缀合的FVIII变体

摘要

本发明涉及缀合的因子VIII变体。本发明特别涉及包含不同聚合物基团的缀合FVIII变体及其用途。

说明书

背景

A型血友病是由凝血因子VIII (FVIII)活性缺陷或功能障碍所致的一种遗传性出血病症。临床表现不在于初期止血(凝血块的形成正常发生)，而在于凝血块因缺乏次级凝血酶(secondary thrombin)形成而不稳定。

A型血友病目前通过静脉内注射从血液中分离或重组产生的凝血因子FVIII来治疗。治疗可为按需要的或预防性的。最近发表的资料支持预防相比按需治疗显著优越。这些优点包括减少出血频率和降低血友关节病发展的风险，这两者都使患者有更好的生活质量。然而，虽然预防能使患者在生活中基本上不出现症状，但其需要频繁的外周静脉注射，通常是一周三次，这已知为痛苦的，麻烦的和费时的。另外，在儿童中反复静脉穿刺未必可行。因此支持给药频率较小的产品和/或给药很大程度上使得常规的预防性治疗成为可能。

一直认为偶联诸如聚乙二醇(PEG)或聚唾液酸(PSA)等聚合物到蛋白质上导致循环时间增加，对蛋白酶的抗性提高和免疫原性降低。然而本领域仍需要具有延长的循环半衰期的FVIII变体。

概述

本发明涉及与至少一种PEG聚合物和至少一种多糖缀合的FVIII变体及其用途。本文显示，相比与例如两个PEG分子或两个多糖分子缀合的FVIII变体，这种异缀合的FVIII变体(heteroconjugated FVIII variant)具有更高的循环半衰期。

附图简述

图1显示根据本发明合成FVIII变体的实例。

详述

定义：

因子VIII分子：FVIII/因子VIII是主要由肝细胞产生的大复合糖蛋白。人FVIII由2351个氨基酸组成，包括信号肽，并含有由同源性限定的若干不同结构域。有3个A结构域、1个独特的B结构域和2个C结构域。结构域的顺序可列为NH₂-A1-A2-B-A3-C1-C2-COOH。FVIII在血浆内作为在B-A3边界分开的2条链而循环。这两条链通过二价金属离子结合而连接。A1-A2-B链称为重链(HC)，而A3-C1-C2称为轻链(LC)。

FVIII与von Willebrand因子(VWF)缔合而循环。VWF为大的多聚体糖蛋白，其作为FVIII的载体，并为正常血小板粘附到血管壁成分所需。与VWF复合的FVIII的血浆半衰期约为12小时。

“天然FVIII”为如在SEQ ID NO. 1 (氨基酸1-2332)所示的全长人FVIII分子。B结构域跨越SEQ ID NO 1中的氨基酸741-1648。

本发明的“FVIII变体”可以是自血浆和/或重组FVIII衍生的FVIII。本发明的FVIII变体可以是例如B结构域截短的FVIII分子，其中例如剩余结构域密切对应于SEQ ID NO 1中氨基酸编号1-740和1649-2332所示序列。本发明的B结构域截短的FVIII变体可与SEQ ID NO 1所示序列具有微小差异，意即剩余结构域(即3个A结构域和2个C结构域)与SEQ ID NO 1所示氨基酸序列(氨基酸1-740和1649-2332)可具有微小差异，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸的差异，或者可有约1%、2%、3%、4%或5%的差异，这是因为事实上可引入突变以例如降低vWF的结合能力。此外，可以在分子的其它位置引入氨基酸修饰(取代、缺失等)，以修饰因子VIII与各种其它组分(例如LRP、各种受体、其它凝血因子、细胞表面)的结合能力，引入和/或消除糖基化位点等。本发明FVIII变体具有FVIII活性，意即能以与FVIII功能类似或等同的方式在凝血级联中起作用；通过与被激活的血小板上的FIXa相互作用而诱导FXa的形成；并支持凝血块的形成。其活性可通过本领域熟知的技术进行体外确定，所述技术例如为显色测定(chromogenic assay)、凝血分析、内源凝血酶潜在性分析等。本发明FVIII变体具有FVIII活性，其具有至少约10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%和100%或甚至超过100%的天然人FVIII的活性。

B结构域：因子VIII中的B结构域跨越SEQ ID NO 1的氨基酸741-1648。B结构域在若干不同位点被切割，在循环血浆FVIII分子中产生大异质性。高度糖基化的B结构域的确切功能尚未知晓。已经知道的是该结构域对于凝血级联中的FVIII活性而言并非必要。这种明显的功能缺乏由以下事实支持：B结构域缺失/截短的FVIII似乎具有与在全长天然FVIII中所观察到的相同的体内性能。尽管如此，有迹象表示B结构域可减少与细胞膜的缔合，至少在无血清条件下如此。

B结构域截短/缺失的因子VIII分子：将内源全长FVIII合成为单链前体分子。分泌之前，该前体切割成重链和轻链。可由2种不同策略产生B结构域-缺失的重组FVIII。可将无B结构域的重链和轻链单独作为两条不同多肽链合成(二链策略)或者将B结构域缺失的FVIII作为一条前体多肽链合成，该前体多肽链按照与全长FVIII前体相同的方式切割为重链和轻链(单链策略)。

在B结构域-缺失的FVIII前体多肽中，重链和轻链部分通常由接头间隔开来。为了将在B结构域缺失的FVIII中引入免疫原性表位的风险降至最低，接头序列优选源自FVIII B结构域。至少，接头必须包含蛋白酶识别位点，所述蛋白酶将B结构域缺失的FVIII前体多肽切割为重链和轻链。在全长FVIII的B结构域中，氨基酸1644-1648构成该识别位点。在B结构域缺失的FVIII激活时导致接头被除去的凝血酶位点位于重链上。因此，接头的大小和氨基酸序列不太可能影响到经凝血酶激活而将其从剩余FVIII分子上切除。B结构域的缺失对于产生FVIII是有利的。然而，B结构域的部分可包括在接头中而不降低产率。B结构域对产率的负面效应不是由B结构域的任何特定大小或序列所造成。

截短的B结构域可含有若干O-糖基化位点。然而，依据一个优选的实施方案，所述分子在截短的B结构域中包含仅1个、或者2、3或4个O联寡糖。

依据一个优选的实施方案，截短的B结构域包含仅1个潜在O-糖基化位点并且亲水聚合物与该O-糖基化位点共价缀合。可将在本发明B结构域截短的分子中的O联寡糖连接到O-糖基化位点，所述位点可通过重组方式和/或通过截短B结构域而将“隐藏”的O-糖基化位点暴露而人工产生。在这两种情况下，可通过设计B结构域截短的因子VIII的氨基酸序列并随后对所述氨基酸序列进行计算机(in silico)分析，预测截短的B结构域中O-糖基化位点的概率，从而制备所述分子。具有所述糖基化位点概率相对高的分子可在合适宿主细胞中合成，然后分析糖基化模式并随后选择在截短的B结构域中具有O联糖基化的分子。

用于产生重组因子VIII蛋白的合适宿主细胞优选是哺乳动物来源，以确保所述分子被糖基化。在实施本发明时，所述细胞是哺乳动物细胞，更优选已建立的哺乳动物细胞系，包括但不限于CHO (例如ATCC CCL 61)、COS-1 (例如ATCC CRL 1650)、幼仓鼠肾(BHK)和HEK293 (例如ATCC CRL 1573; Graham等，J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977)细胞系。优选的BHK细胞系为tk- ts13 BHK细胞系(Waechter和Baserga, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:1106-1110, 1982)，下文称为BHK 570细胞。BHK 570细胞系可得自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection), 12301 Parklawn Dr., Rockville, MD 20852，其ATCC保藏号为CRL 10314。tk- ts13 BHK细胞系也可得自ATCC，其保藏号为CRL 1632。优选的CHO细胞系为CHO K1细胞系(可得自ATCC，其保藏号为CCl61)以及CHO-DXB11和CHO-DG44细胞系。

其他合适的细胞系包括但不限于Rat Hep I (Rat肝癌细胞，ATCC CRL 1600)、Rat Hep II (Rat肝癌细胞，ATCC CRL 1548)、TCMK (ATCC CCL 139)、人肺细胞(ATCC HB 8065)、NCTC 1469 (ATCC CCL 9.1)，DUKX细胞(CHO细胞系) (Urlaub和Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, 1980) (DUKX也称为DXB11细胞)和DG44 (CHO细胞系) (Cell, 33: 405, 1983，和Somatic Cell和Molecular Genetics 12: 555, 1986)。还可使用3T3细胞、Namalwa细胞、骨髓瘤和骨髓瘤与其它细胞的融合体。在某些实施方案中，所述细胞可以是突变的或重组的细胞，例如与其来源细胞类型相比表达在质量或数量上不同酶谱的细胞，所述酶催化蛋白质翻译后修饰(例如糖基化酶例如糖基转移酶和/或糖苷酶，或加工酶例如前肽)。DUKX细胞(CHO细胞系)特别优选。

当前优选的细胞是HEK293、COS、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、幼仓鼠肾(BHK)和骨髓瘤细胞，尤其是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。

N-联寡糖和O-联寡糖：N-聚糖和O-聚糖两者都通过产生蛋白质的细胞连接到蛋白质上。当新生蛋白质从核糖体转运到内质网并继而运输到高尔基体以后，细胞N-糖基化机制(machinery)识别和糖基化氨基酸链中的N-糖基化信号(N-X-S/T基序) (Kiely等，JBC (1976) 251(18), 5490; Glabe等，JBC(1980)255(19), 9236，Lenting等，Haemophilia (2010) 16(suppl.5), 194))。N-联FVIII寡糖可为天然存在的，其在本领域中已经有描述(Lenting等，Haemophilia (2010) 16(Suppl 5), 194和其中引用的参考文献)，或可通过基因工程引入。

同样，O-聚糖连接到特异的O-糖基化位点。普遍存在的粘蛋白型的O-联糖基化作用包括N-乙酰半乳糖胺部分连接到Ser和Thr残基，该过程发生在蛋白质到达高尔基体之时(Lenting等，2010)。

