W)作为搜索模型通过分子取代解析BP-2a-515的晶体结构。使用 ARP/wARP(36)延伸初始Molrep输出模型。使用REFMAC 5(37)精细化所述结 构，并且使用Coot(38)建模成电子密度图。精细化的后期包含翻译-振动-螺旋 （translational-libration-screw）(TLS)选项(39)。在模型构建和精细化中，显 然所述蛋白在N末端被剪切，缺少约190个残基，如前面就RrgB所观察的 (15)。根据使用MolProbity(http://molprobity.biochem.duke.edu/)(40,41)进行的 确认，最终模型显示优化的立体化学几何参数，99.1%的残基在拉氏图的最有 利区，没有离群值（outlier）。BP-2a-515残基190-640的原子坐标和结构因 子保存于蛋白数据库，新泽西州新布兰斯维克的罗格斯大学 (http://www.rcsb.org)结构生物信息学研究联合实验室（Research Collaboratory for Structural Bioinformatics），登录代码2XTL(涉及加入PDB的参考文献: Berman,H.M.,等，The Protein Data Bank（《蛋白数据库》）.Nucleic Acids Res, 2000.28(1):第235-42页)。

菌株和生长条件

本研究中使用的GBS株系为2603V/R(血清型V)、515(Ia)、CJB111(V)、 H36B(血清型Ib)、5401(II)和3050(II)。细菌生长于37°C的托-休二氏培养基 （THB;迪菲克实验室（Difco Laboratories））或补充有5%绵羊血的胰蛋白 酶大豆琼脂中。

重组蛋白和抗血清的克隆、表达、纯化。

GBS菌株515和H36B用作克隆序列的DNA来源，所述序列编码BP-2a 515和H36B等位基因变体的单一结构域（D1、D2、D3和D4）。通过革兰氏 阳性菌标准方案用NucleoSpin组织试剂盒（MN公司（Machery-Nagel））按 照生产商说明分离基因组DNA。对应每个结构域的基因首先克隆到载体 pENTR^TM/TEV/D-TOPO(英杰公司（Invitrogen）)并且然后使用GATEWAY 克隆系统(英杰公司)亚克隆到pET54DEST载体(N末端6xHIS标签)或pET59 DEST(N末端6xHis-TRX标签)(诺瓦基公司（Novagen）)，除了SAI 1511的 D3结构域，其通过PIPE克隆方法克隆到pSpeedET载体[249]。使用的寡聚物 列于表1。所得的构建体进行检查测序，并且然后转化进大肠杆菌BL21(DE3) (诺瓦基公司)以表达为带6His-或TRX-标签的融合蛋白。

与515、CJB111和2603等位基因变体(分别为TIGR注释SAL1486、 SAM1372和SAG1407)对应，全长重组BP-2a蛋白如前述生成[2]，而全长H36B 变体(TIGR注释SAI 1511)使用株H36B作为DNA来源克隆到pET24b+(诺瓦 基公司)。设计引物以扩增没有信号肽的编码区域以及起始于LPXTG基序的 3'末端序列。

从GENEART合成构建编码BP-2a融合蛋白、6XD3和4XD3-H的基因。 然后在大肠杆菌HK100菌株中使用PIPE克隆将所述6XD3基因克隆到适用于 内部的pET15载体中。使用NdeI和XhoI限制性酶将所述4XD3-H基因亚克 隆到表达载体pColdI(N末端6xHIS标签,塔卡拉公司（Takara）)。最终构建 体进行测序并转化到BL21(DE3)(诺瓦基公司)。

为了表达重组蛋白，对于pET克隆，培养物用1mM IPTG诱导后在25°C 维持5小时，或对于SpeedET克隆用0.2%阿拉伯糖。所有重组蛋白用亲和色 谱和凝胶过滤纯化。简单的说，通过离心收获细胞并在“裂解缓冲液”中裂解， 所述缓冲液含溶于PBS的10mM咪唑、1mg\ml溶菌酶、0.5mg\ml DNA酶和 COMPLETE抑制剂混合物(罗氏公司（Roche）)。裂解物离心澄清并应用在含 10mM咪唑的PBS中预平衡的His捕获HP柱(安玛西亚生物科学公司 （Armesham Biosciences）)。用20mM和50mM咪唑缓冲液进行两次清洗步骤 后，用含250mM咪唑的相同缓冲液进行蛋白洗脱。然后浓缩所洗脱的蛋白并 且加载到用PBS预平衡的HiLoad 16/60Superdex 75(安玛西亚生物科学公司 （Amersham Biosciences）)。为了表达，4XD3-H维持于37°C直到OD 600nm 达到0.7的值，并且在1mM IPTG存在下诱导后，温度转换到20°C且培养物 在此温度维持过夜。纯组分的蛋白浓度用BCA试验（皮尔斯公司（PIERCE）） 评估。

通过用前述纯的重组蛋白免疫CD1小鼠来生产对各蛋白特异的抗血清 [250]。由ELISA监控所收集血清中的蛋白特异性免疫反应（总Ig）。

定点诱变

为了生成所含赖氨酸残基在异肽键中突变成丙氨酸的BP-2a 515变体的 突变形式，引入突变到载有LPXTG基序的野生型BP-2a 515变体中。用于扩 增编码有LPXTG基序的BP-2a 515与LPXTG基序的基因的引物列举于表1。 使用PIPE方法进行定点诱变，并且设计每个突变的正向和反向引物对，如表 1所列。将野生型蛋白和突变形式克隆到SpeedET载体(N末端6xHis标签)并 在大肠杆菌HK100菌株中表达。通过DNA测序确认所得构建体的序列。蛋白 通过上述亲和色谱和凝胶过滤纯化。

