一种(2E,6E)-2,6-双亚苄基环己酮类似物及其制备方法与应用

摘要

本发明提供了一种（2E，6E）-2,6-双亚苄基环己酮类似物，包括具有通式Ⅲ所示结构的化合物及其药学上可接受的盐，该类化合物具有显著的药理活性。此外，本发明进一步提供了该类化合物的制备方法及作为1型11beta-羟基类固醇脱氢酶（11beta-hydroxysteroid dehydrogenase type I，11b-HSD1）抑制剂在预防和治疗人类糖尿病中的应用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种新化合物，具体地说，涉及一种（2E，6E）-2,6-双亚苄基环己酮类似物及其制备方法与应用。 

背景技术

糖尿病（Diabetes mellitus，DM)是一种世界性疾病，根据WHO报道，2012年12月统计，目前全世界有3.46亿人患有糖尿病。如果没有任何干预这个数据预计到2030年将翻一番，其中80%发生在低中收入国家。DM已成为世界第三大疾病，其发病率和对人类健康的危险性，仅次于癌症和心脑血管病。在我国，目前大约有4000万名糖尿病患者，居全球第二，其中2型DM(T2DM)患者占全部DM的90%～95%。目前，1型糖尿病治疗研究的方向是开发给药方便的胰岛素制剂及胰岛素代用品；而2型糖尿病可用化学药物促使β细胞分泌更多胰岛素，或改善靶组织对胰岛素的敏感性进行治疗，研发新作用机制或新结构类型的高效低毒的抗糖尿病药物已成为国际上新药研发的热点。 

糖皮质激素是胰岛素作用的拮抗剂，它削弱依赖胰岛素的葡萄糖摄取和增加脂类分解，提高肝脏糖异生和通过蛋白水解作用增加基质（Andrew McMaster等,Nature Reviews Endocrinology,2008,4,91），并且直接抑制胰岛β细胞分泌胰岛素（PospísilováY等,Vnitr Lek,2007,53,1,18）。胰岛素抑制肝糖异生，而糖皮质激素增加糖异生，直接或间接激活参与此过程的主要基因或激素，如：胰高血糖素、肝内磷酸烯醇丙酮羧化酶的基因表达(PEPCK)，PEPCK是糖异生的限速酶，它被糖皮质激素反应元件调控，它还会对cAMP r调控元件绑定蛋白(CREB)作用（Gavin P.,Molecular and Cellular Endocrinology,2009,300,2）。糖皮质激素和CREB协同作用诱导过氧化酶体增值激活受体-γ共活化剂1(PGC-1)，它是肝糖异生主要的激活剂(Yoon JC等,Nature,2001,413,131)。另外，糖皮质激素通过抑制转运蛋白4的翻译，对抗胰岛素反应包括抑制胰岛素信号传递和抑制胰岛素刺激葡萄糖摄取（NicholasMichael Morton,Molecular and cellular endocrinology,2010,316,154）。所以糖皮质激素水平的高低直接影响胰岛素的作用。 

糖皮质激素是在下丘脑-垂体-肾上腺-轴线（HPA）控制下，由肾上腺分泌到血液中。然而在HPA决定血液糖皮质激素水平的同时，最近突出的研究表明细胞内11beta羟基类固醇脱氢酶11b-HSDs）调节糖皮质激素水平。因此尽管在一些细胞中有正常的糖皮质激素水平，但是有时会使它处于非活性状态，有时由非活性的转化为活性状态，这些都是由11b-HSD来催化，11b-HSD有两种异构体，11b-HSD1能活化惰性的前体（强的松或11-脱氢皮质酮）变为活化的糖皮质激素（皮质醇或皮质酮），它主要在肝脏、脂肪组织、脑、骨骼肌、平滑肌细胞中具有还原性(T.M.Stulnig1,Diabetologia,2004,47,1)。 

在日常变化过程中血浆活性皮质醇浓度变化较大(1–100nmol/L)。与此相反，非活性可的松没有大的日常变化，在50-100nmol/L波动，与皮质醇比较有较高的自由的血浆浓度（Stewart PM等,Vitam Horm,1999,57,249）。因此，血浆可的松可以当成是非活性的糖皮质激素的贮存池能够不断的提供11b-HSD1还原性以维持局部活性糖皮质激素浓度，在新陈代谢活跃组织中糖皮质激素与胰岛素功能对抗。 