O-聚糖连接到氨基酸链特异的O-糖基化位点上，但触发O-糖基化的基序比N-糖基化信号异质化得多，并且我们预测氨基酸序列中O-糖基化位点的能力仍然不足(Julenius等，Glycobiology (2005), 15(2)，153和Julenius等，Bioinformatics for Glycobiology and Glycomics (2009) 163)。

因此，在截短的因子VIII B结构域中O-联寡糖可共价连接到天然存在的O-联糖基化序列或通过重组技术人工构建的O-联糖基化序列。

其实例为B结构域截短的因子VIII变体，其中B结构域对应于SEQ ID NO: 1中的氨基酸742-763。这种变体包括在B结构域接头中的O-糖基化位点。

另一种实例为“N8”，一种B结构域缺失的因子VIII，该因子VIII重链包括人全长因子VIII氨基酸1-740，并且该因子VIII轻链包括人全长因子VIII氨基酸1649-2332。重链和轻链序列由21氨基酸的接头连接(SFSQNSRHPSQNPPVLKRHQR – SEQ ID NO 2)，接头包含人全长因子VIII氨基酸741-750和1638-1648的序列(Thim等， Haemophilia (2010) 16, 349)。

唾液酸转移酶：唾液酸转移酶是将唾液酸转移到初生寡糖上的酶。每种唾液酸转移酶对特定的糖底物具有特异性。唾液酸转移酶将唾液酸添加到唾液酸化糖脂(神经节苷脂)的末端部分或添加到糖蛋白的N-联或O-联糖链上。有大约20种不同唾液酸转移酶，其可根据所作用的受体结构和它们所形成的糖键类型而区分。根据本发明优选的唾液酸转移酶是ST3Gal-I (对O-聚糖特异)和ST3Gal-III (对N-聚糖特异)。因此可通过例如选择特异性唾液酸转移酶和/或改造具有特定糖基化模式的因子VIII分子，对本发明缀合因子VIII分子的结构进行改造。

聚合物至O-联或(N)-联寡糖的糖缀合：可通过在生物合成相对早的阶段加入唾液酸残基修饰和终止O-聚糖的生物合成。某些唾液酸转移酶能够在核心1 GalT作用后对GalNAcα-Ser/Thr或早期O-聚糖核心亚型起作用。术语T抗原与Galβ1–3GalNAcα-Ser/Thr二糖的存在相关。这些结构的生产包括糖基转移酶间竞争同一底物，因此高尔基体中糖基转移酶的表达水平和亚细胞分布决定了O-聚糖生物合成和多样化中结构的结果。只有Galβ1–3GalNAcα-Ser/Thr二糖适合糖衍生作用。

然而，这种结构的可用量可通过利用唾液酸酶或核心1 GalT或其结合处理蛋白质而大大地增多。由于聚合物的糖缀合过程，唾液酸聚合物通过连接至目标蛋白Galβ1-3GalNAcα-Ser/Thr二糖的α2,3键添加到末端Gal部分(WO03031464和WO09108806)。

很多亲水聚合物可连接到O-联寡糖。通过O-聚糖将亲水聚合物酶促缀合到FVIII的基本要求是能够如WO03031464公开的经由游离的氨基基团将它们偶联到胞苷一磷酸-5'-甘氨酰神经氨酸(GSC)衍生物上。这可通过本领域技术人员已知的很多不同的偶联化学方法实现。活化的生物相容聚合物实例包括聚环氧烷，非限制性地如聚乙二醇(PEG)、2-(甲基丙烯酰氧基)乙基磷酸胆碱(mPC)聚合物(如在WO03062290描述的)、葡聚糖、多聚乙酰神经氨酸(colominic acid)或其他基于碳水化合物的聚合物、氨基酸或特定肽序列的聚合物、生物素衍生物、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯-马来酸酐共聚物、聚苯乙烯-苹果酸酐共聚物、聚噁唑啉、聚丙烯酰吗啉、肝素、白蛋白、纤维素、壳聚糖水解产物、淀粉如羟乙基淀粉和羟丙基淀粉、糖原、琼脂糖及其衍生物、瓜尔胶、普鲁兰(pullulan)、菊粉、黄原胶、角叉菜胶、果胶、藻酸水解产物、其他生物聚合物和其任何等价物。

可在例如WO0331464公开的通过唾液酸转移酶介导的方法将侧基连接到N-联寡糖。该方法经常导致几个侧基连接到因子VIII分子上。

连接到FVIII的N-联寡糖的侧基描述为(N)-侧链FVIII。连接到O-联寡糖的侧基描述为(O)-侧链FVIII。例如，(O)-PEG(40kD) (N)-PSA(20kD) FVIII意为PEG(40KD)连接到O-联寡糖，且PSA(20kD)连接到N-联寡糖。

化学缀合：本发明FVIII变体可使用不同的化学-酶方法与PEG和多糖聚合物缀合。

将相关部分化学缀合到药物通常采用例如通过酰化或还原烷基化以随机衍生赖氨酸的技术，但这些方法的实用性通常是有限的，这是因为产物的异质性和获得产物的生物活性常常降低。

位点选择性缀合方法对于能够利用适于选择位点的蛋白质结构和生物知识而言是重要的，所述位点不影响蛋白生物活性，并同时获得关于稳定性、药物代谢动力学参数、免疫原性、结合到生物伴侣分子等需要的结果。

可利用如下事实可实现N-端特异或至少N-端优先的缀合：N-端伯氨的pKa为7.8，然而赖氨酸侧链ε-氨基基团的pKa则高得多。

更窄的应用方法利用在蛋白质氨基端引入乙醛酰基。然而这限于能容忍更苛刻的高碘酸氧化反应和包含N-端丝氨酸或苏氨酸残基的蛋白质。

硫醇选择性缀合到不成对的半胱氨酸残基也是为实现位点选择性缀合的潜在有效的方法，其使用缀合相关部分的马来酰亚胺或卤代乙酸酯衍生物。缀合作用可在如下部位进行：天然游离的半胱氨酸(游离的半胱氨酸为在蛋白质中的稀有残基)，但因为半胱氨酸为非常疏水的氨基酸，其通常埋藏在蛋白质结构内部，因此很难接近试剂；或更可能地为通过定点诱变引入到蛋白质的半胱氨酸残基，但存在可能的蛋白质结构变化和免疫原性的潜在问题。

酶缀合的方法也可使用，并且为接近蛋白质中少数的氨基酸残基的有价值的工具。例如在人生长激素的13个谷氨酰胺残基中，只有两个为微生物转谷氨酰胺酶的底物(WO06/134148)。(Fontana等，Adv. Drug Delivery Rev. (2008) 60, 13-28和其中引用的参考文献，Bonora等，(2009), Post –translational Modification of Protein Biopharmaceuticals, Wiley, 341和其中引用的参考文献)。

PEG：本发明相关的术语“PEG”包括任何形式的聚(乙二醇)，包括烷氧基PEG、双官能PEG、多臂PEG、分叉PEG、支化PEG、侧基PEG (pendent PEG) (即具有一个或多个聚合物骨架的官能侧基的PEG或相关聚合物)或其中具有可降解键的PEG。

聚合物骨架可为线性的或支化的。支化聚合物骨架在本领域通常为已知的。典型地，支化聚合物具有中央支化核心部分和很多的连接到中央支化核心的线性聚合物链。PEG通常以支化形式使用，其可通过将环氧乙烷加入到各种多元醇例如丙三醇、季戊四醇和山梨醇而制备。中央支化部分还可来源于诸如赖氨酸或半胱氨酸等若干氨基酸。在一个实例中，支化聚(乙二醇)的通式可表示为R(-PEG-OH)m，其中R代表核心部分，例如丙三醇或季戊四醇，且m代表臂的数目。多臂PEG分子(如在美国专利号5,932,462中描述的，其全文在此引为参考)也可用作聚合物骨架。

尽管聚合物骨架每条链的分子量可以变化，但其通常在约100 Da-约160,000 Da的范围间，例如约5,000 Da-约100,000 Da。更具体而言，本发明每种缀合亲水聚合物的大小可在如下范围间变化：约500 Da-约80,000 Da，例如约1000 Da-约80,000 Da；约2000 Da-约70,000 Da；约5000-约70,000 Da；约5000-约60,000 Da；约10,000-约70,000 Da；约20,000-约60,000 Da；约30,000-约60,000 Da；约30,000-约50,000 Da；或约30,000-约40,000 Da。应理解这些大小代表估计值而非精确测量值。根据优选的实施方式，本发明分子与亲水聚合物的异质群体缀合，例如大小为例如10,000、40,000或80,000 Da +/-约5000、约4000、约3000、约2000或约1000 Da的PEG。

多糖

本发明相关的多糖为基于多糖的聚合物，包括同-或异-多糖，其由如下的单体单元构成：例如葡萄糖、半乳糖、硫代半乳糖、N-乙酰-半乳糖、岩藻糖、果糖、木糖、阿拉伯糖、葡糖醛酸、硫代葡糖醛酸、艾杜糖醛酸、硫代艾杜糖醛酸、半乳糖醛酸、甘露糖醛酸、葡糖胺、N-乙酰-葡糖胺、硫代葡糖胺、半乳糖胺、N-乙酰-半乳糖胺、N-乙酰-半乳糖胺-硫酸酯、N-乙酰-半乳糖胺-二硫酸酯、N-乙酰-半乳糖胺-硫酸酯、N-乙酰-神经氨酸(Neu5Ac)、硫代-N-乙酰-神经氨酸、N-羟乙酰基-神经氨酸(Neu5Gc)、2-酮-3-脱氧-nonulosonic acid (KDN)。

本发明相关的多糖实例包括：乳糖、淀粉、羟乙基淀粉(HES)、淀粉酶(amylase)、葡聚糖硫酸酯、葡聚糖、糊精、糖原、透明质酸、聚山梨醇、聚甘露醇、肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素(keratin sulphate)、肝素或硫酸软骨素、硫酸化的聚唾液酸和聚唾液酸(PSA)。

