人工设计的抗HIV感染多肽、组合物以及用途

摘要

本发明属于生物医药领域，涉及一种人工设计的抗HIV感染的多肽，具体地，涉及式IX

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种人工设计的、非天然序列的抗HIV感染多肽，具体地，涉及式I所示的多肽、其衍生物、其立体异构体、或其无生理毒性的盐。本发明还涉及含有上述的式I多肽、其衍生物、其立体异构体、或其无生理毒性的盐的药物组合物，以及式I多肽、其衍生物、其立体异构体、或其无生理毒性的盐在治疗或预防HIV感染所致相关疾病尤其是获得性免疫缺陷综合征(AIDS，即艾滋病)的用途。 

X_a1AAX_d1X_e1BB-X_a2AAX_d2X_e2BB-X_a3AAX_d3X_e3BB-X_a4AAX_d4X_e4BB-X_a5AAX_d5X_e5BB         式I。 

背景技术

艾滋病目前在世界范围内流行，给人类健康带来严重威胁。人免疫缺陷病毒I型(HIV-1)是造成AIDS感染的主要病原体。由于传统的逆转录酶抑制剂及蛋白酶抑制剂耐药性问题日益突出，使得开发作用于HIV-1生命周期新靶点药物成为共识。HIV融合抑制剂(HIV fusion inhibitors)是干扰病毒进入靶细胞的新一类抗HIV药物，与传统的酶抑制剂不同，它作用于细胞外，在感染的初始环节切断病毒的传播，这对于预防及控制HIV-1感染具有特殊意义，因而成为新机制抗HIV药物研究的热点。 

HIV融合抑制剂以HIV-1融合蛋白gp41为作用靶标，gp41是介导HIV-1与靶细胞膜融合的功能蛋白质。HIV融合抑制剂通过抑制gp41促进膜融合的核心六聚体结构(6-HB)的形成，从而抑制病毒进入靶细胞。T-20是第一个也是目前唯一上市的HIV-1 融合抑制剂，它是衍生于HIV-1 gp41 CHR功能区的天然序列36肽(称为C肽)，于2003年被FDA批准。T20能够与gp41结合，从而竞争性抑制gp41介导融合的功能性核心结构形成，阻断HIV-1与靶细胞膜的融合过程，抑制病毒感染靶细胞。 

尽管T-20的发现开辟了利用肽类药物控制HIV的新领域，但由于其本身存在的一些缺陷和不足，限制了T20的广泛应用。首先是耐药性，由于T20完全衍生于gp41天然序列，对靶标突变的敏感性高，靶标序列单个氨基酸残基突变即会导致T20活性降低10倍，两个残基突变则会使其活性降低100倍。因此，T20的天然序列虽然最大限度地保持了天然配基的结构，但亦由于靶标HIV-1 gp41序列的高突变性而导致病毒容易对T20产生耐药性。 

其次，T20易被蛋白酶降解，体内生物利用度低。因此，如何克服耐药性以及提高酶解稳定性，是新一代HIV融合抑制剂研究的主要方向。 

目前的HIV-1肽类融合抑制剂，主要是基于活性天然配基序列的优化及改造。如第一代融合抑制剂T-20，C34等是直接衍生于gp41 CHR的天然序列；第二代T1249、西夫韦肽、T1144等则是在天然序列的基础上，对其中非保守氨基酸残基进行删除替换而得到的。由于天然起源序列对耐药性突变的高敏感性，需要探索新的设计思路。 

本发明人提出了基于靶标结构的非天然起源序列的抗HIV活性肽设计思想：基于靶标gp41 NHR螺旋三聚体的三维晶体结构，应用计算机辅助的理性设计方法，从头设计非天然序列的α螺旋肽，模拟天然C肽的活性构象，与靶标结合而产生相应的生物学功能，由此设计全新结构的抗HIV活性多肽。利用非天然序列与天然序列完全非同源性特点，探索抑制耐药性的新思路。由此而 完成了本发明内容。 