国外学者用转基因小鼠研究得出数据显示11b-HSD1-/-小鼠细胞内糖皮质激素被损伤，它不再与胰岛素抵抗(Erika Harno等,Trends in Endocrinology & Metabolism,2010,21,619) 

因此11b-HSD1抑制剂的研究备受国内外学者的重视，11b-HSD1 抑制作用对糖尿病者的胰岛素敏感性具有积极影响。因为大多数2型糖尿病患者都是肥胖者，其内脏脂肪肥大并且11b-HSD1高表达，抑制剂或者11b-HSD1能够改善糖血症。与非特异性抑制剂11β-HSD对比，肾11b-HSD2抑制剂能够引起高血压和低血钾症，鼠类选择性抑制剂11b-HSD1(BVT.2733)显示在自发性地高血糖症KKAy小鼠中能够降低肝磷酸烯酮式丙酮酸羧激酶PEPCK和葡萄糖-6-磷酸酶mRNA表达，同时降低血糖和血清胰岛素浓度(Malgorzata Wamil等,Drug Discovery Today,2007,12,504)。11b-HSD1人选择性抑制剂已经合成(Barf T等,J Med Chem,2002,45,3813)，11b-HSD1选择性抑制剂能够对胰岛素抵抗或者2型糖尿病肥胖患者有益处。因为在这些失调状态，11b-HSD1表达以组织特异性方式反常调控，在脂肪组织高表达，但在肝脏中低活性，11b-HSD1选择性抑制剂的临床作用能随着它们在脂肪组织和肝脏组织中局部浓度变化而改变。除了在新陈代谢活跃的组织有影响，我们期盼HPAaxis中11b-HSD1诱导改变，因为中枢神经系统11b-HSD1的抑制作用破坏下丘脑垂体肾上腺负反馈。11b-HSD1对于大脑中糖皮质激素活性很重要，并且调控HPA轴。因此下丘脑11β-HSD1的抑制剂能够通过降低局部的皮质醇浓度麻痹负反馈调控，并且导致肾上腺分泌糖皮质激素增多。为了避免11b-HSD1特殊抑制剂对下丘脑的干预，这些药物应该不能穿过血脑屏障。另一方面，中枢神经系统中的11b-HSD1的抑制作用能够保护大脑避免收到老化时糖皮质激素的负面影响(Adam J.Rose等,The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology,2010,122,10)。因此11b-HSD1抑制剂，将会有望成为未来有趣的新型的药物，甚至不仅仅局限于治疗肥胖和2型糖尿病。 

（2E，6E）-2,6-双亚苄基环己酮类似物是主链为不饱和脂族及侧链芳香族基团。需要开发具有更好的抑制11b-HSD1酶活性的（2E，6E）-2,6-双亚苄基环己酮类似物，为日后开发预防和治疗结糖尿病 的药物提供实验和临床基础。 

发明内容

本发明的目的是提供一种具有抑制1型11beta-羟基类固醇脱氢酶的活性的（2E，6E）-2,6-双亚苄基环己酮类似物。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案： 

一种（2E，6E）-2,6-双亚苄基环己酮类似物，包括具有通式Ⅲ所示结构的化合物及其药学上可接受的盐： 

其中：R₁和R₂各自独立选自H、Br、CF₃或者F； 

其中，优选所述的R₁和R₂各自独立选自Br、CF₃或F。 

更优选所述的R₁为Br或F，R₂为CF₃或F，即： 

CYH09 

本发明的另一目的在于提供上述（2E，6E）-2,6-双亚苄基环己酮类似物的制备方法，为实现上述目的，本发明采用如下技术方案： 

上述（2E，6E）-2,6-双亚苄基环己酮类似物的制备方法，具体为：环己酮和卤代苯甲醛在溶剂中，以氢氧化钾或甲醇钠为催化剂，加热回流0.3-2h进行反应，反应温度为20℃-80℃，分离及纯化产物得到目标化合物。 

本发明所述的制备方法中，所述的卤代苯甲醛为2，6二氟苯甲醛、2-溴-6-氟苯甲醛、2-氟-6-三氟甲基苯甲醛、2，6二溴苯甲醛、2，6二氯苯甲醛或2-三氟甲基-6-氟苯甲醛，优选2，6二氟苯甲醛、2-溴-6-氟苯甲醛或2-氟-6-三氟甲基苯甲醛。 

本发明所述的制备方法中，所述的溶剂为乙醇或甲醇。优选所述的溶剂为乙醇。所述溶剂的体积用量为反应物总质量的3-5倍，其中体积单位为ml，质量单位为g，如当酮与醛的总质量为0.5g，溶剂的用量应当为1.5-2.5ml。 