根据本发明优选的多糖为PSA。PSA为在哺乳动物中存在的聚合物，即其为非免疫原性的(或是非常弱的)。哺乳动物中不存在已知的PSA受体。已显示PSA提供了对蛋白酶降解具有增强抗性的治疗蛋白质。优选大多数或所有的糖残基为N-乙酰-神经氨酸(Neu5Ac)残基，优选只有Neu5Ac残基。细菌生成的聚唾液酸为优选的聚唾液酸源。它们包括来自脑膜炎奈瑟氏球菌C(N. meningitidis C)的血清群C荚膜多糖C和来自大肠杆菌K92的多糖K92，以及来自脑膜炎奈瑟氏球菌B (Neisseria meningitidis B)和大肠杆菌K1(Escherichia coli K1)、不液化莫拉氏菌(Moraxella nonliquifaciens)、溶血性曼氏杆菌A2 (Mannheimia haemolytica A2) (之前称为溶血巴斯德氏菌A2(Pasteurella haemolytica A2))的血清群B荚膜多糖。来自大肠杆菌K92的多糖包括α2,8和α2,9交替连接的Neu5Ac单元。来自脑膜炎奈瑟氏球菌C群(N. meningitidis group C)的多糖C具有α2,9连接的Neu5Ac单元。优选的聚唾液酸来自群体B；它们包括2,8-α连接的Neu5Ac。PSA的分子量优选高于或等于20kDa、25 kDa、30 kDa、35 kDa、40 kDa、45 kDa、50 kDa、55 kDa、60 kDa、65 kDa、70 kDa、75 kDa、80 kDa、85 kDa、90 kDa、95 kDa或100 kDa。本发明相关的PSA聚合物优选窄的分子量分布。

在本发明的方法中，PSA的反应性醛优选在多糖非还原的末端。然而，反应性醛也可例如在US4356170描述的在还原末端提供。

在本发明的另一方面，聚唾液酸化的部分可利用唾液酸转移酶和聚唾液酸转移酶的组合来酶促制备。唾液酸转移酶优选空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)唾液酸转移酶CstII (Gilbert等，JBC (2002) 277, 327)，可使用N8的(O)-脱唾液酸聚糖作为底物，或使用N8的复合型(N)-聚糖作为底物。

产生的聚糖具有α2,3-α2,8连接的二唾液酸末端基序，然后其可用作细菌聚唾液酸转移酶的底物，例如脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)或大肠杆菌K1的α2,8-聚唾液酸转移酶(Willis等，Glycobiology (2008) 18(2) 177, WO 2008/151448 A1, Cho和Troy, PNAS (1994), 91, 11427)。

或者，聚唾液酸化部分可如WO2007/087711A1描述的利用包含双功能的唾液酸转移酶和聚唾液酸转移酶的融合蛋白来酶促制备。或者，聚唾液酸化部分可使用例如STX (ST8Sia II)和/或PST (ST8Sia IV)的哺乳动物α2,8-聚唾液酸转移酶，并使用N8的(N)-聚糖作底物来酶促产生(Angata等，JBC 277(39)36808和其中引用的文献)。

药物组合物：本文中药物组合物优选旨在包括以下组合物，其含有本发明因子VIIII抗体，和任选的适合胃肠外给药(例如即用的无菌含水组合物或可在如水或含水缓冲液中重配的干燥无菌的组合物)的因子VIII分子。本发明组合物可包含各种药学可接受的赋形剂、稳定剂等。

该组合物中附加成分可包含湿润剂、乳化剂、抗氧化剂、填充量剂、张度调节剂、螯合剂、金属离子、油性载体、蛋白质(如人血清白蛋白、明胶或蛋白质)和两性离子(例如氨基酸，例如甜菜碱、牛磺酸、精氨酸、甘氨酸、赖氨酸和组氨酸)。当然该种附加成分不应不利地影响本发明药学制剂的总体稳定性。可利用注射器任选笔形注射器通过皮下、肌内、腹膜内或静脉内注射进行胃肠外给药。或者，可利用注射泵进行胃肠外给药。进一步的选择是如下组合物，其可为以鼻或肺喷雾剂的形式用于给予FVIII抗体化合物的溶液或混悬液。作为更进一步的选择，含有本发明FVIII化合物的药物组合物也可适于经皮肤给药，例如通过无针注射或贴剂，任选离子渗透贴剂，或跨粘膜给药，例如口腔给药。

本文所用术语“治疗”指对有需要的任何人或其他动物受试者的医学疗法。预期所述受试者接受了医疗从业者的体检，所述医疗从业者做出了试验性或确定性诊断，其会显示使用所述特定治疗对所述人或其他动物受试者的健康有益。所述治疗的时机和目的根据受试者健康现状在不同的个体之间可以变化。因此，所述治疗可为预防性的、治标的和/或针对症状的。

尽管本发明的某些特征已在本文中阐述和描述，但对于本领域技术人员现在仍可以做出很多改变、替换、变更和等同替换。因此，应理解所附的权利要求意为覆盖所有落入本发明真正精神范围内的所述改变和变更。

在第一方面，本发明涉及一种缀合至少一种PEG聚合物和至少一种多糖的FVIII变体。相比“同缀合”的FVIII变体(例如FVIII-PEG-PEG或FVIII-PSA-PSA变体)，这种“异缀合”的变体意想不到地具有提高的体内循环半衰期。

在本发明的一个实施方案中，多糖为PSA。

在另一个实施方案中，本发明所述FVIII变体为B结构域截短的分子，其通过在截短的B结构域中O-联寡糖与PEG聚合物或PSA聚合物共价缀合，其中FVIII激活导致去除了所述O-联聚合物。

在另一个实施方案中，所述变体通过N-联寡糖与至少一种PEG聚合物或PSA聚合物共价缀合。这种N-联寡糖可为天然存在的，或可通过基因工程引入。

在另一个实施方案中，所述FVIII变体通过在截短的B结构域中O-联寡糖与PEG聚合物共价缀合，其中所述变体通过N-联寡糖与至少一种PSA聚合物共价缀合。如果聚合物基团缀合到B结构域中的聚糖，则这种FVIII变体在其激活阶段可与内源激活的FVIII相似。

在另一个实施方案中，所述FVIII变体包含2-4个PSA聚合物，所述PSA聚合物连接到A1结构域中的一个双支化N-联寡糖和A3结构域中的一个双支化N-联寡糖。

在另一个实施方案中，所述FVIII变体通过N-联寡糖与至少一种PEG聚合物或PSA聚合物共价缀合。

在另一个实施方案中，所述FVIII变体通过在截短的B结构域中的O-联寡糖与PEG聚合物共价缀合，其中所述变体通过N-联寡糖与至少一种PSA聚合物共价缀合。

在另一个实施方案中，所述FVIII变体包含2-4个PSA聚合物，所述PSA聚合物连接到A1结构域中一个双支化N-联寡糖和在A3结构域中一个双支化N-联寡糖上。

在一个实施方案中，所述FVIII变体包含1或2个PSA聚合物，所述PSA聚合物连接到A1结构域中一个双支化N-联寡糖。

在一个实施方案中，所述FVIII变体包含1或2个PSA聚合物，所述PSA聚合物连接到在A3结构域中一个双支化N-联寡糖。

在一个实施方案中，所述FVIII变体通过在截短的B结构域中O-联寡糖与PSA聚合物共价缀合，其中所述变体通过N-联寡糖与至少一种PEG聚合物共价缀合。

在一个实施方案中，所述FVIII变体通过在截短的B结构域中O-联寡糖与PEG聚合物共价缀合，其中所述变体通过N-联寡糖与至少一种PSA聚合物共价缀合。

在一个实施方案中，所述FVIII变体包含2-4个PEG聚合物，所述PEG聚合物连接到A1结构域中的一个双支化N-联寡糖和在A3结构域中的一个双支化N-联寡糖上。

在一个实施方案中，所述FVIII变体包含1-2个PEG聚合物，所述PEG聚合物连接到A1结构域中的一个双支化N-联寡糖。

在一个实施方案中，所述FVIII变体包含1-2个PEG聚合物，所述PEG聚合物连接到在A3结构域中的一个双支化N-联寡糖。

在另一个实施方案中，所述FVIII变体包含具有30-50 kDa大小的PEG聚合物。

在另一个实施方案中，所述FVIII变体包含具有15-50 kDa大小的PSA聚合物。

在另一个实施方案中，所述FVIII变体包含具有40-50 kDa大小的PSA聚合物。

在另一个实施方案中，所述FVIII变体为B结构域截短的FVIII变体，其中B-结构域包含SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列。

在另一个实施方案中，所述多糖为羟乙基淀粉(HES)。

第二方面涉及一种本发明FVIII变体的制备方法，其中所述方法包括将FVIII分子与至少一种PEG聚合物和至少一种多糖缀合。

在一个实施方案中，所述方法中至少一个缀合步骤为酶促步骤。

第三方面涉及根据本发明方法获得或可获得的FVIII变体。

第四方面涉及药物组合物，其包含本发明FVIII变体和任选一种或多种药学接受的赋形剂。该组合物优选用作静脉内或皮下给药。

第五方面涉及本发明FVIII变体或药物组合物作为药物的用途。

第六方面涉及本发明FVIII变体或药物组合物作为治疗A型血友病的药物的用途。

第七方面涉及治疗血友病的方法，其包括将治疗有效量的本发明FVIII变体或药物组合物给予患者。

实施例

简写：

DIC：二异丙基碳化二亚胺

HOBt：1-羟基-苯并三唑

THF：四氢呋喃

DCM：二氯甲烷

DMF：二甲基甲酰胺

TFA：三氟乙酸

HC，LC：N8重链和轻链

CMP：胞苷一磷酸

GSC：胞苷一磷酸-5'-甘氨酰-神经氨酸

GSC-ONH₂：5’-(2-(12-((氨基氧基甲基羰基)氨基)-4,7,10-三氧杂十二烷酰)-氨基乙酰基)神经氨酸胞苷一磷酸

HOAt：1-羟基-7-氮杂-苯并三唑

PSA：聚唾液酸。在此以α2,8-聚唾液酸举例说明(多聚乙酰神经氨酸)

