用于增加在巴氏毕赤酵母中生产的治疗性糖蛋白上的N-糖基化位点占据的方法

摘要

描述了一种与在没有如本文所述修饰的重组宿主细胞中生产的治疗性糖蛋白的N-糖基化位点占据相比，增加在如本文所述修饰且遗传地工程改造成表达糖蛋白的重组宿主细胞中生产的治疗性糖蛋白的N-糖基化位点占据的方法。具体地，所述方法会在编码内源OTase复合物的宿主细胞基因的表达存在下，提供过表达异源单亚基寡糖基转移酶的重组宿主细胞，在具体实施方案中，所述异源单亚基寡糖基转移酶能够在功能上抑制酵母寡糖基转移酶(OTase)复合物的至少一种必需蛋白(例如，硕大利什曼原虫STT3D蛋白)的致死突变表型。所述方法可用于在低等真核生物细胞(诸如酵母和丝状真菌)中和在高等真核生物细胞(诸如植物和昆虫细胞和哺乳动物细胞)中生产具有增加的N-糖基化位点占据的治疗性糖蛋白。

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发明背景

(1)发明领域

本发明涉及与在没有根据本发明修饰的重组宿主细胞中生产 的治疗性糖蛋白的N-糖基化位点占据相比，增加在根据本发明修饰 的且遗传地工程改造成表达糖蛋白的重组宿主细胞中生产的异源 糖蛋白的N-糖基化位点占据的方法。具体地，本发明提供了过表达 异源单亚基寡糖基转移酶的重组宿主细胞，在具体实施方案中，所 述异源单亚基寡糖基转移酶能够在有宿主细胞的内源寡糖基转移 酶(OTase)复合物存在下在功能上抑制酵母寡糖基转移酶(OTase) 复合物的至少一种必需蛋白的致死突变表型，也提供了使用这些宿 主细胞来生产异源糖蛋白的方法。

(2)相关技术的描述

生产重组人蛋白质的能力已经引起人类健康护理的重大进步， 并且仍然是活跃的药物发现领域。许多治疗性蛋白需要在翻译后将 聚糖添加至蛋白质的特定天冬酰胺残基(N-糖基化)上，以确保适 当的结构-功能活性以及随后在人血清中的稳定性。对于在人类中治 疗性用途，糖蛋白需要人样N-糖基化。可模拟人样糖蛋白加工的哺 乳动物细胞系(例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人视网膜细胞) 具有一些缺点，包括低的蛋白质效价、长的发酵时间、异质产物以 及连续的病毒抑制。因此，希望使用这样的表达系统：其不仅在短 的发酵时间内产生高蛋白质效价，而且可以生产人样糖蛋白。

就治疗性蛋白表达而言，真菌宿主诸如酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)或甲基营养酵母诸如巴氏毕赤酵母 (Pichia pastoris)具有独特优点，例如，它们不会分泌大量内源蛋 白，可利用强诱导型启动子来生产异源蛋白，它们可以在确定的化 学培养基中生长，且不需要使用动物血清，它们可以生产高效价的 重组蛋白(Cregg等人，FEMS Microbiol.Rev.24：45-66(2000))。 但是，在酵母中表达的糖基化蛋白通常含有额外的甘露糖糖类，它 们产生“高甘露糖型”聚糖。因为这些高甘露糖型N-聚糖当被施用给 某些个体时可以导致不利应答，酵母通常尚未用于生产意图用于人 类的治疗性糖蛋白。但是，在美国专利号7,029,872和7,449,308中 描述了遗传地工程改造酵母来生产人样N-聚糖的方法，在美国公开 的申请号20040230042、20050208617、20040171826、20050208617 和20060286637中也描述了所述方法。这些方法已经被用于构建可 以生产治疗性糖蛋白的重组酵母，所述治疗性糖蛋白在其上面主要 具有人样复杂型或杂合型N-聚糖，而不是酵母型N-聚糖。

已经发现，尽管遗传地工程改造的酵母可以生产具有哺乳动物 或人样N-聚糖的糖蛋白，在糖蛋白上的N-聚糖附着位点的占据宽 泛地变化，且通常低于这些相同位点在哺乳动物细胞生产的糖蛋白 中的占据。就在巴氏毕赤酵母中生产的不同重组抗体而言，已经观 察到该现象。但是，也已经在哺乳动物细胞中观察到N-聚糖附着位 点的占据的变异性。例如，Gawlitzek等人，Identification of cell  culture conditions to control N-glycosylation site-occupancy of  recombinant glycoproteins expressed in CHO cells，Biotechnol. Bioengin.103：1164-1175(2009)公开称，就在CHO细胞中生产的特 定糖蛋白的特定位点而言，N-糖基化位点占据可以变化，且可以修 改生长条件，以控制在这些位点处的占据。国际公开的申请号WO 2006107990公开了一种使用多萜醇-连接的寡糖合成途径来提高真 核细胞的蛋白N-糖基化的方法。Jones等人，Biochim.Biophys.Acta. 1726：121-137(2005)已经综述了N-糖基化位点占据的控制。但是， 仍然需要增加在重组宿主细胞中生产的治疗性蛋白的N-糖基化位 点占据的方法。

发明内容

本发明提供了一种在如本文所述修饰的重组宿主细胞中生产 治疗性糖蛋白的方法，其中在如本文所述修饰的宿主细胞中生产的 糖蛋白的N-糖基化位点占据增加，超过了在没有如本文所述修饰的 宿主细胞中生产的相同糖蛋白的N-糖基化位点占据。例如，在如本 文所述修饰的酵母宿主细胞中，在其中生产的糖蛋白的N-糖基化位 点占据与在重组哺乳动物或人细胞中生产的相同糖蛋白的N-糖基 化位点占据相同或更相似。

为了增加在重组宿主细胞中生产的糖蛋白上的N-糖基化位点 占据，在所述宿主细胞中表达所述糖蛋白之前或同时，在所述重组 宿主细胞中过表达一种或多种异源单亚基寡糖基转移酶(OTase)。 在具体方面，至少一种异源单亚基寡糖基转移酶能够在功能上补偿 构成内源性的宿主细胞异源寡聚的寡糖基转移酶(OTase)复合物 的一个或多个必需亚基的致死突变。硕大利什曼原虫(Leishmania  major)STT3D蛋白是异源单亚基寡糖基转移酶的一个实例，其已 经被证实会抑制酿酒酵母中的STT3基因座和至少一个选自下述的 基因座的致死突变：WBP1、OST1、SWP1和OST2(Naseb等人，Molec. Biol.Cell 19：3758-3768(2008))。一般而言，在有构成宿主细胞 的内源OTase复合物的蛋白(包括宿主细胞的内源STT3蛋白)存 在下，组成性地或诱导性地过表达所述一种或多种异源单亚基寡糖 基转移酶。编码所述异源单亚基寡糖基转移酶基因的表达盒可以整 合进宿主细胞基因组内的任意位点中，或位于宿主细胞的染色体外 间隙中，即，自主复制的遗传元件，诸如质粒、病毒、2μm质粒、 微型染色体等。

在具体实施方案中，一种或多种单亚基寡糖基转移酶是利什曼 原虫属的种的STT3A蛋白、STT3B蛋白、STT3C蛋白、STT3D蛋 白或它们的组合。在具体实施方案中，所述一种或多种单亚基寡糖 基转移酶是硕大利什曼原虫STT3A蛋白、STT3B蛋白、STT3C蛋 白、STT3D蛋白或它们的组合。在没有编码构成宿主细胞的OTase 复合物的蛋白(包括宿主细胞STT3蛋白)的内源基因的表达存在 下，不过表达编码单亚基寡糖基转移酶的核酸分子。相反，在编码 构成宿主细胞的内源寡糖基转移酶(OTase)复合物的蛋白的基因 的表达(包括编码宿主细胞的STT3的内源基因的表达)存在下， 组成性地或诱导性地过表达单亚基寡糖基转移酶的核酸分子。编码 单亚基OTase的每个表达盒可以整合进宿主细胞基因组内的任意 位点中，或位于宿主细胞的染色体外间隙中，即，自主复制的遗传 元件，诸如质粒、病毒、2μm质粒、微型染色体等。

在本文中已经使用巴氏毕赤酵母宿主细胞例证了本发明，所述 宿主细胞被遗传地工程改造成生产哺乳动物或人样复杂型N-聚糖； 但是，本发明可以应用于其它酵母或丝状真菌宿主细胞，具体地， 遗传地工程改造成生产哺乳动物或人样复杂型或杂合型N-聚糖的 酵母或丝状真菌，以提高在所述酵母或丝状真菌宿主细胞中生产的 糖蛋白的总N-糖基化位点占据。在其它方面，所述宿主细胞是生产 重组异源蛋白的酵母或丝状真菌，所述重组异源蛋白具有野生型或 内源性的宿主细胞N-糖基化模式，例如，高甘露糖基化的或高甘露 糖型N-聚糖。在其它方面，所述宿主细胞是这样的酵母或丝状真菌： 其缺少α-1，6-甘露糖基转移酶活性(例如，在诸如但不限于酿酒酵 母或巴氏毕赤酵母的不同酵母菌株的情况下，och1p活性)，并因 而生产具有高甘露糖型N-聚糖的重组异源蛋白。此外，本发明也可 以应用于植物和哺乳动物表达系统，以提高在这些植物或哺乳动物 表达系统中生产的糖蛋白(特别是具有超过2个N-连接的糖基化位 点的糖蛋白)的总N-糖基化位点占据。

因此，在上述内容的一个方面，提供了一种在重组宿主细胞中 生产异源糖蛋白的方法，所述方法包括：提供重组宿主细胞，所述 重组宿主细胞包括编码一种或多种异源单亚基寡糖基转移酶的一 种或多种核酸分子和编码异源糖蛋白的核酸分子；和在用于表达所 述异源糖蛋白的条件下，培养所述宿主细胞，以生产所述异源糖蛋 白。

在上述内容的另一个方面，提供了一种在宿主细胞中生产具有 哺乳动物或人样复杂型或杂合型N-聚糖的异源糖蛋白的方法，所述 方法包括：提供宿主细胞，所述宿主细胞包括编码一种或多种异源 单亚基寡糖基转移酶的一种或多种核酸分子和编码异源糖蛋白的 核酸分子；和在用于表达所述异源糖蛋白的条件下，培养所述宿主 细胞，以生产所述异源糖蛋白。

一般而言，在上述的方面，表达内源性的宿主细胞基因，所述 基因编码构成内源寡糖基转移酶(OTase)复合物的蛋白。

在上述方法的其它方面，所述宿主细胞选自：巴氏毕赤酵母 (Pichia pastoris)、芬兰毕赤酵母(Pichia finlandica)、喜海藻糖 毕赤酵母(Pichia trehalophila)、Pichia koclamae、膜醭毕赤酵母 (Pichia membranaefaciens)、Pichia opuntiae、Pichia  thermotolerans、柳毕赤酵母(Pichia salictaria)、Pichia guercuum、 皮杰普氏毕赤酵母(Pichia pijperi)、具柄毕赤酵母(Pichia stiptis)、 甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、Pichia minuta(Ogataea minuta， Pichia lindneri)、毕赤酵母属的种(Pichia sp.)、酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)、酵母属的种(Saccharomyces sp.)、 多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、克鲁维酵母属的种 (Kluyveromyces sp.)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、 白色假丝酵母菌(Candida albicans)、构巢曲霉(Aspergillus  nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、 里氏木霉(Trichoderma reesei)、Chrysosporium lucknowense、镰 孢菌属的种(Fusarium sp.)、禾赤镰孢(Fusarium gramineum)、 镰孢霉(Fusarium venenatum)和粗糙链孢霉(Neurospora crassa)。 在其它方面，所述宿主细胞是昆虫、植物或哺乳动物宿主细胞。

在上述内容的另一个方面，提供了一种在低等真核生物宿主细 胞中生产异源糖蛋白的方法，所述方法包括：提供重组的低等真核 生物宿主细胞，所述宿主细胞包括编码异源单亚基寡糖基转移酶的 至少一种核酸分子和编码所述异源糖蛋白的核酸分子，且其中表达 内源性的宿主细胞基因，所述基因编码构成内源寡糖基转移酶 (OTase)复合物的蛋白；和在用于表达所述异源糖蛋白的条件下， 培养所述宿主细胞，以生产所述异源糖蛋白。

在上述方法的其它方面，所述低等真核生物宿主细胞选自：巴 氏毕赤酵母、芬兰毕赤酵母、喜海藻糖毕赤酵母、Pichia koclamae、 膜醭毕赤酵母、Pichia opuntiae、Pichia thermotolerans、柳毕赤酵 母、Pichia guercuum、皮杰普氏毕赤酵母、具柄毕赤酵母、甲醇毕 赤酵母、Pichia minuta(Ogataea minuta、Pichia lindneri)、毕赤酵 母属的种、酿酒酵母、酵母属的种、多形汉逊酵母、克鲁维酵母属 的种、乳酸克鲁维酵母、白色假丝酵母菌、构巢曲霉、黑曲霉、米 曲霉、里氏木霉、Chrysosporium lucknowense、镰孢菌属的种、禾 赤镰孢、镰孢霉和粗糙链孢霉。

在上述内容的另一个方面，提供了一种在重组酵母宿主细胞中 生产异源糖蛋白的方法，所述方法包括：提供重组酵母宿主细胞， 所述宿主细胞包括编码异源单亚基寡糖基转移酶的至少一种核酸 分子和编码所述异源糖蛋白的核酸分子，且其中表达内源性的宿主 细胞基因，所述基因编码构成内源寡糖基转移酶(OTase)复合物 的蛋白；和在用于表达所述异源糖蛋白的条件下，培养所述宿主细 胞，以生产所述异源糖蛋白。

在上述方法中，所述重组酵母宿主细胞生产具有酵母N-聚糖模 式的糖蛋白，或所述酵母已经被遗传地工程改造成生产具有酵母模 式、但是缺少高甘露糖基化的糖蛋白，但是其生产高甘露糖型N- 聚糖。例如，可以将所述酵母遗传地工程改造成缺少α1，6-甘露糖基 转移酶活性，例如，Och1p活性。在其它方面，将所述酵母遗传地 工程改造成生产具有哺乳动物或人样N-聚糖的糖蛋白。

在具体实施方案中，所述单亚基寡糖基转移酶是利什曼原虫属 的种的STT3A蛋白、STT3B蛋白、STT3C蛋白、STT3D蛋白或它 们的组合。在具体实施方案中，所述单亚基寡糖基转移酶是硕大利 什曼原虫STT3A蛋白、STT3B蛋白、STT3C蛋白、STT3D蛋白或 它们的组合。在其它实施方案中，所述单亚基寡糖基转移酶能够在 功能上抑制OTase复合物(例如，酵母OTase复合物)的至少一种 必需蛋白的致死突变表型。在其它方面，所述OTase复合物的必需 蛋白由酿酒酵母和/或巴氏毕赤酵母STT3基因座、WBP1基因座、 OST1基因座、SWP1基因座或OST2基因座或它们的同系物编码。 例如，在其它方面，单亚基寡糖基转移酶的实例是硕大利什曼原虫 STT3D蛋白，其能够在功能上抑制(或挽救或补偿)酿酒酵母OTase 复合物的至少一种必需蛋白的致死表型。

在上述方法的其它方面，所述酵母宿主细胞选自：巴氏毕赤酵 母、芬兰毕赤酵母、喜海藻糖毕赤酵母、Pichia koclamae、膜醭毕 赤酵母、Pichia opuntiae、Pichia thermotolerans、柳毕赤酵母、Pichia  guercuum、皮杰普氏毕赤酵母、具柄毕赤酵母、甲醇毕赤酵母、Pichia  minuta(Ogataea minuta、Pichia lindneri)、毕赤酵母属的种、酿 酒酵母、酵母属的种、多形汉逊酵母、克鲁维酵母属的种、乳酸克 鲁维酵母和白色假丝酵母菌。

在上述内容的另一个方面，提供了一种在重组酵母宿主细胞中 生产异源糖蛋白的方法，所述方法包括：提供重组酵母宿主细胞， 所述宿主细胞包括编码异源单亚基寡糖基转移酶的至少一种核酸 分子和编码所述异源糖蛋白的核酸分子，所述异源单亚基寡糖基转 移酶能够在功能上抑制酵母寡糖基转移酶(OTase)复合物的至少 一种必需蛋白的致死突变表型，且其中表达内源性的宿主细胞基 因，所述基因编码构成内源寡糖基转移酶(OTase)复合物的蛋白； 和在用于表达所述异源糖蛋白的条件下，培养所述宿主细胞，以生 产所述异源糖蛋白。

在上述方法中，所述重组酵母宿主细胞生产具有酵母N-聚糖模 式的糖蛋白，或所述酵母已经被遗传地工程改造成生产具有酵母模 式(其包括高甘露糖型N-聚糖)的糖蛋白，但是其缺少高甘露糖基 化。例如，可以将所述酵母遗传地工程改造成缺少α1，6-甘露糖基转 移酶活性，例如，Och1p活性。在其它方面，将所述酵母遗传地工 程改造成生产具有哺乳动物或人样N-聚糖的糖蛋白。

在具体实施方案中，所述宿主细胞另外包括，编码利什曼原虫 属的种的STT3A蛋白、STT3B蛋白、STT3C蛋白、STT3D蛋白或 它们的组合的一种或多种核酸分子。在具体实施方案中，所述宿主 细胞另外包括，编码硕大利什曼原虫STT3A蛋白、STT3B蛋白、 STT3C蛋白或它们的组合的一种或多种核酸。

在上述方法的其它方面，所述酵母宿主细胞选自：巴氏毕赤酵 母、芬兰毕赤酵母、喜海藻糖毕赤酵母、Pichia koclamae、膜醭毕 赤酵母、Pichia opuntiae、Pichia thermotolerans、柳毕赤酵母、Pichia  guercuum、皮杰普氏毕赤酵母、具柄毕赤酵母、甲醇毕赤酵母、Pichia  minuta(Ogataea minuta、Pichia lindneri)、毕赤酵母属的种、酿 酒酵母、酵母属的种、多形汉逊酵母、克鲁维酵母属的种、乳酸克 鲁维酵母和白色假丝酵母菌。

在上述内容的另一个方面，提供了一种在丝状真菌宿主细胞中 生产异源糖蛋白的方法，所述方法包括：提供丝状真菌宿主细胞， 所述宿主细胞包括编码单亚基异源寡糖基转移酶的至少一种核酸 分子和编码异源糖蛋白的核酸分子，且其中表达内源性的宿主细胞 基因，所述基因编码构成内源寡糖基转移酶(OTase)复合物的蛋 白；和在用于表达所述异源糖蛋白的条件下，培养所述宿主细胞， 以生产所述异源糖蛋白。所述丝状真菌宿主细胞生产糖蛋白，其中 所述N-聚糖具有丝状真菌模式，或它被遗传地工程改造成生产具有 哺乳动物或人样N-聚糖的糖蛋白。

在具体实施方案中，所述单亚基寡糖基转移酶是利什曼原虫属 的种的STT3A蛋白、STT3B蛋白、STT3C蛋白、STT3D蛋白或它 们的组合。在具体实施方案中，所述单亚基寡糖基转移酶是硕大利 什曼原虫STT3A蛋白、STT3B蛋白、STT3C蛋白、STT3D蛋白或 它们的组合。在其它实施方案中，所述单亚基寡糖基转移酶能够在 功能上抑制OTase复合物(例如，酵母OTase复合物)的至少一种 必需蛋白的致死突变表型。在其它方面，所述OTase复合物的必需 蛋白由酿酒酵母和/或巴氏毕赤酵母STT3基因座、WBP1基因座、 OST1基因座、SWP1基因座或OST2基因座或它们的同系物编码。 例如，在其它方面，所述单亚基寡糖基转移酶是硕大利什曼原虫 STT3D蛋白，其能够在功能上抑制(或挽救或补偿)酿酒酵母OTase 复合物的至少一种必需蛋白的致死表型。

在上述内容的其它方面，所述丝状真菌宿主细胞选自：构巢曲 霉、黑曲霉、米曲霉、里氏木霉、Chrysosporium lucknowense、镰 孢菌属的种、禾赤镰孢、镰孢霉和粗糙链孢霉。

在任一种上述方法的其它实施方案中，所述宿主细胞被遗传地 工程改造成生产糖蛋白，所述糖蛋白包含选自G0、G1、G2、A1 或A2的一种或多种哺乳动物或人样复合物N-聚糖。在其它实施方 案中，所述宿主细胞被遗传地工程改造成生产糖蛋白，所述糖蛋白 包含一种或多种哺乳动物或人样复杂型N-聚糖，所述N-聚糖具有 二天线的(bisected)N-聚糖或具有多天线的(multiantennary)N- 聚糖。在其它实施方案中，所述宿主细胞被遗传地工程改造成生产 糖蛋白，所述糖蛋白包含一种或多种选自下述的哺乳动物或人样杂 合型N-聚糖：GlcNAcMan₃GlcNAc₂、GalGlcNAcMan₃GlcNAc₂、 NANAGalGlcNAcMan₃GlcNAc₂、Man₅GlcNAc₂、 GlcNAcMan₅GlcNAc₂、GalGlcNAcMan₅GlcNAc₂和 NANAGalGlcNAcMan₅GlcNAc₂。在其它实施方案中，所述N-聚糖 结构由G-2结构Man₃GlcNAc₂组成。

在任一种上述方法的具体实施方案中，所述异源糖蛋白可以 是，例如，促红细胞生成素(EPO)；细胞因子诸如干扰素α、干 扰素β、干扰素γ和干扰素ω；和粒细胞-集落刺激因子(GCSF)； 粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)；凝血因子诸如因子 VIII、因子IX和人蛋白C；抗凝血酶III；凝血酶；可溶性的IgE 受体α-链；免疫球蛋白诸如IgG、IgG片段、IgG融合体和IgM； 免疫粘附素和其它Fc融合蛋白诸如可溶性的TNF受体-Fc融合蛋 白；RAGE-Fc融合蛋白；白介素；尿激酶；胰凝乳蛋白酶；尿素胰 蛋白酶抑制剂；IGF结合蛋白；表皮生长因子；生长激素释放因子； 膜联蛋白V融合蛋白；血管生成抑制因子；血管内皮生长因子-2； 骨髓前体抑制因子-1；骨保护素；α-1-抗胰蛋白酶；甲胎蛋白；DNA 酶II；纤溶酶原的环状结构区3；葡糖脑苷脂酶；TNF结合蛋白 1；滤泡刺激激素；细胞毒性的T淋巴细胞相关抗原4-Ig；跨膜活 化剂和钙调节剂和亲环蛋白配体；胰高血糖素样蛋白1；或IL-2受 体激动剂。

在任一种上述方法的其它实施方案中，所述异源蛋白是抗体， 其实例包括、但不限于：抗-Her2抗体、抗-RSV(呼吸道合胞病毒) 抗体、抗-TNFα抗体、抗-VEGF抗体、抗-CD3受体抗体、抗-CD41 7E3抗体、抗-CD25抗体、抗-CD52抗体、抗-CD33抗体、抗-IgE 抗体、抗-CD11a抗体、抗-EGF受体抗体或抗-CD20抗体。

在任一种上述方法的具体方面，所述宿主细胞包括：编码糖苷 酶、甘露糖苷酶的一个或多个催化结构域的一种或多种核酸分子， 或源自下述成员的糖基转移酶活性：UDP-GlcNAc转移酶(GnT)I、 GnT II、GnT III、GnT IV、GnT V、GnT VI、UDP-半乳糖基转移 酶(GalT)、岩藻糖基转移酶和唾液酸基转移酶。在具体实施方案 中，所述甘露糖苷酶选自：秀丽隐杆线虫(C.elegans)甘露糖苷酶 IA、秀丽隐杆线虫甘露糖苷酶IB、黑腹果蝇(D.melanogaster)甘 露糖苷酶IA、智人(H.sapiens)甘露糖苷酶IB、桔青霉(P.citrinum) 甘露糖苷酶I、小鼠甘露糖苷酶IA、小鼠甘露糖苷酶IB、构巢曲霉 (A.nidulans)甘露糖苷酶IA、构巢曲霉甘露糖苷酶IB、构巢曲霉 甘露糖苷酶IC、小鼠甘露糖苷酶II、秀丽隐杆线虫甘露糖苷酶II、 智人甘露糖苷酶II和甘露糖苷酶III。

在任一种上述方法的某些方面，通过形成包含催化结构域和细 胞靶向信号肽的融合蛋白，定位至少一个催化结构域。所述融合蛋 白可以由如下形成的至少一种遗传构建体编码：使编码细胞靶向信 号肽的DNA片段与编码具有酶活性的催化结构域的DNA片段进行 框架内连接。靶向信号肽的实例包括、但不限于：内质网或高尔基 体的膜结合蛋白、补救信号、II型膜蛋白、I型膜蛋白、跨膜的核 苷酸糖转运蛋白、甘露糖苷酶、唾液酸转移酶、葡萄糖苷酶、甘露 糖基转移酶和磷酸-甘露糖基转移酶。

在任一种上述方法的具体方面，所述宿主细胞另外包括，编码 一种或多种选自下述的酶的一种或多种核酸分子：UDP-GlcNAc转 运蛋白、UDP-半乳糖转运蛋白、GDP-岩藻糖转运蛋白、CMP-唾液 酸转运蛋白和核苷酸二磷酸酶。

在任一种上述方法的其它方面，所述宿主细胞包括一种或多种 编码下述酶活性的核酸分子：α1，2-甘露糖苷酶活性、UDP-GlcNAc 转移酶(GnT)I活性、甘露糖苷酶II活性和GnT II活性。

在任一种上述方法的其它方面，所述宿主细胞包括一种或多种 编码下述酶活性的核酸分子：α1，2-甘露糖苷酶活性、UDP-GlcNAc 转移酶(GnT)I活性、甘露糖苷酶II活性、GnT II活性和UDP- 半乳糖基转移酶(GalT)活性。

在任一种上述方法的其它方面，所述宿主细胞在一种或多种选 自下述的酶的活性方面具有缺陷：甘露糖基转移酶和磷酸甘露糖基 转移酶。在其它方面，所述宿主细胞不表达选自下述的酶：1，6甘 露糖基转移酶、1，3甘露糖基转移酶和1，2甘露糖基转移酶。

在任一种上述方法的一个具体方面，所述宿主细胞是巴氏毕赤 酵母的och1突变体och1突变体。

另外提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含：(a)编码异 源单亚基寡糖基转移酶的第一种核酸分子；和(b)编码异源糖蛋 白的第二种核酸分子；和表达内源性的宿主细胞基因(包括表达内 源性的宿主细胞STT3基因)，所述基因编码构成内源寡糖基转移 酶(OTase)复合物的蛋白。

另外提供了一种低等真核宿主细胞，所述宿主细胞包含：(a) 编码异源单亚基寡糖基转移酶的第一种核酸分子；和(b)编码异 源糖蛋白的第二种核酸分子；和表达内源性的宿主细胞基因，所述 基因编码构成内源寡糖基转移酶(OTase)复合物的蛋白。

另外提供了一种酵母宿主细胞，所述宿主细胞包含：(a)编 码异源单亚基寡糖基转移酶的第一种核酸分子；和(b)编码异源 糖蛋白的第二种核酸分子；和表达内源性的宿主细胞基因，所述基 因编码构成内源寡糖基转移酶(OTase)复合物的蛋白。

另外提供了一种酵母宿主细胞，所述宿主细胞包含：(a)编 码异源单亚基寡糖基转移酶的第一种核酸分子，所述异源单亚基寡 糖基转移酶能够在功能上抑制酵母寡糖基转移酶(OTase)复合物 的至少一种必需蛋白的致死突变表型；和(b)编码异源糖蛋白的 第二种核酸分子；和表达内源性的宿主细胞基因，所述基因编码构 成内源寡糖基转移酶(OTase)复合物的蛋白。