流式细胞术

针对515和H36B变体的已纯化缺失突变体产生的小鼠血清用流式细胞仪 在全细菌上分析以评价对应结构域的表面暴露。存在0.08%(wt/vol)多聚甲醛 时固定指数期细菌细胞并37°C孵育1小时。然后固定的细菌用PBS清洗一次， 在新生牛血清(西格玛公司（Sigma）)中重悬并25°C孵育20分钟。所述细胞 然后在预免疫或免疫血清中4°C孵育1小时，在稀释缓冲液(PBS,20%新生 牛血清,0.1%BSA)中1:200稀释。细胞在PBS-01%BSA中清洗并用R-藻红蛋 白偶联的F(ab)2山羊抗小鼠IgG(杰克逊免疫研究实验室公司（Jackson ImmunoResearch Laboratories;Inc.）)的1:100稀释液于4°C再孵育1小时。清 洗后，细胞在PBS中重悬并用FACS Calibur设备(新泽西州富兰克林湖市的 BD公司(Becton Dickinson))分析，使用FlowJo软件(俄勒冈州艾士兰的树星公 司(Tree Star))。数据表示为用免疫血清相比预免疫血清染色的细胞间的荧光差 异。

免疫印迹

B型链球菌（Streptococcus）株在THB(美国密歇根州底特律的迪菲克 实验室（Difco Laboratories）)中生长过夜到对数期(OD600=0.5)。细菌成团， 在PBS中洗涤并且在包含400单位变溶菌素(西格玛-艾尔德里奇公司 （Sigma-Aldrich）)的50mM Tris-HCl中重新悬浮。细菌悬浮液然后在37°C孵 育2小时，通过冻融裂解。在14000rpm离心10min除去细胞碎片，并用伯 乐（Bio-Rad）蛋白试验测量蛋白浓度。通过4-12%NuPage Novex预制凝胶(英 杰公司（Invitrogen）)分离总细胞蛋白并用iBlot^TM干印迹系统(英杰公司)将其 电转到PVDF膜上。在含0.05%吐温20和10%脱脂奶的1X磷酸盐缓冲盐水 （PBS:140mM NaCl,2.7mM KCl,10mM Na2HPO4和1.8mm KH2PO4,pH 7.3）中室温封闭1小时后，膜和1:500稀释的一抗室温(RT)孵育1小时。用含 0.05%吐温20的PBS(PBST)清洗三次后，所述膜用辣根过氧化物酶偶联的二抗 （大科公司（Dako））孵育1小时。用Opti-4CN底物试剂盒(伯乐公司（Bio-Rad）) 观察阳性条带。

调理吞噬作用试验

使用不同的HL-60作为吞噬细胞和菌株515、CJB111、3050和5401作为 靶标细胞进行调理吞噬作用试验。在托-休二氏（Todd-Hewitt）培养基(THB) 中生长GBS株到对数期中期(A650nm=0.3)。细菌通过离心收集，用冷的盐水 溶液洗涤两次，并且最终在HBSS缓冲液(英杰公司)中重新悬浮到≈1.2x10⁷CFU/ml的浓度。前髓细胞性HL-60细胞(ATCC,CCL-240)在包含10%Fetal 克隆I(海克隆公司(HyClone))的RPMI 1640(吉布科(Gibco)，英杰公司 (Invitrogen))中于37°C，5%CO2扩增，并且通过向生长培养基中加入100mM N,N二甲基甲酰胺(DMF,西格玛公司)，细胞分化成粒细胞样细胞到浓度 4x10⁵细胞/ml。4天后，细胞通过离心收集并且在HBSS缓冲液中重新悬浮到 浓度细胞/ml。简言之，在包含≈3x10⁶分化的HL-60、≈1,5x10⁵CFU 的GBS细胞、10%幼兔补体(塞得兰公司(Cedarlane))和热灭活小鼠抗血清的 125μl总体积中于37°C发生反应1小时，在600rpm振荡。紧接孵育前后1 小时，25-μl等分样品在无菌水中稀释，并且接种到有5%绵羊血的胰蛋白酶 大豆琼脂板中。每个实验包含的阴性对照组由包含免疫前血清的反应、没有 HL-60的反应和有热灭活补体的反应组成。通过将0时间点CFU数目的对数 值减去1小时试验存活菌落数目的对数值测定调理吞噬细胞杀伤的量(对数 （Log）杀灭)。

小鼠活性母体免疫模型

GBS感染的母体免疫/新生幼仔攻击模型用于证实前述小鼠中产生的 蛋白的保护效力(Maione等,2005)。简单地说，CD-1雌小鼠（6-8周龄）在 第1天（CFA中）、21天和35天（IFA）用PBS或20mg重组蛋白免疫， 最后一次免疫后饲养3天。出生48小时内，幼仔腹膜内注射一定剂量的不 同GBS株系，该剂量计算成引起90%致死率。攻击后监控2天幼仔的存活。 用菲希尔精确检验进行统计分析。所有动物研究按照高级卫生研究所 （Istituto Superiore di Sanità）(意大利)的指南进行。

结果

我们已经显示B型链球菌中菌毛2a骨架蛋白(BP-2a)能在小鼠中赋予 活性母体/幼仔攻击模型内的保护[1]。然而，7个高度可变的等位基因变体 的存在和每个变体赋予仅针对同源菌株保护的证明限制了在针对GBS的广 谱疫苗中单独使用此抗原或与其他抗原联用的可能性[2]。然而，BP-2a是 感兴趣的抗原，因为在出现特异抗体的调理吞噬试验中检测时，其能促进 高水平的GBS调理杀伤。我们使用这个特异性特征以探索此抗原的保护能 力和鉴定BP-2a的优势免疫表位。

BP-2a 515变体的同源比较建模

为了设计BP-2a的合适缺失突变体，进行蛋白的结构鉴定，首先通过 同源比较建模聚焦515变体(TIGR注释SAL 1486)。搜索PDB中与BP-2a 有显著序列相同性的蛋白。发现的最佳模板结构是PBD代码650，对应于 肺炎链球菌的RrgB菌毛蛋白。RrgB结晶包含残基187-647的区域，并且 排列在三个免疫球蛋白样结构域中，每个结构域载有稳定异肽键。前两个 结构域（D2和D3）紧密堆积以形成致密结构，其中两个反平行螺旋和第 三结构域（D4）突出。PDB 650结晶不包含RrgB蛋白的第一结构域(D1)。