NAN-CMP：N-乙酰神经氨酸胞苷一磷酸

SEC-MALS：利用多角度光散射检测的大小排阻层析。

IEX：离子交换

CV：柱体积

(O)-PEG40 (N)-PSA-N8型的N8缀合物的合成

总体描述：市售多聚乙酰神经氨酸在阴离子交换柱中分级分离，合并具有约20kD或约45kD的分子量的流分。获得的物质使用高碘酸钠氧化。氧化的PSA偶联到GSC-羟胺衍生物5’-(2-(12-((氨基氧基甲基羰基)氨基)-4,7,10-三氧杂十二烷酰)-氨基乙酰基)神经氨酸胞苷一磷酸，以生成GSC-ON=PSA试剂，该试剂在对N-脱唾液酸(O)-PEG40 N8的ST3Gal-III催化聚唾液酸化中用作供体(PSA因此偶联到N-聚糖上)。

合成该类型缀合物的具体描述在下面给出：

实施例1：合成12-((Fmoc-氨基氧基甲基羰基)氨基)-4-7-10-三氧杂十二烷酸3：

Fmoc-氨基氧基乙酸1 (1000 mg, 3.2 mmol), 12-氨基-4-7-10-三氧杂十二烷酸叔丁酯2 (885 mg; 3.2 mmol)和HOBt (431.5mg; 3.2 mmol)溶于THF (5ml)中。然后加入DIC (402mg; 3.2 mmol)。在室温下搅拌该混合物过夜。

LC-MS分析显示已形成所需产物(m/z =574)。

反应混合物在DCM和碳酸氢钠间分配。

有机相用碳酸氢钠洗涤两次，然后在硫酸钠上干燥并蒸发。

将残留物溶于20% TFA-DCM (10ml)，在室温下搅拌30min，并蒸发。LC-MS分析显示存在所需产物12-((Fmoc-氨基氧基甲基羰基)氨基)-4-7-10-三氧杂十一烷酸3 (m/z = 517)。

通过快速色谱法在二氧化硅上纯化油性的残留物，其中使用溶剂A：DCM和溶剂B：含5%CH₃OH的DCM，流速为40ml/min。梯度为：0.5CV的0%B，11.5CV的0-100%B，2.5CV的100%B。在90和100%B之间洗脱产物。相关的流分在TLC上检验，合并纯流分并蒸发，得到无色的油状物，产率为75%。

实施例2：合成GSC衍生物：(5’-(2-(12-((氨基氧基甲基羰基)氨基)-4-7-10-三氧杂十二烷酰基)-氨基乙酰基)-神经氨酸胞苷一磷酸) 6 (“GSC-ONH₂”)

将HOAt (2.2ml, 1.1当量的0.5M的NMP溶液)和DIC (0.205ml, 1.3mmol, 1.3当量)加入到羧酸3 (0.52g, 1mmol)的无水THF (5ml)溶液中。在室温下搅拌反应混合物0.5h。

然后加入等量的DIC，接着加入新鲜配制的在100mM HEPES含水缓冲液(10ml)中的GSC 4 (0.69g, 1.1mmol)溶液。反应混合物变黄。在5.5h的反应时间后进一步加入DIC (1.1当量)。

然后在室温下温育反应混合物过夜。

LC-MS分析显示已经成所需产物5 (m/z = 1128.7)。

通过PTFE过滤器过滤反应混合物，然后使用乙腈和250mM碳酸氢铵作为溶剂通过HPLC在反相C18柱上进行纯化。合并和冻干相关流分。通过分析型HPLC在冻干之前和之后检验纯度，所述HPLC在反相C18柱(Waters Symmetry C18, 5μ, 3.9×150mm)上，并使用溶剂A：乙腈，B：H₂O，C：0.5M NH₄HCO₃ pH7.9。线性梯度在15min内以B:C (90:10)混合物开始并以A:B:C: (60:30:10)混合物结束，流速为1ml/min。柱加热器温度设置为42℃。在冻干时会有轻微的分解作用(低于4%)。

然后使用如下的Dowex 50W树脂将铵阳离子交换为钠：Dowex 50WX2, 100-200目(H+形式) (12g)置于20 ml过滤注射器中。使用1N NaOH洗涤树脂，直至洗脱物呈碱性(25 ml)。然后用水洗涤树脂，直至洗脱物pH呈中性。将产物溶于THF:H₂O (1:10) (11ml)，上样到树脂上，并逐滴洗脱(7×5ml H₂O)。将流分点样到TLC (Mercks Silica凝胶60 F₂₅₄ nm)上；合并并冻干相关流分。

产物在装配有氮检测器的HPLC上定量，使产物在反相Phenomenex Jupiter C18 100×4.6mm, 5μ, 300柱上运行。

溶剂为A：H₂O，B：2-丙醇，C：1% TFA。梯度以A:C (90:10)混合物开始，以(A:B:C) (10:80:10)混合物结束，流速为1ml/min。产率为46%。

第二步：

然后使用二甲胺将产物脱保护：

将5 (200 mg)溶于10%甲醇水溶液(3.3 ml)中。在室温下搅拌二甲胺(3 ml的40%水溶液)和反应混合物1.5h。10-15min后混合物变混浊。通过LC-MS监测反应。在20℃下1h后完成反应。

反应混合物用水(5ml)稀释，并用二氯甲烷(4×5ml)洗涤。两相都在LC-MS上检验。水相含有产物，并且不能检测到芴部分。在有机相检测不到产物。冻干水相，产生GSC衍生物5’-(2-(12-((氨基氧基甲基羰基)氨基)-4,7,10-三氧杂十二烷酰)-氨基乙酰基)神经氨酸胞苷一磷酸(“GSC-ONH₂”) 6，为无色固体。

实施例3：多聚乙酰神经氨酸的分级分离得到分子量约20kDa的材料：

所用多聚乙酰神经氨酸为市购自Sigma-Aldrich的化合物(来自大肠杆菌的α2,8聚唾液酸钠盐，(PSA))。为了得到更均一的材料(指其分子量)，根据WO 2008/074032将其在离子交换柱上分级分离。相应分子量约20kD的流分用在后续的实验中。

实施例4：高碘酸钠氧化在实施例3中分离的20kD PSA材料：

对PSA聚合物非还原端的多元醇进行高碘酸钠氧化，基本按照文献(例如Jain等, BBA (2003) 1622, 42-49)所述，但作出某些修改。将高碘酸钠溶液(0.96mg于2.244ml水中)加至20kD PSA溶液(40mg于2.24ml水中)中。黑暗中23℃下温育反应物15min。

过量的高碘酸盐利用3-甲硫基-1-丙醇(4.7μl)淬灭。在23℃下进一步温育反应物2h。

通过在Millipore Ultra(5kD截留值)上超滤将反应混合物的缓冲液转换为水，并冻干。在下一步中照原样使用冻干的材料，其中该材料与GSC-ONH₂反应。

实施例5：将高碘酸钠氧化的PSA(20kD)偶联到GSC-ONH₂以产生唾液酸转移酶ST3GalIII底物GSC-ON=PSA(20kD)：溶液：

反应缓冲液：100mM咪唑pH6.8

GSC-ONH₂(来自实施例X2)：反应缓冲液中8.2mg/ml

高碘酸盐氧化的PSA(20kD)：反应缓冲液中175mg/ml

苯胺(MW=93.13, d=1.0217)

盐酸甲基羟基胺：反应缓冲液中58.5mg/ml

程序：

将反应缓冲液中的GSC-ONH₂溶液(400μl, 3.26mg, 3.6μmol, 约2当量)加至反应缓冲液中的高碘酸盐氧化的PSA(20kD)溶液(200μl, 35mg, 1.75μmole)中。在剧烈磁力搅拌下通过加入1M HCl (5.5μl)调节pH到6.9。然后加入苯胺(0.56μl, 6nmol)。在25℃下温育淡黄色且稍微混浊的混合物。在10-15min后观察到一些沉淀。

反应进程之后接着在大小排阻柱Waters Biosuite 125, HR ESC 300×7.8mm (+保护柱)上分析，其中100mM磷酸盐缓冲液pH6.8缓冲液作为洗脱液，流速为0.6ml/min，室温，DAD探测器设在212nm和272nm。在30min、2h和18h的反应时间后进行分析。

在这个体系中GSC-ONH₂在18.5min时洗脱。产物在约13.8min的保留时间作为宽“峰”洗脱。

因为PSA(20kD)和产物GSC-ON=PSA(20kD)两者都在同样的保留时间洗脱，所以反应的进程通过查看如下比率监测：(272nm处产物峰的面积)对比(212nm处产物峰的面积) (PSA仅在212nm处吸收，GSC在272nm处吸收)。比率从30min到2h在增加，且到18h的反应时间前保持恒定。

在19h的反应时间后，通过加入甲基羟基胺溶液(25μl, 10当量)淬灭任何未反应的醛，并且在室温下温育混合物1h。

然后在0.45μ过滤器(Millipore Millex-HV (PVDF))上过滤反应混合物，并进一步在ProSpin CS-800 (Princeton Separations) (条件为1.5 g/l L-组氨酸、3 g/l蔗糖、18 g/l NaCl、0.1 g/l吐温80、0.25 g/l CaCl₂·2H₂O缓冲液(pH7.3))上纯化，以去除低分子量试剂。

相对于CMP (Sigma C1006)进行终产物的定量，即通过测量已知浓度的CMP溶液在272nm处吸收值制作标准曲线。

获得GSC-ON=PSA(20kD)，其产率相对于高碘酸氧化的PSA为45%。

实施例6：通过唾液酸转移酶ST3Gal-III催化的(N)-脱唾液酸(O)-PEG(40kD) N8与GSC-ON=PSA(20kD)反应制备(N)-PSA (20kD)-(O)-PEG (40kD)-N8：

第一步：

(O)-PEG(40kD) (N)-脱唾液酸-N8 N8

根据专利WO2009/108806 A1中公开的方法合成该化合物。

第二步：

ST3Gal-III催化的(O)-PEG(40kD) (N)-脱唾液酸N8与GSC-ON=PSA(20kD)的PSA化：

溶液：

反应缓冲液：1.5 g/l L-组氨酸、3 g/l蔗糖、18 g/l NaCl、0.1 g/l吐温80、0.25 g/l CaCl₂·2H₂O，pH7.3

GSC-ON=PSA(20kD)：在反应缓冲液中0.78mM

ST3Gal-III：(大鼠酶)：1.42mg/ml (1.34U/mg)