另外提供了一种丝状真菌宿主细胞，所述宿主细胞包含：(a) 编码异源单亚基寡糖基转移酶的第一种核酸分子；和(b)编码异 源糖蛋白的第二种核酸分子；和表达内源性的宿主细胞基因，所述 基因编码构成内源寡糖基转移酶(OTase)复合物的蛋白。

另外提供了一种丝状真菌宿主细胞，所述宿主细胞包含：(a) 编码异源单亚基寡糖基转移酶的第一种核酸分子，所述异源单亚基 寡糖基转移酶能够在功能上抑制酵母或丝状真菌寡糖基转移酶 (OTase)复合物的至少一种必需蛋白的致死突变表型；和(b)编 码异源糖蛋白的第二种核酸分子；和表达内源性的宿主细胞基因， 所述基因编码构成内源寡糖基转移酶(OTase)复合物的蛋白

在具体实施方案中，所述单亚基寡糖基转移酶是利什曼原虫属 的种的STT3A蛋白、STT3B蛋白、STT3C蛋白、STT3D蛋白或它 们的组合。在具体实施方案中，所述单亚基寡糖基转移酶是硕大利 什曼原虫STT3A蛋白、STT3B蛋白、STT3C蛋白、STT3D蛋白或 它们的组合。在其它实施方案中，所述单亚基寡糖基转移酶能够在 功能上抑制OTase复合物(例如，酵母OTase复合物)的至少一种 必需蛋白的致死突变表型。在其它方面，所述OTase复合物的必需 蛋白由酿酒酵母和/或巴氏毕赤酵母STT3基因座、WBP1基因座、 OST1基因座、SWP1基因座或OST2基因座或它们的同系物编码。 例如，在其它方面，单亚基寡糖基转移酶的实例是硕大利什曼原虫 STT3D蛋白，其能够在功能上抑制(或挽救或补偿)酿酒酵母OTase 复合物的至少一种必需蛋白的致死表型。

在其它方面，上述宿主细胞另外包括一种或多种编码利什曼原 虫属的种的STT3A蛋白、STT3B蛋白、STT3C蛋白或它们的组合 的核酸分子。

在任一种上述宿主细胞的其它实施方案中，所述宿主细胞被遗 传地工程改造成生产糖蛋白，所述糖蛋白包含选自G0、G1、G2、 A1或A2的一种或多种哺乳动物或人样复杂型N-聚糖。在其它实施 方案中，所述宿主细胞被遗传地工程改造成生产糖蛋白，所述糖蛋 白包含一种或多种人样复杂型N-聚糖，所述N-聚糖具有二天线的 N-聚糖或具有多天线的N-聚糖。在其它实施方案中，所述宿主细胞 被遗传地工程改造成生产糖蛋白，所述糖蛋白包含选自下述的一种 或多种哺乳动物或人样杂合型N-聚糖：GlcNAcMan₃GlcNAc₂、 GalGlcNAcMan₃GlcNAc₂、NANAGalGlcNAcMan₃GlcNAc₂、 Man₅GlcNAc₂、GlcNAcMan₅GlcNAc₂、GalGlcNAcMan₅GlcNAc₂和 NANAGalGlcNAcMan₅GlcNAc₂。在其它实施方案中，所述N-聚糖 结构由G-2结构Man₃GlcNAc₂组成。

在任一种上述宿主细胞的具体实施方案中，所述异源糖蛋白可 以例如选自：促红细胞生成素(EPO)；细胞因子诸如干扰素α、 干扰素β、干扰素γ和干扰素ω；和粒细胞-集落刺激因子(GCSF)； 粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)；凝血因子诸如因子 VIII、因子IX和人蛋白C；抗凝血酶III；凝血酶；可溶性的IgE 受体α-链；免疫球蛋白诸如IgG、IgG片段、IgG融合体和IgM； 免疫粘附素和其它Fc融合蛋白诸如可溶性的TNF受体-Fc融合蛋 白；RAGE-Fc融合蛋白；白介素；尿激酶；胰凝乳蛋白酶；尿素胰 蛋白酶抑制剂；IGF结合蛋白；表皮生长因子；生长激素释放因子； 膜联蛋白V融合蛋白；血管生成抑制因子；血管内皮生长因子-2； 骨髓前体抑制因子-1；骨保护素；α-1-抗胰蛋白酶；甲胎蛋白；DNA 酶II；纤溶酶原的环状结构区3；葡糖脑苷脂酶；TNF结合蛋白 1；滤泡刺激激素；细胞毒性的T淋巴细胞相关抗原4-Ig；跨膜活 化剂和钙调节剂和亲环蛋白配体；胰高血糖素样蛋白1；和IL-2受 体激动剂。

在任一种上述宿主细胞的其它实施方案中，所述异源蛋白是抗 体，其实例包括、但不限于：抗-Her2抗体、抗-RSV(呼吸道合胞 病毒)抗体、抗-TNFα抗体、抗-VEGF抗体、抗-CD3受体抗体、 抗-CD417E3抗体、抗-CD25抗体、抗-CD52抗体、抗-CD33抗体、 抗-IgE抗体、抗-CD11a抗体、抗-EGF受体抗体或抗-CD20抗体。

在上述宿主细胞的具体方面，所述宿主细胞包括：编码糖苷酶、 甘露糖苷酶的一个或多个催化结构域的一种或多种核酸分子，或源 自下述成员的糖基转移酶活性：UDP-GlcNAc转移酶(GnT)I、GnT II、GnT III、GnT IV、GnT V、GnT VI、UDP-半乳糖基转移酶(GalT)、 岩藻糖基转移酶和唾液酸基转移酶。在具体实施方案中，所述甘露 糖苷酶选自：秀丽隐杆线虫甘露糖苷酶IA、秀丽隐杆线虫甘露糖苷 酶IB、黑腹果蝇甘露糖苷酶IA、智人甘露糖苷酶IB、桔青霉甘露 糖苷酶I、小鼠甘露糖苷酶IA、小鼠甘露糖苷酶IB、构巢曲霉甘露 糖苷酶IA、构巢曲霉甘露糖苷酶IB、构巢曲霉甘露糖苷酶IC、小 鼠甘露糖苷酶II、秀丽隐杆线虫甘露糖苷酶II、智人甘露糖苷酶II 和甘露糖苷酶III。

在任一种上述宿主细胞的某些方面，通过形成包含催化结构域 和细胞靶向信号肽的融合蛋白，定位至少一个催化结构域。所述融 合蛋白可以由如下形成的至少一种遗传构建体编码：使编码细胞靶 向信号肽的DNA片段与编码具有酶活性的催化结构域的DNA片段 进行框架内连接。靶向信号肽的实例包括、但不限于：内质网或高 尔基体的膜结合蛋白、补救信号诸如HDEL或KDEL、II型膜蛋白、 I型膜蛋白、跨膜的核苷酸糖转运蛋白、甘露糖苷酶、唾液酸转移 酶、葡萄糖苷酶、甘露糖基转移酶和磷酸-甘露糖基转移酶。

在任一种上述宿主细胞的具体方面，所述宿主细胞另外包括， 编码选自下述的一种或多种酶的一种或多种核酸分子： UDP-GlcNAc转运蛋白、UDP-半乳糖转运蛋白、GDP-岩藻糖转运 蛋白、CMP-唾液酸转运蛋白和核苷酸二磷酸酶。

在任一种上述宿主细胞的其它方面，所述宿主细胞包括编码下 述酶活性的一种或多种核酸分子：α1，2-甘露糖苷酶活性、 UDP-GlcNAc转移酶(GnT)I活性、甘露糖苷酶II活性和GnT II 活性。

在任一种上述宿主细胞的其它方面，所述宿主细胞包括编码下 述酶活性的一种或多种核酸分子：α1，2-甘露糖苷酶活性、 UDP-GlcNAc转移酶(GnT)I活性、甘露糖苷酶II活性、GnT II 活性和UDP-半乳糖基转移酶(GalT)活性。

在任一种上述宿主细胞的其它方面，所述宿主细胞选自：巴氏 毕赤酵母、芬兰毕赤酵母、喜海藻糖毕赤酵母、Pichia koclamae、 膜醭毕赤酵母、Pichia opuntiae、Pichia thermotolerans、柳毕赤酵 母、Pichia guercuum、皮杰普氏毕赤酵母、具柄毕赤酵母、甲醇毕 赤酵母、毕赤酵母属的种、酿酒酵母、酵母属的种、多形汉逊酵母、 克鲁维酵母属的种、乳酸克鲁维酵母、白色假丝酵母菌、构巢曲霉、 黑曲霉、米曲霉、里氏木霉、Chrysosporium lucknowense、镰孢菌 属的种、禾赤镰孢、镰孢霉、粗糙链孢霉、植物细胞、昆虫细胞和 哺乳动物细胞。

在任一种上述宿主细胞的其它方面，所述宿主细胞在一种或多 种选自下述的酶的活性方面具有缺陷：甘露糖基转移酶和磷酸甘露 糖基转移酶。在其它方面，所述宿主细胞不表达选自下述的酶：1，6 甘露糖基转移酶、1，3甘露糖基转移酶和1，2甘露糖基转移酶。

在任一种上述宿主细胞的一个具体方面，所述宿主细胞是巴氏 毕赤酵母。在另一个方面，所述宿主细胞是巴氏毕赤酵母的och1 突变体。

本文的方法和宿主细胞可以用于生产这样的糖蛋白组合物：其 中在所述组合物中的糖蛋白的至少70％、75％、80％、85％、90％、 95％、98％或99％的N-糖基化位点被占据。

另外，本文的方法和宿主细胞可以用于生产这样的糖蛋白组合 物：其中在所述组合物中的糖蛋白的至少70％、75％、80％、85％、 90％、95％、98％或99％的N-糖基化位点被占据，且其在其它方面 具有缺少岩藻糖的哺乳动物或人样N-聚糖。

另外，所述方法和被遗传地工程改造成生产哺乳动物样或人样 N-聚糖的酵母或丝状真菌宿主细胞，可以用于生产这样的糖蛋白组 合物：其中在所述组合物中的糖蛋白的至少70％、75％、80％、85％、 90％、95％、98％或99％的N-糖基化位点被占据，且其在其它方面 具有缺少岩藻糖的哺乳动物或人样N-聚糖。

在有些方面，遗传地工程改造成生产岩藻糖基化的哺乳动物或 人样N-聚糖的酵母或丝状宿主细胞，可以用于生产这样的糖蛋白组 合物：其中在所述组合物中的糖蛋白的至少70％、75％、80％、85％、 90％、95％、98％或99％的N-糖基化位点被占据，且其在其它方面 具有含有岩藻糖的哺乳动物或人样N-聚糖。

本文的方法和宿主细胞可以用于生产这样的抗体组合物：其中 在所述组合物中的至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％ 或99％的抗体分子具有被占据的2个N-糖基化位点。

另外，本文的方法和宿主细胞可以用于生产这样的抗体组合 物：其中在所述组合物中的至少70％、75％、80％、85％、90％、 95％、98％或99％的抗体分子具有被占据的2个N-糖基化位点，且 所述N-聚糖缺少岩藻糖。

另外，本文的方法和酵母或丝状真菌宿主细胞可以用于生产这 样的抗体组合物：其中在所述组合物中的至少70％、75％、80％、 85％、90％、95％、98％或99％的抗体分子具有被占据的2个N- 糖基化位点，且所述N-聚糖缺少岩藻糖。

另外，所述方法和被遗传地工程改造成生产哺乳动物样或人样 N-聚糖的酵母或丝状真菌宿主细胞可以用于生产这样的抗体组合 物：其中在所述组合物中的至少70％、75％、80％、85％、90％、 95％、98％或99％的抗体分子具有被占据的2个N-糖基化位点，且 所述抗体具有缺少岩藻糖的哺乳动物或人样N-聚糖。在有些方面， 被遗传地工程改造成生产岩藻糖基化的哺乳动物或人样N-聚糖的 酵母或丝状宿主细胞可以用于生产这样的抗体组合物：其中在所述 组合物中的至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％ 的抗体分子具有被占据的2个N-糖基化位点，且所述抗体具有含有 岩藻糖的哺乳动物或人样N-聚糖。

另外提供了一种包含多种抗体和药学上可接受的载体的糖蛋 白组合物，其中在所述组合物中的约70％至约99％的完整抗体分子 具有被占据的2个N-糖基化位点，且约50-70摩尔％的N-聚糖具有 G0结构，15-25摩尔％的N-聚糖具有G1结构，4-12摩尔％的N- 聚糖具有G2结构，5-17摩尔％的N-聚糖具有Man₅结构，且3-15 摩尔％的N-聚糖具有杂合型结构。

另外提供了一种包含多种抗体和药学上可接受的载体的糖蛋 白组合物，其中在所述组合物中的约70％至99％的完整抗体分子具 有被占据的2个N-糖基化位点，且约53-58摩尔％的N-聚糖具有 G0结构，20-22摩尔％的N-聚糖具有G1结构，且约16-18摩尔％ 的N-聚糖包含Man₅GlcNAc₂核心结构。

在具体实施方案中，所述抗体包括选自下述的抗体：抗-Her2 抗体、抗-RSV(呼吸道合胞病毒)抗体、抗-TNFα抗体、抗-VEGF 抗体、抗-CD3受体抗体、抗-CD417E3抗体、抗-CD25抗体、抗-CD52 抗体、抗-CD33抗体、抗-IgE抗体、抗-CD11a抗体、抗-EGF受体 抗体和抗-CD20抗体。

另外提供了组合物，所述组合物包含由本文所述的宿主细胞和 方法生产的一种或多种糖蛋白。

在具体实施方案中，本文提供的糖蛋白组合物包含这样的糖蛋 白：所述糖蛋白具有岩藻糖基化的和未岩藻糖基化的杂合型和复杂 型N-聚糖，包括二天线的(bisected)和多天线的(multiantennary) 物质，包括、但不限于N-聚糖诸如GlcNAc_(1-4)Man₃GlcNAc₂、 Gal_(1-4)GlcNAc_(1-4)Man₃GlcNAc₂、 NANA_(1-4)Gal_(1-4)GlcNAc_(1-4)Man₃GlcNAc₂。

在具体实施方案中，本文提供的糖蛋白组合物包含这样的糖蛋 白，所述糖蛋白具有至少一种选自下述的杂合型N-聚糖： GlcNAcMan₃GlcNAc₂、GalGlcNAcMan₃GlcNAc₂、 NANAGalGlcNAcMan₃GlcNAc₂、GlcNAcMan₅GlcNAc₂、 GalGlcNAcMan₅GlcNAc₂和NANAGalGlcNAcMan₅GlcNAc₂。在具 体方面，所述杂合型N-聚糖是所述组合物中的优势N-聚糖物质。 在其它方面，所述杂合型N-聚糖是特定的N-聚糖物质，其占所述 组合物中的杂合型N-聚糖的约30％、40％、50％、60％、70％、80％、 90％、95％、97％、98％、99％或100％。

在具体实施方案中，本文提供的糖蛋白组合物包含这样的糖蛋 白，所述糖蛋白具有至少一种选自下述的复杂型N-聚糖： GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂、GalGlcNAc₂Man₃GlcNAc₂、 Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂、NANAGal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂和 NANA₂Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂。在具体方面，所述复杂型N-聚 糖是所述组合物中的优势N-聚糖物质。在其它方面，所述复杂型 N-聚糖是特定的N-聚糖物质，其占所述组合物中的复杂型N-聚糖 的约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、 98％、99％或100％。

在具体实施方案中，所述N-聚糖被岩藻糖基化。一般而言，所 述岩藻糖与在所述N-聚糖的还原端处的GlcNAc发生α1，3-连接，与 在所述N-聚糖的还原端处的GlcNAc发生α1，6-连接，与在所述N- 聚糖的非还原端处的Gal发生α1，2-连接，与在所述N-聚糖的非还 原端处的GlcNac发生α1，3-连接，或与在所述N-聚糖的非还原端处 的GlcNAc发生α1，4-连接。

因此，在上述糖蛋白组合物的具体方面，所述糖型是：处于α1，3- 连接或α1，6-连接岩藻糖以生成选自GlcNAcMan₅GlcNAc₂(Fuc)、 GlcNAcMan₃GlcNAc₂(Fuc)、GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂(Fuc)、 GalGlcNAc₂Man₃GlcNAc₂(Fuc)、Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂(Fuc)、 NANAGal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂(Fuc)和 NANA₂Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂(Fuc)的糖型；处于α1，3-连接或 α1，4-连接岩藻糖以生成选自GlcNAc(Fuc)Man₅GlcNAc₂、GlcNAc (Fuc)Man₃GlcNAc₂、GlcNAc₂(Fuc_1-2)Man₃GlcNAc₂、GalGlcNAc₂(Fuc_1-2)Man₃GlcNAc₂、Gal₂GlcNAc₂(Fuc1-2)Man₃GlcNAc₂、 NANAGal₂GlcNAc₂(Fuc_1-2)Man₃GlcNAc₂和NANA₂Gal₂GlcNAc₂(Fuc_1-2)Man₃GlcNAc₂的糖型；或处于α1，2-连接岩藻糖以生成选 自Gal(Fuc)GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂、Gal₂(Fuc_1-2) GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂、NANAGal₂(Fuc_1-2)GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂和NANA₂Gal₂(Fuc_1-2)GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂的糖型。

在上述内容的其它方面，所述复杂型N-聚糖另外包括岩藻糖基 化的和未岩藻糖基化的二天线的和多天线的物质。

在其它方面，所述糖蛋白包括高甘露糖型N-聚糖(包括、但不 限于，Man₅GlcNAc₂)或由Man₃GlcNAc₂N-聚糖结构组成的N-聚 糖。

定义

本文使用的术语“N-聚糖”和“糖型”可互换地使用，是指N-连接的 寡糖，例如，通过天冬酰胺-N-乙酰基葡糖胺连接与多肽的天冬酰胺 残基相连的寡糖。N-连接的糖蛋白含有与蛋白中的天冬酰胺残基的酰 胺氮相连的N-乙酰基葡糖胺残基。在糖蛋白上发现的优势糖是葡萄 糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)、N- 乙酰基葡糖胺(GlcNAc)和唾液酸(例如，N-乙酰基-神经氨酸 (NANA))。糖基的加工在内质网的内腔中共翻译地进行，并且就 N-连接的糖蛋白而言，在翻译后继续在高尔基体中进行。

N-聚糖具有共同的戊糖核心Man₃GlcNAc₂(“Man”是指甘露糖； “Glc”是指葡萄糖；“NAc”是指N-乙酰基；GlcNAc是指N-乙酰基葡糖 胺)。通常，将非还原端放在左边，将还原端放在右边，呈现N-聚糖 结构。N-聚糖的还原端是与构成蛋白上的糖基化位点的Asn残基相连 的末端。N-聚糖在构成周围糖(例如，GlcNAc、半乳糖、岩藻糖和唾 液酸)的支链(天线)的数目方面存在差异，所述支链添加在 Man₃GlcNAc₂(“Man₃”)核心结构上，所述核心结构也称作“三甘露 糖核心”、“戊糖核心”或“少甘露糖核心”。根据它们的支链组成对N- 聚糖进行分类(例如，高甘露糖型、复杂型或杂合型)。“高甘露糖” 型N-聚糖具有5个或更多个甘露糖残基。“复杂”型N-聚糖通常具有 至少一个与1，3甘露糖臂相连的GlcNAc和至少一个与“三甘露糖”核 心的1，6甘露糖臂相连的GlcNAc。复杂型N-聚糖还可能具有半乳糖 (“Gal”)或N-乙酰基半乳糖胺(“GalNAc”)残基，所述残基任选地 被唾液酸或衍生物(例如，“NANA”或“NeuAc”，其中“Neu”是指神经 氨酸，且“Ac”是指乙酰基)修饰。复杂型N-聚糖还可能具有构成“二 天线的”GlcNAc和核心岩藻糖(“Fuc”)的链内取代。复杂型N-聚糖 还可能具有在“三甘露糖核心”上的多个天线，经常称作“多天线的聚 糖”。“杂合型”N-聚糖具有至少一个在三甘露糖核心的1，3甘露糖臂的 末端上的GlcNAc和零个或更多个在三甘露糖核心的1，6甘露糖臂上 的甘露糖。不同的N-聚糖也称作“糖型”。

关于复杂型N-聚糖，术语“G-2”、“G-1”、“G0”、“G1”、“G2”、 “A1”和“A2”具有下述含义。“G-2”是指可以表征为Man₃GlcNAc₂的 N-聚糖结构；术语“G-1”是指可以表征为GlcNAcMan₃GlcNAc₂的N- 聚糖结构；术语“G0”是指可以表征为GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂的N-聚 糖结构；术语“G1”是指可以表征为GalGlcNAc₂Man₃GlcNAc₂的N-聚 糖结构；术语“G2”是指可以表征为Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂的N- 聚糖结构；术语“A1”是指可以表征为 NANAGal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂的N-聚糖结构；且，术语“A2”是指 可以表征为NANA₂Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂的N-聚糖结构。除非另 有说明，术语G-2”、“G-1”、“G0”、“G1”、“G2”、“A1”和“A2”是指 这样的N-聚糖物质：其缺少与在所述N-聚糖的还原端处的GlcNAc 残基相连的岩藻糖。当术语包括“F”时，“F”指示，所述N-聚糖物质 含有与在所述N-聚糖的还原端处的GlcNAc残基相连的岩藻糖残基。 例如，G0F、G1F、G2F、A1F和A2F都指示，所述N-聚糖另外包括 与在所述N-聚糖的还原端处的GlcNAc残基相连的岩藻糖残基。低等 真核生物诸如酵母和丝状真菌通常不生产含有岩藻糖的N-聚糖。

关于多天线的N-聚糖，术语“多天线的N-聚糖”是指这样的N-聚 糖：其另外包含在甘露糖残基上的GlcNAc残基，所述甘露糖残基构 成所述N-聚糖的1，6臂或1，3臂的非还原端，或者其另外包含在每个 甘露糖残基上的GlcNAc残基，所述甘露糖残基构成所述N-聚糖的1，6 臂和1，3臂的非还原端。因而，多天线的N-聚糖可以用式 GlcNAc_(2-4)Man₃GlcNAc₂、Gal_(1-4)GlcNAc_(2-4)Man₃GlcNAc₂或 NANA_(1-4)Gal_(1-4)GlcNAc_(2-4)Man₃GlcNAc₂来表征。术语“-4”是指1、2、 3或4个残基。

关于二天线的N-聚糖，术语“二天线的N-聚糖”是指这样的N-聚 糖：其中GlcNAc残基与在所述N-聚糖的还原端处的甘露糖残基相连。 二天线的N-聚糖可以用式GlcNAc₃Man₃GlcNAc₂来表征，其中每个甘 露糖残基在它的非还原端处与GlcNAc残基相连。相比而言，当多天 线的N-聚糖被表征为GlcNAc₃Man₃GlcNAc₂时，该式指示，2个 GlcNAc残基与在所述N-聚糖的2个臂之一的非还原端处的甘露糖残 基相连，且1个GlcNAc残基与在所述N-聚糖的另一个臂的非还原端 处的甘露糖残基相连。

本文所用的缩写具有本领域的常见用法，参见，例如，上面的糖 类的缩写。其它常见的缩写包括“PNGase”或“聚糖酶”或“葡萄糖苷 酶”，它们都是指肽N-糖苷酶F(EC 3.2.2.18)。

本文使用的术语“糖蛋白”是指，具有与其相连的一种或多种N- 聚糖的任意蛋白。因而，该术语即指本领域通常视作糖蛋白的蛋白， 也指已经被遗传地工程改造成含有一个或多个N-连接的糖基化位 点的蛋白。

本文使用的“人源化的糖蛋白”或“人样糖蛋白”表示这样的蛋白： 其具有与其相连的N-聚糖，所述N-聚糖具有少于4个甘露糖残基， 或者表示具有至少5个甘露糖残基的合成的糖蛋白中间体(它们也是 有用的，且可以进一步在体外或在体内操作)。优选地，根据本发明 生产的糖蛋白至少短暂地含有至少30摩尔％、优选至少40摩尔％、 更优选50、60、70、80、90或甚至100摩尔％的Man₅GlcNAc₂中间 体。这可以如下实现，例如，通过将本发明的宿主细胞工程改造成表 达“更好的”(即，更有效的)糖基化酶。例如，选择甘露糖苷酶，使 得它在宿主细胞中蛋白被糖基化的位点处所存在的条件下具有最佳 活性，并将其导入宿主细胞中，优选地通过使所述酶靶向需要活性的 宿主细胞细胞器。

本文使用的术语“重组宿主细胞”(“表达宿主细胞”、“表达宿主 系统”、“表达系统”或简称“宿主细胞”)意图表示，其中已经导入重 组载体的细胞。应当理解，这样的术语意图不仅表示特定受试细胞， 而且表示这样的细胞的后代。因为突变或环境影响可能造成在后代中 发生某些修饰，这样的后代实际上可能不同于母代细胞，但仍然被包 括在本文使用的术语“宿主细胞”的范围内。重组宿主细胞可以是分 离的细胞或培养生长的细胞系，或可以是存在于活组织或生物体中的 细胞。优选的宿主细胞是酵母和真菌。

当提及在糖蛋白制品中存在的聚糖的“摩尔％”时，该术语是指， 当用PNGase处理蛋白制品、然后通过不受糖型组成影响的方法进行 定量时(例如，用荧光标签诸如2-氨基苯甲酰胺标记PNGase释放出 的聚糖集合，然后通过高效液相色谱法或毛细管电泳法进行分离，再 通过荧光强度来定量聚糖)，在释放出的N-连接的寡糖集合中存在的 特定聚糖的摩尔％。例如，50摩尔％GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂Gal₂NANA₂是指，50％的释放的聚糖是GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂Gal₂NANA₂，剩余 的50％由其它N-连接的寡糖组成。在实施方案中，在糖蛋白制品中 的特定聚糖的摩尔％是20％至100％，优选高于25％、30％、35％、 40％或45％，更优选高于50％、55％、60％、65％或70％，最优选 高于75％、80％85％、90％或95％。

术语“可操作地连接的”表达控制序列是指这样的连接：其中表 达控制序列与目标基因相邻近以控制目标基因，以及以反式或在一定 距离内起作用而控制目标基因的表达控制序列。

术语“表达控制序列”或“调节序列”可互换地使用，在本文中用于 表示这样的多核苷酸序列：所述多核苷酸序列是影响它们可操作地连 接的编码序列的表达所必需的。表达控制序列是控制核酸序列的转 录、转录后事件以及翻译的序列。表达控制序列包括：合适的转录起 始、终止、启动子和增强子序列；有效的RNA加工信号诸如剪接和 聚腺苷酸化信号；稳定胞质mRNA的序列；增强翻译效率的序列(例 如，核糖体结合位点)；增强蛋白质稳定性的序列；以及当需要时， 增强蛋白质分泌的序列。这样的控制序列的性质随宿主生物体而不 同；在原核生物中，这样的控制序列通常包括启动子、核糖体结合位 点和转录终止序列。术语“控制序列”意图至少包括其存在对于表达 而言是必需的所有组分，并且还可以包括其存在是有利的额外组分， 例如前导序列和融合配偶体序列。

术语“转染”等是指，将异源核酸导入真核生物细胞(高等和低 等真核生物细胞)中。在历史上，术语“转化”已经用于描述核酸向酵 母或真菌细胞中的导入；但是，在本文中，术语“转染”用于表示核酸 向任意真核生物细胞(包括酵母和真菌细胞)中的导入。

