氮-3-异噁唑基-3-4-噻吩基-嘧啶磺酰基丙酰胺衍生物在制备抗肿瘤药物中的用途

摘要

本发明属于医药领域，具体涉及氮-(4，5-2氢异噁唑-3-基)-3-(4-(噻吩-2-基)-嘧啶-2-磺酰基)丙酰胺衍生物在制备抗肿瘤药物中的用途。本发明的要解决的技术问题是于为抑制肿瘤代谢的药物提供一类新的化合物。本发明的技术方案是提供氮-(4，5-2氢异噁唑-3-基)-3-(4-(噻吩-2-基)-嘧啶-2-磺酰基)丙酰胺衍生物在制备抗肿瘤药物中的用途，结构如式I所示。本发明创造性地发现式I所示的化合物具有好的抗肿瘤作用，能用于制备抗肿瘤药物组合物，为抗肿瘤药物制备领域提供了一种新的选择，具有很好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及氮-(4，5-2氢异噁唑-3-基)-3-(4-(噻吩-2-基)-嘧啶-2-磺酰基)丙酰胺衍生物在制备抗肿瘤药物中的用途。 

背景技术

恶性肿瘤已成为危害人类健康和生存的重要杀手，其发病率和死亡率已超过心血管疾病，并且发病率有明显上升的趋势。虽然随着近年来治疗方法的不断改进和新药物的发现，使得部分肿瘤的5年生存率有所上升，但是诸如肺癌，肝癌，前列腺癌等癌症的预后仍很差，死亡率高。肿瘤病人多伴随有能量消耗高、体重减轻等代谢紊乱现象。上世纪20年代，德国诺贝尔奖得主奥托·瓦伯格发现肿瘤组织的代谢明显增强，肿瘤细胞主要依赖糖酵解进行代谢，其耗糖速度远大于正常细胞。近年来，肿瘤代谢异常现象再次引起人们的重视，这种“瓦伯格效应”又开始成为肿瘤研究的焦点。哈佛大学科学家发现主要存在于肿瘤细胞的M2型丙酮酸激酶(PKM2)可促进肿瘤细胞“瓦伯格效应”的发生，并对肿瘤的形成和生长起着至关重要的作用。实验研究已发现，抑制PKM2的活性，可以干扰肿瘤的代谢，抑制肿瘤的增值，增加肿瘤细胞的凋亡，从而达到抑制肿瘤生长的目的。 

基于PKM2的抑制剂在肿瘤治疗中的重要价值，本发明的发明人开展了针对PKM2的靶向小分子药物设计和合成研究工作，设计并合成了一些实体化合物，进过体外细胞筛选，发现其中一些化合物对肿瘤细胞的增值具有一定的抑制活性，它们在多种肿瘤细胞株上显示出良好的抑制活性，并在体内实验中也显示了较好的实验效果。 