发明内容

本发明目的是根据靶标结构，人为设计新的完全非天然序列的抗HIV感染多肽，达到与天然序列相当或更高的抑制HIV感染活性，同时能够抑制T20耐药性HIV毒株。 

本发明的一个方面涉及式I所示的多肽、其衍生物、其立体异构体、或其无生理毒性的盐， 

X_a1AAX_d1X_e1BB-X_a2AAX_d2X_e2BB-X_a3AAX_d3X_e3BB-X_a4AAX_d4X_e4BB-X_a5AAX_d5X_e5BB式I。 

其中， 

X_a1、X_a2、X_a3、X_a4、X_a5分别独立地为D型或L型的天然或非天然的疏水性或亲水性氨基酸； 

A为D型或L型的天然或非天然酸性氨基酸； 

X_d1、X_d2、X_d3、X_d4、X_d5分别独立地为D型或L型的天然或非天然的疏水性氨基酸； 

X_e1、X_e2、X_e3、X_e4、X_e5分别独立地为D型或L型的天然或非天然疏水性氨基酸； 

B为D型或L型的天然或非天然碱性氨基酸； 

本发明所用术语“立体异构体”是指式I多肽的D-或L-立体构型。 

在本发明的一个实施方案中，X_a1、X_a2、X_a3、X_a4、X_a5分别独立地选自D型或L型的如下氨基酸：色氨酸(W)、萘丙氨酸(N_a1)、3-喹啉丙氨酸(Q_a1)、异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)、正亮氨酸(Nle)、亮氨酸(L)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、 天冬酰胺(N)、和谷氨酰胺(Q)； 

A选自D型或L型的谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)； 

X_d1、X_d2、X_d3、X_d4、X_d5分别独立地选自D型或L型的如下氨基酸：谷酰胺(Q)、色氨酸(W)、萘丙氨酸(N_a1)、3-喹啉丙氨酸(Q_a1)、异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)、正亮氨酸(N_1e)、亮氨酸(L)、丙氨酸(A)、天冬酰胺(N)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、和酪氨酸(Y)； 

X_e1、X_e2、X_e3、X_e4、X_e5分别独立地选自D型或L型的如下氨基酸：异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)、正亮氨酸(N_1e)、亮氨酸(L)、丙氨酸(A)丝氨酸(S)、谷酰胺(Q)、天冬酰胺(N)、苏氨酸(T)、和酪氨酸(Y)； 

B选自D型或L型的赖氨酸(K)或精氨酸(R)。 

在本发明的一个实施方案中，所述的式I多肽、其衍生物、其立体异构体、或其无生理毒性的盐，其中，所述式I多肽选自如下的化合物： 

1.WEEWDKK IEELIKK SEELIKK IEEQIKK QEESIKK(SEQ ID NO：1)； 

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67.NEESIKK Q_a1EEQ_a1DKK IEELIKK SEELIKK IEEQIKK(SEQ ID NO：67)； 

68.NEEQIKK Q_a1EEQ_a1DKK IEELIKK SEELIKK IEEQIKK(SEQ ID NO：68)； 

本发明的另一个方面涉及一种药物组合物，其含有至少一种上述的式I多肽、其衍生物、其立体异构体、或其无生理毒性的盐，以及药学上可接受的载体或辅料。 

本发明的还一个方面涉及一种HIV融合抑制剂，其含有至少一种上述的式I多肽、其衍生物、其立体异构体、或其无生理毒性的盐。 

本发明的还一个方面涉及上述的式I多肽、其衍生物、其立体异构体、或其无生理毒性的盐在制备HIV融合抑制剂中的用途。 

本发明的还一个方面涉及上述的式I多肽、其衍生物、其立体异构体、或其无生理毒性的盐在制备用于治疗或预防HIV感染相关疾病尤其是艾滋病的药物中的用途。 

本发明的还一个方面涉及一种治疗或预防HIV感染相关疾病尤其是艾滋病的方法，所述的方法包括对给予接受治疗或者预防的对象有效量的式I多肽、其衍生物、其立体异构体、或其无生理毒性的盐。 

在本发明中，术语“天然”是指自然存在的，未经人为修饰的，如HIV-1 gp41本身的氨基酸序列等。 

在本发明中，术语“非天然”是指人为设计的，与天然不同的，如对直接衍生的天然序列经改造、修饰后的序列等。 

在本发明中，术语“疏水性氨基酸”是指侧链为疏水性基团的氨基酸，包括：Ala，Val，Leu，Ile，Met，Phe，Trp等。 

在本发明中，术语“亲水性氨基酸”是指侧链含有能与水作用形成氢键的亲水基团的氨基酸，包括：Ser，Thr，Cys，Asp，Asn，Glu，Gln，Arg，Lys，His，Tyr等。 