术语“真核”是指有核的细胞或生物体，包括昆虫细胞、植物细胞、 哺乳动物细胞、动物细胞和低等真核细胞。

术语“低等真核细胞”包括酵母和丝状真菌。酵母和丝状真菌包 括，但不限于：巴氏毕赤酵母、芬兰毕赤酵母、喜海藻糖毕赤酵母、 Pichia koclamae、膜醭毕赤酵母、Pichia minuta(Ogataea minuta、 Pichia lindneri)、Pichia opuntiae、Pichia thermotolerans、柳毕赤酵 母、Pichia guercuum、皮杰普氏毕赤酵母、具柄毕赤酵母、甲醇毕赤 酵母、毕赤酵母属的种、酿酒酵母、酵母属的种、多形汉逊酵母、 克鲁维酵母属的种、乳酸克鲁维酵母、白色假丝酵母菌、构巢曲霉、 黑曲霉、米曲霉、里氏木霉、Chrysosporium lucknowense、镰孢菌 属的种、禾赤镰孢、镰孢霉、小立碗藓(Physcomitrella patens)和 粗糙链孢霉、毕赤酵母属的种、任意酵母属的种、多形汉逊酵母、任 意克鲁维酵母属的种、白色假丝酵母菌、任意曲霉菌属的种、里氏木 霉、Chrysosporium lucknowense、任意镰孢菌属的种和粗糙链孢霉。

本文使用的术语“抗体”、“免疫球蛋白”和“免疫球蛋白分子”可互 换地使用。每种免疫球蛋白分子具有独特的结构，所述结构容许它结 合它的特异性抗原，但是所有免疫球蛋白具有本文描述的相同的整体 结构。已知基础的免疫球蛋白结构单位包含亚基的四聚体。每个四聚 体由两个相同的多肽链配对组成，每个配对具有一个“轻”链(约25 kDa)和一个“重”链(约50-70kDa)。每条链的氨基端部分包括主要 负责抗原识别的约100-110个或更多个氨基酸的可变区。每条链的羧 基端部分限定主要负责效应子功能的恒定区。轻链被分类为κ或λ。 重链被分类为γ、μ、α、δ或ε，并将抗体的同种型分别定义为IgG、 IgM、IgA、IgD和IgE。

轻链和重链再分为可变区和恒定区(一般参见，Fundamental  Immunology(Paul，W.，编，第2版，Raven Press，N.Y.，1989)，第7 章。每个轻链/重链对的可变区形成抗体结合位点。因而，完整的抗体 具有两个结合位点。除了在双功能或双特异性的抗体中以外，两个结 合位点是相同的。链都展现出由三个高变区(也称为互补决定区或 CDR)连接的相对保守的框架区(FR)的相同一般结构。每个配对 的两条链的CDR通过框架区对准，允许与特定的表位结合。该术语 包括天然发生的形式，以及片段和衍生物。在该术语的范围内包括， 免疫球蛋白(Ig)种类，即，IgG、IgA、IgE、IgM和IgD。在该术 语的范围内还包括，IgG亚型，即，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。该 术语按照最广义使用，包括单一单克隆抗体(包括激动剂和拮抗剂抗 体)，以及将结合多个表位或抗原的抗体组合物。该术语特别地涵盖 单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例 如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们至少含有或被修饰成至少 含有免疫球蛋白重链恒定区的CH2结构域的一部分，所述部分包含 CH2结构域的N-连接的糖基化位点或其变体。在该术语内包括，仅 包含Fc区的分子，例如免疫粘附素(美国公开的专利申请号 2004/0136986，它的公开内容通过引用并入本文)、Fc融合体和抗体 -样分子。

术语“Fc片段”是指，含有CH2和CH3结构域的抗体的“片段结 晶的”C-端区域。术语“Fab片段”是指，含有VH、CH1、VL和CL 结构域的抗体的“片段抗原结合”区域。

本文使用的术语“单克隆抗体”(mAb)是指，从基本上同质的抗 体群体中获得的抗体，即，除了可能以少量存在的可能自然发生的突 变之外，组成所述群体的各个抗体是同一的。单克隆抗体是高度特异 性的，针对单个的抗原性位点。此外，与常规的(多克隆的)抗体制 品(其通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体)相比，每个 mAb针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性之外，单克隆抗体 的益处是，它们可以通过例如杂交瘤培养来生产，不会被其它免疫球 蛋白污染。术语“单克隆的”指示，抗体是从基本上同质的抗体群体获 得的特性，不能被解释为需要通过任何特别的方法来生产抗体。例如， 要根据本发明使用的单克隆抗体可以通过由Kohler等(1975)，Nature， 256：495首先描述的杂交瘤方法制备，或可以通过重组DNA方法制 备(参见，例如，美国专利号4,816,567；它的公开内容通过引用并入 本文)。

在术语“抗体”或“免疫球蛋白”的范围内，术语“片段”包括通过用 各种蛋白酶消化产生的那些，通过化学裂解和/或化学解离产生的那 些，以及重组地产生的那些，只要该片段仍然能够特异性地结合靶分 子。这样的片段包括Fc、Fab、Fab’、Fv、F(ab’)₂和单链Fv(scFv) 片段。在下文，术语“免疫球蛋白”还包括术语“片段”。

免疫球蛋白进一步包括，其序列被修饰但仍然能够特异性地结合 靶分子的免疫球蛋白或片段，包括：种间嵌合的和人源化的抗体；抗 体融合体；异聚抗体复合物和抗体融合体，例如双体(diabody)(双 特异性抗体)、单链双体和内抗体(intrabody)(参见，例如， Intracellular Antibodies：Research and Disease Applications，(Marasco， 编，Springer-Verlag New York，Inc.，1998)。

术语“催化抗体”是指，能够催化生化反应的免疫球蛋白分子。催 化抗体是本领域众所周知的，且已经描述在：Schochetman等人的美 国专利申请号7,205,136、4,888,281、5,037,750，Barbas，III等人的美 国专利申请号5,733,757、5,985,626和6,368,839(它们的公开内容都 通过引用并入本文)中。

分别在以下文献中定义了抗体和抗体-抗原复合物与免疫系统的 细胞的相互作用以及应答的种类，包括抗体依赖性的细胞-介导的细 胞毒性(ADCC)和补体依赖性的细胞毒性(CDC)、免疫复合物的 清除(吞噬作用)、B细胞的抗体生产以及IgG血清半衰期：Daeron 等人，Annu.Rev.Immunol.15：203-234(1997)；Ward和Ghetie， Therapeutic Immunol.2：77-94(1995)；Cox和Greenberg，Semin. Immunol.13：339-345(2001)；Heyman，Immunol.Lett.88：157-161 (2003)；和Ravetch，Curr.Opin.Immunol.9：121-125(1997)。

本文使用的术语“基本上由......组成”将理解成暗指，包含声称的 对象或对象的组；同时排除会实质上影响或改变该声称的对象的修饰 或其它对象。关于N-聚糖的种类，术语“基本上由声称的N-聚糖组成” 将理解为包括所述N-聚糖，不管该N-聚糖是否在与糖蛋白的天冬酰 胺残基直接相连的N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)处被岩藻糖基化。

本文使用的术语“优势地”或变体如“优势的”或“占优势的”将被 理解为表示这样的聚糖物质：在已经用PNGase处理糖蛋白、通过质 谱法(例如MALDI-TOF MS或HPLC)分析释放的聚糖之后，其在 总的中性N-聚糖中具有最高摩尔百分比(％)。换句话说，短语“优 势地”被定义为这样的单个实体，例如特定的糖型：其以比任意其它 单个实体更大的摩尔百分比存在。例如，如果组合物由40摩尔％的 物质A、35摩尔％的物质B和25摩尔％的物质C组成，所述组合物 优势地包含物质A，物质B将是第二优势物质。某些宿主细胞可以产 生包含中性N-聚糖和带电荷的N-聚糖(如甘露糖基磷酸)的组合物。 因而，糖蛋白的组成可以包括多种带电荷和不带电荷的或者中性的 N-聚糖。在本发明中，它是处于在其中测定优势N-聚糖的组合物中 的全部多种中性N-聚糖的环境中。因而，本文使用的“优势N-聚糖” 是指，所述组合物中全部多种中性N-聚糖的优势N-聚糖，该优势N- 聚糖具有特定结构。

本文使用的术语“基本上不含有”特定糖残基(诸如岩藻糖或半乳 糖等)用于表明，该糖蛋白组合物基本上缺少含有这种残基的N-聚 糖。按照纯度来表示，基本上不含有是指，含有这种糖残基的N-聚 糖结构的量不超过10％，优选低于5％，更优选低于1％，最优选低 于0.5％，其中所述百分比是按照重量或按照摩尔％。因而，在根据 本发明的糖蛋白组合物中，基本上所有的N-聚糖结构不含有例如岩 藻糖或半乳糖或两者。

如本文使用的，当在任何时候没有可检测量的特定糖残基存在于 N-聚糖结构上时，糖蛋白组合物“缺少”或“缺乏”这种糖残基，例如岩 藻糖或半乳糖。例如，在本发明的优选的实施方案中，所述糖蛋白组 合物由如上定义的低等真核生物生产，包括酵母(例如，毕赤酵母属 的种；酵母属的种；克鲁维酵母属的种；曲霉菌属的种)，并且将“缺 乏岩藻糖”，因为这些生物体的细胞不具有生产岩藻糖基化的N-聚糖 结构所需的酶。因而，术语“基本上不含有岩藻糖”涵盖术语“缺少岩 藻糖”。然而，即使组合物曾经含有岩藻糖基化的N-聚糖结构或含有 如上所述的有限但可检测量的岩藻糖基化的N-聚糖结构，所述组合 物可以是“基本上不含有岩藻糖”。

附图说明

图1A-H显示了从野生型菌株NRRL-Y11430(图1A)开始的 巴氏毕赤酵母(P.pastoris)菌株YGLY13992(图1F)和菌株 YGLY14401(图1G)的系谱学。

图2显示了编码LmSTT3D ORF的质粒pGLY6301的图谱，所 述LmSTT3D ORF是在巴氏毕赤酵母醇氧化酶I(AOX1)启动子和 酿酒酵母(S.cerevisiae)CYC转录终止序列的控制下。所述质粒是 靶向URA6基因座的滚入(roll-in)载体。转化体的选择使用由酿 酒酵母ARR3ORF编码的砷抗性，所述酿酒酵母ARR3ORF是在巴 氏毕赤酵母RPL10启动子和酿酒酵母CYC转录终止序列的控制下。

图3显示了编码LmSTT3D ORF的质粒pGLY6294的图谱，所 述LmSTT3D ORF是在巴氏毕赤酵母GAPDH启动子和酿酒酵母 CYC转录终止序列的控制下。所述质粒是靶向TRP1基因座的 KINKO载体：TRP1ORF的3′末端邻近巴氏毕赤酵母ALG3转录终 止序列。转化体的选择使用由诺尔斯链霉菌(Streptomyces noursei) 诺尔丝菌素乙酰基转移酶(NAT)ORF编码的诺尔丝菌素抗性，所 述ORF是在Ashbya gossypii TEF1启动子(PTEF)和Ashbya gossypii  TEF1终止序列(TTEF)的控制下。

图4显示了质粒pGLY6的图谱。质粒pGLY6是一种整合载体， 其靶向URA5基因座，且含有包含酿酒酵母转化酶基因或转录单元 (ScSUC2)的核酸分子，所述核酸分子在一侧侧接包含来自巴氏毕 赤酵母URA5基因的5′区域的核苷酸序列(PpURA5-5′)的核酸分 子，且在另一侧侧接包含来自巴氏毕赤酵母URA5基因的3′区域的 核苷酸序列(PpURA5-3′)的核酸分子。

图5显示了质粒pGLY40的图谱。质粒pGLY40是一种整合载 体，其靶向OCH1基因座，且含有包含巴氏毕赤酵母URA5基因或 转录单元(PpURA5)的核酸分子，所述核酸分子侧接包含lacZ重 复序列(lacZ重复序列)的核酸分子，后一种核酸分子又在一侧侧 接包含来自OCH1基因的5′区域的核苷酸序列(PpOCH1-5′)的核 酸分子，且在另一侧侧接包含来自OCH1基因的3′区域的核苷酸序 列(PpOCH1-3′)的核酸分子。

图6显示了质粒pGLY43a的图谱。质粒pGLY43a是一种整合 载体，其靶向BMT2基因座，且含有包含乳酸克鲁维酵母(K.lactis) UDP-N-乙酰基葡糖胺(UDP-GlcNAc)转运基因或转录单元的核酸 分子(KlGlcNAc transp.)，所述核酸分子邻近包含巴氏毕赤酵母 URA5基因或转录单元(PpURA5)的核酸分子，后一种核酸分子侧 接包含lacZ重复序列(lacZ重复序列)的核酸分子。所述邻近基因 在一侧侧接包含来自BMT2基因的5′区域的核苷酸序列 (PpPBS2-5′)的核酸分子，且在另一侧侧接包含来自BMT2基因 的3′区域的核苷酸序列(PpPBS2-3′)的核酸分子。

图7显示了质粒pGLY48的图谱。质粒pGLY48是一种整合载 体，其靶向MNN4L1基因座，且含有表达盒，所述表达盒包含编码 UDP-GlcNAc运载体开放读码框(ORF)的小鼠同系物(MmGlcNAc  Transp.)的核酸分子，所述核酸分子在5′末端处可操作地连接至包 含巴氏毕赤酵母GAPDH启动子(PpGAPDH Prom)的核酸分子上， 且在3′末端处可操作地连接至包含酿酒酵母CYC终止序列(ScCYC  TT)的核酸分子上，所述表达盒邻近包含巴氏毕赤酵母URA5基因 或转录单元(PpURA5)的核酸分子，所述核酸分子侧接lacZ重复 序列(lacZ重复序列)，且其中所述表达盒共同地在一侧侧接包含 来自巴氏毕赤酵母MNN4L1基因的5′区域的核苷酸序列 (PpMNN4L1-5′)的核酸分子，且在另一侧侧接包含来自MNN4L1 基因的3′区域的核苷酸序列(PpMNN4L1-3′)的核酸分子。

图8显示了质粒pGLY45的图谱。质粒pGLY45是一种整合载 体，其靶向PNO1/MNN4基因座，且含有包含巴氏毕赤酵母URA5 基因或转录单元(PpURA5)的核酸分子，所述核酸分子侧接包含 lacZ重复序列(lacZ重复序列)的核酸分子，后一核酸分子又在一 侧侧接包含来自PNO1基因的5′区域的核苷酸序列(PpPNO1-5′) 的核酸分子，且在另一侧侧接包含来自MNN4基因的3′区域的核苷 酸序列(PpMNN4-3′)的核酸分子。

图9显示了质粒pGLY1430的图谱。质粒pGLY1430是一种 KINKO整合载体，其靶向ADE1基因座且不会破坏该基因座的表 达，且含有串联的4个表达盒，所述表达盒编码：(1)人GlcNAc 转移酶I催化结构域(经过密码子优化)，其在N-端处与巴氏毕赤 酵母SEV12前导序列肽融合(CO-NA10)，(2)UDP-GlcNAc运 载体的小鼠同系物(MmTr)，(3)小鼠甘露糖苷酶IA催化结构 域(FB)，其在N-端处与酿酒酵母SEC12前导序列肽融合(FB8)， 和(4)巴氏毕赤酵母URA5基因或转录单元(PpURA5)，其侧接 lacZ重复序列(lacZ)。所述表达盒共同地侧接ADE1基因的5′区 域和ORF(ADE15′和ORF)以及ADE1基因的3′区域(PpADE1-3′)。 PpPMA1prom是巴氏毕赤酵母PMA1启动子；PpPMA1TT是巴氏 毕赤酵母PMA1终止序列；SEC4是巴氏毕赤酵母SEC4启动子； OCH1TT是巴氏毕赤酵母OCH1终止序列；ScCYC TT是酿酒酵母 CYC终止序列；PpOCH1 Prom是巴氏毕赤酵母OCH1启动子； PpALG3TT是巴氏毕赤酵母ALG3终止序列；且PpGAPDH是巴 氏毕赤酵母GADPH启动子。

图10显示了质粒pGLY582的图谱。质粒pGLY582是一种整 合载体，其靶向HIS1基因座，且含有串联的4个表达盒，所述表 达盒编码：(1)酿酒酵母UDP-葡萄糖差向异构酶(ScGAL10)， (2)人半乳糖基转移酶I(hGalT)催化结构域，其在N-端处与酿 酒酵母KRE2-s前导序列肽融合(33)，(3)巴氏毕赤酵母URA5 基因或转录单元(PpURA5)，其侧接lacZ重复序列(lacZ重复序 列)，和(4)黑腹果蝇UDP-半乳糖运载体(DmUGT)。所述表 达盒共同地侧接HIS1基因的5′区域(PpHIS1-5′)和HIS1基因的 3′区域(PpHIS1-3′)。PMA1是巴氏毕赤酵母PMA1启动子；PpPMA1 TT是巴氏毕赤酵母PMA1终止序列；GAPDH是巴氏毕赤酵母 GADPH启动子和ScCYC TT是酿酒酵母CYC终止序列；PpOCH1 Prom是巴氏毕赤酵母OCH1启动子，且PpALG12TT是巴氏毕赤 酵母ALG12终止序列。

图11显示了质粒pGLY167b的图谱。质粒pGLY167b是一种 整合载体，其靶向ARG1基因座，且含有串联的3个表达盒，所述 表达盒编码：(1)黑腹果蝇甘露糖苷酶II催化结构域(经过密码 子优化)，其在N-端处与酿酒酵母MNN2前导序列肽融合 (CO-KD53)，(2)巴氏毕赤酵母HIS1基因或转录单元，和(3) 大鼠N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)转移酶II催化结构域(经过密码 子优化)，其在N-端处与酿酒酵母MNN2前导序列肽融合 (CO-TC54)。所述表达盒共同地侧接ARG1基因的5′区域 (PpARG1-5′)和ARG1基因的3′区域(PpARG1-3′)。PpPMA1prom 是巴氏毕赤酵母PMA1启动子；PpPMA1TT是巴氏毕赤酵母PMA1 终止序列；PpGAPDH是巴氏毕赤酵母GADPH启动子；ScCYC TT 是酿酒酵母CYC终止序列；PpOCH1Prom是巴氏毕赤酵母OCH1 启动子；且PpALG12TT是巴氏毕赤酵母ALG12终止序列。

图12显示了质粒pGLY3411(pSH1092)的图谱。质粒pGLY3411 (pSH1092)是一种含有表达盒的整合载体，所述表达盒包含巴氏 毕赤酵母URA5基因或转录单元(PpURA5)，所述PpURA5侧接 lacZ重复序列(lacZ重复序列)，所述表达盒在一侧侧接巴氏毕赤 酵母BMT4基因的5′核苷酸序列(PpPBS45′)，在另一侧侧接巴 氏毕赤酵母BMT4基因的3′核苷酸序列(PpPBS43′)。

图13显示了质粒pGLY3419(pSH1110)的图谱。质粒pGLY3430 (pSH1115)是一种含有表达盒的整合载体，所述表达盒包含巴氏 毕赤酵母URA5基因或转录单元(PpURA5)，所述PpURA5侧接 lacZ重复序列(lacZ重复序列)，所述表达盒在一侧侧接巴氏毕赤 酵母BMT1基因的5′核苷酸序列(PBS15′)，在另一侧侧接巴氏 毕赤酵母BMT1基因的3′核苷酸序列(PBS13′)。

图14显示了质粒pGLY3421(pSH1106)的图谱。质粒pGLY4472 (pSH1186)含有表达盒，所述表达盒包含巴氏毕赤酵母URA5基 因或转录单元(PpURA5)，所述PpURA5侧接lacZ重复序列(lacZ 重复序列)，所述表达盒在一侧侧接巴氏毕赤酵母BMT3基因的5′ 核苷酸序列(PpPBS35′)，在另一侧侧接巴氏毕赤酵母BMT3基 因的3′核苷酸序列(PpPBS33′)。

图15显示了质粒pGLY3673的图谱。质粒pGLY3673是一种 KINKO整合载体，其靶向PRO1基因座且不会破坏该基因座的表 达，且含有表达盒，所述表达盒编码里氏木霉(T.reesei)α-1，2-甘 露糖苷酶催化结构域，所述催化结构域在N-端处与酿酒酵母 αMATpre信号肽(aMATTrMan)融合，以将所述嵌合蛋白靶向分 泌途径和从所述细胞分泌。

图16显示了pGLY6833的图谱，所述pGLY6833编码抗-Her2 抗体的轻链和重链。所述质粒是一种靶向TRP2基因座的滚入载体。 编码轻链和重链的ORF是在巴氏毕赤酵母AOX1启动子和巴氏毕 赤酵母CIT13UTR转录终止序列的控制下。转化体的选择使用由 zeocin抗性蛋白(Zeocin^R)ORF编码的zeocin抗性，所述ORF是 在巴氏毕赤酵母TEF1启动子和酿酒酵母CYC终止序列的控制下。

图17显示了pGLY6564的图谱，所述pGLY6564编码抗-RSV 抗体的轻链和重链。所述质粒是一种靶向TRP2基因座的滚入载体。 编码重链的ORF是在巴氏毕赤酵母AOX1启动子和酿酒酵母CYC 转录终止序列的控制下。编码轻链的ORF是在巴氏毕赤酵母AOX1 启动子和巴氏毕赤酵母AOX1转录终止序列的控制下。转化体的选 择使用由zeocin抗性蛋白(Zeocin^R)ORF编码的zeocin抗性，所 述ORF是在巴氏毕赤酵母TEF1启动子和酿酒酵母CYC终止序列 的控制下。

图18显示了与在其中组成性地表达(GAPDH启动子)或诱导 性地表达(AOX1启动子)LmSTT3D的菌株相比，在对照菌株中 生产的抗-Her2和抗-RSV抗体的N-糖基化位点占据百分比。

图19显示了与在CHO细胞中生产的可商业得到的抗-Her2抗 体(赫赛汀)的N-糖基化位点占据相比，在菌株YGLY13992和菌 株YGLY17351中生产的抗-Her2抗体的N-糖基化位点占据的对比。 菌株YGLY13992不包括编码LmSTT3D的表达盒，而菌株 YGLY17351包括编码LmSTT3的表达盒，所述表达盒在诱导型 PpAOX1启动子控制下。

图20表明，不论生物反应器规模，在不同的生物反应器中生长 的菌株YGLY17351所生产的抗-Her2抗体的N-糖基化位点占据百 分比是一致的。

图21显示了抗-Her2抗体(赫赛汀)的商业批次的CE和Q-TOF 分析的结果。

图22显示了与图21所用相同的商业批次、但是在用PNGase F 处理一段时间以后的CE和Q-TOF分析的结果。

图23A-D显示了从YGLY7961开始的巴氏毕赤酵母菌株 YGLY12900的系谱学。

图24显示了质粒pGLY2456的图谱。质粒pGLY2456是一种 KINKO整合载体，其靶向TRP2基因座且不会破坏该基因座的表 达，且含有6个表达盒，所述表达盒编码：(1)经过密码子优化 的小鼠CMP-唾液酸运载体(CO mCMP-Sia Transp)，(2)经过 密码子优化的人UDP-GlcNAc 2-差向异构酶/N-乙酰基甘露糖胺激 酶(CO hGNE)，(3)巴氏毕赤酵母ARG1基因或转录单元，(4) 经过密码子优化的人CMP-唾液酸合酶(CO hCMP-NANA S)，(5) 经过密码子优化的人N-乙酰神经氨酸-9-磷酸合酶(CO hSIAP S)， 和，(6)经过密码子优化的小鼠a-2，6-唾液酸基转移酶催化结构域， 其在N-端处与酿酒酵母KRE2前导序列肽融合(comST6-33)。所 述表达盒共同地侧接TRP2基因的5′区域和ORF(PpTRP25′)和 TRP2基因的3′区域(PpTRP2-3′)。PpPMA1prom是巴氏毕赤酵 母PMA1启动子；PpPMA1TT是巴氏毕赤酵母PMA1终止序列； CYC TT是酿酒酵母CYC终止序列；PpTEF Prom是巴氏毕赤酵母 TEF1启动子；PpTEF TT是巴氏毕赤酵母TEF1终止序列；PpALG3 TT是巴氏毕赤酵母ALG3终止序列；且pGAP是巴氏毕赤酵母 GAPDH启动子。

图25显示了质粒pGLY5048的图谱。质粒pGLY5048是一种 整合载体，其靶向STE13基因座，且含有表达盒，所述表达盒编码： (1)里氏木霉α-1，2-甘露糖苷酶催化结构域，其在N-端处与酿酒 酵母αMATpre信号肽(aMATTrMan)融合，以将所述嵌合蛋白靶 向分泌途径和从所述细胞分泌，和(2)巴氏毕赤酵母URA5基因 或转录单元。

图26显示了质粒pGLY5019的图谱。质粒pGLY5019是一种 整合载体，其靶向DAP2基因座，且含有表达盒，所述表达盒包含 编码诺尔丝菌素抗性(NAT^R)ORF的核酸分子，所述ORF可操作 地连接至Ashbya gossypii TEF1启动子和A.gossypii TEF1终止序 列，所述表达盒在一侧侧接巴氏毕赤酵母DAP2基因的5′核苷酸序 列，在另一侧侧接巴氏毕赤酵母DAP2基因的3′核苷酸序列。

图27显示了质粒pGLY5085的图谱。质粒pGLY5085是一种 KINKO质粒，其用于将参与生产唾液酸化的N-聚糖的第二组基因 导入巴氏毕赤酵母中。所述质粒与质粒YGLY2456类似，但是巴氏 毕赤酵母ARG1基因已经被替换为编码潮霉素抗性(Hyg^R)的表达 盒，且所述质粒靶向巴氏毕赤酵母TRP5基因座。所述6个串联盒 在一侧侧接包含来自TRP5基因的5′区域和ORF(在终止密码子处 结束)的核苷酸序列的核酸分子，继之以巴氏毕赤酵母ALG3终止 序列，且在另一侧侧接包含来自TRP5基因的3′区域的核苷酸序列 的核酸分子。

图28显示了质粒pGLY7240的图谱。所述质粒是一种整合载 体，其靶向TRP2基因座，且含有编码zeocin抗性蛋白(Zeocin^R) 的ORF，所述ORF是在巴氏毕赤酵母TEF1启动子和酿酒酵母CYC 终止序列的控制下。所述质粒编码GM-CSF/CWP1融合蛋白，其在 5′末端处可操作地连接至巴氏毕赤酵母AOX1启动子，且在3′末端 处可操作地连接至酿酒酵母CYC转录终止序列。

图29显示了在菌株YGLY16349(其共表达LmSTT3D)中生 产的GM-CSF的蛋白印迹，大部分GM-CSF(泳道2-8)在2个N- 连接的位点处被糖基化，与此相比，在对照菌株(YGLY15560，泳 道9)中，大部分GM-CSF在1个位点处被N-糖基化，小部分在 2N位点处被N-糖基化和未糖基化。

图30显示了分别从YGLY15560(A)和YGLY16349(B)表 达的GM-CSF的Q-TOP分析。没有检测到未糖基化的GM-CSF。

具体实施方式

本发明提供了一种在宿主细胞中生产治疗性糖蛋白的方法，其 中所述糖蛋白的N-糖基化位点占据增加，超过在没有如本文所述修 饰的宿主细胞中生产的相同糖蛋白的N-糖基化位点占据。当在低等 真核生物宿主细胞(例如，酵母宿主细胞或丝状真菌宿主细胞)中 实践本发明时，在所述宿主细胞中生产的重组糖蛋白的N-糖基化位 点占据与在哺乳动物或人宿主细胞中生产的相同重组糖蛋白的N- 糖基化位点占据相同或更相似。