发明内容

本发明的目的在于为制备肿瘤防治的药物提供新的有效选择。 

本发明的技术方案是提供结构如式I所示的氮-(4，5-2氢异噁唑-3-基)-3-(4-(噻吩-2-基)-嘧啶-2-磺酰基)丙酰胺衍生物在制备肿瘤防治药物中的用途： 

其中，R₁、R₂、R₇、R₈独立的为H、卤素、NH₂、CF₃、卤代C1～C8烷基、C1～C8烷氧基或C1～C8烷基； 

R₃～R₆独立的为H或C1～C8烷基； 

R₉～R₁₁独立的为H、呋喃环基、环丙基、吡唑基或C1～C8烷基。 

优选的，R₁～R₆独立的为H或C1～C8烷基，且R₁和R₂中至少一个为C1～C8烷基； 

R₇、R₈独立的为H、C1～C8烷基或CF₃，且R₇和R₈中至少一个为CF₃； 

R₉～R₁₁独立的为H或C1～C8烷基。 

进一步优选的，R₁～R₆独立的为H或C1～C4烷基，且R₁和R₂中至少一个为C1～C4烷基； 

R₇、R₈独立的为H、C1～C4烷基或CF₃，且R₇和R₈中至少一个为CF₃； 

R₉～R₁₁独立的为H或C1～C4烷基。 

更进一步优选的，R₁、R₂独立的为H或C1～C8烷基，且R₁和R₂中至少一个为C1～C8烷基； 

R₇、R₈独立的为H或CF₃，且R₇和R₈中至少一个为CF₃； 

R₃～R₆、R₉～R₁₁为H。 

最优选的，R₁、R₂独立的为H或甲基，且R₁和R₂中至少一个为甲基； 

R₇、R₈独立的为H或CF₃，且R₇和R₈中至少一个为CF₃； 

R₃～R₆、R₉～R₁₁为H。 

本发明另外还提供了结构如式II所示的氮-(4，5-2氢异噁唑-3-基)-3-(4-(噻吩-2-基)-嘧啶-2-磺酰基)丙酰胺衍生物在制备肿瘤防治药物中的用途： 

式II 

其中，所述R₁’独立的为H、卤素、NH₂、CF₃、卤代C1～C8烷基、C₁～C₈烷氧基或C1～C8烷基；所述R₂’独立的为H、呋喃环、环丙基或吡唑。 

进一步的，所述R₁’独立的为C1～C4烷基、卤代C1～C4烷基或C₁～C₄烷氧基。 

进一步的，所述化合物的其化学名为： 

N-(5-methyl-4，5-dihydroisoxazol-3-yl)-3-(4-(thiophen-2-yl)-6-(trifluoromethyl)pyrimidin-2-ylsulfonyl)propanamide 

进一步的，所述化合物具有式III所示的结构 

式III 

本发明的有益效果在于，创造性地发现式I所示的氮-(4，5-2氢异噁唑-3-基)-3-(4-(噻吩-2-基)-嘧啶-2-磺酰基)丙酰胺衍生物具有好的抗肿瘤作用，能用于制备抗肿瘤药物组合物，并通过实验表明其很可能是通过降低肿瘤细胞代谢起到抗肿瘤作用。为抗肿瘤药 物制备领域提供了一种新的选择，具有很好的应用前景。 

附图说明

图1为本发明中氮-(4，5-2氢异噁唑-3-基)-3-(4-(噻吩-2-基)-嘧啶-2-磺酰基)丙酰胺衍生物对人肺癌细胞株A549的增值抑制实验结果。 

图2为本发明中氮-(4，5-2氢异噁唑-3-基)-3-(4-(噻吩-2-基)-嘧啶-2-磺酰基)丙酰胺衍生物对人肝癌细胞株HepG2的增值抑制实验结果。 

图3为本发明中异噁唑噻吩嘧啶对人肺癌A549肿瘤模型的治疗实验结果。 

图4为本发明中异噁唑噻吩嘧啶对人肝癌HepG2肿瘤模型的治疗实验结果。 

图5为本发明中异噁唑噻吩嘧啶对人乳腺癌MCF-7肿瘤模型的治疗实验结果。 

图6为本发明中异噁唑噻吩嘧啶对人结肠癌SW480肿瘤模型的治疗实验结果。 

图7为本发明中异噁唑噻吩嘧啶对人卵巢癌SKOV-3肿瘤模型的治疗实验结果。 

以下结合附图通过对具体实施方式的描述说明但不限制本发明。 

具体实施方式

实施例一式III所示的化合物抑制肿瘤的体外实验 

一、式III所示的化合物的来源及理化性质 

本发明具体实施方式中使用的一种氮-(4，5-2氢异噁唑-3-基)-3-(4-(噻吩-2-基)-嘧啶-2-磺酰基)丙酰胺衍生物结构式如式III所示，购买自荷兰Specs公司(Specs，荷兰)，相对分子质量为448.05， 

式III 

该异噁唑噻吩嘧啶为浅黄色粉末，在水，乙醇等溶剂中溶解性差。 

其化学名为：N-(5-methyl-4，5-dihydroisoxazol-3-yl)-3-(4-(thiophen-2-yl)-6-(trifluoromethyl)pyrimidin-2-ylsulfonyl)propanamide； 