比对BP-2a 515变体和RrgB的氨基酸序列并且报告了共有43%的序列 相同性和61%的序列相似性。序列比较揭示了菌毛蛋白基序YPK、E-盒表 达盒、LPXTG基序和所有参与异肽键的残基保守性良好(图1A)。进一步 手工优化成对比对以处理二级结构，从而精细化同源建模过程输入（input）。 模型的质量通过用概况（Profile）-3D模块(加利福尼亚州圣地亚哥的 Discovery Studio 2.5软件公司)计算相容性评分来评价。与预期的高评分值 201.7和低评分值90.7相比，所述模板报告评分168.6。BP-2a-515的最佳 模型报告了由Profile-3D为154计算的验证评分，而这个模型的最小和最 大可能评分分别是92.2379和204.973。鉴于甚至模板晶体结构没有达到正 确折叠蛋白的期望评分，所述模型获得与结晶评分相当的验证评分。

如图1B所示，对应氨基酸残基191–640的蛋白模型显示三个IgG-样 折叠结构域(D2、D3和D4)，每个特征为有稳定异肽键。对生成模型叠加 模板结构，获得低至的RMSD，意味着BP-2a的序列与模板结构拟合 良好。仅鉴定了都由于短残基插入或删除引起的环中微小差异。另外，结 晶化异肽键的叠加显示键附近的区域相对保守。特别地，催化键的谷氨酸 或天冬氨酸（aspartatic acid）完全浸没在周围的疏水性腔中。在BP-2a 515 变体中，参与异肽键的残基是：D2结构域中的Lys199-Asn325，有Asp 247 作为催化和稳定残基；D3结构域中的Lys355-Asn437，有Glu416；和D4 结构域中的Lys463-Asn636，有Glu589。根据BP-2a蛋白的N末端部分(残 基1-190)的二级结构和折叠预测，假设这部分有D2、D3和D4相同的IgG 样折叠(数据未显示)。

质谱分析确认出现三个内部异肽键。

纯化重组的全长SAL 1486并且用于确认出现建模研究假设的异肽键。 选择用于鉴定的方法是基于有Lys-C的不同构建体的总体消化和消化产物 的质谱分析。为了简单分选键肽，用O甲基异脲衍生消化产物，所示O甲 基异脲修饰高精氨酸的C末端赖氨酸，就每个修饰的C末端而言增加42Da 质量。异肽键肽显示42D(部分衍生)和84Da(全部衍生)的质量偏移。蛋白 对“溶液中”酶消化有抗性(数据未显示)。允许更大肽覆盖的方法从 SDS-PAGE上运行的多肽“凝胶中”消化获得。图2显示了从全长重组 SAL 1486获得的质谱，从而能确认假设的异肽。

m/z 1762.05Da的分子离子证明了蛋白D4结构域载有的异肽键参与氨 基酸，所述分子离子对应于通过异肽键连接肽⁶³⁰DAQQVINKK⁶³⁸的(期望分 子量为1761.90Da)的肽⁴⁶¹FVKTNK⁴⁶⁶的分子量(图2A,上图)。胍基化反应 诱导分别对应单个和两个C末端肽衍生化的42和84Da信号偏移，确认了 两个肽的共价连接。以相同的方式，从m/z 2145.18和4040.85的离子中分 配结构域D2和D3中的异肽键，所述离子分别对应连接肽¹³⁹NNK^l41(期望 分子量为2145.13 Da)的肽^53ITVNKTWAVDGNEVNK⁶⁸的分子量，和通过 异肽键连接肽⁶⁸NTETKPQVDKNFADK⁸²(期望分子量为4040.07 Da)的肽 ¹⁸⁵ITYSATLNGSAVVEVLETNDVK²⁰⁶(图2B和2C)。胍基化反应通过42 和84 Da的双质量偏移确认肽的共价连接。值得注意的是对应全长重组蛋 白D1结构域的N末端部分中没有鉴定到异肽键。

为了确认赖氨酸参与严格对应结构模型所预测K199、K355和K463 的D2、D3和D4结构域的异肽键，由定点诱变生成蛋白的重组形式，其中 三个赖氨酸残基突变成丙氨酸残基(K199A/K355A/K463A)。使用酶消化和 质谱分析的相同方案，并且没有鉴定出对应异肽相连肽和上面报道的信号 (数据未显示)。

BP-2a-515菌毛亚基的X射线晶体结构

为了鉴定有保护表位的结构域，BP-2a-515的晶体结构通过分子取代在 分辨率解析并精细化。数据的收集和精细化统计示于表2。确证所述 晶体不对称单位包含两条独立链的二聚体(A：残基192-640和B：残基 190-641)，各由三个不同的结构域组成：D2(残基190-332)、D3(残基333-455) 和D4(残基456-641)(图7)。观察到的BP-2a-515二聚体没有显示结合表面 处的广泛分子间相互作用，因此不预期溶液中产生所述二聚体，并且这很 可能是晶体堆积的结果，如欧洲生物信息研究所(European Bioinformatics Institute)的蛋白界面、表面和组装(PISA)服务(Protein Interfaces，Surfaces and    Assemblies    (PISA)    Service    )    所    示    [25 1] (http://www.ebi.ac.uk/msd-srv/prot_int/pistart.html)。

尽管使用全长蛋白进行晶体化，但晶体中缺失N末端(D1结构域)的约 190氨基酸，提示其在结晶化前被切割。报道了肺炎球菌RrgB菌毛蛋白的 相似特性，其结构近期以分辨率解析[252]并且与BP-2a-515结构高度 同源。