为了增加在重组宿主细胞中生产的糖蛋白上的N-糖基化位点 占据，在所述宿主细胞中表达所述糖蛋白之前或同时，在所述重组 宿主细胞中过表达编码至少一种异源单亚基寡糖基转移酶的至少 一种核酸分子，在具体实施方案中，所述至少一种异源单亚基寡糖 基转移酶能够在功能上抑制构成内源性的宿主细胞异源寡聚的寡 糖基转移酶(OTase)复合物的一个或多个必需亚基的致死突变。

硕大利什曼原虫STT3A蛋白、硕大利什曼原虫STT3B蛋白和 硕大利什曼原虫STT3D蛋白是已经证实会抑制酿酒酵母中的STT3 基因座缺失的致死表型的单亚基寡糖基转移酶(Naseb等人，Molec. Biol.Cell 19：3758-3768(2008))。Naseb等人(同上)进一步 证实，硕大利什曼原虫STT3D蛋白可以抑制WBP1、OST1、SWP1 或OST2基因座的缺失的致死表型。Hese等人(Glycobiology 19： 160-171(2009))教导，硕大利什曼原虫STT3A(STT3-1)、STT3B (STT3-2)和STT3D(STT3-4)蛋白可以在功能上补偿OST2、SWP1 和WBP1基因座的缺失。硕大利什曼原虫STT3D(LmSTT3D)蛋 白是一种异源单亚基寡糖基转移酶，其能够抑制Δstt3突变的致死 表型和Δwbp1、Δost1、Δswp1和Δost2突变中的至少一种致死表型， 其在本文的实施例中被证实能够增强由宿主细胞生产的异源糖蛋 白(例如抗体)的N-糖基化位点占据。

在有构成宿主细胞的内源OTase复合物的蛋白(包括宿主细胞 的STT3蛋白)存在下，组成性地或诱导性地过表达一种或多种异 源单亚基寡糖基转移酶。编码每个异源单亚基寡糖基转移酶基因的 表达盒可以整合进宿主细胞基因组内的任意位点中，或位于宿主细 胞的染色体外间隙中，即，自主复制的遗传元件，诸如质粒、病毒、 2μm质粒、微型染色体等。一般而言，所述异源单亚基寡糖基转移 酶是在表达盒中提供给宿主细胞，所述表达盒各自包含编码单亚基 寡糖基转移酶开放读码框(ORF)的核酸分子，所述ORF可操作 地连接至适合在特定宿主细胞中表达异源蛋白的异源组成型或诱 导型启动子和其它异源转录或翻译调控元件上。如下使每个表达盒 的一个或多个拷贝整合进宿主细胞基因组的一个或多个位置：通过 用于整合的特定基因座的位点特异性的靶向，或通过将表达盒随机 地整合进基因组中。基于基因座对表达盒中的单亚基寡糖基转移酶 的异位组成型或诱导型表达的适合性，可以选择用于靶向整合的基 因座。通过诸如单交换和双交换同源重组等技术将异源核酸分子整 合进宿主细胞基因组中的方法，是本领域众所周知的(参见例如， 美国公开的申请号20090124000和国际公开的申请号 WO2009085135，它们的公开内容通过引用并入本文)。作为将表 达盒的一个或多个拷贝整合进宿主细胞基因组中的替代或附加，使 用2μ质粒、病毒载体、微型染色体或自主复制的其它遗传载体， 使所述表达盒的一个或多个拷贝定位在宿主细胞的染色体外间隙 中。

尽管在本文中已经用遗传地工程改造成生产哺乳动物或人样 糖基化模式(其包含复杂型N-聚糖)的巴氏毕赤酵母宿主细胞例证 了本发明，用于增加在宿主细胞中生产的糖蛋白的N-糖基化位点占 据的总量(与在没有如本文所述修饰成表达单亚基寡糖基转移酶基 因的宿主中生产的糖蛋白的相应值相比)的本发明也可以应用于这 样的巴氏毕赤酵母宿主细胞：所述细胞没有遗传地工程改造成生产 具有哺乳动物或人糖基化模式的糖蛋白，但是相反表达具有内源或 野生型糖基化模式(例如高甘露糖基化的N-糖基化)的糖蛋白，或 当所述宿主细胞缺少α-1，6-甘露糖基转移酶 (alpha-1，6-mannosylatransferase，och1p)活性时，表达具有高甘 露糖型N-糖基化的糖蛋白。本发明也可以应用于其它酵母或丝状真 菌，或应用于植物或藻类宿主细胞，它们表达具有内源或野生型糖 基化模式(例如高甘露糖基化的N-糖基化)的糖蛋白，或当所述宿 主细胞缺少α-1，6-甘露糖基转移酶(och1p)活性时，表达具有高甘 露糖型N-糖基化的糖蛋白，或者它们已经被遗传地工程改造成生产 哺乳动物或人样复杂型或杂合型N-聚糖，以增加在宿主细胞中生产 的糖蛋白的N-糖基化位点占据的总量(与在没有如本文所述修饰成 表达单亚基寡糖基转移酶基因的宿主中生产的糖蛋白的相应值相 比)。本发明也可以应用于哺乳动物表达系统，以增加具有超过2 个N-连接的位点的糖蛋白的N-糖基化位点占据(与在没有如本文 所述修饰成表达单亚基寡糖基转移酶基因的宿主细胞中生产的糖 蛋白的相应值相比)。

动物、植物和真菌的OTase复合物是异源寡聚蛋白复合物。在 充分研究的模型生物酿酒酵母中，所述OTase复合物目前似乎由至 少8个不同的亚基组成：Ost1p、Ost2p、Wbp1、Stt3p、Swp1p、 Ost4p、Ost5p和Ost3p/Ost6p(Silberstein和Gilmore，FASEB J.10： 849-858(1996)；Knauer和Lehle，Biochim.Biophys.Acta.1426： 259-273(1999)；Dempski和Imperiali，Curr.Opin.Chem.Biol.6： 844-850(2002)；Yan和Lennarz，J.Biol.Chem.277：47692-47700 (2005)；Kelleher和Gilmore，Glycobiol.16：47R-62R(2006)； Weerapana和Imperiali，Glycobiol.16：91R-101R(2006))。在巴 氏毕赤酵母中，所述OTase复合物似乎至少包括Ost1p、Ost2p、 Ost3p、Ost4p、Ost6p、Wbp1、Swp1p和Stt3p(参见Shutter等人， Nat.Biotechnol.27：561-566(2009))。

已经假定，STT3蛋白是OTase复合物中的催化亚基(Yan和 Lennarz，J.Biol.Chem.277：47692-47700(2002)；Kelleher等人， Mol.Cell.12：101-111(2003)；Nilsson等人，J.Cell Biol.161： 715-725(2003))。实验表明，在没有任何其它辅助蛋白存在下， 酵母Stt3p的原核同系物是一种有活性的寡糖基转移酶，这支持了 该假设(Wacker等人，Science.298：1790-1793(2002)；Kowarik 等人，Science 314：1148-1150(2006))。在几乎所有的真核基因组 中，都编码与酵母Stt3p同源的蛋白(Kelleher和Gilmore，Glycobiol. 16：47R-62R(2006))。但是，比较基因组分析提示，在真核生物 的进化趋异过程中，OTase的组成变得日益复杂。

单亚基寡糖基转移酶存在于贾第虫属(Giardia)和动基体目原 生动物(kinetoplastid)中，而由STT3、OST1、OST2和WBP1同 系物组成的4亚基寡糖基转移酶存在于双滴虫目原生动物 (diplomonad)、内阿米巴属和顶虫(apicomplexan)物种中。另 外，在锥虫基因组中可以编码多种形式的假定的STT3蛋白：3种 STT3同系物存在于布鲁斯锥虫(Trypanosoma brucei)中，4种存 在于硕大利什曼原虫中(McConville等人，Microbiol.Mol.Biol.Rev. 66：122-154(2002)；Berriman等人，Science.309：416-422(2005)； Ivens等人，Science.309：436-442(2005)；Samuelson等人，Proc.Natl. Acad.Sci.USA 102：1548-1553(2005)；Kelleher和Gilmore， Glycobiol.16：47R-62R(2006))。

在锥虫寄生物中，N-连接的糖基化主要遵循关于真菌或动物细 胞所述的途径，但是不同的寡糖结构被转移至蛋白(Parodi， Glycobiology 3：193-199(1993)；McConville等人，Microbiol.Mol. Biol.Rev.66：122-154(2002))。已经证实，取决于物种， Man₆GlcNAc₂或Man₇GlcNAc₂是在利什曼原虫属中转移给蛋白的 最大聚糖(Parodi，Glycobiology 3：193-199(1993)。不同于优选地 使用Glc₃Man₉GlcNAc₂的酵母和哺乳动物寡糖基转移酶，锥虫寡糖 基转移酶不是选择性的，且在相同的速率转移不同的脂质连接的寡 糖(Bosch等人，J.Biol.Chem.263：17360-17365(1988))。因此， 最简单的真核寡糖基转移酶是单亚基STT3蛋白，这类似于在细菌 N-糖基化系统中发现的寡糖基转移酶。Nasab等人，Molecular  Biology of the Cell 19：3758-3768(2008)在酿酒酵母中单个地表达 了4种硕大利什曼原虫STT3蛋白中的每一种，并发现，它们中的 3种(LmSTT3A蛋白、LmSTT3B蛋白和LmSTT3D蛋白)能够补 偿酵母STT3基因座的缺失。另外，LmSTT3D表达会抑制编码各种 必需OTase亚基的基因中的单缺失和双缺失的致死表型。LmSTT3 蛋白不会掺入酵母OTase复合物中，但是相反形成同源二聚酶，该 酶能够替代酵母细胞的内源多聚酶。所述结果指示，尽管这些单亚 基寡糖基转移酶可能模仿原核生物酶，它们使用真核生物糖基化的 典型底物：也就是说，N-X-S/T N-糖基化识别位点和多萜醇焦磷酸 盐-连接的高甘露糖型寡糖。

在例如下述报道中，已经讨论了在酵母中的N-糖基化位点占 据：Schultz和Aebi，Molec.Cell.Proteomics 8：357-364(2009)；Hese 等人，op.cit.)和Nasab等人，(op.cit.)。已经证实，鼠弓形虫 (Toxoplasma gondii)或克鲁斯锥虫(Trypanosoma cruzi)STT3蛋 白在酿酒酵母中的表达会补偿stt3缺失的致死表型(Shams-Eldin 等人，Mol.Biochem.Parasitol.143：6-11(2005)；Castro等人，Proc. Natl.Acad.Sci.USA 103：14756-14760(2006))，并且尽管克鲁斯 锥虫STT3蛋白掺入酵母OTase复合物中，硕大利什曼原虫STT3 蛋白相反地似乎形成同源二聚体(Nasab等人，op.cit.)。但是，在 这些报道中，已经在测量内源蛋白的N-糖基化位点占据的研究中， 测试了LmSTT3D蛋白对内源酵母STT3基因座的致死突变和酵母 OTase复合物的其它必需组分的功能抑制。另外，在所述研究中使 用的酵母菌株生产具有酵母糖基化模式(不是哺乳动物或人样糖基 化模式)的糖蛋白，所述糖蛋白包含杂合型或复杂型N-聚糖。

与上述报道相比，在本发明中，在重组宿主细胞中组成性地或 诱导性地过表达编码异源单亚基寡糖基转移酶的开放读码框(如在 本文中使用编码LmSTT3D的开放读码框所例证的)蛋白，其中所 述宿主细胞另外表达编码构成宿主细胞寡糖基转移酶(OTase)复 合物的蛋白的内源基因，这包括内源性的宿主细胞STT3基因的表 达。因而，所述宿主细胞表达异源单亚基寡糖基转移酶和内源性的 宿主细胞OTase复合物，包括内源性的宿主细胞SST3蛋白。此外， 关于重组酵母、丝状真菌、藻类或植物宿主细胞，所述宿主细胞可 以进一步被遗传地工程改造成生产具有哺乳动物或人样糖基化模 式(包含复杂型和/或杂合型N-聚糖)的糖蛋白，且不生产具有宿 主细胞的内源糖基化模式的糖蛋白。

在本文中已经使用巴氏毕赤酵母宿主细胞例证了本发明，所述 宿主细胞被遗传地工程改造成生产哺乳动物或人样复杂型N-聚糖； 但是，本发明可以应用于其它酵母宿主细胞(包括、但不限于酿酒 酵母、粟酒裂殖酵母、Ogataea minuta和巴氏毕赤酵母)或丝状真 菌(包括、但不限于里氏木霉)，所述细胞生产具有酵母或真菌 N-聚糖(高甘露糖基化的N-聚糖或高甘露糖型N-聚糖)的糖蛋白， 或者被遗传地工程改造成生产具有哺乳动物或人样高甘露糖型、复 杂型或杂合型N-聚糖的糖蛋白，以提高在宿主细胞中生产的糖蛋白 的总N-糖基化位点占据。此外，本发明也可以应用于植物和哺乳动 物表达系统，以提高在这些植物或哺乳动物表达系统中生产的糖蛋 白的总N-糖基化位点占据，特别是具有超过2个N-连接的糖基化 位点的糖蛋白。

因此，在上述内容的一个方面，提供了一种在宿主细胞中生产 异源糖蛋白的方法，所述方法包括：提供宿主细胞，所述宿主细胞 包括编码至少一种异源单亚基寡糖基转移酶的核酸分子和编码异 源糖蛋白的核酸分子，且其中表达内源性的宿主细胞基因，所述基 因编码构成内源寡糖基转移酶(OTase)复合物的蛋白；和在用于 表达所述异源糖蛋白的条件下，培养所述宿主细胞，以生产所述异 源糖蛋白。

在上述内容的另一个方面，提供了一种在宿主细胞中生产具有 哺乳动物或人样复杂型或杂合型N-聚糖的异源糖蛋白的方法，所述 方法包括：提供宿主细胞，所述宿主细胞被遗传地工程改造成生产 具有人样N-聚糖的糖蛋白，且包括编码至少一种异源单亚基寡糖基 转移酶的核酸分子和编码异源糖蛋白的核酸分子，且其中表达内源 性的宿主细胞基因，所述基因编码构成内源寡糖基转移酶(OTase) 复合物的蛋白；和在用于表达所述异源糖蛋白的条件下，培养所述 宿主细胞，以生产所述异源糖蛋白。

编码构成寡糖基转移酶(OTase)复合物的蛋白的内源性宿主 细胞基因的表达，包括编码内源STT3蛋白或同系物的内源宿主细 胞基因的表达。在酵母宿主细胞的情况下，表达编码构成OTase复 合物的蛋白的内源性宿主细胞基因，这包括内源STT3基因的表达。 目前，已知编码构成酿酒酵母OTase复合物的蛋白的基因包括： OST1、OST2、OST3、OST4、OST5、OST6、WBP1、SWP1和STT3 (参见例如，Spirig等人，Molec.Gen.Genet.256：628-637(1997)， 且在巴氏毕赤酵母中，所述OTase复合物似乎至少包括Ost1p、 Ost2p、Ost3p、Ost4p、Ost6p、Wbp1、Swp1p和Stt3p(参见Shutter 等人，op.cit.)。

一般而言，所述异源单亚基寡糖基转移酶能够在功能上抑制 OTase复合物(例如，酵母OTase复合物)的至少一种必需蛋白的 致死突变表型。因而，所述异源单亚基寡糖基转移酶能够在功能上 补偿或挽救OTase复合物的至少一种必需蛋白的致死突变。在其它 方面，所述OTase复合物的必需蛋白由酿酒酵母和/或巴氏毕赤酵 母STT3基因座、WBP1基因座、OST1基因座、SWP1基因座或OST2 基因座或它们的同系物编码。一般而言，可以在本文所述方法中用 于增加N-糖基化位点占据的异源单亚基寡糖基转移酶是这样的异 源单亚基寡糖基转移酶：其在具体实施方案中，能够在功能上抑制 (或挽救或补偿)酿酒酵母和/或巴氏毕赤酵母OTase复合物的至 少一种必需蛋白的致死表型。例如，在其它方面，所述异源单亚基 寡糖基转移酶是硕大利什曼原虫STT3D蛋白，其能够在功能上抑 制(或挽救或补偿)酿酒酵母或巴氏毕赤酵母OTase复合物的至少 一种必需蛋白的致死表型。因此，就特定宿主细胞而言，特定异源 单亚基寡糖基转移酶适合在所述特定宿主细胞中表达，只要所述单 亚基异源寡糖基转移酶能够抑制酵母OTase复合物的至少一种必 需蛋白的致死表型。在其它方面，为在特定宿主细胞中的表达选择 异源单亚基异源寡糖基转移酶，只要所述单亚基异源寡糖基转移酶 能够抑制酿酒酵母和/或巴氏毕赤酵母OTase复合物的至少一种必 需蛋白的致死表型。所述必需蛋白包括OST1、OST2、WBP1、SWP1 和STT3。

本文使用的致死突变包括：编码OTase复合物的必需蛋白的基 因的删除或破坏，或在使所述必需蛋白丧失功能的编码序列中的突 变。该术语可以另外包括击倒(knock-down)突变，其中使用shRNA 或RNAi废除功能性必需蛋白的生产。

另外提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含：编码至少一种 异源单亚基寡糖基转移酶的第一种核酸分子；和编码异源糖蛋白的 第二种核酸分子；且所述宿主细胞表达它的内源基因，所述内源基 因编码构成内源寡糖基转移酶(OTase)复合物的蛋白，所述表达 包括：表达编码宿主细胞STT3蛋白的内源宿主细胞基因，该基因 在酵母中是STT3基因。在酵母宿主细胞的其它方面，所述宿主细 胞表达编码构成OTase复合物的蛋白的内源基因。

在任意上述内容的具体方面，所述宿主细胞另外包括：一种或 多种编码额外异源寡糖基转移酶的核酸分子，所述额外异源寡糖基 转移酶可以包括单亚基的或多聚的寡糖基转移酶。例如，所述宿主 细胞可以包含编码一种或多种选自下述的单亚基寡糖基转移酶的 一种或多种核酸分子：LmSTT3A蛋白、LmSTT3B蛋白和LmSTT3D 蛋白。在其它方面，所述宿主细胞可以另外包括编码LmSTT3C蛋 白的核酸分子。在任意上述内容的其它方面，所述宿主细胞可以包 括编码一种或多种选自下述的寡糖基转移酶的一种或多种核酸分 子：鼠弓形虫STT3蛋白、克鲁斯锥虫STT3蛋白、布鲁斯锥虫STT3 蛋白和秀丽隐杆线虫STT3蛋白。在任意上述内容的其它方面，所 述宿主细胞可以另外包括编码巴氏毕赤酵母STT3蛋白的核酸分 子。

诸如酵母或丝状真菌等低等真核生物经常用于表达重组糖蛋 白，因为它们可以经济地培养、产生高产率，且当适当地修饰时， 能够适当地糖基化。酵母尤其会提供确定的遗传学，这允许快速的 转染、经过测试的蛋白定位策略和容易的基因敲除技术。合适的载 体具有需要的表达控制序列，诸如启动子(包括3-磷酸甘油酸酯激 酶或其它糖酵解酶)和复制起点、终止序列等。

有用的低等真核生物宿主细胞包括、但不限于：巴氏毕赤酵母、 芬兰毕赤酵母、喜海藻糖毕赤酵母、Pichia koclamae、膜醭毕赤酵 母、Pichia minuta(Ogataea minuta、Pichia lindneri)、Pichia opuntiae、 Pichia thermotolerans、柳毕赤酵母、Pichia guercuum、皮杰普氏毕 赤酵母、具柄毕赤酵母、甲醇毕赤酵母、毕赤酵母属的种、酿酒酵 母、酵母属的种、多形汉逊酵母、克鲁维酵母属的种、乳酸克鲁维 酵母、白色假丝酵母菌、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、里氏木霉、 Chrysosporium lucknowense、镰孢菌属的种、禾赤镰孢、镰孢霉和 粗糙链孢霉。诸如乳酸克鲁维酵母、巴氏毕赤酵母、甲醇毕赤酵母 和多形汉逊酵母等多种酵母特别适合细胞培养，因为它们能够生长 至高细胞密度，并分泌大量重组蛋白。同样地，诸如黑曲霉、镰刀 菌属的种、粗糙链孢霉等丝状真菌可以用于在工业规模生产本发明 的糖蛋白。在低等真核生物的情况下，常规地培养细胞约1天半至 3天。

因此，提供了一种在低等真核生物宿主细胞中生产异源糖蛋白 的方法，所述方法包括：提供低等真核生物宿主细胞，所述宿主细 胞包括编码异源单亚基寡糖基转移酶的核酸分子和编码异源糖蛋 白的核酸分子；和在用于表达所述异源糖蛋白的条件下，培养所述 宿主细胞，以生产所述异源糖蛋白。

另外提供了一种低等真核生物宿主细胞，所述宿主细胞包含： 编码异源单亚基寡糖基转移酶的第一种核酸分子；和编码异源糖蛋 白的第二种核酸分子；且其中表达编码构成寡糖基转移酶(OTase) 复合物的蛋白的内源性宿主细胞基因。

另外提供了一种酵母或丝状真菌宿主细胞，所述宿主细胞包 含：编码异源单亚基寡糖基转移酶的第一种核酸分子；和编码异源 糖蛋白的第二种核酸分子；且其中表达编码构成寡糖基转移酶 (OTase)复合物的蛋白的内源性宿主细胞基因。这包括内源STT3 基因的表达，所述基因在酵母中是STT3基因。

在具体方面，上述酵母或丝状真菌宿主细胞可以是这样的宿主 细胞：其生产具有酵母样或丝状真菌样糖基化模式的糖蛋白。所述 酵母糖基化模式可以包括高甘露糖基化的N-聚糖，或可以将所述酵 母遗传地工程改造成缺少α1，6-甘露糖基转移酶活性，也就是说，将 所述酵母宿主遗传地工程改造成缺少och1p活性，在该情况下，所 述酵母生产具有高甘露糖型N-聚糖的糖蛋白，所述糖蛋白不再进一 步高甘露糖基化。

在上述方法和宿主细胞的具体实施方案中，所述异源单亚基寡 糖基转移酶能够在功能上抑制OTase复合物的至少一种必需蛋白 的致死突变表型。在其它方面，所述OTase复合物的必需蛋白由 STT3基因座、WBP1基因座、OST1基因座、SWP1基因座或OST2 基因座或它们的同系物编码。在其它方面，单亚基寡糖基转移酶的 实例是硕大利什曼原虫STT3D蛋白。

本文的方法和宿主细胞提供了在宿主细胞中生产异源糖蛋白 的方法，其中所述异源糖蛋白的组成的N-糖基化位点占据，大于在 没有如本文所述修饰成表达异源单亚基寡糖基转移酶和内源性宿 主细胞基因(其编码构成寡糖基转移酶(OTase)复合物的蛋白) 的宿主细胞中生产的异源糖蛋白的N-糖基化位点占据。就诸如酵母 等低等真核生物宿主细胞而言，当异源糖蛋白的N-糖基化位点占据 低于在哺乳动物或人细胞中生产的异源糖蛋白所得到的值时，可以 如下使在所述宿主细胞中生产的糖蛋白的N-糖基化位点占据与在 哺乳动物或人细胞中生产的糖蛋白的N-糖基化位点占据相同或更 相似：在表达异源单亚基寡糖基转移酶和内源性的宿主细胞基因 (其编码构成寡糖基转移酶(OTase)复合物的蛋白)的宿主细胞 中生产糖蛋白。如在实施例中所证实的，表达异源单亚基寡糖基转 移酶和内源性的宿主细胞基因(其编码构成寡糖基转移酶(OTase) 复合物的蛋白)的巴氏毕赤酵母宿主细胞能够生产抗体，其中所述 抗体的N-糖基化位点占据与在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中生产 的抗体的N-糖基化位点占据类似(也参见图19)。

一种测量N-糖基化位点占据的方法是，分离糖基化的蛋白和未 糖基化的蛋白，测量各自的量，并使用下式测定N-糖基化位点占据

(糖基化的蛋白的摩尔数)/(糖基化的蛋白的摩尔数+未糖基化的 蛋白的摩尔数)x100＝N-糖基化位点占据百分比。

当测量抗体组合物中的抗体的N-糖基化位点占据时，还原所述 组合物中的抗体，并测定糖基化的和未糖基化的重链的摩尔数。每 个重链具有在Asn-297处的一个N-糖基化位点。基于释放的N-聚糖 的总摩尔数和抗体重链的总摩尔数，测定N-糖基化位点占据百分 比。例如，94％的N-糖基化位点占据指示，所述组合物中的94％ 的重链具有在Asn-297处的N-聚糖，且6％的重链缺少N-聚糖。抗 体由2个重链和2个轻链组成。在上述实施例中，在所述组合物中 的抗体可以：具有与N-聚糖相连的2个重链，2个重链之一具有N- 聚糖，或任一个链都不具有N-聚糖。因此，重链的94％的N-糖基 化位点占据提示，在所述组合物中的约88％的抗体具有N-糖基化 的2个重链，且11.4％的抗体的2个重链中仅一个被N-糖基化。为 了获得上述内容是正确的定性指示，通过诸如Q-TOF(具有MS/MS 能力的混合四极飞行时间质谱仪)等方法，分析完整抗体。

用于测量抗体的N-糖基化位点占据的一般方法可以使用在实 施例3中例证的下述方法。将抗体还原成重链(HC)和轻链(LC)， 并通过诸如毛细管电泳等方法测定糖基化的重链(GHC)和未糖基 化的重链(NGHC)的量。使用下式，计算N-糖基化位点占据：

(GHC摩尔数)/(GHC摩尔数+NGHC摩尔数)x100＝N-糖基化 位点HC占据百分比。

对于任意N-糖基化位点，该位点被占据或未占据。因此，100％ 的N-聚糖占据等同于1∶1(1摩尔的N-聚糖/1摩尔的N-糖基化位点， 例如，来自还原的抗体的重链)或2∶1(2摩尔的N-聚糖/1摩尔的 具有2个N-糖基化位点的蛋白，例如，未还原的抗体)的比例。80％ 的N-聚糖占据等同于0.8∶1(0.8摩尔的N-聚糖/1摩尔的N-糖基化 位点，例如，来自还原的抗体的重链)或1.6∶1(1.6摩尔的N-聚糖 /1摩尔的具有2个N-糖基化位点的蛋白，例如，未还原的抗体)的 比例。

通过公式(GHC分数)²x100＝完全占据的抗体(完整的、未还 原的抗体，其中2个N-糖基化位点被占据)，可以估测其中重链被 糖基化的完整抗体的比例。实施例3表明，本文所述方法能够生产 这样的抗体组合物：其中在所述组合物中的约70％至约98％的未还 原的完整抗体分子具有被占据的2个N-糖基化位点。由于使用还原 的抗体分子来测量N-糖基化位点占据，本文的结果证实，对于包含 含有单个糖基化位点的糖蛋白分子的组合物而言，超过84％至至少 99％的糖蛋白分子被N-糖基化。因此，本文的方法和宿主细胞能够 生产这样的糖蛋白组合物：其中在所述组合物中的糖蛋白的至少 70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的N-糖基化位 点被占据。

另一种用于测量糖蛋白组合物中的糖蛋白的N-糖基化位点占 据的方法可以如下实现：从所述组合物中的糖蛋白释放出N-聚糖， 并测量释放的N-聚糖的摩尔量，将糖蛋白的摩尔量乘以所述糖蛋白 上的糖基化位点的数目。可以使用下式：