在本发明中，术语“酸性氨基酸”是指侧链含羧基的氨基酸，包括：Glu，Asp等。 

在本发明中，术语“碱性氨基酸”是指侧链含氨基或胍基的氨基酸，包括：Lys，Arg等。 

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。 

在本发明中使用的缩写具有下面的含义： 

AIDS(Acquired Immure Deficiency Syndrome)艾滋病，获得性免疫缺陷综合征 

Ala(Alanine，A)           丙氨酸 

Arg(Arginine，R)          精氨酸 

Asn(Asparagine，N)        天冬酰氨 

Asp(Aspartic acid，D)     天冬氨酸 

DCM(Dichloromethane)              二氯甲烷 

DMF(N，N-Dimethyl malonate)       二甲基甲酰胺 

Env(Envelope glycoprotein)        包膜糖蛋白 

ESI-MS(Electronic spray ion mass spectroscopy)电喷雾质谱 

Fmoc(Fluorenylmethoxycarbonyl)     芴甲氧羰基 

Gly(Glycine，G)                    甘氨酸 

Gln(Glutamine，Q)                  谷酰氨 

Glu(Glutamic acid，E)              谷氨酸 

6-HB(six-helix bundle)             六螺旋体 

HBTU    2-(1H-1-羟基苯并三唑)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸 

His(Histidine，H)                  组氨酸 

HoBt(1-Hydroxylbenzotriazole anhydrous) 1-羟基苯并三氮唑 

NHR(N-terminal heptad repeat，NHR) N末端重复序列 

CHR(C-terminal heptad repeat，CHR) C末端重复序列 

HIV(Human Immunodeficiency Virus)) 人免疫缺陷病毒 

HIV-1                              人免疫缺陷病毒I型 

HPLC(High performance liquid chromatography)高效液相色谱 

Ile(Isoleucine，I)                 异亮氨酸 

Leu(Leucine，L)                    亮氨酸 

N_1e                                正亮氨酸 

Lys(Lys ine，K)                    赖氨酸 

Phe(Phenylalanine，F)              苯丙氨酸 

Ser(Serine，S)                     丝氨酸 

TFA(trifluoroacetic acid)          三氟乙酸 

Thr(Threonie，T)                   苏氨酸 

Trp(Tryptophan，W)                 色氨酸 

Tyr(Tyrosine，Y)                   酪氨酸 

V_al(Valine，V)                     缬氨酸 

N_a1                                萘丙氨酸 

Q_a1                                3-喹啉丙氨酸 

实施例所用固相合成载体Rink酰胺树脂为天津南开合成责任有限公司产品；HBTU、HOBT、DIEA以及Fmoc保护的天然氨基酸为上海吉尔生化公司以及成都诚诺新技术有限责任公司产品； Fmoc保护的萘丙氨酸及喹啉丙氨酸为本实验室合成产品；N-甲基吡咯烷酮(NMP)为ACROS公司产品；三氟乙酸(TFA)为北京博迈杰科技有限公司产品；DMF、DCM为韩国三星公司产品；色谱纯乙腈为Fisher公司产品。其它试剂如无说明均为国产分析纯产品。 

实施例1：化合物6的制备 

采用标准的Fmoc固相多肽合成方法。所有肽序列均C端为酰胺化，N端为乙酰化。选用Rink Amide树脂，氨基酸为L构型，肽链由C端向N端延长。缩合剂为HBTU/HOBt/DIEA。脱保护剂为哌啶/DMF溶液。裂解剂为三氟乙酸(TFA)，粗肽用水溶解后冻干保存。用中压液相色谱Flash或高压液相制备色谱(HPLC)进行分离纯化，纯肽含量＞95％。基质辅助激光解析飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)确证多肽序列分子量。 