(O)-PEG(40kD)-(N)-脱唾液酸N8：在反应缓冲液中1.76mg/ml

方法：

将GSC-ON=PSA溶液(36.5μl, 28.5nmol, 10.5当量)加至(O)-PEG(40kD) (N)-脱唾液酸N8溶液(272μl, 0.48mg蛋白质, 2.71nmol)中。加入反应缓冲液(104μl)。反应通过加入酶(63.2μl, 89.6μg, 约120mU)启动。在32℃下温育反应混合物22h。

通过加入10μl反应缓冲液中的NAN-CMP (1mg)溶液将产物封端。在32℃下温育反应混合物1h。

后处理和纯化：

所用缓冲液为：

缓冲液A：20mM咪唑缓冲液pH 7.4，含有10mM CaCl₂、1M丙三醇、0.02%吐温80，不含NaCl

缓冲液B：缓冲液A + 1M NaCl

反应缓冲液：1.5 g/l L-组氨酸、3 g/l蔗糖、18 g/l NaCl、0.1 g/l吐温80、0.25 g/l CaCl₂·2H₂O，pH7.3

后处理和纯化：

在缓冲液A (8ml)中稀释后，根据厂商说明书通过在Vivapure Q Mini M设备上离子交换来纯化反应混合物。在缓冲液B中回收产物。

使用反应缓冲液作为洗脱液将产物进一步在大小排阻柱Superdex 200 10×300 GL (GE Healthcare)上运行。

蛋白质回收率为32%。

产物表征：

SDS PAGE分析：

使用考马斯亮蓝染色，在还原条件下在7% Tris乙酸SDS凝胶上(150V, 1h10) (Invitrogen)对回收的产物进行电泳。蛋白质标准品为来自Invitrogen的HiMark未染色的HMW Protein Standard。

(O)-PEG (40kD) (N)-脱唾液酸N8的聚乙二醇化重链条带在约240kD处显示，轻链在约83kD处显示。PSA化后，被假定对应于PSA化重链的条带如预期地出现在更高的分子量处(在260和280kD之间)。另外，被假定对应于PSA化轻链的宽且弥散的条带出现在97和116kD间。

不能检测到相应于N8重链的剩余条带，只能看到轻链的痕迹，表明PSA确实转移到(O)-PEG40kD-N8重链和轻链两者上

在反相HPLC上分析：

在反相Daiso 300, 250x2.1, 5μ柱上进行分析。洗脱液为A: H₂O/TFA 0.1%，和B: H₂O/ACN/TFA (80:20:0.09%)，流速为0.25ml/min，柱加热器(column oven)温度为40℃。梯度在30min内为从35%到84%。HPLC装配有两个探测器：DAD探测器(280nm)和荧光探测器，激发波长在280nm处，发射波长在348nm处。

产物的重链和轻链的保留时间如在下表所示。FVIII的重链和轻链和中间产物(O)-PEG (40kD)-N8的保留时间示出以作比较：

因此，对于更有极性终产物[(N)-PSA (20kD)-(O)-PEG (40kD) N8]，不出所料，重链和轻链的保留时间相比起始和中间化合物的HC和LC的保留时间更短。颇为意想不到的是，在偶联聚唾液酸后不能获得对保留时间较大的作用。但是该系统不反映生理条件，因为在洗脱液中存在的酸中和了来自PSA羧酸部分的负电荷。

活性：

在来自Chromogenix的显色测定CoA试验SP FVIII中测量终产物的活性：与起始FVIII相比，超过80%的活性得以恢复。

实施例7：对多聚乙酰神经氨酸片段化以获得分子量约45kD的材料：

所用多聚乙酰神经氨酸为市购自Sigma-Aldrich的化合物(α2,8聚唾液酸钠，(PSA))。为了获得更均一的材料(指其分子量)，使用缓冲液A和B将其在HiPrep 16/10 Q FF阴离子交换柱(GE Healthcare)上进行分级分离。

A: 10mM三乙醇胺pH7.4, 25mM NaCl

B: 10mM三乙醇胺pH7.4, 1M NaCl

利用8CV的缓冲液A平衡柱后，使用24CV的17.5%-100%B的梯度，流速为2ml/min将多聚乙酰神经氨酸分级分级(5ml流分)。在210nm处进行UV检测。通过在Millipore Amicon Ultra(3kD截留值)上超滤将流分的缓冲液转换为水，冻干，并通过SEC-MALS和UV分析。合并对应于分子量约45kD(在最大UV吸收值处分子量)，分子量范围为38-77kD (“45kD PSA”)的流分，将其用于后续实验。

实施例8：高碘酸钠氧化45kD PSA：

将4mM的高碘酸钠水溶液(167μl, 2.24摩尔当量)加至在实施例7中所获材料(“45kD PSA”)的水溶液(在0.5ml水中13.5mg)中。黑暗中室温下温育反应物15min。

过量的高碘酸钠通过3-甲硫基-1-丙醇(0.7μl, 12摩尔当量)淬灭。室温下温育反应物2h。

通过在Millipore Amicon Ultra(4.5kD截留值)上超滤将反应混合物的缓冲液转换为水，并冻干。在下一步中照原样使用冻干的材料。

实施例9：将高碘酸钠氧化的PSA(45kD)偶联到GSC-ONH₂以生成唾液酸转移酶ST3GalIII底物GSC-ON=PSA(45kD)：

溶液：

反应缓冲液: 100mM咪唑pH6.8

GSC-ONH₂(得自实施例2)：在反应缓冲液中8.3mg/ml (pH调节为6.8)。

高碘酸盐氧化的45kDa PSA (得自实施例Y2)：在反应缓冲液中355mg/ml

饱和的苯胺水溶液(约0.38M)

盐酸甲基羟基胺：在反应缓冲液中58.5mg/ml

方法：

基本按照实施例5中描述的进行反应。详细的描述如下：将反应缓冲液中的GSC-ONH₂(得自实施例2)溶液(168μl, 1.4mg, 1.5μmol,约2当量)加至反应缓冲液中的高碘酸盐氧化的45kD PSA (得自实施例8)溶液(92μl, 32.7mg, 0.73μmol)中。然后加入饱和的苯胺水溶液(6.8μl, 2.58μmol)。在室温下温育反应混合物。

在反应过程之后接着使用大小排阻柱Waters Biosuite 125, HR ESC 300×7.8mm (+保护柱)进行HPLC分析。洗脱液为100mM磷酸盐缓冲液pH6.8缓冲液，流速为0.6ml/min。分析在室温下进行，DAD探测器设在214nm(PSA和GSC部分检测)和272nm(GSC部分检测)处。GSC-ONH₂在18.5min时洗脱，氧化的45kD PSA和反应产物在10.3min的相同保留时间洗脱。

因为氧化的45kD PSA和产物GSC-ON=PSA两者都在同样的保留时间洗脱，所以反应进程通过查看如下比率监测：(272nm处氧化的45kD PSA/GSC-ON=PSA峰的面积)相比(212nm处氧化的45kD PSA/GSC-ON=PSA的面积)。

在1h、1h45、3h、4h30、5h30、10h和23h30的反应时间后进行分析。

比率从1h到1h45在增加，但在1h45和3h间不变化。因此在4h的反应时间加入更多的GSC-ONH₂试剂(32μl, 267μg)。同样地，在10h的反应时间后加入更多试剂(0.9mg)，并且混合物在室温下放置总共23h30。

使用Micro ?kta系统(GE Health care)在Superdex 200 10/300 GL (GE Healthcare)柱上纯化反应混合物。洗脱液为20mM咪唑缓冲液pH7.3、10mM CaCl₂、0.02%吐温80、1M丙三醇、0.5M NaCl，流速为0.4ml/min，流分体积为0.5ml。在210和272nm处检测。合并相关流分，通过超滤在Millipore Amicon Ultra(5kD截留值)上来截留浓缩，并照原样在下一步中使用。估计终产物的浓度为0.27mM(通过比较272nm处CMP (Sigma C1006)标准曲线)。

实施例10: 通过唾液酸转移酶ST3Gal-III催化(N-脱唾液酸)(O)-PEG(40kD) N8与GSC-ON=PSA(45kD)反应制备N-PSA(45kD) (O)-PEG(40kD) N8聚糖：

第一步：

(O)-PEG40kD (N)-脱唾液酸N8:

根据专利WO2009/108806 A1中描述的方法合成该化合物。

第二步：

ST3Gal-III催化的(N)-脱唾液酸(O)-PEG(40kD) (N)-脱唾液酸N8与GSC-ON=PSA(45kD)的PSA化：溶液：

反应缓冲液: 20mM咪唑缓冲液pH7.3, 10mM CaCl₂, 0.02%吐温80, 1M丙三醇, 0.5M NaCl。

脱唾液酸-[O]-PEG40kD-N8: 2.78mg/ml

GSC-ON=PSA(45kD) 在反应缓冲液中0.27mM

ST3Gal-III:(大鼠酶):MBP-SBP-ST3Gal III: 1mg/ml

方法：

将GSC-ON=PSA(45kD)溶液(190μl, 51.3nmol, 2.3mg, 10当量)加至(N)脱唾液酸(O)-PEG40kD-N8溶液(325μl, 0.9mg蛋白质, 5.13nmol)中。反应通过加入酶(116.3μl, 116.3μg)启动。在32℃下温育反应混合物17h。

通过加入15μl反应缓冲液中的NAN-CMP (1.2mg)溶液使产物封端。在32℃下温育反应混合物1h。

后处理和纯化:

利用20mM咪唑缓冲液 pH7.3, 10mM CaCl₂, 1M丙三醇, 0.02%吐温80, 25mM NaCl稀释反应混合物至16ml，之后通过离子交换在MonoQ 5/50 GL (GE Healthcare)上纯化。所用缓冲液为：缓冲液A: 含有10mM CaCl₂, 1M丙三醇, 0.02%吐温80(不含NaCl)的20mM咪唑缓冲液(pH7.4)；和缓冲液B: 含有10mM CaCl₂, 1M丙三醇, 0.02%吐温 80, 1M NaCl的20mM咪唑缓冲液(pH7.4)。流速为0.7ml/min。用20CV平衡柱子。洗脱概况如下：3CV的0%B, 5CV的0-20%B, 15CV的20%B，15CV的20-100%B, 10CV的100%B。在280nm处进行UV检测。在室温下进行分级分离。酶首先洗脱出来，然后产物作为具有小肩的峰洗脱。合并和进一步纯化对应于主峰的流分，并且使用含有1.5 g/l L-组氨酸、3 g/l蔗糖、18 g/l NaCl、0.1 g/l吐温80、0.25 g/l CaCl₂·2H₂O(pH7.3)的缓冲液作为洗脱液在大小排阻柱Superdex 200 10x300 GL (GE Healthcare)上交换缓冲液。流速为0.5ml/min。在280nm处进行UV检测。产物作为主峰洗脱，接着是次峰(minor peak)，峰之间由基线分隔。合并对应于主峰的流分，并通过在Millipore Amicon Ultra(50kD截留值)上超滤来截留浓缩。蛋白质回收率为52%。