(N-聚糖的总摩尔数)/(糖蛋白总摩尔数x位点数目)x100＝N-糖 基化位点占据百分比。

上式会给出被占据的总N-糖基化位点的百分比。

可以遗传修饰低等真核生物、特别是酵母，使得它们表达糖蛋 白，其中糖基化模式是哺乳动物或人样的或人源化的。以此方式， 可以生产糖蛋白组合物，其中特定的希望的糖型在所述组合物中占 优势。这可以如下实现：消除选择的内源糖基化酶，和/或遗传地工 程改造所述宿主细胞，和/或供给外源性酶来模仿哺乳动物糖基化途 径的全部或一部分，如在美国公开的申请号2004/0018590中所述， 它的公开内容通过引用并入本文。如果需要的话，可以进行糖基化 的其它基因工程，从而可以生产具有或没有核心岩藻糖基化的糖蛋 白。

可以遗传修饰低等真核生物诸如酵母，使得它们表达糖蛋白， 其中糖基化模式是哺乳动物样或人样的或人源化的。这可以如下实 现：消除选择的内源糖基化酶，和/或供给外源性酶，如在Gerngross 等人，美国专利号7,449,308中所述，它的公开内容通过引用并入本 文。因而，在本发明的具体方面，所述宿主细胞是酵母，例如，甲 基营养酵母诸如巴氏毕赤酵母或Ogataea minuta和它们的突变体和 它们的遗传工程改造的变体。以此方式，可以生产糖蛋白组合物， 其中特定的希望的糖型在所述组合物中占优势。这可以如下实现： 消除选择的内源糖基化酶，和/或遗传地工程改造所述宿主细胞，和 /或供给外源性酶来模仿哺乳动物糖基化途径的全部或一部分，如在 美国专利号7,449,308中所述，它的公开内容通过引用并入本文。 如果需要的话，可以进行糖基化的其它基因工程，从而可以生产具 有或没有核心岩藻糖基化的糖蛋白。使用诸如酵母等低等真核宿主 细胞的其它优点是，这些细胞能够生产相对同质的糖蛋白组合物， 使得存在的糖蛋白的优势糖型可以是所述组合物中的糖蛋白的大 于30摩尔％。在具体方面，存在的优势糖型可以是在所述组合物 中存在的糖蛋白的大于40摩尔％、50摩尔％、60摩尔％、70摩尔 ％，最优选大于80摩尔％。这可以如下实现：消除选择的内源糖基 化酶，和/或供给外源性酶，如在Gerngross等人，美国专利号 7,029,872和美国专利号7,449,308中所述，它们的公开内容通过引 用并入本文。例如，可以选择或工程改造宿主细胞成缺少1，6-甘露 糖基转移酶活性，所述酶否则会将甘露糖残基添加在糖蛋白的N- 聚糖上。

在一个实施方案中，所述宿主细胞另外包括与细胞靶向信号肽 融合的α1，2-甘露糖苷酶催化结构域，所述靶向信号肽通常不与所述 催化结构域结合，并选择成将α1，2-甘露糖苷酶活性靶向宿主细胞的 内质网或高尔基体。重组糖蛋白在宿主细胞的内质网或高尔基体中 的穿过，会生成包含Man₅GlcNAc₂糖型的重组糖蛋白，例如，优势 地包含Man₅GlcNAc₂糖型的重组糖蛋白组合物。例如，美国专利号 7,029,872、美国专利号7,449,308和美国公开的专利申请号 2005/0170452(它们的公开内容都通过引用并入本文)公开了能够 生产包含Man₅GlcNAc₂糖型的糖蛋白的低等真核生物宿主细胞。

在另一个实施方案中，上一段所述的宿主细胞另外包括与细胞 靶向信号肽融合的N-乙酰基葡糖胺基转移酶I(GlcNAc转移酶I 或GnT I)催化结构域，所述靶向信号肽通常不与所述催化结构域 结合，并选择成将GlcNAc转移酶I活性靶向宿主细胞的内质网或 高尔基体。重组糖蛋白在宿主细胞的内质网或高尔基体中的穿过， 会生成包含GlcNAcMan₅GlcNAc₂糖型的重组糖蛋白，例如，优势 地包含GlcNAcMan₅GlcNAc₂糖型的重组糖蛋白组合物。例如，美 国专利号7,029,872、美国专利号7,449,308和美国公开的专利申请 号2005/0170452(它们的公开内容都通过引用并入本文)公开了能 够生产包含GlcNAcMan₅GlcNAc₂糖型的糖蛋白的低等真核生物宿 主细胞。可以在体外用己糖胺酶(hexaminidase)处理在上述细胞 中生产的糖蛋白，以生产包含Man₅GlcNAc₂糖型的重组糖蛋白。

在另一个实施方案中，上一段所述的宿主细胞另外包括与细胞 靶向信号肽融合的甘露糖苷酶II催化结构域，所述靶向信号肽通常 不与所述催化结构域结合，并选择成将甘露糖苷酶II活性靶向宿主 细胞的内质网或高尔基体。重组糖蛋白在宿主细胞的内质网或高尔 基体中的穿过，会生成包含GlcNAcMan₃GlcNAc₂糖型的重组糖蛋 白，例如，优势地包含GlcNAcMan₃GlcNAc₂糖型的重组糖蛋白组 合物。美国专利号7,029,872和美国专利号7,625,756(它们的公开 内容都通过引用并入本文)公开了表达甘露糖苷酶II酶且能够生产 优势地具有GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂糖型的糖蛋白的低等真核生物宿 主细胞。可以在体外用己糖胺酶处理在上述细胞中生产的糖蛋白， 以生产包含Man₃GlcNAc₂糖型的重组糖蛋白。

在另一个实施方案中，上一段所述的宿主细胞另外包括与细胞 靶向信号肽融合的N-乙酰基葡糖胺基转移酶II(GlcNAc转移酶II 或GnT II)催化结构域，所述靶向信号肽通常不与所述催化结构域 结合，并选择成将GlcNAc转移酶II活性靶向宿主细胞的内质网或 高尔基体。重组糖蛋白在宿主细胞的内质网或高尔基体中的穿过， 会生成包含GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂糖型的重组糖蛋白，例如，优势 地包含GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂糖型的重组糖蛋白组合物。美国专利 号7,029,872和7,449,308和美国公开的专利申请号2005/0170452(它 们的公开内容都通过引用并入本文)公开了能够生产包含 GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂糖型的糖蛋白的低等真核生物宿主细胞。可 以在体外用己糖胺酶处理在上述细胞中生产的糖蛋白，以生产包含 Man₃GlcNAc₂糖型的重组糖蛋白。

在另一个实施方案中，上一段所述的宿主细胞另外包括与细胞 靶向信号肽融合的半乳糖基转移酶催化结构域，所述靶向信号肽通 常不与所述催化结构域结合，并选择成将半乳糖基转移酶活性靶向 宿主细胞的内质网或高尔基体。重组糖蛋白在宿主细胞的内质网或 高尔基体中的穿过，会生成包含GalGlcNAc₂Man₃GlcNAc₂或 Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂糖型或其混合物的重组糖蛋白，例如， 优势地包含GalGlcNAc₂Man₃GlcNAc₂糖型或 Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂糖型或其混合物的重组糖蛋白组合物。 美国专利号7,029,872和美国公开的专利申请号2006/0040353(它们 的公开内容都通过引用并入本文)公开了能够生产包含 Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂糖型的糖蛋白的低等真核生物宿主细胞。 可以在体外用半乳糖苷酶处理在上述细胞中生产的糖蛋白，以生产 包含GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂糖型的重组糖蛋白，例如优势地包含 GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂糖型的重组糖蛋白组合物。

在另一个实施方案中，上一段所述的宿主细胞另外包括与细胞 靶向信号肽融合的唾液酸基转移酶催化结构域，所述靶向信号肽通 常不与所述催化结构域结合，并选择成将唾液酸基转移酶活性靶向 宿主细胞的内质网或高尔基体。重组糖蛋白在宿主细胞的内质网或 高尔基体中的穿过，会生成优势地包含 NANA₂Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂糖型或 NANAGal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂糖型或其混合物的重组糖蛋白。就 低等真核生物宿主细胞(诸如酵母和丝状真菌)而言，有用的是， 所述宿主细胞另外包括，用于提供向所述N-聚糖转移的CMP-唾液 酸的装置。美国公开的专利申请号2005/0260729(它的公开内容通 过引用并入本文)公开了一种将低等真核生物遗传地工程改造成具 有CMP-唾液酸合成途径的方法，美国公开的专利申请号 2006/0286637(它的公开内容通过引用并入本文)公开了一种将低 等真核生物遗传地工程改造成生产唾液酸化的糖蛋白的方法。可以 在体外用神经氨酸酶处理在上述细胞中生产的糖蛋白，以生产优势 地包含Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂糖型或GalGlcNAc₂Man₃GlcNAc₂糖型或其混合物的重组糖蛋白。

任一种前述宿主细胞可以另外包括一种或多种选自GnT III、 GnT IV、GnT V、GnT VI和GnT IX的GlcNAc转移酶，以生产具 有二天线的(GnT III)和/或多天线的(GnT IV、V、VI和IX)N- 聚糖结构的糖蛋白，诸如在美国专利号7,598,055和美国公开的专 利申请号2007/0037248(它们的公开内容都通过引用并入本文)中 公开的N-聚糖结构。

在其它实施方案中，生产优势地具有GlcNAcMan₅GlcNAc₂N- 聚糖的糖蛋白的宿主细胞另外包括与细胞靶向信号肽融合的半乳 糖基转移酶催化结构域，所述靶向信号肽通常不与所述催化结构域 结合，并选择成将半乳糖基转移酶活性靶向宿主细胞的内质网或高 尔基体。重组糖蛋白在宿主细胞的内质网或高尔基体中的穿过，会 生成优势地包含GalGlcNAcMan₅GlcNAc₂糖型的重组糖蛋白。

在另一个实施方案中，上一段所述的生产优势地具有 GalGlcNAcMan₅GlcNAc₂N-聚糖的糖蛋白的宿主细胞另外包括与 细胞靶向信号肽融合的唾液酸基转移酶催化结构域，所述靶向信号 肽通常不与所述催化结构域结合，并选择成将唾液酸基转移酶活性 靶向宿主细胞的内质网或高尔基体。重组糖蛋白在宿主细胞的内质 网或高尔基体中的穿过，会生成包含 NANAGalGlcNAcMan₅GlcNAc₂糖型的重组糖蛋白。

在任一种前述宿主细胞的其它方面，所述宿主细胞被进一步修 饰成包括岩藻糖基转移酶和用于生产岩藻糖并将岩藻糖运输进内 质网或高尔基体中的途径。在公开的国际申请号WO 2008112092 (它的公开内容通过引用并入本文)中，公开了用于修饰巴氏毕赤 酵母以使它能够生产糖蛋白(其中在所述糖蛋白上的一种或多种 N-聚糖被岩藻糖基化)的方法的实例。在本发明的具体方面，所述 巴氏毕赤酵母宿主细胞被进一步修饰成包括岩藻糖基化途径，该途 径包含：GDP-甘露糖-4，6-脱水酶、GDP-酮-脱氧-甘露糖-差向异构 酶/GDP-酮-脱氧-半乳糖-还原酶、GDP-岩藻糖转运蛋白和岩藻糖基 转移酶。在具体方面，所述岩藻糖基转移酶选自：α1，2-岩藻糖基转 移酶、α1，3-岩藻糖基转移酶、α1，4-岩藻糖基转移酶和α1，6-岩藻糖 基转移酶。

不同的前述宿主细胞另外包括一种或多种糖转运蛋白，诸如 UDP-GlcNAc转运蛋白(例如，乳酸克鲁维酵母和小家鼠 UDP-GlcNAc转运蛋白)、UDP-半乳糖转运蛋白(例如，黑腹果蝇 UDP-半乳糖转运蛋白)和CMP-唾液酸运载体(例如，人唾液酸转 运蛋白)。因为诸如酵母和丝状真菌等低等真核生物宿主细胞缺少 上述转运蛋白，优选地，可以将诸如酵母和丝状真菌等低等真核生 物宿主细胞遗传地工程改造成包括上述转运蛋白。

宿主细胞另外包括这样的巴氏毕赤酵母：通过删除或破坏磷酸 甘露糖基转移酶基因PNO1和MNN4B中的一个或两个(参见例如， 美国专利号7,198,921和7,259,007；它们的公开内容都通过引用并 入本文)，将其遗传地工程改造，以消除具有磷酸甘露糖残基的糖 蛋白，在其它方面，也可以包括删除或破坏MNN4A基因。破坏包 括：破坏编码特定酶的开放读码框，或破坏所述开放读码框的表达， 或使用干扰RNA、反义RNA等废除编码一种或多种β-甘露糖基转 移酶和/或磷酸甘露糖基转移酶的RNA的翻译。所述宿主细胞可以 另外包括被修饰成生产特定N-聚糖结构的任一种前述宿主细胞。

宿主细胞另外包括如下遗传修饰成控制糖蛋白的O-糖基化的 低等真核生物细胞(例如，酵母诸如巴氏毕赤酵母)：通过删除或 破坏一种或多种蛋白O-甘露糖基转移酶(Dol-P-Man：蛋白(Ser/Thr) 甘露糖基转移酶基因)(PMT)(参见美国专利号5,714,377；它的 公开内容通过引用并入本文)，或如在公开的国际申请号WO 2007061631(它的公开内容通过引用并入本文)中所述，通过在有 Pmtp抑制剂和/或α1，2甘露糖苷酶存在下进行培养，或通过两种方 法。破坏包括：破坏编码Pmtp的开放读码框，或破坏所述开放读 码框的表达，或使用干扰RNA、反义RNA等废除编码一种或多种 Pmtp的RNA的翻译。所述宿主细胞可以另外包括被修饰成生产特 定N-聚糖结构的任一种前述宿主细胞。

Pmtp抑制剂包括、但不限于：亚苄基噻唑烷二酮。可以使用 的亚苄基噻唑烷二酮的实例是：5-[[3，4-双(苯基甲氧基)苯基]亚甲 基]-4-氧代-2-硫代-3-噻唑烷醋酸；5-[[3-(1-苯基乙氧基)-4-(2-苯基乙 氧基)]苯基]亚甲基]-4-氧代-2-硫代-3-噻唑烷醋酸；和5-[[3-(1-苯基 -2-羟基)乙氧基)-4-(2-苯基乙氧基)]苯基]亚甲基]-4-氧代-2-硫代-3-噻 唑烷醋酸。

在具体实施方案中，减少、破坏或删除至少一个内源PMT基 因的功能或表达。例如，在具体实施方案中，减少、破坏或删除选 自PMT1、PMT2、PMT3和PMT4基因的至少一个内源PMT基因 的功能或表达；或在有一种或多种PMT抑制剂存在下培养所述宿 主细胞。在其它实施方案中，所述宿主细胞包括一个或多个PMT 基因删除或破坏，且在有一种或多种Pmtp抑制剂存在下培养所述 宿主细胞。在这些实施方案的具体方面，所述宿主细胞也表达分泌 型α-1，2-甘露糖苷酶。

PMT删除或破坏和/或Pmtp抑制剂如下控制O-糖基化：通过 减少O-糖基化占据，也就是说，通过减少被糖基化的糖蛋白上的 O-糖基化位点的总数。由所述细胞分泌的α-1，2-甘露糖苷酶的进一 步添加，通过减小在糖蛋白上的O-聚糖的甘露糖链长度来控制O- 糖基化。因而，将PMT删除或破坏和/或Pmtp抑制剂与分泌型α-1，2- 甘露糖苷酶的表达相组合，会通过减少占据和链长度来控制O-糖基 化。在特定情况下，经验地确定PMT删除或破坏、Pmtp抑制剂和 α-1，2-甘露糖苷酶的特定组合，因为可以以不同的效率程度表达特 定异源糖蛋白(例如抗体)并运输穿过高尔基体，因而可能需要PMT 删除或破坏、Pmtp抑制剂和α-1，2-甘露糖苷酶的特定组合。在另一 个方面，删除编码一种或多种内源甘露糖基转移酶的基因。所述删 除可以与提供分泌型α-1，2-甘露糖苷酶和/或PMT抑制剂相组合， 或可以替代提供分泌型α-1，2-甘露糖苷酶和/或PMT抑制剂。

因而，O-糖基化的控制可以用于在本文所述的宿主细胞中以更 好的总产率生产特定糖蛋白，或生产适当地装配的糖蛋白。O-糖基 化的减少或消除似乎对糖蛋白(诸如完整抗体)的装配和运输具有 有益影响，因为它们横跨分泌途径，且被运输至细胞表面。因而， 在其中O-糖基化受到控制的细胞中，适当地装配的糖蛋白(诸如抗 体片段)的产率增加，超过在其中O-糖基化不受控制的宿主细胞中 得到的产率。

为了减少或消除具有β-连接的甘露糖残基的N-聚糖和O-聚糖 (其可耐受α-甘露糖苷酶)的可能性，通过删除或破坏一个或多个 β-甘露糖基转移酶基因(例如，BMT1、BMT2、BMT3和BMT4) (参见，美国专利号7,465,577和美国专利号7,713,719)，对重组 的糖工程改造的巴氏毕赤酵母宿主细胞进行遗传工程改造，以消除 具有α-甘露糖苷酶抗性的N-聚糖的糖蛋白。BMT2和一个或多个 BMT1、BMT3和BMT4的删除或破坏，也会减少或消除与针对宿 主细胞蛋白的抗体的可检测的交叉反应性。

在有些情况下，可以如下提高糖蛋白的产率：通过过表达编码 哺乳动物或人分子伴侣蛋白的核酸分子，或用编码一种或多种哺乳 动物或人分子伴侣蛋白的核酸分子替代编码一种或多种内源分子 伴侣蛋白的基因。另外，哺乳动物或人分子伴侣蛋白在宿主细胞中 的表达，似乎也控制所述细胞中的O-糖基化。因而，在本文中另外 包括这样的宿主细胞：其中已经减少或消除至少一个编码分子伴侣 蛋白的内源基因的功能，并在所述宿主细胞中表达编码所述分子伴 侣蛋白的至少一种哺乳动物或人同系物的载体。还包括这样的宿主 细胞：其中表达内源性的宿主细胞分子伴侣和哺乳动物或人分子伴 侣蛋白。在其它方面，所述低等真核宿主细胞是酵母或丝状真菌宿 主细胞。在公开的国际申请号WO 2009105357和WO2010019487 (它们的公开内容通过引用并入本文)中，已经公开了宿主细胞的 分子伴侣的应用实例，在所述宿主细胞中导入了人分子伴侣蛋白， 以提高产率并减少或控制重组蛋白的O-糖基化。象上面一样，另外 包括这样的低等真核宿主细胞：其中，除了用编码一种或多种哺乳 动物或人分子伴侣蛋白的核酸分子替代编码一种或多种内源分子 伴侣蛋白的基因或者如上所述过表达一种或多种哺乳动物或人分 子伴侣蛋白以外，减少、破坏或删除编码蛋白O-甘露糖基转移酶 (PMT)蛋白的至少一个内源基因的功能或表达。在具体实施方案 中，减少、破坏或删除选自PMT1、PMT2、PMT3和PMT4基因的 至少一个内源PMT基因的功能。

因此，本文公开的方法可以使用已经被遗传修饰成生产糖蛋白 的任意宿主细胞，其中所述优势N-聚糖选自：复杂型N-聚糖、杂 合型N-聚糖和高甘露糖型N-聚糖，其中复杂型N-聚糖可以选自： GlcNAc_(2-4)Man₃GlcNAc₂、Gal_(1-4)GlcNAc_(2-4)Man₃GlcNAc₂和 NANA_(1-4)Gal_(1-4)GlcNAc_(2-4)Man₃GlcNAc₂；杂合型N-聚糖可以选自： GlcNAcMan₃GlcNAc₂、GalGlcNAcMan₃GlcNAc₂、 NANAGalGlcNAcMan₃GlcNAc₂GlcNAcMan₅GlcNAc₂、 GalGlcNAcMan₅GlcNAc₂和NANAGalGlcNAcMan₅GlcNAc₂；高甘 露糖型N-聚糖可以选自：Man₅GlcNAc₂、Man₆GlcNAc₂、 Man₇GlcNAc₂、Man₈GlcNAc₂和Man₉GlcNAc₂。另外包括具有由 N-聚糖结构Man₃GlcNAc₂组成的N-聚糖的糖蛋白，例如，如在美 国公开的申请号20050170452中所示。

因此，提供了一种在低等真核生物宿主细胞中生产具有哺乳动 物或人样复杂型或杂合型N-聚糖的异源糖蛋白的方法，所述方法包 括：提供低等真核生物宿主细胞，所述宿主细胞被遗传地工程改造 成生产具有人样N-聚糖的糖蛋白，且包括编码异源单亚基寡糖基转 移酶的核酸分子和编码异源糖蛋白的核酸分子；和在用于表达所述 异源糖蛋白的条件下，培养所述宿主细胞，以生产所述异源糖蛋白。

在上述内容的另一个方面，提供了一种在酵母或丝状真菌宿主 细胞中生产具有哺乳动物或人样复杂型或杂合型N-聚糖的异源糖 蛋白的方法，所述方法包括：提供酵母或丝状真菌宿主细胞，所述 宿主细胞被遗传地工程改造成生产具有人样N-聚糖的糖蛋白，且包 括编码异源单亚基寡糖基转移酶的核酸分子和编码异源糖蛋白的 核酸分子；和在用于表达所述异源糖蛋白的条件下，培养所述宿主 细胞，以生产所述异源糖蛋白。

另外提供了被遗传地工程改造成生产具有哺乳动物或人样N- 聚糖的糖蛋白的酵母或丝状真菌宿主细胞，所述宿主细胞包含：编 码异源单亚基寡糖基转移酶的第一种核酸分子；和编码异源糖蛋白 的第二种核酸分子；且其中表达编码构成寡糖基转移酶(OTase) 复合物的蛋白的内源性宿主细胞基因。这包括内源STT3基因的表 达，所述基因在酵母中是STT3基因。

一般而言，在上述方法和宿主细胞中，所述单亚基寡糖基转移 酶能够在功能上抑制OTase复合物的至少一种必需蛋白的致死突 变表型。在其它方面，所述OTase复合物的必需蛋白由STT3基因 座、WBP1基因座、OST1基因座、SWP1基因座或OST2基因座或 它们的同系物编码。在其它方面，单亚基寡糖基转移酶的实例是硕 大利什曼原虫STT3D蛋白。

启动子是用于控制基因表达的DNA序列元件。具体地，启动 子指定转录起始位点，且可以包括TATA框和上游启动子元件。选 择的启动子是预期在选择的特定宿主系统中可工作的那些启动子。 例如，当诸如酿酒酵母、乳酸克鲁维酵母、Ogataea minuta或巴氏 毕赤酵母等酵母是宿主细胞时，使用酵母启动子，而真菌启动子则 用于诸如黑曲霉、粗糙链孢霉或里氏木霉等宿主细胞中。酵母启动 子的实例包括、但不限于：the GAPDH、AOX1、SEC4、HH1、PMA1、 OCH1、GAL1、PGK、GAP、TPI、CYC1、ADH2、PHO5、CUP1、 MFα1、FLD1、PMA1、PDI、TEF、RPL10和GUT1启动子。Romanos 等人，Yeast 8：423-488(1992)提供了酵母启动子和表达载体的综 述。Hartner等人，Nucl.Acid Res.36：e76(2008年6月6日在线出 版)描述了用于精细调节异源蛋白在巴氏毕赤酵母中的表达的启动 子文库。

可操作地连接至本文公开的核酸分子上的启动子可以是组成 型启动子或诱导型启动子。诱导型启动子，例如AOX1启动子，是 在转录因子结合以后响应于诱导物而指导在增加或降低的速率的 转录的启动子。本文使用的转录因子包括，可以结合以调节或控制 启动子区域并从而影响转录的任何因子。通过使宿主暴露于诱导物 或从宿主细胞培养基中去除诱导物，可以控制宿主细胞内的RNA 合成或转录因子的启动子结合能力。因此，为了调节诱导型启动子 的表达，向宿主细胞的生长培养基中加入诱导物，或从其中去除诱 导物。这样的诱导物可以包括：糖、磷酸盐、醇、金属离子、激素、 热、冷等。例如，在酵母中常用的诱导物是葡萄糖、半乳糖、醇等。

选择的转录终止序列是在选择的特定宿主细胞中可工作的那 些。例如，当酵母宿主细胞(诸如酿酒酵母、乳酸克鲁维酵母或巴 氏毕赤酵母)是宿主细胞时，在表达载体中使用酵母转录终止序列， 而真菌转录终止序列用于诸如黑曲霉、粗糙链孢霉或里氏木霉等宿 主细胞中。转录终止序列包括、但不限于：酿酒酵母CYC转录终止 序列(ScCYC TT)、巴氏毕赤酵母ALG3转录终止序列(ALG3TT)、 巴氏毕赤酵母ALG6转录终止序列(ALG6TT)、巴氏毕赤酵母 ALG12转录终止序列(ALG12TT)、巴氏毕赤酵母AOX1转录终 止序列(AOX1TT)、巴氏毕赤酵母OCH1转录终止序列(OCH1TT) 和巴氏毕赤酵母PMA1转录终止序列(PMA1TT)。其它转录终止 序列可以参见实施例和相关技术。

为了遗传地工程改造酵母，可以用于构建重组宿主细胞的选择 标记包括抗药性标记和遗传功能，所述遗传功能允许酵母宿主细胞 合成必需的细胞营养物，例如氨基酸。在酵母中常用的抗药性标记 包括氯霉素、卡那霉素、甲氨蝶呤、G418(遗传霉素)、Zeocin等。 允许酵母宿主细胞合成必需的细胞营养物的遗传功能，与在对应的 基因组功能中具有营养缺陷型突变的可用酵母菌株一起使用。常见 的酵母选择标记会提供用于合成亮氨酸(LEU2)、色氨酸(TRP1 和TRP2)、脯氨酸(PRO1)、尿嘧啶(URA3、URA5、URA6)、 组氨酸(HIS3)、赖氨酸(LYS2)、腺嘌呤(ADE1或ADE2)等 的遗传功能。其它酵母选择标记包括：来自酿酒酵母的ARR3基因， 其给在有亚砷酸盐存在下生长的酵母细胞赋予亚砷酸盐抗性 (Bobrowicz等人，Yeast，13：819-828(1997)；Wysocki等人，J.Biol. Chem.272：30061-30066(1997))。许多合适的整合位点包括在美 国专利号7,479,389(它的公开内容通过引用并入本文)中列举的那 些，且包括酿酒酵母和其它酵母或真菌的已知基因座的同系物。用 于将载体整合进酵母中的方法是众所周知的(参见例如，美国专利 号7,479,389、美国专利号7,514,253、美国公开的申请号2009012400 和WO2009/085135；它们的公开内容都通过引用并入本文)。插入 位点的实例包括、但不限于：毕赤酵母ADE基因；毕赤酵母TRP (包括TRP1至TRP2)基因；毕赤酵母MCA基因；毕赤酵母CYM 基因；毕赤酵母PEP基因；毕赤酵母PRB基因；和毕赤酵母LEU 基因。毕赤酵母ADE1和ARG4基因已经描述在Lin Cereghino等人， Gene 263：159-169(2001)和美国专利号4,818,700(它的公开内容 通过引用并入本文)中，HIS3和TRP1基因已经描述在Cosano等 人，Yeast 14：861-867(1998)中，HIS4已经描述在GenBank登记 号X56180中。