结晶溶液中出现的酒石酸钾钠与优化晶体生长和提高衍射分辨率有 关。事实上，结构中三个关键性和稳定位点上结合三个钾阳离子。两个(相 同配位的)钾阳离子在两条链的D2结构域上结合并稳定柔性接头，通过从 结构域D2、D3贡献残基来连接D3和D4结构域与水分子(图7)。第三个钾 阳离子稳定链A中D4结构域的柔性环。

证实三个结构域的组成以显示修饰的IgG折叠[252]，这是已就肺炎链 球菌的RrgB观察到的结构特征。确实，使用成对结构比对C-α匹配程序来 叠加BP-2a-515链B和RrgB的C-α原子 (http://bioinfo3d.cs.tau.ac.il/c_alpha_match/)，产生280/452残基上的 r.m.s.d值。两个蛋白之间的主要的结构差异涉及D3结构域的空间定位，通 过RrgB中没有出现的两个β链连接到β夹心的D4结构域中两个α螺旋的 移动，和柔性区域。

与RrgB相似，通过赖氨酸侧链的ε氨基和天冬酰胺的δ-氨基甲酰基之 间形成的稳定、共价分子内异肽键鉴定各结构域。三个异肽键在Lys199和 Asn325(D2结构域)、Lys437和Asn355(D3结构域)以及Lys463和Asn636 (D4结构域)之间产生，并且稳定其各自结构域的二级结构元件。由于相较 RrgB的D3构象移动，后一种异肽键是唯一一个不与RrgB中等价键的空间 定位匹配的异肽键。这些键周围的区域大部分为疏水性，包含数个芳香族 残基，与就数个菌毛蛋白中异肽键的观察情况一致。

4个结构域D1、D2、D3和D4看来各自独立折叠。这通过在大肠杆菌 中表达和纯化各个结构域来证明，作为根据BP-2a-515晶体结构定义的结 构域边界来选择其N和C末端的独立构建体。在大肠杆菌中以可溶形式表 达所有四个结构域，并且D2、D3和D4的胰蛋白酶消化的质谱分析揭示了 所述结构域载有与全长蛋白中发现的相同异肽键(数据未显示)。这表明独立 表达的结构域总体结构组成得到充分保存以使赖氨酸和天冬酰胺残基处于 合适反应距离。

总之，PI-2a(515等位基因)主链亚基的晶体结构指示所述蛋白组织成4 个结构域，其显示为独立结构化且稳定。

分子内异肽键对保护是非必须的

已经显示对菌毛组装非必须的分子内异肽键有助于菌毛的结构和蛋白 水解稳定性。野生型和突变BP-2a蛋白的SDS-PAGE显示没有异肽键的蛋 白有比野生型形式更慢的电泳迁移率。出现天然蛋白内的内部交联可以使 野生型蛋白结构更加紧密和更能通过凝胶基质，而所述突变形式有运行到 更高分子量的更大结构(图3A)。

为了评价出现这些内部连接是否会影响蛋白BP-2a的保护能力并且研 究所述突变蛋白以及野生型是否能诱导体内保护免疫，测试小鼠母体免疫 模型中的两个蛋白[250]。用纯化的重组蛋白免疫成年雌性CD1小鼠组，并 且在三次免疫后，交配小鼠且得到的后代用计算成杀死约90%幼崽的GBS 剂量攻击。用蛋白突变形式观察的高水平保护(表3)显示异肽键的丧失没有 干扰蛋白赋予小鼠保护和引起调理活性抗体的能力(图3B)。

结构域D3高度表面暴露且对保护重要

基于上述结构模型获得的信息，生成BP-2a 515变体的四个缺失突变 体，蛋白分成四个重叠片段，对应由建模预测的四个IgG样结构域(图4A)： D1对应氨基酸30-162的区域;D2对应氨基酸156-338的区域;D3对应 氨基酸332-499的区域;和D4对应氨基酸457-640的区域。

删除片段被克隆，在大肠杆菌中表达和作为带HIS或TRX标签的重组 蛋白纯化，如材料和方法中所述。有趣的是，结构域D2和D3和D4中出 现的异肽键也在这些结构域的单个重组形式中得到鉴定，表明单个结构域 有形成这个共价键的所有必要条件(数据未显示)。

四个纯化的可溶结构域用于免疫CD1小鼠，并且蛋白特异性免疫反应 (即总免疫球蛋白水平)通过ELISA和Western印迹监控。针对每个片段生 成的血清也使用全细菌株515通过流式细胞术分析，从而评价哪个结构域 在从细菌表面突出的多聚化菌毛上暴露。如图4B显示，结构域D3和D4 高度暴露，水平与针对全长蛋白产生的抗血清观察到的相当。使用抗体抗 D2获得弱偏移，表明其不是高度暴露，而D1没有暴露。

为了研究哪个结构域能赋予针对GBS感染的保护，使用来自免疫小鼠 和体内活性母体小鼠免疫/新生幼仔攻击模型的血清进行体外调理吞噬分 析。根据FACS结果，只有结构域D3和D4结构域能引起调理吞噬抗体并 且赋予小鼠针对GBS感染的保护(图4C和表3和4)。特别地，结构域D3 显示最高水平的表面暴露和调理素活性。

FACS阳性的选择和D3结构域中调理素单抗作图确认蛋白的C末端部 分且特别是D3对保护免疫重要(数据未显示)。

结构域D3代表BP-2a的主要等位基因变体的优势免疫表位

观察到迄今描述的共有48%-98%范围序列同源性的所有等位基因变 体在小鼠模型中有保护性，尽管其仅保护用载有免疫各母亲所用等位基因 变体的菌株攻击的幼仔([2]和数据未显示)。

为了研究用515等位基因获得的结果是否在其他变体中得到确认，应 用上述相同的方法对属于两个主要家族的最具代表性变体(名为515、 CJB 111、H36B和2603)中的优势免疫部分作图。