产物表征：

SDS PAGE分析：

使用考马斯亮蓝染色，在还原条件下在7% Tris乙酸SDS凝胶上(150V, 1h10) (Invitrogen)对回收的产物进行电泳。蛋白质标准品为来自Invitrogen的HiMark未染色的HMW Protein Standard。

具有(O)-PEG (40kD)-N8的聚乙二醇化重链条带出现在约240kD处。PSA化后，具有更高分子量的条带出现在约290kD处。另外，宽且弥散的条带(被假定对应于PSA化轻链)在120和160kD间出现。

可检测到对应于FVIII重链分子量的非常微弱的条带，并且可看到对应于FVIII轻链的条带痕迹。

在HPLC上分析：

在反相Daiso 300, 250x2.1, 5μ柱上进行分析。洗脱液为A: H₂O/TFA 0.1%,和B: H₂O/ACN/TFA (80:20:0.09%)，流速为0.25ml/min，并且干燥器温度为40℃。梯度为在30min内从35%到84%。HPLC装配有两个探测器：DAD探测器(214nm)。产物的重链和轻链的保留时间如在下表所示。N8和中间产物(O)-PEG (40kD)-N8的重链和轻链的保留时间示出以作比较：

不出所料，(N)-PSA(45kD)-(O)-PEG(40kD)-N8相对于[(N)-PSA (20kD)-(O)-PEG (40kD) N8(比较实施例6)获得了同样的概况，即更有极性的终产物(N)-PSA(45kD)-(O)-PEG (40kD) N8]显示的重链和轻链的保留时间比起始和中间化合物的HC和LC的保留时间更短。

活性：

根据厂商说明书，在来自Chromogenix的显色测定CoA试验SP FVIII中测量终产物的活性。相比起始N8，约55%的活性得以恢复。

实施例11: 合成(O)-PSA (N)-PSA-N8类型的N8缀合物

总体描述：对N8进行脱唾液酸化(反应由来自产脲节杆菌(Arthrobacter ureafaciens)的唾液酸酶催化)以生成(O)-脱唾液酸(N)-脱唾液酸N8。通过ST3Gal-I催化GSC-ON=PSA (实施例5或9)与(O)-脱唾液酸(N)-脱唾液酸N8反应，PSA转移到(O)-脱唾液酸聚糖上。在通过离子交换纯化后，GSC-ON=PSA试剂用作ST3Gal-III催化的N-脱唾液酸(O)-PEG40 N8聚唾液酸化中的供体。最终，通过加入NAN-CMP到反应混合物，将任何剩余未反应的半乳糖部分封端。

合成该类型缀合物的详细描述如下给出：

第一步：通过对N8的脱唾液酸化和ST3Gal-I催化的PSA转移到N8的(O)-脱唾液酸聚糖上来制备(O)-PSA820kD) (N)-脱唾液酸N8 (一锅反应)：

溶液：

反应缓冲液：20mM咪唑缓冲液 pH7.3、10mM CaCl₂、0.02%吐温80、1M丙三醇、0.5M NaCl。

N8：在反应缓冲液中5.7mg/ml (8650U/mg)

唾液酸酶：来自产脲节杆菌(Arthrobacter ureafaciens)，0.4mg/ml, 242U/mg

GSC-ON=PSA(20kD)：25mg/ml，在(3 g/l蔗糖、1.5 g/l L-组氨酸、18 g/l NaCl、0.1 g/l吐温80、0.25 g/l CaCl₂；pH7.3)中

His-ST3Gal-I；AA46-343；2.5mg/ml，在(50mM Tris pH8, 100mM NaCl)中

方法：

将产脲节杆菌唾液酸酶(7μl, 678mU,终浓度1.5U/ml)溶液和ST3Gal-I酶(108μl, 0.27mg)溶液加至反应缓冲液中的N8溶液(1.5mg, 8.5nmol, 263μl)中。加入GSC-ON=PSA(20kD)溶液(68μl, 1.7mg,约85nmol,约10当量)。在23℃下温育反应混合物24h。

后处理和纯化:

利用含有(20mM咪唑缓冲液pH7.3、10mM CaCl₂、0.02%吐温80、1M丙三醇)的缓冲液20倍稀释反应混合物，并将其在离子交换柱(MonoQ 5/50GL, GE Healthcare)上纯化。洗脱缓冲液为：缓冲液A：20mM咪唑缓冲液 pH7.3、10mM CaCl₂、0.02%吐温80、1M丙三醇；和缓冲液B：缓冲液A中加入1.5M NaCl。流速为0.35ml/min。在15℃下进行纯化。利用UV, 280nm进行检测。洗脱情况如下：5CV的从0到20% B, 25CV的20-100%B, 5CV的100%B。1ml的流分在96深孔板中收集。

使用银染，在还原条件下通过SDS PAGE分析相关流分(7% Tris乙酸SDS凝胶，(150V, 1h10) (Invitrogen)，蛋白质标准品为来自Invitrogen的HiMark未染色的HMW Protein Standard)。对应于主峰的流分含有N8(约35%的N8不被O-糖基化(Thim等，Haemophilia (2010), 16(增刊5), 194))和(O)-PSA化N8的混合物。不能检测到唾液酸酶和ST3Gal-I酶的痕迹。

合并对应于主峰的流分，并通过超滤(Millipore Amicon Ultra，50kD截留值)来截留浓缩，得到根据反相HPLC分析蛋白质浓度为5.5mg/ml的溶液(HPLC方法详见实施例10)。蛋白质回收率为约79%。

第二步：通过ST3Gal-III催化的PSA转移到(O)-PSA(20kD) (N)-脱唾液酸N8的(N)-脱唾液酸聚糖上合成(O)-PSA(20kD) (N)-PSA(20kD) N8：

溶液：

(O)-PSA(20kD)-(N)-脱唾液酸N8和N8的混合物(得自第一步)：5.5mg蛋白质/ml

GSC-ON=PSA(20kD)：(3 g/l 蔗糖、1.5 g/l L-组氨酸、18 g/l NaCl、0.1 g/l吐温80、0.25 g/l CaCl₂；pH7.3)中25mg/ml

ST3Gal-III：在(14mM Hepes pH7、140mM NaCl、50%丙三醇)中0.33mg/ml的(MBP-SBD-ST3Gal-III)，0.54U/ml。通过在Millipore Biomax(5kD截留值)上超滤来截留浓缩(约15倍)。

NAN-CMP：50mg/ml在20mM咪唑缓冲液pH7.3、10mM CaCl₂、0.02%吐温80、1M丙三醇中

方法：

向第一步获得的(O)-PSA(20kD)-(N)-脱唾液酸N8和N8的混合物(210μl, 6.4nmol)中加入GSC-ON=PSA(20kD)溶液(26μl, 32nmol)。反应通过加入ST3Gal-III酶溶液(40μl, 324mU, 198μg)启动。在32℃下温育反应混合物。在3h的反应时间后，加入GSC-ON=PSA(20kD)溶液的新部分(20μl, 25nmol)。温育反应混合物21h。

封端：

将NAN-CMP溶液(10μl, 0.5mg)加至上述反应混合物中。在32℃下温育混合物2h。

后处理和纯化:

在20mM咪唑缓冲液pH7.4、10mM CaCl₂、0.02%吐温80、1M丙三醇中20倍稀释反应混合物。

然后使用缓冲液A (20mM咪唑缓冲液pH7.4、10mM CaCl₂、0.02%吐温80、1M 丙三醇)作洗涤缓冲液和使用缓冲液B(缓冲液A中加入NaCl至1M的浓度)作为洗脱缓冲液，根据厂商说明在IEX膜(Sartorius Vivapure Q Mini M)上将其纯化。

纯化前洗脱产物通过超滤来截留浓缩(Millipore Amicon Ultra设备, 50kD截留值)，并且在大小排阻柱(Superdex 200 10/30GL, GE Healthcare)上交换缓冲液。该缓冲液含有蔗糖(3 g/l)、L-组氨酸(1.5 g/l)、NaCl (18 g/l)、吐温80 (0.1g/l)和CaCl₂ (0.25 g/l) pH7.3。流速为0.4ml/min，通过UV在280nm下检测，并收集0.5ml的流分。

剩余的ST3Gal-III(可能是聚集物)表现为在主峰前洗脱的肩峰(shoulder)。合并对应于主峰的流分(不含有St3Gal-III)，并通过HPLC定量(关于HPLC的详细方法参见实施例10)。总蛋白回收率(从N8开始)为28%。

产物表征：

SDS PAGE分析：

使用考马斯亮蓝染色，在还原条件下在7% Tris乙酸SDS凝胶(150V, 1h10) (Invitrogen)对回收的产物进行电泳。蛋白质标准品为来自Invitrogen的HiMark未染色的HMW Protein Standard。

很宽且弥散的条带在97和116kD间出现：该条带假定对应于PSA化的重链和轻链。可检测到未衍生的重链和轻链的痕迹。在240和280kD间显示的条带假定对应于PSA化的单链N8。

在HPLC上分析：

如在实施例10中表明的进行分析。

产物的重链和轻链的保留时间如在下表所示。N8的重链和轻链的保留时间示出以作比较：

因此，如对更有极性蛋白质所预期的，PSA化HC保留时间降低(峰显得更宽)。影响对于PSA化轻链较不明显，也反应了只有两个潜在衍生位点可被利用，而对重链(HC的(O)-和(N)-聚糖)有三个位点可被利用的事实。