本文公开的方法可以被改造用于哺乳动物、植物和昆虫细胞 中。动物细胞的实例包括、但不限于：SC-I细胞、LLC-MK细胞、 CV-I细胞、CHO细胞、COS细胞、鼠细胞、人细胞、HeLa细胞、 293细胞、VERO细胞、MDBK细胞、MDCK细胞、MDOK细胞、 CRFK细胞、RAF细胞、TCMK细胞、LLC-PK细胞、PK15细胞、 WI-38细胞、MRC-5细胞、T-FLY细胞、BHK细胞、SP2/0、NSO 细胞和它们的衍生物。昆虫细胞包括黑腹果蝇起源的细胞。可以遗 传地工程改造这些细胞，以使所述细胞能够生产具有特定N-聚糖或 优势地具有特定N-聚糖的免疫球蛋白。例如，美国专利号6,949,372 公开了在昆虫细胞中生产唾液酸化的糖蛋白的方法。 Yamane-Ohnuki等人Biotechnol.Bioeng.87：614-622(2004)、Kanda 等人，Biotechnol.Bioeng.94：680-688(2006)、Kanda等人，Glycobiol. 17：104-118(2006)和美国公开的申请号2005/0216958和 2007/0020260(它们的公开内容通过引用并入本文)公开了能够生 产免疫球蛋白的哺乳动物细胞，其中在所述免疫球蛋白上的N-聚糖 缺少岩藻糖或具有减少的岩藻糖。美国公开的专利申请号 2005/0074843(它的公开内容通过引用并入本文)公开了在哺乳动 物细胞中制备具有二天线的N-聚糖的抗体。

应当针对在选定的细胞类型中的功能性，选择为了调节表达盒 在哺乳动物、昆虫或植物细胞中的表达所选的可调节的启动子。合 适的可调节的启动子的实例包括、但不限于：四环素可调节的启动 子(参见例如，Berens和Hillen，Eur.J.Biochem.270：3109-3121 (2003))，RU 486可诱导的启动子、蜕皮激素可诱导的启动子和 卡那霉素可调节的系统。这些启动子可以替代在实施例所述的表达 盒中例证的启动子。可以使捕获部分与适合用于选定的细胞类型中 的细胞表面锚定蛋白相融合。对于哺乳动物、昆虫和植物细胞而言， 众所周知包括GPI蛋白在内的细胞表面锚定蛋白。Kennard等人， Methods Biotechnol.Vo.8：Animal Cell Biotechnology (Jenkins编. Human Press，Inc.，Totowa，NJ)第187-200页(1999)已经描述了锚定 GPI的融合蛋白。用于将表达盒整合进宿主细胞基因组中以制备稳 定重组体的基因组靶向序列，可以替代在实施例中例证的基因组靶 向和整合序列。用于制备稳定的和短暂转染的哺乳动物、昆虫和植 物宿主细胞的转染方法，是本领域众所周知的。在已经如本文所述 构建出转染的宿主细胞以后，可以针对目标免疫球蛋白的表达来筛 选所述细胞，并如本文所述进行选择。

因此，在上述内容的另一个方面，提供了一种在哺乳动物或昆 虫宿主细胞中生产异源糖蛋白的方法，所述方法包括：提供哺乳动 物或昆虫宿主细胞，所述宿主细胞包括编码异源单亚基寡糖基转移 酶(例如，硕大利什曼原虫STT3蛋白)的核酸分子和编码异源糖 蛋白的核酸分子；和在用于表达所述异源糖蛋白的条件下，培养所 述宿主细胞，以生产所述异源糖蛋白。在其它方面，所述宿主细胞 被遗传地工程改造成生产糖蛋白，所述糖蛋白具有人样N-聚糖或对 于所述宿主细胞而言通常不是内源性的N-聚糖。

在上述内容的另一个方面，提供了一种在哺乳动物或昆虫宿主 细胞中生产异源糖蛋白的方法，其中所述异源糖蛋白的N-糖基化位 点占据大于83％，所述方法包括：提供哺乳动物或昆虫宿主细胞， 所述宿主细胞包括编码异源单亚基寡糖基转移酶(例如，硕大利什 曼原虫STT3蛋白)的核酸分子和编码异源糖蛋白的核酸分子；和 在用于表达所述异源糖蛋白的条件下，培养所述宿主细胞，以生产 所述异源糖蛋白，其中所述异源糖蛋白的N-糖基化位点占据大于 83％。在其它方面，所述宿主细胞被遗传地工程改造成生产糖蛋白， 所述糖蛋白具有人样N-聚糖或对于所述宿主细胞而言通常不是内 源性的N-聚糖。

在上述方法的另一个实施方案中，表达编码构成寡糖基转移酶 (OTase)复合物的蛋白的内源性宿主细胞基因。

在上述方法的具体实施方案中，所述N-糖基化位点占据是至少 94％。在其它实施方案中，所述N-糖基化位点占据是至少99％。

另外提供了哺乳动物或昆虫宿主细胞，所述宿主细胞包含：编 码异源单亚基寡糖基转移酶(例如，硕大利什曼原虫STT3D蛋白) 的第一种核酸分子；和编码异源糖蛋白的第二种核酸分子；且其中 表达编码构成内源性的宿主细胞寡糖基转移酶(OTase)复合物的 蛋白的内源性宿主细胞基因。

在具体实施方案中，所述高等真核生物细胞、组织或生物体还 可以来自植物界，例如，小麦、稻、玉米、烟草等。或者，可以选 择苔藓植物细胞，例如来自立碗藓属(Physcomitrella)、葫芦藓属 (Funaria)、水藓属(Sphagnum)、角齿藓属(Ceratodon)、地 钱属(Marchantia)和Sphaerocarpos属的物种。示例性的植物细胞 是小立碗藓的苔藓植物细胞，其已经公开在WO 2004/057002和 WO2008/006554(它们的公开内容都通过引用并入本文)中。可以 进一步操作使用植物细胞的表达系统，以具有改变的糖基化途径， 使所述细胞能够生产优势地具有特定N-聚糖的免疫球蛋白。例如， 可以遗传地工程改造所述细胞，以具有功能障碍性的或不具有核心 岩藻糖基转移酶、和/或具有功能障碍性的或不具有木糖基转移酶、 和/或具有功能障碍性的或不具有β1，4-半乳糖基转移酶。或者，可 以如下从免疫球蛋白中去除半乳糖、岩藻糖和/或木糖：通过用去除 所述残基的酶处理。可以使用本领域已知的导致半乳糖、岩藻糖和 /或木糖残基从N-聚糖释放出的任意酶，例如α-半乳糖苷酶、β-木 糖苷酶和α-岩藻糖苷酶。或者，可以使用这样的表达系统：其合成 修饰的N-聚糖，所述N-聚糖不可被1，3-岩藻糖基转移酶和/或1，2- 木糖基转移酶和/或1，4-半乳糖基转移酶用作底物。用于修饰植物细 胞中的糖基化途径的方法公开在美国专利号7,449,308、6,998,267 和7,388,081(它们的公开内容通过引用并入本文)中，它们公开了 遗传地工程改造植物以生产具有人样N-聚糖的重组糖蛋白的方法。 WO 2008006554(它的公开内容通过引用并入本文)公开了在植物 中生产糖蛋白(诸如抗体)的方法，所述植物被遗传地工程改造成 生产没有木糖或岩藻糖的糖蛋白。WO 2007006570(它的公开内容 通过引用并入本文)公开了遗传地工程改造苔藓植物、纤毛虫、藻 类和酵母以生产具有动物或人样糖基化模式的糖蛋白的方法。

因此，在上述内容的另一个方面，提供了一种在植物宿主细胞 中生产具有哺乳动物或人样复杂型或杂合型N-聚糖的异源糖蛋白 的方法，所述方法包括：提供植物宿主细胞，所述宿主细胞被遗传 地工程改造成生产具有哺乳动物或人样N-聚糖的糖蛋白，且包括编 码异源单亚基寡糖基转移酶(例如，硕大利什曼原虫STT3D蛋白) 的核酸分子和编码异源糖蛋白的核酸分子；和在用于表达所述异源 糖蛋白的条件下，培养所述宿主细胞，以生产所述异源糖蛋白。

在上述内容的另一个方面，提供了一种在植物宿主细胞中生产 具有哺乳动物或人样复杂型或杂合型N-聚糖的异源糖蛋白的方法， 其中所述异源糖蛋白的N-糖基化位点占据大于83％，所述方法包 括：提供植物宿主细胞，所述宿主细胞被遗传地工程改造成生产具 有哺乳动物或人样N-聚糖的糖蛋白，且包括编码异源单亚基寡糖基 转移酶(例如，硕大利什曼原虫STT3D蛋白)的核酸分子和编码 异源糖蛋白的核酸分子；和在用于表达所述异源糖蛋白的条件下， 培养所述宿主细胞，以生产具有哺乳动物或人样N-聚糖的异源糖蛋 白，其中所述异源糖蛋白的N-糖基化位点占据大于83％。

在上述方法的另一个实施方案中，表达编码构成内源性的宿主 细胞寡糖基转移酶(OTase)复合物的蛋白的内源性宿主细胞基因。

在上述方法的具体实施方案中，所述N-糖基化位点占据是至少 94％。在其它实施方案中，所述N-糖基化位点占据是至少99％。

另外提供了一种植物宿主细胞，所述宿主细胞包含：编码异源 单亚基寡糖基转移酶(例如，硕大利什曼原虫STT3D蛋白)的第 一种核酸分子；和编码异源糖蛋白的第二种核酸分子；且其中表达 编码构成内源性的宿主细胞寡糖基转移酶(OTase)复合物的蛋白 的内源性宿主细胞基因。

本文的宿主细胞和方法可用于生产宽范围的重组蛋白和糖蛋 白。可以在本文所述的宿主细胞中生产的重组蛋白和糖蛋白的实例 包括、但不限于：促红细胞生成素(EPO)；细胞因子诸如干扰素 α、干扰素β、干扰素γ和干扰素ω；和粒细胞-集落刺激因子(GCSF)； 粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)；凝血因子诸如因子 VIII、因子IX和人蛋白C；抗凝血酶III；凝血酶；可溶性的IgE 受体α-链；免疫球蛋白或抗体诸如IgG、IgG片段、IgG融合体和 IgM；免疫粘附素和其它Fc融合蛋白诸如可溶性的TNF受体-Fc 融合蛋白；RAGE-Fc融合蛋白；白介素；尿激酶；胰凝乳蛋白酶； 尿素胰蛋白酶抑制剂；IGF结合蛋白；表皮生长因子；生长激素释 放因子；膜联蛋白V融合蛋白；血管生成抑制因子；血管内皮生长 因子-2；骨髓前体抑制因子-1；骨保护素；α-1-抗胰蛋白酶；甲胎蛋 白；DNA酶II；人纤溶酶原的环状结构区3；葡糖脑苷脂酶；TNF 结合蛋白1；滤泡刺激激素；细胞毒性的T淋巴细胞相关抗原4-Ig； 跨膜活化剂和钙调节剂和亲环蛋白配体；胰高血糖素样蛋白1；和 IL-2受体激动剂。

在希望提供抗体或Fc融合蛋白组合物的情况下，本文公开的 重组宿主细胞和方法具体地可用于生产抗体、Fc融合蛋白等，其中 与如本文教导地进行修饰之前在宿主细胞中可得到的半乳糖百分 比相比，含有半乳糖的N-聚糖的百分比增加。在本文的宿主细胞中 可以生产的抗体的实例包括、但不限于：人抗体、人源化抗体、嵌 合抗体、重链抗体(例如，骆驼或骆马)。具体的抗体包括、但不 限于在它们的通用名(靶标)下列举的下述抗体：莫罗单抗-CD3 (抗-CD3受体抗体)、阿昔单抗(抗-CD417E3抗体)、利妥昔单 抗(抗-CD20抗体)、达珠单抗(抗-CD25抗体)、巴利昔单抗(抗 -CD25抗体)、帕利珠单抗(抗-RSV(呼吸道合胞病毒)抗体)、 英夫利昔单抗(抗-TNFα抗体)、曲妥单抗(抗-Her2抗体)、吉 姆单抗奥佐米星(抗-CD33抗体)、阿仑珠单抗(抗-CD52抗体)、 替伊莫单抗(抗-CD20抗体)、阿达木单抗(抗-TNFα抗体)、奥 马珠单抗(抗-IgE抗体)、托西莫单抗-¹³¹I(抗-CD20抗体的碘化 衍生物)、依法珠单抗(抗-CD11a抗体)、西妥昔单抗(抗-EGF 受体抗体)、戈利木单抗(抗-TNFα抗体)、贝伐单抗(抗-VEGF-A 抗体)和它们的变体。在本文所述的宿主细胞中可以生产的Fc-融 合蛋白的实例包括、但不限于：依那西普(TNFR-Fc融合蛋白)、 FGF-21-Fc融合蛋白、GLP-1-Fc融合蛋白、RAGE-Fc融合蛋白、 EPO-Fc融合蛋白、ActRIIA-Fc融合蛋白、ActRIIB-Fc融合蛋白、 胰高血糖素-Fc融合体、oxyntomodulin-Fc-融合体和它们的类似物 和变体。

因而，本文的方法和宿主细胞可以用于生产这样的糖蛋白组合 物：其中在所述组合物中的糖蛋白的至少70％、75％、80％、85％、 90％、95％、98％或99％的N-糖基化位点被占据，且所述糖蛋白具 有哺乳动物或人样N-聚糖。

另外，本文的方法和宿主细胞可以用于生产这样的糖蛋白组合 物：其中在所述组合物中的糖蛋白的至少70％、75％、80％、85％、 90％、95％、98％或99％的N-糖基化位点被占据，且所述糖蛋白具 有缺少岩藻糖的哺乳动物或人样N-聚糖。

另外，方法和酵母或丝状真菌宿主细胞遗传地工程改造成生产 哺乳动物样或人样N-聚糖可以用于生产这样的糖蛋白组合物：其中 在所述组合物中的糖蛋白的至少70％、75％、80％、85％、90％、 95％、98％或99％的N-糖基化位点被占据，且所述糖蛋白具有缺少 岩藻糖的哺乳动物或人样N-聚糖。

在有些方面，所述被遗传地工程改造成生产岩藻糖基化的哺乳 动物或人样N-聚糖的酵母或丝状宿主细胞可以用于生产这样的糖 蛋白组合物：其中在所述组合物中的糖蛋白的至少70％、75％、 80％、85％、90％、95％、98％或99％的N-糖基化位点被占据，且 所述糖蛋白具有含有岩藻糖的哺乳动物或人样N-聚糖。

本文公开的重组细胞可以用于生产适合与异源肽或药物分子 化学缀合的抗体和Fc片段。例如，WO2005047334、WO2005047336、 WO2005047337和WO2006107124(它们的公开内容通过引用并入 本文)公开了将肽或药物分子与Fc片段化学缀合。EP1180121、 EP1105409和US 6,593,295(它们的公开内容通过引用并入本文) 公开了将肽等与血液组分(包括完整抗体)化学缀合。

因而，本文的方法和宿主细胞可以用于生产这样的抗体组合 物：在所述组合物中的至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、 98％或99％的抗体分子具有被占据的2个N-糖基化位点，且所述抗 体具有哺乳动物或人样N-聚糖。

另外，本文的方法和宿主细胞可以用于生产这样的抗体组合 物：在所述组合物中的至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、 98％或99％的抗体分子具有被占据的2个N-糖基化位点，且所述抗 体具有缺少岩藻糖的哺乳动物或人样N-聚糖。

另外，方法和酵母或丝状真菌宿主细胞遗传地工程改造成生产 哺乳动物样或人样N-聚糖可以用于生产这样的抗体组合物：在所述 组合物中的至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％ 的抗体分子具有被占据的2个N-糖基化位点，且所述抗体具有缺少 岩藻糖的哺乳动物或人样N-聚糖。

在有些方面，所述被遗传地工程改造成生产岩藻糖基化的哺乳 动物或人样N-聚糖的酵母或丝状宿主细胞可以用于生产这样的抗 体组合物：在所述组合物中的至少70％、75％、80％、85％、90％、 95％、98％或99％的抗体分子具有被占据的2个N-糖基化位点，且 所述抗体具有含有岩藻糖的哺乳动物或人样N-聚糖。

如在实施例3中所证实的，在巴氏毕赤酵母菌株(其已经被遗 传地工程改造成生产以半乳糖结尾的N-聚糖)中生产的抗体的N- 糖基化组成似乎含有约50-60摩尔％G0、18-24摩尔％G1、3-8％摩 尔％G2、12-17摩尔％Man₅和3-6摩尔％杂合物。

因此，提供了一种包含多种抗体和药学上可接受的载体的糖蛋 白组合物，其中在所述组合物中的至少70％的抗体分子具有被占据 的2个N-糖基化位点，且约50-70摩尔％的N-聚糖具有G0结构， 15-25摩尔％的N-聚糖具有G1结构，4-12摩尔％的N-聚糖具有G2 结构，5-17摩尔％的N-聚糖具有Man₅结构，且5-15摩尔％的N- 聚糖具有杂合型结构。另外提供了一种包含多种抗体和药学上可接 受的载体的糖蛋白组合物，其中在所述组合物中的至少70％的抗体 分子具有被占据的2个N-糖基化位点，且约53-58摩尔％的N-聚糖 具有G0结构，20-22摩尔％的N-聚糖具有G1结构，且约16-18摩 尔％的N-聚糖包含Man₅GlcNAc₂核心结构。在上述内容的其它方 面，所述N-聚糖另外包括岩藻糖。

因此，提供了一种包含多种抗体和药学上可接受的载体的糖蛋 白组合物，其中在所述组合物中的至少75％的抗体分子具有被占据 的2个N-糖基化位点，且约50-70摩尔％的N-聚糖具有G0结构， 15-25摩尔％的N-聚糖具有G1结构，4-12摩尔％的N-聚糖具有G2 结构，5-17摩尔％的N-聚糖具有Man₅结构，且5-15摩尔％的N- 聚糖具有杂合型结构。另外提供了一种包含多种抗体和药学上可接 受的载体的糖蛋白组合物，其中在所述组合物中的至少75％的抗体 分子具有被占据的2个N-糖基化位点，且约53-58摩尔％的N-聚糖 具有G0结构，20-22摩尔％的N-聚糖具有G1结构，且约16-18摩 尔％的N-聚糖包含Man₅GlcNAc₂核心结构。在上述内容的其它方 面，所述N-聚糖另外包括岩藻糖。

另外，提供了一种包含多种抗体和药学上可接受的载体的糖蛋 白组合物，其中在所述组合物中的至少80％的抗体分子具有被占据 的2个N-糖基化位点，且约50-70摩尔％的N-聚糖具有G0结构， 15-25摩尔％的N-聚糖具有G1结构，4-12摩尔％的N-聚糖具有G2 结构，5-17摩尔％的N-聚糖具有Man₅结构，且5-15摩尔％的N- 聚糖具有杂合型结构。另外提供了一种包含多种抗体和药学上可接 受的载体的糖蛋白组合物，其中在所述组合物中的至少80％的抗体 分子具有被占据的2个N-糖基化位点，且约53-58摩尔％的N-聚糖 具有G0结构，20-22摩尔％的N-聚糖具有G1结构，且约16-18摩 尔％的N-聚糖包含Man₅GlcNAc₂核心结构。在上述内容的其它方 面，所述N-聚糖另外包括岩藻糖。

因此，提供了一种包含多种抗体和药学上可接受的载体的糖蛋 白组合物，其中在所述组合物中的至少85％的抗体分子具有被占据 的2个N-糖基化位点，且约50-70摩尔％的N-聚糖具有G0结构， 15-25摩尔％的N-聚糖具有G1结构，4-12摩尔％的N-聚糖具有G2 结构，5-17摩尔％的N-聚糖具有Man₅结构，且5-15摩尔％的N- 聚糖具有杂合型结构。另外提供了一种包含多种抗体和药学上可接 受的载体的糖蛋白组合物，其中在所述组合物中的至少85％的抗体 分子具有被占据的2个N-糖基化位点，且约53-58摩尔％的N-聚糖 具有G0结构，20-22摩尔％的N-聚糖具有G1结构，且约16-18摩 尔％的N-聚糖包含Man₅GlcNAc₂核心结构。在上述内容的其它方 面，所述N-聚糖另外包括岩藻糖。

另外，提供了一种包含多种抗体和药学上可接受的载体的糖蛋 白组合物，其中在所述组合物中的至少90％的抗体分子具有被占据 的2个N-糖基化位点，且约50-70摩尔％的N-聚糖具有G0结构， 15-25摩尔％的N-聚糖具有G1结构，4-12摩尔％的N-聚糖具有G2 结构，5-17摩尔％的N-聚糖具有Man₅结构，且5-15摩尔％的N- 聚糖具有杂合型结构。另外提供了一种包含多种抗体和药学上可接 受的载体的糖蛋白组合物，其中在所述组合物中的至少90％的抗体 分子具有被占据的2个N-糖基化位点，且约53-58摩尔％的N-聚糖 具有G0结构，20-22摩尔％的N-聚糖具有G1结构，且约16-18摩 尔％的N-聚糖包含Man₅GlcNAc₂核心结构。在上述内容的其它方 面，所述N-聚糖另外包括岩藻糖。

因此，提供了一种包含多种抗体和药学上可接受的载体的糖蛋 白组合物，其中在所述组合物中的至少95％的抗体分子具有被占据 的2个N-糖基化位点，且约50-70摩尔％的N-聚糖具有G0结构， 15-25摩尔％的N-聚糖具有G1结构，4-12摩尔％的N-聚糖具有G2 结构，5-17摩尔％的N-聚糖具有Man₅结构，且5-15摩尔％的N- 聚糖具有杂合型结构。另外提供了一种包含多种抗体和药学上可接 受的载体的糖蛋白组合物，其中在所述组合物中的至少95％的抗体 分子具有被占据的2个N-糖基化位点，且约53-58摩尔％的N-聚糖 具有G0结构，20-22摩尔％的N-聚糖具有G1结构，且约16-18摩 尔％的N-聚糖包含Man₅GlcNAc₂核心结构。在上述内容的其它方 面，所述N-聚糖另外包括岩藻糖。

另外，提供了一种包含多种抗体和药学上可接受的载体的糖蛋 白组合物，其中在所述组合物中的至少98％的抗体分子具有被占据 的2个N-糖基化位点，且约50-70摩尔％的N-聚糖具有G0结构， 15-25摩尔％的N-聚糖具有G1结构，4-12摩尔％的N-聚糖具有G2 结构，5-17摩尔％的N-聚糖具有Man₅结构，且5-15摩尔％的N- 聚糖具有杂合型结构。另外提供了一种包含多种抗体和药学上可接 受的载体的糖蛋白组合物，其中在所述组合物中的至少98％的抗体 分子具有被占据的2个N-糖基化位点，且约53-58摩尔％的N-聚糖 具有G0结构，20-22摩尔％的N-聚糖具有G1结构，且约16-18摩 尔％的N-聚糖包含Man₅GlcNAc₂核心结构。在上述内容的其它方 面，所述N-聚糖另外包括岩藻糖。

因此，提供了一种包含多种抗体和药学上可接受的载体的糖蛋 白组合物，其中在所述组合物中的至少99％的抗体分子具有被占据 的2个N-糖基化位点，且约50-70摩尔％的N-聚糖具有G0结构， 15-25摩尔％的N-聚糖具有G1结构，4-12摩尔％的N-聚糖具有G2 结构，5-17摩尔％的N-聚糖具有Man₅结构，且5-15摩尔％的N- 聚糖具有杂合型结构。另外提供了一种包含多种抗体和药学上可接 受的载体的糖蛋白组合物，其中在所述组合物中的至少99％的抗体 分子具有被占据的2个N-糖基化位点，且约53-58摩尔％的N-聚糖 具有G0结构，20-22摩尔％的N-聚糖具有G1结构，且约16-18摩 尔％的N-聚糖包含Man₅GlcNAc₂核心结构。在上述内容的其它方 面，所述N-聚糖另外包括岩藻糖。

在具体实施方案中，所述抗体包含选自下述的抗体：抗-Her2 抗体、抗-RSV(呼吸道合胞病毒)抗体、抗-TNFα抗体、抗-VEGF 抗体、抗-CD3受体抗体、抗-CD417E3抗体、抗-CD25抗体、抗-CD52 抗体、抗-CD33抗体、抗-IgE抗体、抗-CD11a抗体、抗-EGF受体 抗体和抗-CD20抗体。

在本文中参考或提及的所有专利和出版物都指示本发明所属 领域的技术人员的技术水平，每篇这样的参考的专利或出版物通过 引用并入本文，达到与下述相同的程度：如同单个地通过引用整体 并入，或在本文中完整地阐述。

下述的实施例意图促进对本发明的进一步理解。

实施例1

如下构建包含表达盒的质粒，所述表达盒编码硕大利什曼原虫 STT3D(LmSTT3D)开放读码框(ORF)，所述ORF可操作地连 接至诱导型或组成型启动子上。

为在巴氏毕赤酵母中的最佳表达，对编码LmSTT3D(SEQ ID  NO：12)的开放读码框进行密码子优化，并由德国勃兰登堡 (Brandenburg，Germany)的GeneArt AG进行合成。所述编码 LmSTT3D的密码子优化的核酸分子被命名为pGLY6287，且具有在 SEQ ID NO：11中所示的核苷酸序列。

质粒pGLY6301(图2)是一种滚入整合质粒，其靶向在巴氏 毕赤酵母中的URA6基因座。编码LmSTT3D的表达盒包含编码 LmSTT3D ORF(其为在巴氏毕赤酵母中的有效表达进行了密码子 优化)的核酸分子，所述核酸分子在5′末端处可操作地连接至具有 诱导型巴氏毕赤酵母AOX1启动子序列(SEQ ID NO：23)的核酸分 子上，且在3′末端处可操作地连接至具有酿酒酵母CYC转录终止序 列(SEQ ID NO：24)的核酸分子上。为了选择转化体，所述质粒包 含编码酿酒酵母ARR3ORF的表达盒，其中编码所述ORF(SEQ ID  NO：32)的核酸分子在5′末端处可操作地连接至具有巴氏毕赤酵母 RPL10启动子序列(SEQ ID NO：25)的核酸分子上，且在3′末端处 可操作地连接至具有酿酒酵母CYC转录终止序列(SEQ ID NO：24) 的核酸分子上。所述质粒另外包括用于靶向URA6基因座(SEQ ID  NO：33)的核酸分子。如下构建质粒pGLY6301：将编码密码子优 化的LmSTT3D ORF的DNA片段(pGLY6287)克隆进已经用EcoRI 和FseI消化的质粒pGFI30t中，所述ORF在5′末端处侧接EcoRI 位点且在3′末端处侧接FseI位点。

质粒pGLY6294(图3)是一种KINKO整合载体，其靶向在巴 氏毕赤酵母中的TRP1基因座，而不破坏该基因座的表达。KINKO (几乎没有或没有敲除的敲入)整合载体能够将异源DNA插入靶 向的基因座中且不破坏在靶向的基因座处的基因的表达，其已经描 述在美国公开的申请号20090124000中。编码LmSTT3D的表达盒 包含编码LmSTT3D ORF的核酸分子，所述核酸分子在5′末端处可 操作地连接至具有组成型巴氏毕赤酵母GAPDH启动子序列(SEQ  ID NO：26)的核酸分子上，且在3′末端处可操作地连接至具有酿酒 酵母CYC转录终止序列(SEQ ID NO：24)的核酸分子上。为了选 择转化体，所述质粒包含编码诺尔丝菌素抗性(NAT^R)ORF(源 自pAG25，所述pAG25来自EROSCARF，Scientific Research and  Development GmbH，Daimlerstrasse 13a，D-61352Bad Homburg， 德国，参见Goldstein等人，Yeast 15：1541(1999))的表达盒；其 中编码所述ORF(SEQ ID NO：34)的核酸分子在5′末端处可操作 地连接至具有Ashbya gossypii TEF1启动子序列(SEQ ID NO：86) 的核酸分子上，且在3′末端处可操作地连接至具有Ashbya gossypii  TEF1终止序列(SEQ ID NO：87)的核酸分子上。所述2个表达盒 在一侧侧接包含来自编码Trp1p的ORF的5′区域的核苷酸序列(其 以终止密码子结尾)(SEQ ID NO：30)的核酸分子，所述核酸分子 与具有巴氏毕赤酵母ALG3终止序列(SEQ ID NO：29)的核酸分子 相连，且在另一侧侧接包含来自TRP1基因的3′区域的核苷酸序列 (SEQ ID NO：31)的核酸分子。如下构建质粒pGLY6294：将编码 密码子优化的LmSTT3D ORF的DNA片段(pGLY6287)克隆进已 经用NotI和FseI消化的质粒pGLY597中，所述ORF在5′末端处 侧接NotI位点且在3′末端处侧接PacI位点。表达盒包含编码诺尔 丝菌素抗性ORF(NAT)的核酸分子，所述ORF可操作地连接至 Ashbya gossypii TEF1启动子(PTEF)和Ashbya gossypii TEF1终止 序列(TTEF)。