为了理解BP-2a变体是否共有相同的结构组织，生成H36B等位基因 的新结构模型(TIGR注释SAI 1511)。因为在序列相同性和相似性方面最不 同，所以从515变体中选择这个变体(序列相同性48%)。肺炎链球菌的RrgB 菌毛蛋白用作模板结构(PDB代码:650)。比对SAI 1511和RrgB的氨基酸 序列并且报告其共有38%的序列相同性和56%的序列相似性。如图5A报 道的SAI 1511模型揭示了与515变体相同的模块结构，包含4个IgG样折 叠结构域，其中的3个包含有相对保守周边的内部Lys–Asn异肽。另外， 尽管主要的蛋白结构组织是保守的在H36B变体模型结构 中有两个RrgB晶体结构中没有的插入环。第一个跨越残基200-214，第 二个跨越残基402-410(图5A)。这两个附加环区域的功能仍然未知。

基于结构分析获得的信息，生成H36B变体的缺失突变体，把这个变 体分成四个重叠片段，在大肠杆菌中表达和作为重组蛋白纯化。D1对应氨 基酸30-158的区域;D2对应氨基酸152-350的区域;D3对应氨基酸343- 493的区域;和D4对应氨基酸487-658的区域(图5B)。所述纯化的可溶结 构域用于免疫CD1小鼠，并且在体外和体内保护试验中测试针对每个片段 生成的血清。

如就515变体观察到的，针对结构域D3产生的抗血清在全细菌细胞的 流式细胞仪分析中测试时，显示最高荧光漂移(图5C)，并且当在人多形核 白细胞(PMN)和幼兔补体存在下分析调理吞噬试验时，能促进细菌的有效 杀灭(图5D)。另外，结构域D3赋予针对攻击株的显著保护水平，其中H36B 变体表达良好并且在细菌表面暴露(表5和6)。

还在所有已知的等位基因变体中确证结构域D3作为BP-2a的优势免疫 表位(数据未显示)。例如，如表7所示，来自CJB 111变体的结构域D3赋 予针对用CJB 111株攻击的显著保护水平。另外发现两个单克隆抗体 (17C4/A3和4H11/B7，SEQ ID NO:262-269)结合包含来自515进化支(SEQ ID NO:38，SEQ ID NO:2的片段)D3亚片段内氨基酸411-436(SEQ ID NO: 270)的表位（数据未显示）。

载有保护表位的融合蛋白赋予针对表达不同等位基因的GBS菌株的交 叉保护。

作为不同变体的优势免疫和保护区域的D3结构域的作图然后用于辅 助设计嵌合蛋白以在哺乳动物模型中测试，从而评价这些融合蛋白赋予广 泛保护的能力。

生成两个融合蛋白。第一个融合蛋白6XD3由6个骨架蛋白变体(515、 CJB 111、H36B、DK21、090和2603)中的结构域D3组成(图6A和B)。第 二个融合蛋白4XD3Helix由四个最有代表性变体(515、CJB111、H36B和 2603)的结构域D3加结构域D4的两个突出螺旋组成(图6A和B)。克隆每 个融合蛋白并在大肠杆菌中表达，和作为重组蛋白纯化，如材料和方法中 所报道(图6C)。

所述纯化的融合蛋白用于免疫CD1小鼠，并且在体外和体内保护试验 中测试针对每个融合蛋白生成的血清。为了解所述血清是否能识别包含 BP-2a不同变体的菌毛样结构，进行Western印迹和FACS分析(数据未显 示和图6D)。所述结果显示针对两个融合蛋白生成的免疫血清能识别来自总 提取物的菌毛样结构。调理吞噬实验证实了针对融合蛋白的抗血清能调节 表达BP-2a不同等位基因变体的GBS菌株的补体依赖性吞噬细胞杀灭(图 6E)。另外，来自体内保护模型的数据显示两个融合蛋白能在用表达不同蛋 白变体的菌株攻击的小鼠中引起保护性免疫，并且能因此用作针对GBS感 染的广泛保护性疫苗(表8和9)。最终，表9显示如果使用His标签，维持 6XD3融合的保护效果。

讨论

包含无乳链球菌(GBS)的很多细菌病原体进化出广泛机制以逃脱宿主 的免疫系统或适应环境的变化，例如采用基因变化和/或不同基因表达的策 略。这些策略在病原体引起疾病的能力中起关键作用，并且也解释了为什 么开发针对这些微生物的疫苗是如此困难。测序技术和生物信息学的进步 造成基因组序列信息的指数式增长，并且可获得多个分离物的完整基因组 以用于大量的病原体。多基因组分析揭示了单个物种的菌株之间未预料到 的高度基因变化，启示有效疫苗和药物开发程序。诸如链球菌等物种可以 有相对小的基因组，但是群中非必须基因的总数使得所述物种对适应环境 挑战有足够的灵活性。

近些年在GBS和其他革兰氏阳性病原体中发现的毒力岛如菌毛岛属于 基因组岛种类，其通过水平基因转移获得并且是非必须基因组的典型示例。 因为其提高基因差异，基因组岛在微生物进化中起重要作用。在GBS中鉴 定的三个菌毛岛(名为PI-1、PI-2a和PI-2b)编码其亚基是潜在蛋白疫苗候选 的高分子量结构。然而，由于菌毛蛋白抗原在GBS大亚群的细菌表面不是 普遍地出现、保守和表达，仅更多蛋白的组合适用于广谱疫苗。

菌毛2a骨架蛋白(BP-2a)对菌毛多聚化重要。尽管BP-2a能赋予小鼠保 护和调节活GBS细菌的调理吞噬杀伤（水平与用针对荚膜多糖抗原的抗体 观察到的杀死相当），其在所有菌毛蛋白抗原中具有最高水平的基因差异。 存在BP-2a的至少7个非交叉保护等位基因变体防碍了仅对广谱疫苗使用 此抗原的可能性，除了包含疫苗中鉴定的所有等位基因。