本发明所述的制备方法中，所述环己酮和卤代苯甲醛的摩尔用量比为3:1-2:1，所述催化剂的质量用量为环己酮与卤代苯甲醛总质量的10%-30%，优选所述环己酮和卤代苯甲醛的摩尔用量比为2.2:1，所述催化剂的质量用量为环己酮与卤代苯甲醛总质量的20%。 

本发明所述的制备方法中，反应时间为0.3h-2h，反应温度为20℃-80℃，优选反应时间为1h-1.5h，反应温度为40-50℃，更优选反应时间为1h，反应温度为50℃。 

本发明所述的催化剂中，所述的氢氧化钾为质量浓度为5%的氢氧化钾水溶液，所述的甲醇钠为质量浓度为0.5%的甲醇钠甲醇溶液。 

上述反应结束后，体系中有大量沉淀产生，将其冷至室温，减压抽滤，滤物用少量乙醇冲洗多次，干燥后经硅胶柱层析进行分离纯化，所得产品真空干燥，得到目标产物。本发明对反应结束后产物的分离 及纯化不作特定限定，现有技术公开的多种分离和纯化方法都可以用于实现本发明，本领域技术人员可以对此进行选择合理。 

此外，本发明进一步要求保护上述（2E，6E）-2,6-双亚苄基环己酮类似物在制备预防及治疗人类糖尿病药物中的应用。 

以及，本发明要求保护含有上述（2E，6E）-2,6-双亚苄基环己酮类似物的药物组合物。本发明所述的组合物可含有0.1%-99%本发明化合物，其余为药物学上可接受的，对人和动物无毒和惰性的可药用载体或者赋形剂。可药用载体或赋形剂是一种或者多种固体、半固体、液体稀释剂、填料以及药物制品。具体药用载体或赋形剂的选择及制剂的制备为本领域技术人员所掌握，本发明对此不作特别限定。本发明的所述的药物组合物以单位体重服务量的形式使用，可以经多种形式，例如口服、直肠舌下、静脉或者透皮给药，但优选口服给药。 

本发明所述的药物组合物，优选为片剂，所述片剂中，主药与辅料的质量比为4:1-6:5，优选5:1。具体处方可为：（2E，6E）-2,6-双亚苄基环己酮类似物70-85份，填充剂10-18份，润滑剂0.5-1份，崩解剂0.5-2份。 

作为本发明片剂的最佳实施方式，具体处方采用：（2E，6E）-2,6-双亚苄基环己酮类似物85.0%，微晶纤维素（填充剂）13.7%，硬脂酸镁（润滑剂）0.5%，羧甲基淀粉钠（崩解剂）0.8%。具体的制备方法可参见现有技术。由于该处方科学合理，辅料之间具有理想的协同作用，所得片剂的稳定性高，药效尤为显著。 

采用上述技术方案，本发明具有如下有益效果： 

临床使用方便，易于接受，不仅药物用量准确，同时增加了药物的稳定性，还可减少毒副作用，也便于药物的贮存、运输和携带。 

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规 手段，所用原料均为市售商品。 

实施例1（2E，6E）-2,6-双亚苄基环己酮类似物的制备及其鉴定化合物： 

(2E,6E)-2,6-bis(2,6-fluorobenzylidene)cyclohexanone（CYH03） 

结构式： 

制备方法： 

将0.5g2，6二氟苯甲醛和环己酮（醛和酮的摩尔比2.2：1）溶于2ml乙醇中，常温搅拌，注射器滴加2ml，5%的氢氧化钾水溶液，50℃下反应0.5h至1h，体系中有大量沉淀产生，冷至室温，减压抽滤，滤物用少量乙醇冲洗多次，干燥后经硅胶柱层析进行分离纯化，所得产品真空干燥，得到目标产物CYH03。 

(2E,6E)-2,6-bis(2,6-fluorobenzylidene)cyclohexanone（CYH03）：黄色化合物，收率为68.3%，纯度为99.8%。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.56(s,2H),7.36–7.28(m,2H),6.94(t,J=7.7Hz,4H),2.68–2.55(m,4H),1.82–1.69(m,2H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ188.33,161.63(d,J=7.5Hz),159.14(d,J=7.4Hz),141.20,130.23(t,J=10.3Hz),124.26,113.46(t,J=19.6Hz),111.50(d,J=6.1Hz),111.30(d,J=6.1Hz),28.91(t,J=3.5Hz),22.55.Purity:98.7%by HPLC.HRMS(ESI):calcdfor(M+Na)+(C20H14F4O)369.0873,found369.0868 