使用CEM全自动微波多肽合成仪进行多肽合成，合成条件如下： 

氨基酸：0.2M的DMF溶液， 

活化剂：0.45M HBTU/HOBt的DMF溶液， 

活化碱：2M DIEA的NMP溶液， 

脱保护剂：20％ v/v哌啶的DMF溶液， 

封闭试剂：20％ v/v乙酸酐的DMF溶液。 

称取Rink Amide树脂0.5g(0.25mmol)置入CEM微波多肽合成仪反应器中，然后将氨基酸，活化剂，活化碱，脱保护试剂，封闭试剂按上述浓度配置好后，用CEM微波全自动多肽合成仪进行合成。完成后肽树脂用DMF洗涤3遍后用无水甲醇收缩，室温真空干燥，得肽树脂2.05g。 

裂解液(体积百分比)：三氟乙酸∶乙二硫醇∶间甲酚∶水＝ 82.5∶10∶5∶2.5。 

肽树脂的裂解：称取微波合成仪合成好的肽树脂2.05g，放入250ml茄形瓶中，冰浴，电磁搅拌。按1克肽树脂加入10ml的量配制裂解液。TFA需预先冰浴降温30min或者预先存放于冰箱中使用；将配制好的裂解液加入到冰浴条件下的肽树脂中，电磁搅拌，树脂变橙红色，冰浴条件下反应30min，然后，撤冰浴，室温再继续搅拌反应90min，反应完成。剧烈搅拌下向反应器中加入冷乙醚200ml，析出白色沉淀，继续搅拌30min；用G4的砂芯抽虑漏斗滤出析出物，用冷乙醚反复洗涤3遍，晾干。加入双蒸水50ml，乙腈5ml使固体充分溶解，抽虑，滤液冻干得粗肽1.03g。 

所得粗肽用中压或高压制备色谱进行纯化。色谱柱为C8柱，洗脱剂为乙腈，水及少量三氟乙酸。具体操作步骤：称取粗肽1.00g，加水20ml，乙腈5ml使固体溶解，离心10min(3000转/分钟)，取上清液上样。色谱柱预先用15％乙腈/水/0.1％三氟乙酸溶液200ml平衡。上样后继续用15％乙腈/水/0.1％三氟乙酸溶液200ml冲洗，高效液相检测洗脱液成分。根据液相检测结果逐渐升高乙腈含量，直至所纯化的多肽主峰被洗脱出来。合并洗脱液，旋转蒸发去除有机溶剂，冻干得纯肽，HPLC检测含量大于95％。 

纯肽经MALDI-TOF-MS或者ESI质谱确证其分子量。 

实施例2-68：化合物1-5，7-68的制备 

编号1-编号5，编号，7-编号68的化合物按实施例(1)方法合成，所述氨基酸均为L构型，只是相应的氨基酸残基进行了替换。 

实施例69：抑制HIV-1生物活性检测 

化合物抑制HIV-1介导的细胞-细胞融合活性评价(IC₅₀)： 

染色转移法检测HIV-1介导的细胞-细胞融合：HIV-1_IIIB感染的H9细胞(H9/HIV-1_IIIB)被一种荧光试剂Calcein-AM(MolecularProbes，Inc.，Eugene，OR)标记，然后，在96孔板中每孔加入50μl已标记的H9/HIV-1_IIIB细胞(2×10⁵/ml)，再加入50μl不同浓度的受试样品(所测试实施例1-34和44-53制备的化合物，从250μg/ml浓度两倍梯度稀释)，37℃温育30min；然后每孔加入MT-2细胞100ul(1×10⁶/ml)，37℃温育2h。融合及未融合的Calcein标记HIV-1感染的MT-2细胞(MT-2为一种常用的效应细胞，在本实验中用于模拟HIV感染的靶细胞，商购获得)用反向荧光显微镜(Zeiss，Germany)计数。计算IC₅₀值。 

按照上述方法，活性测定结果见下面的表1。 

表1：多肽抑制HIV介导的细胞融合活性结果 

表1结果表明，受试化合物化合物1-68以均显示了高的抑制HIV-1介导的细胞融合活性。其中化合物1-3、7、8、10、16、19-24、26、29、30、39、62、68抑制HIV-1介导的细胞融合活性水平(IC₅₀)值与T-20以及C34基本相当。 

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。