对免疫原性多变体抗原如BP-2a而言，选择蛋白的较小保护性部分(蛋 白的高度表面暴露的IgG样折叠结构域D3)使我们能合理地设计和通过融 合来自不同非交叉反应等位基因的单个优势免疫结构域来生产嵌合蛋白。 这些嵌合物获得在小鼠中针对表达所有BP-2a变体的GBS菌株感染赋予广 泛交叉保护的能力。本文报道的结构和功能分析组合方法与基因工程工具 的应用一起，能生成包含所有BP-2a主要变体的优势免疫结构域且同时保 留选定结构域天然结构设计的融合蛋白。有趣的是，结果显示结构域引起 保护免疫的能力不依赖于内部异肽键的出现。

融合蛋白的交叉保护免疫反应在疫苗开发中具有根本的重要意义，因 为其降低逃逸突变体生成的风险并能针对基因不同的GBS菌株产生保护免 疫反应。

表1：用于本文所述实验的引物

表2.BP-2a-515（分子取代）的数据收集和精细化统计。采用一个晶体 解析所述结构。括号内的值用于最高分辨率壳。

表3：活性母体小鼠免疫/新生幼仔攻击模型的结果以确定由针对B型 链球菌515菌株的GBS59515变体单个结构域赋予的保护。由针对GBS 515 菌株的BP-2a 515变体单个结构域赋予的保护通过活性母体小鼠免疫/新生 幼仔攻击模型来评价。保护值计算为[(对照中%死亡-疫苗中%死亡)/对照 中%死亡]*100。

表4：针对GBS菌株515的BP-2a-515等位基因单个结构域赋予的保 护由活性母体小鼠免疫/新生幼仔攻击模型来评价。保护值计算为[(对照中% 败血症–疫苗中%败血症)/对照中%败血症]*100。

注：接受3个剂量(在第1、21和35天)的20μg抗原或缓冲液(PBS)与 弗氏佐剂的雌性小鼠组。然后小鼠交配，用计算成诱导90%幼崽败血症的 GBS剂量攻击其后代。*p值，用菲希尔精确检验。

表5：针对GBS菌株515的BP-2a H36B变体单个结构域赋予的保护 由活性母体小鼠免疫/新生幼仔攻击模型来评价。保护值计算为[(对照中% 死亡–疫苗中%死亡)/对照中%死亡]*100。

表6：针对GBS菌株5401（表达H36B BP-2a变体）的BP-2a-H36B 单个结构域赋予的新生儿保护由活性母体小鼠免疫/新生幼仔攻击模型来评 价。保护值计算为[(对照中%败血症–疫苗中%败血症)/对照中%败血 症]*100。

注：接受3个剂量(在第1、21和35天)的20μg抗原或缓冲液(PBS)与 弗氏佐剂组合的雌性小鼠组。然后小鼠交配，用计算成诱导90%幼崽败血 症的GBS剂量攻击其后代。*p值，用菲希尔精确检验。

表7：针对GBS CJB111菌株（表达BP-2a CJB111变体）的BP-2a-CJB111 变体单个结构域赋予的保护由活性母体小鼠免疫/新生幼仔攻击模型来评 价。保护值计算为[(对照中%败血症-疫苗中%败血症)/对照中%败血 症]*100。

注：接受3个剂量(在第1、21和35天)的20μg抗原或缓冲液(PBS)与 弗氏佐剂的雌性小鼠组。然后小鼠交配，用计算成诱导90%幼崽败血症的 GBS剂量攻击其后代。*p值，用菲希尔精确检验。

表8：由针对GBS菌株组（表达不同的BP-2a等位基因变体）的融合 蛋白赋予活性母体小鼠免疫/新生幼仔攻击模型的保护。保护值计算为[(对 照中%死亡–疫苗中%死亡)/对照中%死亡]*100。

表9：由针对GBS菌株组（表达不同的BP-2a等位基因变体）的融合 蛋白6xD3赋予活性母体小鼠免疫/新生幼仔攻击模型的保护。保护值计算 为[(对照中%败血症-疫苗中%败血症)/对照中%败血症]*100。

注：接受3个剂量(在第1、21和35天)的20μg抗原或缓冲液(PBS)与 弗氏佐剂的雌性小鼠组。然后小鼠交配，用计算成诱导90%幼崽败血症的 GBS剂量攻击其后代。

*p值，p<.0001，用菲希尔精确检验。

表10：由针对GBS菌株组的有和没有标签的融合蛋白赋予活性母体小 鼠免疫/新生幼仔攻击模型的保护。

序列表

SEQ ID NO:1(GBS592603)

SEQ ID NO:2(GBS59515)

SEQ ID NO:3(GBS59cjb111)

SEQ ID NO:4(GBS59h36b)

SEQ ID NO:5(GBS59CJB110)

SEQ ID NO:6(GBS59DK21)

SEQ ID NO:7(GBS59NEM316)

SEQ ID NO:8(D12603)

SEQ ID NO:9(D22603)

SEQ ID NO:10(D32603)

SEQ ID NO:11(D42603)

SEQ ID NO:12(D1515)

SEQ ID NO:13(D2515)

SEQ ID NO:14(D3515)

SEQ ID NO:15(D4515)

SEQ ID NO:16(cjb111D1)

SEQ ID NO:17(cjb111D2)

SEQ ID NO:18(cjb111D3)

SEQ ID NO:19(cjb111D4)

SEQ ID NO:20(h36b D1)

SEQ ID NO:21(h36b D2)

SEQ ID NO:22(h36b D3)

SEQ ID NO:23(h36b D4)

SEQ ID NO:24(CJB110D1)

SEQ ID NO:25(CJB110D2)

SEQ ID NO:26(CJB110D3)

SEQ ID NO:27(CJB110D4)

SEQ ID NO:28(DK21D1)

SEQ ID NO:29(DK21D2)

SEQ ID NO:30(DK21D3)

SEQ ID NO:31(DK21D4)