活性：

在来自Chromogenix的显色测定CoA试验SP FVIII中测量终产物的活性：与起始FVIII相比，约55%的活性得以恢复。

实施例12和13：合成(N)-PSA-N8型的N8缀合物

总体描述：使用来自产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)的唾液酸酶对N8脱唾液酸化，以生成(N)-脱唾液酸N8。GSC-ON=PSA试剂用作在ST3Gal-III催化的对N-脱唾液酸(O)-PEG40 N8聚唾液酸化中的供体。最终，任何剩余未反应的半乳糖部分通过加入NAN-CMP到反应混合物中封端。

合成该类型缀合物的详细描述如下给出：

实施例12：合成(N)-PSA(45kD) N8:

第一步：通过产气荚膜梭菌(C. perfringens)唾液酸酶对N8脱唾液酸化

溶液：

反应缓冲液：20mM咪唑缓冲液pH7.3、10mM CaCl₂、0.02%吐温80、1M丙三醇、0.5M NaCl

唾液酸酶：0.3mg/ml 200U/ml

N8：在反应缓冲液中5.7mg/ml

方法：

将反应缓冲液(350μl)和酶溶液(20μl, 4U)加至N8溶液(350μl, 2mg)中。在23℃下温育混合物45min。

后处理和纯化:

利用(20mM咪唑缓冲液pH7.3, 10mM CaCl₂, 0.02%吐温 80, 1M 丙三醇, 0.15M NaCl)将反应混合物10倍稀释。在?kta Purifier (GE Healthcare)上的阴离子交换柱(MonoQ 5/50 GL, GE Healthcare)上纯化获得的溶液。所用缓冲液为：缓冲液A：20mM咪唑缓冲液pH7.3、10mM CaCl₂、0.02%吐温80、1M丙三醇、25mM NaCl；和缓冲液B：缓冲液A加入1M NaCl。流速为0.5ml/min，利用UV在280nm处检测。如下进行洗脱：5CV的0-20%B，10CV的20%B，10CV的100%B。在最后的梯度步骤以0.5ml的流分收集洗脱物。蛋白质回收率为45%。

第二步：通过ST3Gal-III催化的转移PSA到(N)-脱唾液酸N8上合成(N)-PSA(20kD) N8：

试剂：

反应缓冲液：20mM咪唑缓冲液pH7.3、10mM CaCl₂、0.02%吐温80、1M丙三醇、0.5M NaCl。

[N]-脱唾液酸-N8：2.39mg/ml在20mM咪唑缓冲液(pH7.3)、10mM CaCl₂、0.02%吐温80、1M丙三醇、0.25M NaCl中

GSC-ON=PSA(45kD)：在反应缓冲液中约0.27mM (12.1mg/ml)

ST3Gal III: (大鼠酶)：MBP-SBP-ST3Gal III, 1mg/ml, 1.2U/mg

方法：

将GSC-ON=PSA(45kD)溶液(183μl, 2.22mg)加至[N]-脱唾液酸-N8溶液(364μl, 0.87mg蛋白质)中。反应通过加入酶(122μl, 122μg, 146mU)启动。在32℃下温育反应混合物过夜。

封端：

加入NAN-CMP溶液(在15μl反应缓冲液中1.3mg)，在32℃下温育获得的混合物1h。

后处理和纯化：

利用20mM咪唑缓冲液pH7.3、10mM CaCl₂、0.02%吐温80、1M丙三醇、25mM NaCl将反应混合物10倍稀释，并通过?kta Purifier系统(GE Healthcare)上的阴离子交换(MonoQ 5/50GL, GE Healthcare)将其纯化。所用缓冲液为：缓冲液A：20mM咪唑缓冲液pH7.3、10mM CaCl₂、0.02%吐温80、1M丙三醇、25mM NaCl；和缓冲液B：缓冲液A中加入1M NaCl。流速为0.7ml/min，利用UV在280nm处进行检测。在15℃下进行纯化。如下进行洗脱：5CV的0-20% B, 15CV的20%B, 15CV的20-100%B, 10CV的100%B。洗脱物以0.5ml的流分收集。蛋白质回收率为32%。

产物表征：

SDS PAGE分析：

使用考马斯亮蓝染色，在还原条件下在7% Tris乙酸SDS凝胶(150V, 1h10) (Invitrogen)上对回收产物进行电泳。蛋白质标准品为来自Invitrogen的HiMark未染色的HMW Protein Standard。

很宽且弥散的条带出现在约125和165kD之间：该条带假定对应于PSA化的重链和轻链。可检测到未衍生的重链和轻链的痕迹。

反相HPLC分析：

如在实施例10中表明的进行分析。

产物的重链和轻链的保留时间如在下表所示。N8的重链和轻链的保留时间示出以作比较：

因此，如对更有极性蛋白质预期的，PSA化HC保留时间降低(峰显得更宽)。对于PSA化轻链保留时间的影响基本可忽略。

活性：

在来自Chromogenix的显色测定CoA试验SP FVIII中测量终产物的活性：与起始FVIII相比，约60%的活性得以恢复。

实施例13：合成(N)-PSA(20kD) N8

通过类似于(N)-PSA(45kD) N8的合成方法进行合成。蛋白质的回收率为39%。

表征：

SDS-PAGE分析：如实施例12所述地进行。

很宽且弥散的条带出现在约97和160kD间：该条带被假定对应于PSA化的重链和轻链。可检测到对应于未衍生的重链(痕量)和轻链(相当大量)痕迹的条带。

反相HPLC上分析：

在反相Daiso 300, 250x2.1, 5μ柱上进行分析。洗脱液为：A: H₂O/TFA 0.1%，和B: H₂O/ACN/TFA (80:20:0.09%)，流速为1ml/min，且柱加热器温度为40℃。梯度为在30min内从35%到84%。HPLC装配有两个探测器：DAD探测器(214nm)。产物的重链和轻链的保留时间如在下表所示。N8的重链和轻链的保留时间示出以作比较：

因此，如对更有极性的蛋白质预期的，对于(N)-PSA(45kD) N8化合物，PSA化HC的保留时间降低(峰显得更宽)。对于PSA化轻链保留时间的影响基本可忽略。

活性：

在来自Chromogenix的显色测定CoA试验SP FVIII中测量终产物的活性：与起始FVIII相比，约88%的活性得以恢复。

3.在FVIII KO小鼠中的PK研究：比较各种N8糖-PEG/PSA衍生物的半衰期。

实施例14：N8糖缀合物的药代动力学表征：

在rFVIII缺陷型小鼠(具有C57Bl/6背景的FVIII外显子16被敲除(KO)小鼠)中评价rFVIII变体的药代动力学。FVIII-KO小鼠不具有可检测的FVIII:C。使用雌雄混合群体(大约1:1)，其体重大约为25克，年龄范围16-28周。小鼠在尾静脉接受了单次静脉内注射rFVIII (280 IU/kg)。在给药后直到64小时的时间点，使用无包被毛细玻璃管，从眼窝丛处采血。对每只小鼠收集3份样品，每一时间点收集2-4份样品。用柠檬酸钠立即稳定血液并在4倍体积FVIII Coatest SP缓冲液(50mM Tris、150mM NaCl、1% BSA，pH7.3，含防腐剂)中稀释，然后在4000 × g离心5分钟。将得自稀释血液的血浆在干冰上冷冻并保存于-80oC。按照厂商说明书，在显色测定中使用Coatest SP试剂(Chromogenix)测定FVIII:C。通过非房室法(non-compartmental method) (NCA)，使用WinNonlin Pro软件，进行药物动力学分析。下表显示了半衰期(T?)的估计值。

* 当同一化合物测试了几次时，该表中所示的半衰期值为对每个实验获得的半衰期的平均值。

化合物C (其中(支化)PEG40kD部分与(O)-聚糖连接)具有14h的半衰期，即N8的半衰期延长2倍。在N-聚糖上进一步缀合聚合物对所得化合物的半衰期产生明显不同的影响：

缀合另一个PEG40kD部分不对所得化合物E (T_1/2 = 13h)产生任何影响

尽管缀合(线性)PSA(分子量20或45kD)对所得化合物确实产生明显的作用：化合物F和G的半衰期分别为17.7h和19.5h，使原N8分子的半衰期分别延长2.6或2.9倍。(尽管后者损失了一半的活性)

同样地，在(O)-和(N)-聚糖两者上用PSA(20kD)衍生的N8(化合物D)显示与在(O)-和(N)-聚糖两者上用PEG(40kD)衍生的N8(化合物E)同样的半衰期：T1/2 = 12.6h对比13h；相比仅在(N)-聚糖衍生的N8的半衰期(化合物A)，这仅为适度的改进(T1/2 = 11h)。然而，当PEG(40kD)而非PSA(20kD)在(O)-聚糖上存在时，所得化合物F((O)-PEG40kD) (N)-PSA(20kD) N8)的半衰期明显增加：对于化合物D 17.7h对比12.6h。

这些结果有力地表明PEG和PSA的组合用于糖衍生优于仅使用一种聚合物类型。

这些结果是意想不到的：支化PEG 40kD因为其能掩盖蛋白质表面而预期具有延长作用，从而避免蛋白酶接触N8表面，或使蛋白酶更难接近N8表面，或防止/降低N8结合到清除受体上。作为支化聚合物，预期其相比线性聚合物更有效地实现所述作用(Veronese等，J. Bioactive and Compatible Polymers (1997)12, 196)。只要立体参数适用，就可预见到支化聚合物相比线性聚合物对N8表面具有甚至更好的保护作用，更不用说线性聚合物的分子量(molecular way)只有支化聚合物的一半。两种聚合物都高度水合，它们的结构相似(多数为随机卷曲)。

实施例15: 制备唾液酸转移酶底物(4-甲酰基苯甲酰基)甘氨酰唾液酸胞苷5’-一磷酸酯(醛-GSC, J-1)