上述质粒可以用于将LmSTT3D表达盒导入巴氏毕赤酵母中， 以增加在其中生产的糖蛋白的N-糖基化位点占据，如在下述实施例 中所示。

实施例2

遗传地工程改造的巴氏毕赤酵母菌株YGLY13992是一种生产 重组人抗-Her2抗体的菌株，巴氏毕赤酵母菌株YGLY14401是一种 生产重组人抗-RSV抗体的菌株。在图1A-1H中示意地解释了所述 菌株的构建。简而言之，如下构建所述菌株。

使用以前描述的方法(参见例如，美国专利号7,449,308；美国 专利号7,479,389；美国公开的申请号20090124000；Published PCT 申请号WO2009085135；Nett和Gerngross，Yeast 20：1279(2003)； Choi等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100：5022(2003)；Hamilton 等人，Science 301：1244(2003))，从野生型巴氏毕赤酵母菌株 NRRL-Y 11430构建菌株YGLY8316。使用标准的分子生物学规程， 在pUC19质粒中制备所有质粒。对于为在巴氏毕赤酵母中的表达而 优化的核苷酸序列，通过GENEOPTIMIZER软件(GeneArt， Regensburg，德国)来分析天然核苷酸序列，并将结果用于产生为 巴氏毕赤酵母表达而优化密码子的核苷酸序列。通过电穿孔(使用 电穿孔仪BioRad的生产商推荐的标准技术)，转化酵母菌株。

质粒pGLY6(图4)是一种整合载体，其靶向URA5基因座。 它含有包含酿酒酵母转化酶基因或转录单元(ScSUC2；SEQ ID  NO：38)的核酸分子，所述核酸分子在一侧侧接包含来自巴氏毕赤 酵母URA5基因的5′区域的核苷酸序列(SEQ ID NO：39)的核酸分 子，且在另一侧侧接包含来自巴氏毕赤酵母URA5基因的3′区域的 核苷酸序列(SEQ ID NO：40)的核酸分子。将质粒pGLY6线性化， 并将所述线性化的质粒转化进野生型菌株NRRL-Y 11430中，以生 产许多这样的菌株：其中所述ScSUC2基因通过双交换同源重组而 插入URA5基因座中。从生产的菌株中选出菌株YGLY1-3，且是尿 嘧啶营养缺陷型。

质粒pGLY40(图5)是一种整合载体，其靶向OCH1基因座， 且含有包含巴氏毕赤酵母URA5基因或转录单元(SEQ ID NO：41) 的核酸分子，所述核酸分子侧接包含lacZ重复序列(SEQ ID NO：42) 的核酸分子，后一核酸分子又在一侧侧接包含来自OCH1基因的5′ 区域的核苷酸序列(SEQ ID NO：43)的核酸分子，且在另一侧侧接 包含来自OCH1基因的3′区域的核苷酸序列(SEQ ID NO：44)的核 酸分子。用SfiI使质粒pGLY40线性化，并将所述线性化的质粒转 化进菌株YGLY1-3中，以生产许多这样的菌株：其中侧接lacZ重 复序列的URA5基因已经通过双交换同源重组而插入OCH1基因座 中。从生产的菌株中选出菌株YGLY2-3，且是URA5原营养型。在 有5-氟乳清酸(5-FOA)存在下，反选择菌株YGLY2-3，以生产许 多这样的菌株：其中URA5基因已经丢失，且仅lacZ重复序列保留 在OCH1基因座中。这会赋予该菌株尿嘧啶营养缺陷型。选择菌株 YGLY4-3。

质粒pGLY43a(图6)是一种整合载体，其靶向BMT2基因座， 且含有包含乳酸克鲁维酵母UDP-N-乙酰基葡糖胺(UDP-GlcNAc) 转运基因或转录单元(KlMNN2-2，SEQ ID NO：45)的核酸分子，所 述核酸分子与包含巴氏毕赤酵母URA5基因或转录单元的核酸分子 邻近，后一核酸分子侧接包含lacZ重复序列的核酸分子。所述邻近 基因在一侧侧接包含来自BMT2基因的5′区域的核苷酸序列(SEQ  ID NO：46)的核酸分子，且在另一侧侧接包含来自BMT2基因的 3′区域的核苷酸序列(SEQ ID NO：47)的核酸分子。用SfiI使质粒 pGLY43a线性化，并将所述线性化的质粒转化进菌株YGLY4-3中， 以生产许多这样的菌株：其中侧接lacZ重复序列的KlMNN2-2基因 和URA5基因已经双交换同源重组插入BMT2基因座中。所述BMT2 基因已经公开在Mille等人，J.Biol.Chem.283：9724-9736(2008) 和美国专利号7,465,557中。从生产的菌株中选出菌株YGLY6-3， 且是尿嘧啶原营养型。在有5-FOA存在下反选择菌株YGLY6-3， 以生产这样的菌株：其中URA5基因已经丢失，且仅lacZ重复序列 保留。这会赋予该菌株尿嘧啶营养缺陷型。选择菌株YGLY8-3。

质粒pGLY48(图7)是一种整合载体，其靶向MNN4L1基因 座，且含有表达盒，所述表达盒包含编码UDP-GlcNAc运载体(SEQ  ID NO：48)开放读码框(ORF)的小鼠同系物的核酸分子，所述核 酸分子在5′末端处可操作地连接至包含巴氏毕赤酵母GAPDH启动 子(SEQ ID NO：26)的核酸分子上，且在3′末端处可操作地连接至 包含酿酒酵母CYC终止序列(SEQ ID NO：24)的核酸分子上，所 述表达盒邻近包含巴氏毕赤酵母URA5基因的核酸分子，所述核酸 分子侧接lacZ重复序列，且其中所述表达盒共同地在一侧侧接包含 来自巴氏毕赤酵母MNN4L1基因的5′区域的核苷酸序列(SEQ ID  NO：49)的核酸分子，且在另一侧侧接包含来自MNN4L1基因的3′ 区域的核苷酸序列(SEQ ID NO：50)的核酸分子。用SfiI使质粒 pGLY48线性化，并将所述线性化的质粒转化进菌株YGLY8-3中， 以生产许多这样的菌株：其中编码小鼠UDP-GlcNAc转运蛋白的表 达盒和URA5基因已经通过双交换同源重组而插入MNN4L1基因座 中。所述MNN4L1基因(也称作MNN4B)已经公开在美国专利号 7,259,007中。从生产的菌株中选出菌株YGLY10-3，然后在有5-FOA 存在下反选择，以生产许多这样的菌株：其中URA5基因已经丢失， 且仅lacZ重复序列保留。选择菌株YGLY12-3。

质粒pGLY45(图8)是一种整合载体，其靶向PNO1/MNN4 基因座，且含有包含巴氏毕赤酵母URA5基因或转录单元的核酸分 子，所述核酸分子侧接包含lacZ重复序列的核酸分子，后一核酸分 子又在一侧侧接包含来自PNO1基因的5′区域的核苷酸序列(SEQ ID NO：51)的核酸分子，且在另一侧侧接包含来自MNN4基因的 3′区域的核苷酸序列(SEQ ID NO：52)的核酸分子。用SfiI使质粒 pGLY45线性化，并将所述线性化的质粒转化进菌株YGLY12-3中， 以生产许多这样的菌株：其中侧接lacZ重复序列的URA5基因已经 通过双交换同源重组而插入PNO1/MNN4基因座中。所述PNO1基 因已经公开在美国专利号7,198,921中，所述MNN4基因(也称作 MNN4B)已经公开在美国专利号7,259,007中。从生产的菌株中选 出菌株YGLY14-3，然后在有5-FOA存在下反选择，以生产许多这 样的菌株：其中URA5基因已经丢失，且仅lacZ重复序列保留。选 择菌株YGLY16-3。

质粒pGLY1430(图9)是一种KINKO整合载体，其靶向ADE1 基因座且不会破坏该基因座的表达，且含有串联的4个表达盒，所 述表达盒编码：(1)人GlcNAc转移酶I催化结构域(NA)，其 在N-端处与巴氏毕赤酵母SEC12前导序列肽(10)融合，以将嵌 合酶靶向内质网或高尔基体，(2)UDP-GlcNAc运载体的小鼠同系 物(MmTr)，(3)小鼠甘露糖苷酶IA催化结构域(FB)，其在 N-端处与酿酒酵母SEC12前导序列肽(8)融合，以将嵌合酶靶向 内质网或高尔基体，和(4)巴氏毕赤酵母URA5基因或转录单元。 KINKO(几乎没有或没有敲除的敲入)整合载体能够将异源DNA 插入靶向的基因座中且不破坏在靶向的基因座处的基因的表达，其 已经描述在美国公开的申请号20090124000中。编码NA10的表达 盒包含编码人GlcNAc转移酶I催化结构域的核酸分子(SEQ ID  NO：53)，所述核酸分子为在巴氏毕赤酵母中的表达经过密码子优 化，其在5′末端处与编码SEC12前导序列10的核酸分子(SEQ ID  NO：54)融合，其在5′末端处可操作地连接至包含巴氏毕赤酵母 PMA1启动子的核酸分子上，且在3′末端处可操作地连接至包含巴 氏毕赤酵母PMA1转录终止序列的核酸分子上。编码MmTr的表达 盒包含编码UDP-GlcNAc运载体ORF的小鼠同系物的核酸分子， 所述核酸分子在5′末端处可操作地连接至包含巴氏毕赤酵母SEC4 启动子(SEQ ID NO：55)的核酸分子上，且在3′末端处可操作地连 接至包含巴氏毕赤酵母OCH1终止序列(SEQ ID NO：56)的核酸分 子上。编码FB8的表达盒包含小鼠甘露糖苷酶IA催化结构域的核 酸分子(SEQ ID NO：57)，所述核酸分子在5′末端处与编码SEC12-m 前导序列8的核酸分子(SEQ ID NO：58)融合，其在5′末端处可操 作地连接至包含巴氏毕赤酵母GADPH启动子的核酸分子上，且在 3′末端处可操作地连接至包含酿酒酵母CYC转录终止序列的核酸分 子上。所述URA5表达盒包含含有巴氏毕赤酵母URA5基因或转录 单元的核酸分子，所述核酸分子侧接含有lacZ重复序列的核酸分 子。所述4个串联盒在一侧侧接包含来自ADE1基因的5′区域和整 个ORF的核苷酸序列(SEQ ID NO：59)的核酸分子，继之以巴氏 毕赤酵母ALG3终止序列(SEQ ID NO：29)，且在另一侧侧接包含 来自ADE1基因的3′区域的核苷酸序列(SEQ ID NO：60)的核酸分 子。用SfiI使质粒pGLY1430线性化，并将所述线性化的质粒转化 进菌株YGLY16-3中，以生产许多这样的菌株：其中4个串联的表 达盒已经通过双交换同源重组插入ADE1基因座中，紧邻在ADE1 ORF之后。从生产的菌株中选出菌株YGLY2798，且是精氨酸营养 缺陷型，现在是尿苷、组氨酸和腺嘌呤原营养型。然后在有5-FOA 存在下反选择所述菌株，以生产许多现在是尿苷营养缺陷型的菌 株。选择菌株YGLY3794，且能够生产优势地具有以半乳糖结尾的 N-聚糖的糖蛋白。

质粒pGLY582(图10)是一种整合载体，其靶向HIS1基因座， 且含有串联的4个表达盒，所述表达盒编码：(1)酿酒酵母UDP- 葡萄糖差向异构酶(ScGAL10)，(2)人半乳糖基转移酶I(hGalT) 催化结构域，其在N-端处与酿酒酵母KRE2-s前导序列肽(33)融 合，以将嵌合酶靶向内质网或高尔基体，(3)侧接lacZ重复序列 的巴氏毕赤酵母URA5基因或转录单元，和(4)黑腹果蝇UDP-半 乳糖运载体(DmUGT)。编码ScGAL10的表达盒包含编码ScGAL10 ORF(SEQ ID NO：61)的核酸分子，所述核酸分子在5′末端处可操 作地连接至包含巴氏毕赤酵母PMA1启动子(SEQ ID NO：88)的核 酸分子上，且在3′末端处可操作地连接至包含巴氏毕赤酵母PMA1 转录终止序列(SEQ ID NO：62)的核酸分子上。编码嵌合的半乳糖 基转移酶I的表达盒包含编码hGalT催化结构域的核酸分子(SEQ  ID NO：63)，所述核酸分子为在巴氏毕赤酵母中的表达经过密码子 优化，其在5′末端处与编码KRE2-s前导序列33的核酸分子(SEQ  ID NO：64)融合，其在5′末端处可操作地连接至包含巴氏毕赤酵母 GAPDH启动子的核酸分子上，且在3′末端处可操作地连接至包含 酿酒酵母CYC转录终止序列的核酸分子上。所述URA5表达盒包含 含有巴氏毕赤酵母URA5基因或转录单元的核酸分子，所述核酸分 子侧接含有lacZ重复序列的核酸分子。编码DmUGT的表达盒包含 编码DmUGT ORF(SEQ ID NO：65)的核酸分子，所述核酸分子在 5′末端处可操作地连接至包含巴氏毕赤酵母OCH1启动子(SEQ ID  NO：66)的核酸分子上，且在3′末端处可操作地连接至包含巴氏毕 赤酵母ALG12转录终止序列(SEQ ID NO：67)的核酸分子上。所 述4个串联盒在一侧侧接包含来自HIS1基因的5′区域的核苷酸序 列(SEQ ID NO：68)的核酸分子，且在另一侧侧接包含来自HIS1 基因的3′区域的核苷酸序列(SEQ ID NO：69)的核酸分子。将质粒 pGLY582线性化，并将所述线性化的质粒转化进菌株YGLY3794 中，以生产许多这样的菌株：其中4个串联的表达盒已经通过同源 重组插入HIS1基因座中。选择菌株YGLY3853，且是组氨酸营养 缺陷型和尿苷原营养型。

质粒pGLY167b(图11)是一种整合载体，其靶向ARG1基因 座，且含有串联的3个表达盒，所述表达盒编码：(1)黑腹果蝇 甘露糖苷酶II催化结构域(KD)，其在N-端处与酿酒酵母MNN2 前导序列肽(53)融合，以将嵌合酶靶向内质网或高尔基体，(2) 巴氏毕赤酵母HIS1基因或转录单元，和(3)大鼠N-乙酰基葡糖胺 (GlcNAc)转移酶II催化结构域(TC)，其在N-端处与酿酒酵母 MNN2前导序列肽(54)融合，以将嵌合酶靶向内质网或高尔基体。 编码KD53的表达盒包含编码黑腹果蝇甘露糖苷酶II催化结构域的 核酸分子(SEQ ID NO：70)，所述核酸分子为在巴氏毕赤酵母中的 表达经过密码子优化，其在5′末端处与编码MNN2前导序列53的 核酸分子(SEQ ID NO：71)融合，其在5′末端处可操作地连接至包 含巴氏毕赤酵母GAPDH启动子的核酸分子上，且在3′末端处可操 作地连接至包含酿酒酵母CYC转录终止序列的核酸分子上。所述 HIS1表达盒包含编码巴氏毕赤酵母HIS1基因或转录单元(SEQ ID  NO：72)的核酸分子。编码TC54的表达盒包含编码大鼠GlcNAc 转移酶II催化结构域的核酸分子(SEQ ID NO：73)，所述核酸分 子为在巴氏毕赤酵母中的表达经过密码子优化，其在5′末端处与编 码MNN2前导序列54的核酸分子(SEQ ID NO：74)融合，其在5′ 末端处可操作地连接至包含巴氏毕赤酵母PMA1启动子的核酸分子 上，且在3′末端处可操作地连接至包含巴氏毕赤酵母PMA1转录终 止序列的核酸分子上。所述3个串联盒在一侧侧接包含来自ARG1 基因的5′区域的核苷酸序列(SEQ ID NO：75)的核酸分子，且在另 一侧侧接包含来自ARG1基因的3′区域的核苷酸序列(SEQ ID  NO：76)的核酸分子。用SfiI使质粒pGLY167b线性化，并将所述 线性化的质粒转化进菌株YGLY3853中，以生产许多菌株，其中所 述3个串联表达盒已经通过双交换同源重组插入ARG1基因座中。 从生产的菌株中选出菌株YGLY4754，且是精氨酸营养缺陷型和尿 苷和组氨酸原营养型。然后在有5-FOA存在下反选择所述菌株，以 生产许多现在是尿苷营养缺陷型的菌株。选择菌株YGLY4799。

质粒pGLY3411(图12)是一种含有表达盒的整合载体，所述 表达盒包含巴氏毕赤酵母URA5基因，所述URA5基因侧接lacZ重 复序列，所述表达盒在一侧侧接巴氏毕赤酵母BMT4基因的5′核 苷酸序列(SEQ ID NO：77)，在另一侧侧接巴氏毕赤酵母BMT4 基因的3′核苷酸序列(SEQ ID NO：78)。将质粒pGLY3411线性 化，并将所述线性化的质粒转化进YGLY4799中，以生产许多这样 的菌株：其中URA5表达盒已经通过双交换同源重组插入BMT4基 因座中。从生产的菌株中选出菌株YGLY6903，且是尿嘧啶、腺嘌 呤、组氨酸、脯氨酸、精氨酸和色氨酸原营养型。然后在有5-FOA 存在下反选择所述菌株，以生产许多现在是尿苷营养缺陷型的菌 株。选择菌株YGLY7432和YGLY7433。

质粒pGLY3419(图13)是一种含有表达盒的整合载体，所述 表达盒包含巴氏毕赤酵母URA5基因，所述URA5基因侧接lacZ重 复序列，所述表达盒在一侧侧接巴氏毕赤酵母BMT1基因的5′核 苷酸序列(SEQ ID NO：79)，在另一侧侧接巴氏毕赤酵母BMT1 基因的3′核苷酸序列(SEQ ID NO：80)。将质粒pGLY3419线性 化，并将所述线性化的质粒转化进菌株YGLY7432和YGLY7433 中，以生产许多这样的菌株：其中URA5表达盒已经通过双交换同 源重组插入BMT1基因座中。从生产的菌株中选择菌株YGLY7656 和YGLY7651，且是尿嘧啶、腺嘌呤、组氨酸、脯氨酸、精氨酸和 色氨酸原营养型。然后在有5-FOA存在下反选择所述菌株，以生产 许多现在是尿苷营养缺陷型的菌株。选择菌株YGLY7930和 YGLY7940。

质粒pGLY3421(图14)是一种含有表达盒的整合载体，所述 表达盒包含巴氏毕赤酵母URA5基因，所述URA5基因侧接lacZ重 复序列，所述表达盒在一侧侧接巴氏毕赤酵母BMT3基因的5′核 苷酸序列(SEQ ID NO：81)，在另一侧侧接巴氏毕赤酵母BMT3 基因的3′核苷酸序列(SEQ ID NO：82)。将质粒pGLY3419线性 化，并将所述线性化的质粒转化进菌株YGLY7930和YGLY7940 中，以生产许多这样的菌株：其中URA5表达盒已经通过双交换同 源重组插入BMT1基因座中。从生产的菌株中选择菌株YGLY7965 和YGLY7961，且是尿嘧啶、腺嘌呤、组氨酸、脯氨酸、精氨酸和 色氨酸原营养型。

质粒pGLY3673(图15)是一种KINKO整合载体，其靶向PRO1 基因座且不会破坏该基因座的表达，且含有表达盒，所述表达盒编 码里氏木霉α-1，2-甘露糖苷酶催化结构域，所述催化结构域在N-端 处与酿酒酵母αMATpre信号肽(aMATTrMan)融合，以将所述嵌 合蛋白靶向分泌途径和从所述细胞分泌。编码aMATTrMan的表达 盒包含编码里氏木霉催化结构域的核酸分子(SEQ ID NO：83)，所 述核酸分子在5′末端处与编码酿酒酵母αMATpre信号肽的核酸分 子(SEQ ID NO：13)融合，其在5′末端处可操作地连接至包含巴氏 毕赤酵母AOX1启动子(SEQ ID NO：23)的核酸分子上，且在3′ 末端处可操作地连接至包含酿酒酵母CYC转录终止序列(SEQ ID NO：24)的核酸分子。所述表达盒在一侧侧接包含来自PRO1基因 的5′区域和整个ORF的核苷酸序列(SEQ ID NO：89)的核酸分子， 继之以巴氏毕赤酵母ALG3终止序列，且在另一侧侧接包含来自 PRO1基因的3′区域的核苷酸序列(SEQ ID NO：90)的核酸分子。 所述质粒含有PpARG1基因。将质粒pGLY3673转化进菌株 YGLY7965和YGLY7961中，以生产许多菌株，从生产的菌株中选 择菌株YGLY78316和YGLY8323。

质粒pGLY6833(图16)是一种编码抗-Her2抗体的轻链和重 链的滚入整合质粒，其靶向巴氏毕赤酵母中的TRP2基因座。编码 抗-Her2重链的表达盒包含编码重链ORF(SEQ ID NO：15)的核酸 分子，所述ORF为在巴氏毕赤酵母中的有效表达经过密码子优化， 其在5′末端处可操作地连接至编码酿酒酵母交配因子前信号序列 (SEQ ID NO：14)的核酸分子上，所述核酸分子又在它的N-端处 与具有诱导型巴氏毕赤酵母AOX1启动子序列(SEQ ID NO：23)的 核酸分子融合，且在3′末端处可操作地连接至具有巴氏毕赤酵母 CIT1转录终止序列(SEQ ID NO：85)的核酸分子上。编码抗-Her2 轻链的表达盒包含编码轻链ORF(SEQ ID NO：17)的核酸分子， 所述ORF为在巴氏毕赤酵母中的有效表达经过密码子优化，其在 5′末端处可操作地连接至编码酿酒酵母交配因子前信号序列(SEQ  ID NO：14)的核酸分子上，所述核酸分子又在它的N-端处与具有诱 导型巴氏毕赤酵母AOX1启动子序列(SEQ ID NO：23)的核酸分子 融合，且在3′末端处可操作地连接至具有巴氏毕赤酵母CIT1转录 终止序列(SEQ ID NO：85)的核酸分子上。为了选择转化体，所述 质粒包含编码Zeocin ORF的表达盒，其中编码所述ORF(SEQ ID  NO：35)的核酸分子在5′末端处可操作地连接至具有酿酒酵母TEF 启动子序列(SEQ ID NO：37)的核酸分子上，且在3′末端处可操作 地连接至具有酿酒酵母CYC转录终止序列(SEQ ID NO：24)的核 酸分子上。所述质粒另外包括用于靶向TRP2基因座(SEQ ID  NO：91)的核酸分子。

质粒pGLY6564(图17)是一种编码抗-RSV抗体的轻链和重 链的滚入整合质粒，其靶向巴氏毕赤酵母中的TRP2基因座。编码 抗-RSV重链的表达盒包含编码重链ORF(SEQ ID NO：19)的核酸 分子，所述ORF为在巴氏毕赤酵母中的有效表达经过密码子优化， 其在5′末端处可操作地连接至编码酿酒酵母交配因子前信号序列 (SEQ ID NO：14)的核酸分子上，所述核酸分子又在它的N-端处 与具有诱导型巴氏毕赤酵母AOX1启动子序列(SEQ ID NO：23)的 核酸分子融合，且在3′末端处可操作地连接至具有酿酒酵母CYC 转录终止序列(SEQ ID NO：24)的核酸分子上。编码抗-RSV轻链 的表达盒包含编码轻链ORF(SEQ ID NO：21)的核酸分子，所述 ORF为在巴氏毕赤酵母中的有效表达经过密码子优化，其在5′末端 处可操作地连接至编码酿酒酵母交配因子前信号序列(SEQ ID  NO：14)的核酸分子上，所述核酸分子又在它的N-端处与具有诱导 型巴氏毕赤酵母AOX1启动子序列(SEQ ID NO：23)的核酸分子融 合，且在3′末端处可操作地连接至具有巴氏毕赤酵母AOX1转录终 止序列(SEQ ID NO：36)的核酸分子上。为了选择转化体，所述质 粒包含编码Zeocin ORF的表达盒，其中编码所述ORF(SEQ ID  NO：35)的核酸分子在5′末端处可操作地连接至具有酿酒酵母TEF 启动子序列(SEQ ID NO：37)的核酸分子上，且在3′末端处可操作 地连接至具有酿酒酵母CYC转录终止序列(SEQ ID NO：24)的核 酸分子上。所述质粒另外包括用于靶向TRP2基因座(SEQ ID  NO：91)的核酸分子。

通过将编码抗-Her2抗体的pGLY6833转化进YGLY8316中， 制备菌株YGLY13992。从生产的菌株中选出菌株YGLY13992。在 该菌株中，编码抗-Her2重链和轻链的表达盒靶向巴氏毕赤酵母 TRP2基因座(PpTRP2)。该菌株不包括LmSTT3D表达盒。通过 将编码抗-RSV抗体的pGLY6564转化进YGLY8323中，制备菌株 YGLY14401。从生产的菌株中选出菌株YGLY14401。在该菌株中， 编码抗-RSV重链和轻链的表达盒靶向巴氏毕赤酵母TRP2基因座 (PpTRP2)。该菌株不包括LmSTT3D表达盒。

使用上述LmSTT3D表达/整合质粒载体，基本上如下转化本文 公开的适当菌株。在50mL YPD培养基(酵母浸出物(1％)、蛋 白胨(2％)和葡萄糖(2％))中过夜培养适当的巴氏毕赤酵母菌 株，至约0.2-6的OD。在冰上温育30分钟以后，通过在2500-3000 rpm离心5分钟，沉淀出细胞。去除培养基，并用冰冷却的无菌的 1M山梨醇洗涤细胞3次，然后重新悬浮于0.5mL冰冷却的无菌的 1M山梨醇中。在电穿孔容器中混合10μL线性化的DNA(5-20μg) 和100μL细胞悬浮液，并在冰上温育5分钟。按照预设的巴氏毕赤 酵母方案(2kV，25μF，200Ω)，在Bio-Rad GenePulser Xcell中电 穿孔，随后立即加入1mL YPDS恢复培养基(YPD培养基+1M山 梨醇)。使转化的细胞在室温(24℃)恢复4小时至过夜，然后将 所述细胞涂布在选择性培养基上。

然后如上所述用pGLY6301(其编码LmSTT3D，在诱导型AOX1 启动子控制下)或pGLY6294(其编码LmSTT3D，在组成型GAPDH 启动子控制下)转化每种菌株YGLY13992和YGLY14401，以生成 在实施例3中所述的菌株。

实施例3

分别用SpeI或SfiI，将整合/表达质粒pGLY6301(其包含这样 的表达盒：其中编码LmSTT3D的ORF可操作地连接至诱导型 PpAOX1启动子上)或pGLY6294(其包含这样的表达盒：其中编 码LmSTT3D的ORF可操作地连接至组成型PpGAPDH启动子上) 线性化，并将所述线性化的质粒转化进巴氏毕赤酵母菌株 YGLY13992或YGLY14401中，以生成在表1中所示的菌株 YGLY17351、YGLY17368、YGLY17319和YGLY17354。基本上如 在实施例2中所述进行转化。