SEQ ID NO:32(D1NEM316)

SEQ ID NO:33(D2NEM316)

SEQ ID NO:34(D3NEM316)

SEQ ID NO:35(D4NEM316)

SEQ ID NO:36(2603D3亚片段)

SEQ ID NO:37(2603D4H)

SEQ ID NO:38(515D3亚片段)

SEQ ID NO:39(515D4H)

SEQ ID NO:40(cjb111D3亚片段)

SEQ ID NO:41(cjb111D4H)

SEQ ID NO:42(h36b D3亚片段)

SEQ ID NO:43(h36b D4H)

SEQ ID NO:44(CJB110D3亚片段)

SEQ ID NO:45(CJB110D4H)

SEQ ID NO:46(DK21D3亚片段)

SEQ ID NO:47(DK21D4H)

SEQ ID NO:48(NEM316D3亚片段)

SEQ ID NO:49(DK21D4H)

SEQ ID NO:50(2603D3+D4)

SEQ ID NO:51(2603D3+D4H)

SEQ ID NO:52(2603D2+D3+D4)

SEQ ID NO:53(2603D2+D3+D4H)

SEQ ID NO:54(515D3+D4)

SEQ ID NO:55(515D3+D4H)

SEQ ID NO:56(515D2+D3+D4)

SEQ ID NO:57(515D2+D3+D4H)

SEQ ID NO:58(cjb111D3+D4)

SEQ ID NO:59(cjb111D3+D4H)

SEQ ID NO:60(cjb111D2+D3+D4)

SEQ ID NO:61(cjb111D2+D3+D4H)

SEQ ID NO:62(h36b D3+D4)

SEQ ID NO:63(h36b D3+D4H)

SEQ ID NO:64(h36b D2+D3+D4)

SEQ ID NO:65(h36b D2+D3+D4H)

SEQ ID NO:66(CJB110D3+D4)

SEQ ID NO:67(CJB110D3+D4H)

SEQ ID NO:68(CJB110D2+D3+D4)

SEQ ID NO:69(CJB110 D2+D3+D4H)

SEQ ID NO:70(DK21D3+D4)

SEQ ID NO:71(DK21D3+D4H)

SEQ ID NO:72(DK21D2+D3+D4)

SEQ ID NO:73(DK21D2+D3+D4H)

SEQ ID NO:74(NEM316D3+D4)

SEQ ID NO:75(NEM316D3+D4H)

SEQ ID NO:76(NEM316D2+D3+D4)

SEQ ID NO:77(NEM316D2+D3+D4H)

SEQ ID NO:78(D3的515短片段)

SEQ ID NO:79(his标签)

SEQ ID NO:80(接头)

SEQ ID NO:81(接头)

SEQ ID NO:82(接头)

SEQ ID NO:83(融合E)

SEQ ID NO:84(融合F)

SEQ ID NO:85(融合G)

SEQ ID NO:86(融合H)

SEQ ID NO:87(融合I)

SEQ ID NO:88(编码融合E)

SEQ ID NO:89(编码融合F)

SEQ ID NO:90(编码融合G)

SEQ ID NO:91(编码融合H)

SEQ ID NO:92(编码融合I)

SEQ ID NO:93(编码融合E-大肠杆菌优化)

SEQ ID NO:94(编码融合F-大肠杆菌优化)

SEQ ID NO:95(编码融合G-大肠杆菌优化)

SEQ ID NO:96(编码融合H-大肠杆菌优化)

SEQ ID NO:97(编码融合I-大肠杆菌优化)

SEQ ID NO:98(IC佐剂)

SEQ ID NO:99(聚阳离子肽佐剂)

SEQ ID NO:100(编码GBS592603)

SEQ ID NO:101(编码GBS59515)

SEQ ID NO:102(编码GBS59cjb111)

SEQ ID NO:103(编码GBS59h36b)

SEQ ID NO:104(编码GBS59CJB 110)

SEQ ID NO:105(编码GBS59DK21)

SEQ ID NO:106(编码GBS59NEM316)

SEQ ID NO:107(编码2603D1)

SEQ ID NO:108(编码2603D2)

SEQ ID NO:109(编码2603D3)

SEQ ID NO:110(编码2603D4)

SEQ ID NO:111(编码515D1)

SEQ ID NO:112(编码515D2)

SEQ ID NO:113(编码515D3)

SEQ ID NO:114(编码515D4)

SEQ ID NO:115(编码cjb111D1)

SEQ ID NO:116(编码cjb111D2)

SEQ ID NO:117(编码cjb111D3)

SEQ ID NO:118(编码cjb111D4)

SEQ ID NO:119(编码h36b D1)

SEQ ID NO:120(编码h36b D2)

SEQ ID NO:121(编码h36b D3)

SEQ ID NO:122(编码h36b D4)

SEQ ID NO:123(编码CJB110D1)

SEQ ID NO:124(编码CJB110D2)

SEQ ID NO:125(编码CJB110D3)

SEQ ID NO:126(编码CJB110D4)

SEQ ID NO:127(编码DK21D1)

SEQ ID NO:128(编码DK21D2)

SEQ ID NO:129(编码DK21D3)

SEQ ID NO:130(编码DK21D4)

SEQ ID NO:131(编码NEM316D1)

SEQ ID NO:132(编码NEM316D2)

SEQ ID NO:133(编码NEM316D3)

SEQ ID NO:134(编码NEM316D4)

SEQ ID NO:135(编码2603D3亚片段)

SEQ ID NO:136(编码2603D4H)

SEQ ID NO:137(编码515D3亚片段)

SEQ ID NO:138(编码515D4H)

SEQ ID NO:139(编码cjb 111D3亚片段)

SEQ ID NO:140(编码cjb111D4H)

SEQ ID NO:141(编码h36b D3亚片段)

SEQ ID NO:142(编码h36b D4H)

SEQ ID NO:143(编码CJB110D3亚片段)

SEQ ID NO:144(编码CJB110D4H)