实施例2 

与实施例1相比，区别点仅在于： 

将0.5g2，6二氟苯甲醛和环己酮（醛和酮的摩尔比2：1）溶于1.5ml乙醇中，常温搅拌，注射器滴加3ml质量浓度为0.5%的甲醇钠甲醇溶液，40℃下反应0.3h至0.5h，体系中有大量沉淀产生，冷至室温，减压抽滤，滤物用少量乙醇冲洗多次，干燥后经硅胶柱层析进行分离纯化，所得产品真空干燥，得到目标产物CYH03。 

(2E,6E)-2,6-bis(2,6-fluorobenzylidene)cyclohexanone（CYH03）：黄色化合物，收率为56.2%，纯度为97.8%。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.56(s,2H),7.36–7.28(m,2H),6.94(t,J=7.7Hz,4H),2.68–2.55(m,4H),1.82–1.69(m,2H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ188.33,161.63(d,J=7.5Hz),159.14(d,J=7.4Hz),141.20,130.23(t,J=10.3Hz),124.26,113.46(t,J=19.6Hz),111.50(d,J=6.1Hz),111.30(d,J=6.1Hz),28.91(t,J=3.5Hz),22.55.Purity:98.7%by HPLC.HRMS(ESI):calcdfor(M+Na)+(C20H14F4O)369.0873,found369.0868 

实施例3 

与实施例1相比，区别点仅在于： 

将0.5g2，6二氟苯甲醛和环己酮（醛和酮的摩尔比3：1）溶于2.5ml乙醇中，常温搅拌，注射器滴加3ml质量浓度为0.5%的甲醇钠甲醇溶液，80℃下反应1.5h至2h，体系中有大量沉淀产生，冷至室温，减压抽滤，滤物用少量乙醇冲洗多次，干燥后经硅胶柱层析进行分离纯化，所得产品真空干燥，得到目标产物CYH03。 

(2E,6E)-2,6-bis(2,6-fluorobenzylidene)cyclohexanone（CYH03）：黄色化合物，收率为55.2%，纯度为96.9%。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.56(s,2H),7.36–7.28(m,2H),6.94(t,J=7.7Hz,4H),2.68–2.55(m,4H),1.82–1.69(m,2H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ188.33,161.63(d,J=7.5Hz),159.14(d,J=7.4Hz),141.20,130.23(t,J=10.3Hz),124.26,113.46(t,J=19.6Hz),111.50(d,J=6.1Hz),111.30(d,J=6.1Hz),28.91 (t,J=3.5Hz),22.55.Purity:98.7%by HPLC.HRMS(ESI):calcd for(M+Na)+(C20H14F4O)369.0873,found369.0868 

实施例4（2E，6E）-2,6-双亚苄基环己酮类似物的制备及其鉴定化合物： 

(2E,6E)-2,6-bis(2-bromo-6-fluorobenzylidene)cyclohexanone（CYH06） 

结构式： 

制备方法： 

将0.5g2-溴-6-氟苯甲醛和环己酮（醛和酮的摩尔比2.2：1）溶于2ml乙醇中，常温搅拌，注射器滴加2ml，5%的氢氧化钾水溶液，50℃下反应0.5h至1h，体系中有大量沉淀产生，冷至室温，减压抽滤，滤物用少量乙醇冲洗多次，干燥后经硅胶柱层析进行分离纯化，所得产品真空干燥，得到目标产物CYH06。 

(2E,6E)-2,6-bis(2-bromo-6-fluorobenzylidene)cyclohexanone（CYH06）： 

黄色化合物，收率为66.9%，纯度为99.8%。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.54(s,2H),7.45(d,J=7.9Hz,2H),7.25–7.18(m,2H),7.09(t,J=8.7Hz,2H),2.60–2.50(m,4H),1.80–1.70(m,2H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ188.19,159.54(d,J=251.9Hz),140.28,130.39(d,J=9.2Hz),130.29,128.44(d,J=3.4Hz),125.29(d,J=18.8Hz),124.95(d,J=4.0Hz),114.84(d,J=23.1Hz),28.56(d,J=5.0Hz),22.30.Purity:99.6%by HPLC.HRMS(ESI):calcd for(M+Na)+(C20H14Br2F2O)488.9272,found488.9302. 