使用下述引物，通过集落PCR(cPCR)，证实pGLY6301在 URA6基因座处的基因组整合：PpURA6out/UP (5′-CTGAGGAGTCAGATATCAGCTCAATCTCCAT-3′；SEQ ID  NO：1)和Puc19/LP(5′- TCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGT-3′；SEQ ID NO：2)或 ScARR3/UP(5′-GGCAATAGTCGCGAGAATCCTTAAACCAT-3′； SEQ ID NO：3)和Pp URA6out/LP(5- CTGGATGTTTGATGGGTTCAGTTTCAGCTGGA-3′；SEQ ID NO： 4)。

使用下述引物，通过cPCR，证实pGLY6294在TRP1基因座 处的基因组整合：PpTRP-5′out/UP  (5′- CCTCGTAAAGATCTGCGGTTTGCAAAGT-3′；SEQ ID NO：5)和 PpALG3TT/LP(5′-CCTCCCACTGGAACCGATGATATGGAA-3′； SEQ ID NO：6)或PpTEFTT/UP (5′-GATGCGAAGTTAAGTGCGCAGAAAGTAATATCA-3′；SEQ  ID NO：7)和PpTRP1-3′out/LP (5′-CGTGTGTACCTTGAAACGTCAATGATACTTTGA-3′；SEQ  ID NO：8)。使用下述cPCR引物，证实编码LmSTT3D的表达盒 向基因组中的整合：LmSTT3D/iUP (5′-GCGACTGGTTCCAATTGACAAGCTT-3′(SEQ ID NO：9) 和LmSTT3D/iLP(5′- CAACAGTAGAACCAGAAGCCTCGTAAGTACAG-3′(SEQ ID  NO：10)。PCR条件是：在95℃持续2分钟的1个循环，在95℃ 持续20秒、在55℃持续20秒和在72℃持续1分钟的35个循环； 随后是在72℃持续10分钟的1个循环。

在Sixfor发酵罐中培养所述菌株，以生产抗体，用于N-糖基化 位点占据分析。用于抗体生产的转化菌株的细胞生长条件通常如 下。

在摇瓶中，在24℃，在由1％酵母浸出物、2％蛋白胨、100mM 磷酸钾缓冲液pH 6.0、1.34％酵母氮源碱、4x10-5％生物素和1％甘 油组成的缓冲的甘油-复合培养基(BMGY)中，进行转化的酵母菌 株的蛋白表达。用于蛋白表达的诱导培养基是缓冲的甲醇-复合培养 基(BMMY)，它是用1％甲醇替代BMGY中的甘油。在加入诱导 培养基的同时，将在甲醇中的Pmt抑制剂Pmti-3加入生长培养基 中，至18.3μM的终浓度。收获细胞，并在2,000rpm离心5分钟。

SixFors发酵罐筛选方案遵循表2所示的参数。

在接种后约18小时时，用目标菌株接种装有350mL培养基A (参见下表3)+4％甘油的SixFors罐。与接种物一起加入小剂量 (0.3mL 0.2mg/mL，在100％甲醇中)的Pmti-3(5-[[3-(1-苯基-2- 羟基)乙氧基)-4-(2-苯基乙氧基)]苯基]亚甲基]-4-氧代-2-硫代-3-噻 唑烷醋酸)(参见公开的国际申请号WO 2007061631)。在约20 小时时，向每罐中加入单次剂量的17mL 50％甘油溶液(补充甘油 的分批补料，参见下表4)+更大剂量(0.3mL 4mg/mL)的Pmti-3。 在约26小时，当溶解氧(DO)浓度中的正波峰指示甘油耗尽时， 开始0.7mL/小时的连续甲醇补料(参见下表5)。同时，向每罐中 加入另外剂量的Pmti-3(0.3mL 4mg/mL储液)。在约48小时时， 向每罐中加入另外剂量(0.3mL 4mg/mL)的Pmti-3。在接种后约 60小时，收获并处理培养物。

使用毛细管电泳(CE)，如下测定在抗-Her2或抗-RSV抗体 上的N-聚糖的占据。从细胞培养基中回收抗体，并通过蛋白A柱 色谱法进行纯化。将蛋白A纯化的样品(100-200μg)浓缩至约100 μL，然后用含有1％SDS的100mM Tris-HCl pH 9.0交换缓冲液。 然后，通过加入5μLβ-巯基乙醇，还原样品和2μL 10kDa内部标准 品(由Beckman提供)，并煮沸5分钟。然后根据Beckman Coulter 推荐的方法，在空熔合的二氧化硅毛细管(约70mm，50μm内径) 上分辨约20μL还原的样品。

图18显示了来自CE分析的重链的N-糖基化位点占据。该图 表明，对于两种抗体而言，N-连接的重链物质的量从约80％至约 94％(当组成性地表达LmSTT3D时)增加至约99％(当在诱导抗 体表达的同时诱导LmSTT3D的表达时)。

表7显示，对于其中的抗体获得自宿主细胞(其中在有内源寡 糖基转移酶(OST)复合物存在下过表达LmSTT3D)的组合物而 言，抗-HER2和抗-RSV抗体的N-糖基化位点占据增加。为了测定 N-糖基化位点占据，还原抗体，并测定重链的N-聚糖占据。该表表 明，一般而言，在诱导型启动子控制下的LmSTT3D的过表达，会 使测试的两种抗体的N-糖基化位点占据从约82-83％增加至约99％ (与没有LmSTT3D过表达存在下的N-糖基化位点占据相比，增加 约19％)。LmSTT3D和抗体的表达是在相同诱导型启动子的控制 下。当LmSTT3D的过表达是在组成型启动子的控制下时，测试的 两种抗体的N-糖基化位点占据增加至约94％(与没有LmSTT3D过 表达存在下的N-糖基化位点占据相比，增加约13％)。

表8显示了基于来自还原的抗体制品的单个重链的N-糖基化位 点占据测定，包含完整抗体的组合物的N-糖基化位点占据，所述完 整抗体获得自宿主细胞(其中在有内源寡糖基转移酶(OST)复合 物存在下过表达LmSTT3D)。式(GHC分数)²x100会提供完全占 据的抗体百分比的估测或近似，这基于N-糖基化的重链的分数的测 定。

Q-TOF分析

使用的高效液相色谱法(HPLC)系统由配有自动注射器、柱 加热室和紫外检测器(在210和280nm检测)的Agilent 1200组成。 使用该系统进行的所有LC-MS实验都运行在1mL/min。流量不经 分流地用于MS检测。在Accurate-Mass Q-TOF LC/MS 6520 (Agilent technology)上，以阳离子模式进行质谱测定分析。将双ESI 源的温度设定在350℃。将氮气流量设定在13L/h(对于锥体)和 350l/h，并将喷雾器设定在45psig，将4500伏特施加于毛细管。 根据API-TOF参照质量溶液试剂盒(用于质量校准和蛋白质量测 量)，从HP-0921制备922.009的参照质量。使用Agilent Masshunter， 获得并处理300-3000m/z的离子波谱范围数据。

样品制备如下进行。在50μL 25mM NH₄HCO₃(pH 7.8)至制备 完整的抗体样品(50μg)。对于去糖基化的抗体，用PNGase F(10 单位)在37℃处理完整抗体样品的50μL等分试样18小时。如下制 备还原的抗体：将1M DTT加入完整的抗体或去糖基化的抗体的等 分试样中，至10mM的终浓度，并在37℃温育30min。

将3微克完整的或去糖基化的抗体样品加载上Poroshell 300SB-C3柱(2.1mm×75mm，5μm)(Agilent Technologies)，该柱 维持在70℃。首先用90％溶剂A(0.1％HCOOH)、5％溶剂B(90％ 乙腈在0.1％HCOOH中)，冲洗在柱上的蛋白1分钟。然后如下洗 脱：使用5-100％B的梯度进行26分钟，随后在100％B中再生3分 钟，最后在5％B中平衡10分钟。

对于还原的抗体，将3微克样品加载上Poroshell 300SB-C3柱(2.1 mm×75mm，5μm)(Agilent Technologies)，该柱维持在40℃。首 先用90％溶剂A、5％溶剂B，冲洗在柱上的蛋白3分钟。然后如下 洗脱：使用5-80％B的梯度进行20分钟，随后在80％B中再生7分 钟，最后在5％B中平衡10分钟。

图19显示了Q-TOF分析的结果，其中将在YGLY17351中生 产的未还原的抗-Her2抗体的N-糖基化位点占据与在CHO细胞中 生产的未还原的可商业得到的抗-Her2抗体(赫赛汀)的N-糖基化 位点占据进行了对比。该图表明，在菌株YGLY17351中生产的抗 -Her2抗体所具有的N-糖基化位点占据与在CHO细胞中生产的抗 -Her2抗体的N-糖基化位点占据类似。该图表明，当由菌株 YGLY17351生产抗体时，其中仅1个N-糖基化位点被占据的抗体 的量减少，其中2个N-糖基化位点被占据的抗体的量增加。在 YGLY17351中生产的抗-Her2抗体所表现出的结果与在表8中所示 的近似占据相一致。

图20证实了在YGLY17351中生产的抗-Her2抗体上的N-糖基 化位点占据的可扩缩性。为了评价N-聚糖占据的可扩缩性，在范围 从5mL至40L的生物反应器中测试了YGLY17351。一般而言， 已经观察到在糖工程改造的巴氏毕赤酵母中的糖蛋白的N-糖基化 位点占据随用于生产糖蛋白的工艺条件而变化。但是，过表达 LmSTT3D的菌株表现出非常一致的N-糖基化位点占据(99％)， 不论生物反应器的规模和工艺条件如何。因而，本发明提供了一种 方法，其中在小规模条件下培养的糖工程改造的巴氏毕赤酵母中的 糖蛋白的N-糖基化位点占据，当在大规模条件下培养时得到维持。

为了解释目的，提供了图21和22。图21显示了在CHO细胞 中生产的抗-Her2抗体(赫赛汀)的商业批次的CE和Q-TOF分析 结果。图22显示了抗-Her2抗体的相同商业批在用PNGase F处理 一段时间以后的CE和Q-TOF分析的结果。所述CE显示出未糖基 化的重链的增加，所述Q-TOF显示出在用PNGase F处理以后未糖 基化的抗体的存在(对比图21和图22)。

表9显示了与不过表达LmSTT3D的菌株相比，在过表达 LmSTT3D的菌株中生产的抗-Her2和抗-RSV抗体的N-聚糖组成。 该图证实，来自过表达LmSTT3D的菌株的抗体的N-聚糖的质量与 来自不过表达LmSTT3D的菌株的质量相当。从SixFors(0.5L生物 反应器)，生产抗体，并用2AB标记法，分析来自蛋白A纯化的 抗体的N-聚糖。总之，LmSTT3D的过表达似乎不会显著影响所述 抗体的N-聚糖组成。所述糖基化组成可以随发酵条件而变化，因此， 在巴氏毕赤酵母菌株中生产的抗体的糖基化组成的范围可以是：约 50-70摩尔％G0、15-25摩尔％G1、4-12％摩尔％G2、5-17摩尔％Man₅和3-15摩尔％杂合物。

表10显示了与在CHO细胞中生产的抗-RSV抗体的几个商业 批次(并在商标名称SYNAGIS下作为帕利珠单抗面市)相比，在 菌株YGLY14401中生产的抗-RSV抗体的糖基化模式的对比。

该实施例则表明，本发明能够在巴氏毕赤酵母中生产重组糖蛋 白，其中所述重组糖蛋白的N-糖基化位点占据与在哺乳动物表达系 统(诸如CHO细胞)中生产的重组糖蛋白的N-糖基化位点占据相 当。

实施例4

硕大利什曼原虫STT3A蛋白、硕大利什曼原虫STT3B蛋白和 硕大利什曼原虫STT3D蛋白，都是已经证实会抑制酿酒酵母中的 STT3基因座缺失的致死表型的异源单亚基寡糖基转移酶的实例 (Naseb等人，Molec.Biol.Cell  19：3758-3768(2008))。Naseb 等人(同上)进一步证实，硕大利什曼原虫STT3D蛋白能够抑制 酿酒酵母中的WBP1、OST1、SWP1或OST2基因座的致死突变表 型。Hese等人(Glycobiology 19：160-171(2009))提供的数据提 示，硕大利什曼原虫STT3A、STT3B和STT3D蛋白可以在功能上 补偿WBP1、OST1、SWP1和OST2基因座的突变。其它单亚基异 源寡糖基转移酶包括、但不限于：单亚基贾第虫属或动基体目原生 动物STT3蛋白，例如，秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)STT3 蛋白、布鲁斯锥虫STT3蛋白、克鲁斯锥虫STT3蛋白和鼠弓形虫 STT3蛋白。与硕大利什曼原虫STT3D蛋白(Naseb等人(op.cit.) 教导，该蛋白不会整合进酿酒酵母OTase复合物中)不同，Castro 等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103：14756-14760(2006))教导， 克鲁斯锥虫STT3似乎整合进酿酒酵母OTase复合物中。

在该实施例中，用含有表达盒的质粒载体转化构建的与在先前 实施例中的宿主细胞类似的宿主细胞，所述表达盒编码来自秀丽隐 杆线虫、克鲁斯锥虫的STT3蛋白和硕大利什曼原虫STT3C，并可 操作地连接至AOX1启动子。在该实验中，包括含有编码巴氏毕赤 酵母Stt3p的表达盒的载体。如表11所示，与抗-Her2抗体的表达 并行地表达不同的STT3蛋白，似乎不会导致N-糖基化位点占据的 增加。但是，不同的STT3蛋白可以表现出底物特异性。例如，硕 大利什曼原虫STT3A、B、C和D蛋白在糖基化水平存在底物特异 性差异，这提示，除了必需的N-X-S/T附着位点以外，底物的其它 特征可能影响在特定附着位点处的N-连接的糖基化(Naseb等人，op  cit.)。在表9中所示的结果使用抗-Her2抗体作为底物。抗体的每 个重链的CH2结构域含有单个N-连接的糖基化位点：这通常是在 天冬酰胺残基297(Asn-297)处(Kabat等人，Sequences of proteins  of immunological interest，第5版，美国卫生和人类服务部，NIH公 开号91-3242)。因而，在表9中所示的结果提示，使用的特定单 亚基寡糖基转移酶的底物特异性可能影响N-糖基化位点占据百分 比。

实施例5

如下构建能够生产唾液酸化的N-聚糖的菌株。用编码人 GM-CSF的质粒载体和编码硕大利什曼原虫STT3D的质粒载体， 转染所述菌株。在图23A-23D中示意地解释了所述菌株的构建。简 而言之，如下构建所述菌株。

质粒pGLY2456(图24)是一种KINKO整合载体，其靶向TRP2 基因座且不会破坏该基因座的表达，且含有6个表达盒，所述表达 盒编码：(1)小鼠CMP-唾液酸运载体(mCMP-Sia Transp)，(2) 人UDP-GlcNAc 2-差向异构酶/N-乙酰基甘露糖胺激酶(hGNE)， (3)巴氏毕赤酵母ARG1基因或转录单元，(4)人CMP-唾液酸 合酶(hCSS)，(5)人N-乙酰神经氨酸-9-磷酸合酶(hSPS)，(6) 小鼠α-2，6-唾液酸基转移酶催化结构域(mST6)，其在N-端处与酿 酒酵母KRE2前导序列肽(33)融合，以将嵌合酶靶向内质网或高 尔基体，和巴氏毕赤酵母ARG1基因或转录单元。编码小鼠CMP- 唾液酸运载体的表达盒包含编码mCMP Sia Transp ORF(SEQ ID  NO：92)的核酸分子，所述ORF为在巴氏毕赤酵母中的表达经过密 码子优化，所述核酸分子在5′末端处可操作地连接至包含巴氏毕赤 酵母PMA1启动子的核酸分子上，且在3′末端处可操作地连接至包 含巴氏毕赤酵母PMA1转录终止序列的核酸分子上。编码人 UDP-GlcNAc 2-差向异构酶/N-乙酰基甘露糖胺激酶的表达盒包含 编码hGNE ORF(SEQ ID NO：93)的核酸分子，所述ORF为在巴 氏毕赤酵母中的表达经过密码子优化，所述核酸分子在5′末端处可 操作地连接至包含巴氏毕赤酵母GAPDH启动子的核酸分子上，且 在3′末端处可操作地连接至包含酿酒酵母CYC转录终止序列的核 酸分子上。编码巴氏毕赤酵母ARG1基因的表达盒包含(SEQ ID  NO：94)。编码人CMP-唾液酸合酶的表达盒包含编码hCSS ORF (SEQ ID NO：95)的核酸分子，所述ORF为在巴氏毕赤酵母中的 表达经过密码子优化，所述核酸分子在5′末端处可操作地连接至包 含巴氏毕赤酵母GAPDH启动子的核酸分子上，且在3′末端处可操 作地连接至包含酿酒酵母CYC转录终止序列的核酸分子上。编码人 N-乙酰神经氨酸-9-磷酸合酶的表达盒包含编码hSIAP S ORF(SEQ  ID NO：96)的核酸分子，所述ORF为在巴氏毕赤酵母中的表达经 过密码子优化，所述核酸分子在5′末端处可操作地连接至包含巴氏 毕赤酵母PMA1启动子的核酸分子上，且在3′末端处可操作地连接 至包含巴氏毕赤酵母PMA1转录终止序列的核酸分子上。编码嵌合 的小鼠α-2，6-唾液酸基转移酶的表达盒包含为在巴氏毕赤酵母中的 表达经过密码子优化的编码mST6催化结构域(SEQ ID NO：97)的 核酸分子，所述mST6催化结构域在5′末端处与编码酿酒酵母KRE2 信号肽的核酸分子融合，所述核酸分子在5′末端处可操作地连接至 包含巴氏毕赤酵母TEF启动子的核酸分子上，且在3′末端处可操作 地连接至包含巴氏毕赤酵母TEF转录终止序列的核酸分子上。所述 6个串联盒在一侧侧接包含来自TRP2基因的5′区域和ORF(在终 止密码子处结束)的核苷酸序列(SEQ ID NO：98)的核酸分子，继 之以巴氏毕赤酵母ALG3终止序列，且在另一侧侧接包含来自TRP2 基因的3′区域的核苷酸序列(SEQ ID NO99)的核酸分子。用SfiI 使质粒pGLY2456线性化，并将所述线性化的质粒转化进菌株 YGLY7961中，以生产许多这样的菌株：其中6个表达盒已经通过 双交换同源重组插TRP2基因座中，紧邻在TRP2ORF后面。从 生产的菌株中选出菌株YGLY8146。然后在有5-FOA存在下反选择 所述菌株，以生产许多现在是尿苷营养缺陷型的菌株。选择菌株 YGLY9296。

质粒pGLY5048(图25)是一种整合载体，其靶向STE13基因 座，且含有表达盒，所述表达盒编码：(1)里氏木霉α-1，2-甘露糖 苷酶催化结构域，其在N-端处与酿酒酵母αMATpre信号肽 (aMATTrMan)融合，以将所述嵌合蛋白靶向分泌途径和从所述 细胞分泌，和(2)巴氏毕赤酵母URA5基因或转录单元。编码 aMATTrMan的表达盒包含编码里氏木霉催化结构域的核酸分子 (SEQ ID NO：83)，所述核酸分子在5′末端处与编码酿酒酵母 αMATpre信号肽的核酸分子(SEQ ID NO：13)融合，其在5′末端 处可操作地连接至包含巴氏毕赤酵母AOX1启动子的核酸分子上， 且在3′末端处可操作地连接至包含酿酒酵母CYC转录终止序列的 核酸分子上。所述URA5表达盒包含编码巴氏毕赤酵母URA5基因 或转录单元的核酸分子，后者侧接包含lacZ重复序列的核酸分子。 所述2个串联盒在一侧侧接包含来自STE13基因的5′区域的核苷酸 序列(SEQ ID NO：100)的核酸分子，且在另一侧侧接包含来自 STE13基因的3′区域的核苷酸序列(SEQ ID NO：101)的核酸分子。 用SfiI使质粒pGLY5048线性化，并将所述线性化的质粒转化进菌 株YGLY9296中，以生产许多菌株。从生产的菌株中选出菌株 YGLY9469。该菌株能够生产具有单-甘露糖O-糖基化的糖蛋白(参 见公开的美国申请号20090170159)。

质粒pGLY5019(图26)是一种整合载体，其靶向DAP2基因 座，且含有表达盒，所述表达盒包含编码诺尔丝菌素抗性(NAT^R) 表达盒(源自pAG25，所述pAG25来自EROSCARF，Scientific  Research and Development GmbH，Daimlerstrasse 13a，D-61352Bad  Homburg，德国，参见Goldstein等人，Yeast 15：1541(1999))的 核酸分子。所述NAT^R表达盒(SEQ ID NO：34)可操作地连接至 Ashbyagossypii TEF1启动子和A.gossypii TEF1终止序列，其在一 侧侧接巴氏毕赤酵母DAP2基因的5′核苷酸序列(SEQ ID  NO：102)，在另一侧侧接巴氏毕赤酵母DAP2基因的3′核苷酸序 列(SEQ ID NO：103)。将质粒pGLY5019线性化，并将所述线性 化的质粒转化进菌株YGLY9469中，以生产许多这样的菌株：其中 NAT^R表达盒已经通过双交换同源重组插入DAP2基因座中。从生 产的菌株中选出菌株YGLY9797。

质粒pGLY5085(图27)是一种KINKO质粒，其用于将参与 生产唾液酸化的N-聚糖的第二组基因导入巴氏毕赤酵母中。所述质 粒与质粒YGLY2456类似，但是巴氏毕赤酵母ARG1基因已经被替 换为编码潮霉素抗性(Hyg^R)的表达盒，且所述质粒靶向巴氏毕赤 酵母TRP5基因座。所述HYG^R抗性盒是SEQ ID NO：104。所述 HYG^R表达盒(SEQ ID NO：104)可操作地连接至Ashbya gossypii  TEF1启动子和A.gossypii TEF1终止序列(参见Goldstein等人， Yeast 15：1541(1999))。所述6个串联盒在一侧侧接包含来自TRP5 基因的5′区域和ORF(在终止密码子处结束)的核苷酸序列(SEQ  ID NO：105)的核酸分子，继之以巴氏毕赤酵母ALG3终止序列， 且在另一侧侧接包含来自TRP5基因的3′区域的核苷酸序列(SEQ  ID NO：106)的核酸分子。将质粒pGLY5085转化进菌株YGLY9797 中，以生产许多菌株，从其中选择菌株YGLY1200。

质粒pGLY7240(图28)靶向巴氏毕赤酵母TRP2基因座 (PpTRP2)，该质粒编码包含人GM-CSF的融合蛋白，所述人 GM-CSF经由含有Kex2切割位点的连接物与巴氏毕赤酵母CWP1 蛋白融合。使用Kex2内切蛋白酶，从晚期高尔基体中的GM-CSF 切掉CWP1蛋白，使得游离GM-CSF分泌进发酵上清液中。所述 人GM-CSF具有在SEQ ID NO：108中所示的氨基酸序列，且由在 SEQ ID NO：108中所示的核苷酸序列编码。融合蛋白(SEQ ID  NO：109)由在SEQ ID NO：110中所示的核苷酸序列编码。CWP1 信号序列是氨基酸1-18，CWP1氨基酸序列是来自氨基酸19-289， GGGSLVKR Kex2连接物氨基酸序列(SEQ ID NO：111)是来自氨 基酸290-297，GM-CSF氨基酸序列是来自氨基酸298-424。所述融 合蛋白的表达可操作地连接至Pp AOX1启动子和ScCYC终止序 列。将质粒pGLY7240转化进菌株YGLY12900中，以生产许多菌 株，从其中选择菌株YGLY15660。用质粒pGLY6301(其编码硕大 利什曼原虫STT3D)转化菌株YGLY15660，以生产许多菌株，从 其中选择YGLY16349。

图29表明，LmSTT3D也会提高非抗体糖蛋白GM-CSF的N- 聚糖占据。GM-CSF含有2个N-连接的位点，且在野生型毕赤酵母 中，在GM-CSF上的1个N-连接的位点被优势地糖基化。为了研 究LmSTT3D对GM-CSF的N-聚糖占据的影响，在GM-CSF生产 菌株yGLY15560中过表达甲醇可诱导的LmSTT3D。使用Micro24 生物反应器(M24)，评价N-聚糖占据。使用蛋白印迹和 15％SDS-PAGE，分析来自M24的无细胞上清液的N-聚糖 占据。如用GM-CSF特异性抗体检测的蛋白印迹所证实 的，大部分GM-CSF(泳道2-8)在2个N-连接的位点处被糖基化， 这不同于对照菌株(yGLY15560，泳道9)，在后者中，GM-CSF 优势地在1个位点处被N-糖基化，并且小部分在2个N位点处被 N-糖基化和未糖基化。总之，这指示，LmSTT3D可以提高携带多 个N-连接的位点的糖蛋白的N-聚糖占据。

图30显示了分别从yGLY15560(A)和yGLY16349(B)表达 的GM-CSF的Q-TOP分析。该分析证实，在有LmSTT3D存在下， 大部分GM-CSF在2个N-连接的位点处被糖基化，如图29所示。 没有检测到未糖基化的GM-CSF。

LC-ESI-TOF

在该研究中使用的高效液相色谱法(HPLC)系统由配有自动注 射器、柱加热室和紫外检测器(在210和280nm检测)的Agilent 1200 组成。使用该系统进行的所有LC-MS实验都运行在1ml/min。流量 不经分流地用于MS检测。在Accurate-Mass Q-TOF LC/MS 6520 (Agilent technology)上，以阳离子模式进行质谱测定分析。将双ESI 源的温度设定在350℃。将氮气流量设定在13l/h(对于锥体)和 350l/h，并将喷雾器设定在45psig，将4500伏特施加于毛细管。根 据API-TOF参照质量溶液试剂盒(用于质量校准和蛋白质量测量)， 从HP-0921制备922.009的参照质量。使用Agilent Masshunter，获 得并处理300-3000m/z的离子波谱范围数据。

样品制备

在50μL 25mM NH₄HCO₃(pH 7.8)至制备完整的抗体样品(50 μg)。对于去糖基化的抗体，用PNGase F(10单位)在37℃处理完 整抗体样品的50μL等分试样18小时。如下制备还原的抗体：将1M  DTT加入完整的抗体或去糖基化的抗体的等分试样中，至10mM的 终浓度，并在37℃温育30min。

将3微克完整的或去糖基化的抗体样品加载上Poroshell 300SB-C3柱(2.1mm×75mm，5μm)(Agilent Technologies)，该柱 维持在70℃。首先用90％溶剂A(0.1％HCOOH)、5％溶剂B(90％ 乙腈在0.1％HCOOH中)，冲洗在柱上的蛋白1分钟。然后如下洗 脱：使用5-100％B的梯度进行26分钟，随后在100％B中再生3分 钟，最后在5％B中平衡10分钟。

对于还原的抗体，将3微克样品加载上Poroshell 300SB-C3柱 (2.1mm×75mm，5μm)(Agilent Technologies)，该柱维持在40℃。 首先用90％溶剂A、5％溶剂B，冲洗在柱上的蛋白3分钟。然后如 下洗脱：使用5-80％B的梯度进行20分钟，随后在80％B中再生7 分钟，最后在5％B中平衡10分钟。

序列

在表12中提供了用于生产在实施例1-4中公开的一些菌株的序 列。

尽管在本文中参照例证的实施方案描述了本发明，应当理解， 本发明不限于所述实施方案。具有本领域普通技能且可获取本文教 导的人员会认识到在本发明范围内的其它修改和实施方案。因此， 本发明仅由本文所附的权利要求书来限定。