SEQ ID NO:145(编码DK21D3亚片段)

SEQ ID NO:146(编码DK21D4H)

SEQ ID NO:147(编码NEM316D3亚片段)

SEQ ID NO:148(编码NEM316D4H)

SEQ ID NO:149(编码2603D3+D4)

SEQ ID NO:150(编码2603D3+D4H)

SEQ ID NO:151(编码2603D2+D3+D4)

SEQ ID NO:152(编码2603D2+D3+D4H)

SEQ ID NO:153(编码515D3+D4)

SEQ ID NO:154(编码515D3+D4H)

SEQ ID NO:155(编码515D2+D3+D4)

SEQ ID NO:156(编码515D2+D3+D4H)

SEQ ID NO:157(编码cjb111D3+D4)

SEQ ID NO:158(编码cjb111D3+D4H)

SEQ ID NO:159(编码cjb111D2+D3+D4)

SEQ ID NO:160(编码cjb111D2+D3+D4H)

SEQ ID NO:161(编码h36b D3+D4)

SEQ ID NO:162(编码h36b D3+D4H)

SEQ ID NO:163(编码h36b D2+D3+D4)

SEQ ID NO:164(编码h36b D2+D3+D4H)

SEQ ID NO:165(编码CJB110D3+D4)

SEQ ID NO:166(编码CJB110D3+D4H)

SEQ ID NO:167(编码CJB110D2+D3+D4)

SEQ ID NO:168(编码CJB110D2+D3+D4H)

SEQ ID NO:169(编码DK21D3+D4)

SEQ ID NO:170(编码DK21D3+D4H)

SEQ ID NO:171(编码DK21D2+D3+D4)

SEQ ID NO:172(编码DK21D2+D3+D4H)

SEQ ID NO:173(编码NEM316D3+D4)

SEQ ID NO:174(编码NEM D3+D4H)

SEQ ID NO:175(编码NEM316D2+D3+D4)

SEQ ID NO:176(编码NEM316D2+D3+D4H)

SEQ ID NO:177(GBS802603)

SEQ ID NO:178(没有前导序列的GBS802603)

SEQ ID NO:179(没有跨膜/胞质区的GBS802603)

SEQ ID NO:180(没有跨膜/胞质区和细胞壁锚的GBS802603)

SEQ ID NO:181(没有细胞外结构域的GBS802603)

SEQ ID NO:182(GBS802603的N末端免疫原性片段)

SEQ ID NO:183(GBS672603)

SEQ ID NO:184(没有跨膜区的GBS672603)

SEQ ID NO:185(没有跨膜和细胞壁锚定基序的GBS672603)

SEQ ID NO:186(GBS672603的N末端片段)

SEQ ID NO:187(GBS672603的N末端片段)

SEQ ID NO:188(GBS67h36b)

SEQ ID NO:189(GBS67h36b的N末端片段)

SEQ ID NO:190(GBS67h36b的N末端片段)

SEQ ID NO:191(GBS67CJB110)

SEQ ID NO:192(GBS67CJB 111的N末端片段)

SEQ ID NO:193(GBS67CJB 111的N末端片段)

SEQ ID NO:194(GBS67515)

SEQ ID NO:195(GBS67515的N末端片段)

SEQ ID NO:196(GBS67515的N末端片段)

SEQ ID NO:197(GBS67NEM316)

SEQ ID NO:198(GBS67NEM316的N末端片段)

SEQ ID NO:199(GBS67NEM316的N末端片段)

SEQ ID NO:200(GBS67DK21)

SEQ ID NO:201(GBS67DK21的N末端片段)

SEQ ID NO:202(GBS67DK21的N末端片段)

SEQ ID NO:203(GBS67CJB110)

SEQ ID NO:204(GBS67CJB110的N末端片段)

SEQ ID NO:205(GBS67CJB110的N末端片段)

SEQ ID NO:206(GBS1523COH1)

SEQ ID NO:207(没有信号序列区的GBS1523COH1)

SEQ ID NO:208(有位点41处突变的GBS1523COH1)

SEQ ID NO:209(GBS80-GBS 1523杂交体)

SEQ ID NO:210(GBS80-GBS1523杂交体)

SEQ ID NO:211(GBS80-GBS1523杂交体)

SEQ ID NO:212(GBS80-GBS1523杂交体)

SEQ ID NO:213(GBS1042603)

SEQ ID NO:214(GBS1524)

SEQ ID NO:215(GBS32603)

SEQ ID NO:216(没有信号序列区的GBS32603)

SEQ ID NO:217(GBS32603卷曲螺旋和富脯氨酸区段)

SEQ ID NO:218(GBS32603信号序列和卷曲螺旋)

SEQ ID NO:219(GBS32603卷曲螺旋区段)

SEQ ID NO:220(GBS32603信号序列、卷曲螺旋和富脯氨酸区段)

SEQ ID NO:221(GBS3515)

SEQ ID NO:222(GBS3cjb111)

SEQ ID NO:223(GBS3coh1)

SEQ ID NO:224(SAN1485coh1)

SEQ ID NO:225(GBS1472603)

SEQ ID NO:226(GBS3282603)

SEQ ID NO:227(GBS842603)

SEQ ID NO:228-261(引物)

SEQ ID NO:262(4H11/B7-VH DNA序列)

SEQ ID NO:263(4H11/B7-VH氨基酸序列)

SEQ ID NO:264(4H11/B7-VLk DNA序列)

SEQ ID NO:265(4H11/B7-VLk氨基酸序列)

SEQ ID NO:266(17C4/A3-VH DNA序列)

SEQ ID NO:267(17C4/A3-VH氨基酸序列)

SEQ ID NO:268(17C4/A3-VLk DNA序列)

SEQ ID NO:269(17C4/A3-VLk氨基酸序列)

SEQ ID NO:270(4H11/B7和17C4/A3结合的D3表位)

SEQ ID NO:271(RrgB)

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