实施例5（2E，6E）-2,6-双亚苄基环己酮类似物的制备及其鉴定化合物： 

（2E,6E)-2,6-bis[2-fluoro-6-(trifluoromethyl)benzylidene]cyclohexanone（CYH09） 

结构式： 

制备方法： 

将0.5g2-氟-6-三氟甲基苯甲醛和环己酮（醛和酮的摩尔比2.2：1）溶于2ml乙醇中，常温搅拌，注射器滴加2ml，5%的氢氧化钾水溶液，50℃下反应0.5h至1h，体系中有大量沉淀产生，冷至室温，减压抽滤，滤物用少量乙醇冲洗多次，干燥后经硅胶柱层析进行分离纯化，所得产品真空干燥，得到目标产物CYH09。 

（2E,6E)-2,6-bis[2-fluoro-6-(trifluoromethyl)benzylidene]cyclohexanone（CYH09）： 

黄色化合物，收率为69.1%，纯度为99.6%。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.63(s,2H),7.53(d,J=7.8Hz,2H),7.44(dd,J=13.4,7.9Hz,2H),7.31(t,J=8.7Hz,2H),2.50–2.43(m,4H),1.74–1.64(m,2H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ187.60,160.48,158.01,141.36(s,4H),130.90(m),129.67(d,J=8.8Hz),126.86,123.18(m),121.81(m),119.49(d,J=23.2Hz),28.25(d,J=3.9Hz),22.07.Purity:99.1%by HPLC.HRMS(ESI):calcd for(M+Na)⁺(C₂₂H₁₄F₈O)469.0809,found469.0800 

实施例6 

与实施例1相比，区别点仅在于，本实施例以2，6二溴苯甲醛替换实施例1中的2，6二氟苯甲醛，分别得到以下结构的化合物，其中，产物的收率为69.7%，纯度为99.4%。 

实施例7 

与实施例1相比，区别点仅在于，本实施例以2，6二氯苯甲醛替换实施例1中的2，6二氟苯甲醛，分别得到以下结构的化合物，其中，产物的收率为70.1%，纯度为99.6%。 

实施例8 

将实施例1所得化合物分别经无机酸如盐酸、硫酸、磷酸等；有机酸如乙酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、草酸等处理，以及由元素阴离子形成的盐，如氯、溴、碘。形成盐的阳离子包括钾、钠、钙、镁等。具体的制备处理方法为本领域技术人员所理解和掌握，本发明对此不作特别限定。 

实施例9药物组合物 

取实施例1得到的化合物CYH03，按照其与赋形剂重量比为5:1的比例加入赋形剂，（2E，6E）-2,6-双亚苄基环己酮类似物85.0%，微晶纤维素（填充剂）13.7%，硬脂酸镁（润滑剂）0.5%，羧甲基淀粉钠（崩解剂）0.8%。制粒压片。 

实施例10药物组合物 

取实施例4的方法制的化合物CYH06，然后分别按常规注射液制法加入注射用水、精滤灌封灭菌后制成注射液。其中，主药的浓度为1.5%。 

实施例11药物组合物 

取实施例5得到的化合物CYH09，按照其与赋形剂重量比为5:1的比例加入赋形剂，主药85.0%，微晶纤维素（填充剂）13.7%，硬脂酸镁（润滑剂）0.5%，羧甲基淀粉钠（崩解剂）0.8%。制粒压片。 

实施例12药物组合物 

与实施例11相比，区别点仅在于本实施例具体处方为：（2E，6E）-2,6-双亚苄基环己酮类似物（实施例5得到的化合物CYH09）70g，填充剂微晶纤维素10g，润滑剂硬脂酸镁0.5g，崩解剂羧甲基淀粉钠0.5g。 

实施例13药物组合物 

与实施例11相比，区别点仅在于本实施例具体处方为：（2E，6E）-2,6-双亚苄基环己酮类似物（实施例5得到的化合物CYH09）85g，填充剂微晶纤维素10g，润滑剂硬脂酸镁0.5g，崩解剂羧甲基淀粉钠0.5g。 