将4-甲酰基苯甲酸N-羟基琥珀酰亚氨酯(100 mg, 0.41 mmol)溶于THF (3 ml)，并且加入TRIS缓冲液(100 mM, pH 8.5, 4 ml)。称取甘氨酰唾液酸胞苷5’-一磷酸酯(GSC, 250 mg, 0.34 mmol)并加入到NHS-酯溶液中，并使其在室温下反应2.5 h。反应混合物利用15 ml的10 mM碳酸氢铵缓冲液稀释到4 ml，并用RP HPLC纯化。系统：Waters 2545梯度控制器(gradient controller), 2489 UV探测器。柱：C18, 2 cm. 梯度0->30%含有的10mM碳酸氢铵的CH₃CN。相关流分用LCMS鉴定并冻干。然后通过RP-HPLC再纯化产物。产量：62 mg。产物通过LCMS鉴定。

使用以上试验方案，制备具有化学选择性的醛官能团的唾液酸转移酶底物。

实施例16:制备烷氧基胺官能化的羟乙基淀粉(HES-ONH₂)

将HES 200/0.5输注液(“HyperHAES”, Fresenius Kabi, 80 ml, 60 g/l, 4.8 g, 24 μmol)与1,3-双氨基氧基丙烷.2HCl溶液混合(1.8 g, 10.2 mmol, 425当量)，使pH到1.66。在室温下搅拌混合物过夜。20 ml量的反应混合物用250 ml水稀释。使用Vivaflow 50系统(Sartorius, 10 kDa MWCO PES膜, 泵后压力(pressure after pump)约2.5, 消耗(waste): 7 ml/min)，通过切向过滤掉5 l的水纯化稀释的样品。最终，将其浓缩至50 ml，并且该系统利用50 ml水冲洗。冻干后，获得690 mg产物。

以同样的方式，从“Voluven”输注液(Fresenius Kabi)开始由HES 130/0.4制备HES-ONH₂。

使用以上试验方案，制备具有化学选择性的烷氧基胺官能团的羟乙基淀粉。

实施例17：将醛-GSC (J-1)与烷氧基胺官能化的羟乙基淀粉HES-ONH₂ (J-2)偶联以获得HES-GSC缀合物(J-3)

将HES-ONH₂ (J-2) (100 mg, 0.5 mol)溶于1000 μl PBS-缓冲液pH 7.4中，并且加入醛-GSC (J-1) (31 mg, 41 mol)。使该反应在室温进行22 h，之后利用100ml PBS缓冲液(pH 7.3)稀释该反应混合物。使用Vivaflow 50系统(Sartorius, 10 kDa MWCO RC膜)，通过切向过滤掉4 l的PBS缓冲液来纯化稀释的样品。在含有140 mg HES-GSC的100 ml缓冲液中获得产物。产物通过SEC (柱: BioSep-SEC-S3000, 5μm,290柱 300 × 7.8mm, 缓冲液: PBS-缓冲液 pH 7.3, 流速: 1 ml/min)表征，同时在276 nm处检测胞苷。通过该方法在产物中只检测到高分子量的胞苷衍生物，结论是该产物基本上不含原料醛-GSC。

使用以上实验方案，制备唾液酸转移酶底物，其可用于将羟乙基淀粉连接到糖蛋白的脱唾液酸化聚糖上。

实施例18：使用HES-GSC底物J-3和ST3Gal-I在O-聚糖上用HES修饰wt B-结构域缺失的人FVIII (N8)以获得HES-FVIII缀合物

浓缩HES-GSC (10当量, 45 mg, 50 ml, 在PBS-缓冲液中1mg/ml)，并使用Amicon Ultra超滤小瓶将缓冲液交换为20 mM咪唑、10 mM CaCl₂、0.02%吐温80、1 M丙三醇、pH 7.3、1 M NaCl。终体积为2.2 ml。HES-GSC试剂与N8 (4 mg, 22 nmol, 5.7 mg/ml)、产脲节杆菌唾液酸酶(40 μl, 130 U/ml, 0.43 mg/ml, 5.2 U)和His-ST3Gal-I (400 μl, 2.5 mg/ml)混合，并且在32℃下温育。在22 h后，SDS PAGE分析显示产物形成弥散的条带，其迁移至比HC和LC FVIII两者的条带更高分子量处。用约50 ml缓冲液(20 mM咪唑、10 mM CaCl₂、0.02%吐温80、1 M丙三醇、pH 7.3、25 mM NaCl)稀释反应混合物以减低导电性，并通过离子交换层析纯化。柱：MonoQ 5/50 GL，起始缓冲液：20 mM咪唑、10 mM CaCl₂、0.02%吐温80、1 M丙三醇、pH 7.3、25 mM NaCl，洗脱缓冲液：20 mM咪唑、10 mM CaCl₂、0.02%吐温80、1 M丙三醇、pH 7.3、1 M NaCl。含有所需产物的相关流分通过SDS PAGE分析鉴定为具有三条主带：一条完整的LC，一条强度显著减小的HC条带和代表与HC缀合的HES的高分子量的弥散条带。分离的合并流分含有1.11 mg产物(基于FVIII A280, 0.275 mg/ml)。合并的流分(4 ml)与100 μl的CMP-NAN(在20 mM咪唑、10 mM CaCl₂、0.02%吐温80、1 M丙三醇、pH 7.3、25 mM NaCl的缓冲液中25 mg/ml)和ST3Gal-III (100 μl, 1.2 U/ml)混合，并在32℃下温育1小时。然后利用缓冲液(20 mM咪唑、10 mM CaCl₂、0.02%吐温80、1 M丙三醇、pH 7.3、25 mM NaCl)稀释反应混合物，并将其装载到Vivapure Q, Maxi M旋转过滤器(Sartorius)上。所述过滤器用2 x 15 ml 20 mM咪唑、10 mM CaCl₂、0.02%吐温80、1 M丙三醇、pH 7.3、25 mM NaCl洗涤，并首先用2 x 15 ml 20 mM咪唑、10 mM CaCl₂、0.02%吐温80、1 M丙三醇、pH 7.3、200 mM NaCl洗脱(以去除ST3Gal-III)，然后用3 x 0.5 ml 20 mM咪唑、10 mM CaCl₂、0.02%吐温80、1 M丙三醇、pH 7.3、1 M NaCl洗脱产物。最先的两个流分含有所需产物，分别为800 μg和110 μg (基于FVIII A280)。这两个流分分别用SEC (Superdex 200 10/300 GL柱, 缓冲液：组氨酸(1.5 mg/ml)、CaCl₂ (0.25 mg/ml)、吐温80 (0.1 mg/ml)、NaCl (18 mg/ml)、蔗糖(3 mg/ml))纯化，结果分别回收了218 μg和66 μg (基于FVIII A280)。HPLC蛋白质浓度测定得到的产量分别为130 μg和40 μg(基于在280nm处FVIII A的吸光度)。

使用以上实验方案，制备HES-FVIII缀合物，其中HES通过B-结构域接头的O-聚糖偶联到FVIII。这种缀合策略产生位点选择性HES化的FVIII-分子。此外，唾液酸转移酶介导的缀合是温和的。

实施例19：修饰wt B-结构域缺失的人FVIII (N8)以获得同时PEG化和HES化的缀合物，其中使用HES-GSC底物J-3和ST3Gal-I使HES在O-聚糖上，使用PEG-GSC和ST3Gal-III使PEG在N-聚糖上

在含水缓冲液中在一锅反应中利用固定化唾液酸酶、PEG-GSC和ST3Gal-III处理根据实施例18制备的缀合物。反应完全后，通过过滤去除唾液酸酶，并加入大大过量的CMP-NAN到反应混合物中，以封闭任何末端半乳糖。反应完全后，通过阴离子交换和SEC层析纯化缀合物以使产物与ST3Gal-III和唾液酸转移酶底物分离。

使用这种实验方案，生产在O-和N-聚糖上分别与HES和PEG缀合的FVIII。

实施例20：修饰wt B-结构域缺失的人FVIII (N8)以获得同时PEG化和HES化的缀合物，其中使用HES-GSC底物J-3和ST3Gal-III使HES在N-聚糖上，使用PEG-GSC和ST3Gal-I使PEG在O-聚糖上

根据WO 2009/108806 A1制备O-聚糖PEG化的FVIII。在含水缓冲液中在一锅反应中利用固定化唾液酸酶、实施例17的HES-GSC J-3和ST3Gal-III处理这种缀合物。反应完全后，通过过滤去除唾液酸酶，并加入大大过量的CMP-NAN到反应混合物中，以封闭任何末端半乳糖。反应完全后，通过阴离子交换和SEC层析纯化缀合物以使产物与ST3Gal-III和唾液酸转移酶底物分离。

使用这种实验方案，生产分别在N-和O-聚糖上与HES和PEG缀合的FVIII。

实施例21：制备硫酸化的PSA

根据公开的方法(例如Kunou等，Biomacromolecules (2000), 1, 451和其中引用的文献)进行制备。原料为分子量约20kD的PSA或如在实施例3和7描述而获得的分子量约45kD的PSA。

简言之，PSA的钠盐换成三正丁铵盐，以增加其在有机溶剂中溶解度。这在离子交换树脂(Amberlite IR120B, H+型)上进行。使用SO3-吡啶复合物作为硫酸化试剂，在0℃下在无水DMF中在惰性气氛下对冻干的三丁基铵盐进行硫酸化。通过加入水及调节pH到9终止反应。通过滴加反应混合物至大体积的丙酮中回收产物。通过离心获得的沉淀回收产物。通过凝胶过滤进一步纯化产物，并将洗脱物冻干。

实施例22：对硫酸化PSA的高碘酸钠氧化

如在实施例8中同样的方式进行高碘酸盐氧化，该反应以在实施例21获得的硫酸化的PSA起始。

实施例23：偶联高碘酸钠氧化的硫酸化的PSA至GSC-ONH₂以生产唾液酸转移酶ST3Gal-III底物GSC-ON=硫酸化的PSA

使用来自实施例2的GSC-ONH2和来自实施例22的氧化的硫酸化的PSA作为起始化合物根据实施例9进行偶联。

实施例24：通过唾液酸转移酶ST3Gal-III催化(N)-脱唾液酸(O)-PEG(40kD) N8与GSC-ON=硫酸化PSA的反应以制备(N)-硫酸化的PSA-(O)-PEG (40kD) N8：

在ST3Gal-III存在下使用(N)-脱唾液酸(O)-PEG(40kD) N8作为受体及GSC-ON=硫酸化的PSA作为供体根据实施例10制备该化合物。