为了进一步验证本发明所述化合物的性能，发明人进一步以上述实施例制备的化合物展开了大量专项研究试验，篇幅所限，此处仅例举最具说服力的部分。 

试验例1 

（2E，6E）-2,6-双亚苄基环己酮类似物抑制大鼠睾丸和人肝微粒体1型11b-羟基甾体脱氢酶活性的检测 

1型11b-羟基类固醇脱氢酶（11β-hydroxysteroid dehydrogenase type I，11b-HSD1）是一种以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸为辅酶的酶类，主要在肝脏、脂肪、脑以及睾丸等组织的微粒体中表达。含有11b-HSD1微粒体可以按常规的方法制备（Brennan,J.等，Genes Dev，2003.17，800），也可以从试剂公司购买。按照已有的研究方法进行11b-HSD1酶活性的检测（Haider,S.G.Int.Rev.Cytol.,2004，233，181）。简言之，首先标记反应管，每管加40μg大鼠睾丸和人肝微粒体蛋白和10nM-0.1mM（2E，6E）-2,6-双亚苄 基环己酮类似物（上述实施例所制备得到）（溶于二甲基苯砜，DMSO），然后加入PBS至100μl。然后制备类固醇检测混合物：2μl[1,2-³H]可的松（40,000cpm），2μl未标记的可的松25μmol/L），1μlNADPH（50mmol/L）以及45μl PBS，振荡混合。取50μl类固醇检测混合物加入到反应管中，34℃培育45min。用1ml预冷乙醚终止反应后，涡旋振荡1min。然后将上清转移到5ml玻璃管内，氮气干燥并析出固体。加入70μl乙醚重溶固体，振荡1min后，在薄层层析板上点样，并将薄层层析板放入含有氯仿:甲醇（体积比90:10）层析缸内20min。最后，将薄层层析板放在扫描辐射仪检测(System AR2000,Bioscan Inc.,Washington,DC,USA)上读取放射峰值，并计算类固醇的转化率，从而得到11b-HSD1酶的转化活性。本实验以DMSO作为对照。 

实验结果表明，本发明实施例所制备的（2E，6E）-2,6-双亚苄基环己酮类似物对大鼠睾丸微粒体11β-HSD1活性有抑制作用，其IC₅₀为1793nM-4767nM；对人11β-HSD1活性，其IC₅₀为650nM-111μM。更优选的是选用CYH06。值得注意的是这些（2E，6E）-2,6-双亚苄基环己酮类似物对大鼠和人11b-HSD2酶的活性基本没有抑制作用(详见试验例2)。 

表1（2E，6E）-2,6-双亚苄基环己酮类似物对大鼠睾丸和人肝微粒体11b-HSD1酶活性的抑制作用 

^a%inhibition at the100μM inhibitor. 

^b(IC50,nΜ). 

试验例2 

（2E，6E）-2,6-双亚苄基环己酮类似物抑制大鼠和人微粒体II型11b-羟基甾体脱氢酶活性的检测 

II型11b-羟基类固醇脱氢酶（11β-hydroxysteroid dehydrogenase type II，11b-HSD2）是一种以烟酰胺腺嘌呤核苷酸为辅酶的酶类，主要在肾脏、胎盘等组织的微粒体中表达。含有11b-HSD2微粒体可以按常规的方法制备（Brennan,J.等，Genes Dev，2003.17，800），也可以从试剂公司购买。按照已有的研究方法进行11b-HSD2酶活性的检测（Haider,S.G.Int.Rev.Cytol.,2004，233，181）。简言之，首先标记反应管，每管加40μg大鼠和人微粒体蛋白和10nM-0.1mM（2E，6E）-2,6-双亚苄基环己酮类似物（溶于二甲基苯砜，DMSO），然后加入PBS至100μl。然后制备类固醇检测混合物：2μl[1,2-³H]皮质醇（40,000cpm），2μl未标记的皮质醇（25μmol/L），1μl NAD+（50mmol/L）以及45μl PBS，振荡混合。取50μl类固醇检测混合物加入到反应管中，37C培育45min。用1ml预冷乙醚终止反应后，涡旋振荡1min。然后将上清转移到5ml玻璃管内，氮气干燥并析出固体。加入70μl乙醚重溶固体，振荡1min后，在薄层层析板上点样，并将薄层层析板放入含有氯仿:甲醇（体积比90:10）层析缸内20min。最后，将薄层层析板放在扫描辐射仪检测(System AR2000,BioscanInc.,Washington,DC,USA)上读取放射峰值，并计算类固醇的转化率，从而得到11b-HSD2酶的转化活性。本实验以DMSO作为对照。 

实验结果表明，本发明所述（2E，6E）-2,6-双亚苄基环己酮类似物对11b-HSD2，其IC50为>100μM。 

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本 领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。