中文名：氮-(5-甲基-4，5-异噁唑-3-基)-3-(4-(噻吩-2-基)-6-(三氟甲基)-2-丙磺酰基嘧啶。 

二实验材料 

1、主要试剂 

RPMI-1640、DMEM、胎牛血清、胰酶等购自Gibco BRL公司(Invitrogen Corporation，USA)，溴化噻唑蓝四唑(MTT)、碘化丙啶(PI)，二甲亚砜(DMSO)为Sigma公司(USA)产品。式III所示的氮-(5-甲基-4，5-2氢异噁唑-3-基)-3-(4-(噻吩-2-基)-6-(三氟甲基)嘧啶-2-磺酰基)丙酰胺购自荷兰Specs公司，为化学标准品，体外实验时用DMSO配制成10mg/ml储存液，置4℃冰箱避光保存备用，临用时用完全培养液稀释至所需浓度。 

2、细胞系及培养 

本实验所用的人肺癌细胞株(A549)，人肝癌细胞株(HepG2)，人前列腺癌细胞株(PC-3)，人乳腺癌细胞株(MCF-7)，人结肠癌细胞株(SW480)，人肾癌细胞株(OSC)和人卵巢癌细胞株(SKOV-3)购于美国ATCC公司，常规保存。HepG2细胞及SW480细胞用含10％胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的DMEM完全培养基、5％CO₂、37℃培养。PC-3细胞、MCF-7细胞、OSC细胞、SKOV-3细胞及A549细胞用含10％胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的RPMI-1640完全培养基、5％CO₂、37℃培养。 

三实验方法和结果 

1 统计学方法 

实验数据用均数±标准差表示，采用SPSS13.0统计软件处理。计量资料采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。 

2 细胞增殖抑制实验 

2.1实验方法(MTT法) 

用完全培养液调整细胞浓度为2×10⁴/ml，接种于96孔板，每孔200μl，培养过夜，次日分别用不同剂量的氮-(5-甲基-4，5-2氢异噁唑-3-基)-3-(4-(噻吩-2-基)-6-(三氟甲基)嘧啶-2-磺酰基)丙酰胺(终浓度分别为10，5，2.5，1.25，0.625，0.312，0.16μg/ml)处理细胞，同时等体积的溶剂对照组，DMSO浓度为0.1％(0.1％的DMSO对细胞增殖没有影响)。每个设5个复孔，37℃，5％CO₂培养。分别于培养48小时后，取1个培养板，每孔加入5mg/ml MTT试剂20μl，继续培养2到4小时，弃上清，再加DMSO150μl，振荡混匀15min，用酶标仪(入＝570nm)测定吸光度(A)值(A值与活细胞数成正比)，取其平均值。相对细胞增殖抑制率 (％)＝(对照组A₅₇₀-实验组A₅₇₀)/对照组A₅₇₀×100％。实验至少重复3次(因溶剂对照组无细胞细胞增殖抑制作用，故这里的对照组是指溶剂对照组)。为了观察氮-(5-甲基-4，5-2氢异噁唑-3-基)-3-(4-(噻吩-2-基)-6-(三氟甲基)嘧啶-2-磺酰基)丙酰胺细胞增殖抑制作用是否有时间依赖性，进一步进行氮-(5-甲基-4，5-2氢异噁唑-3-基)-3-(4-(噻吩-2-基)-6-(三氟甲基)嘧啶-2-磺酰基)丙酰胺作用A549细胞和HepG2细胞72小时细胞增殖抑制试验，试验处理方法同上。 

2.2氮-(4，5-2氢异噁唑-3-基)-3-(4-(噻吩-2-基)-嘧啶-2-磺酰基)丙酰胺衍生物对细胞增殖抑制实验结果 

不同浓度氮-(4，5-2氢异噁唑-3-基)-3-(4-(噻吩-2-基)-嘧啶-2-磺酰基)丙酰胺衍生物作用不同细胞后，随药物浓度增大，细胞增殖抑制越明显，各剂量组与对照组相比，细胞增殖抑制率差异均有统计学意义(P＜0.05)(结果见表1)。氮-(5-甲基-4，5-2氢异噁唑-3-基)-3-(4-(噻吩-2-基)-6-(三氟甲基)嘧啶-2-磺酰基)丙酰胺处理A549、HepG2、MCF-7、PC-3、SW480、OSC、SKOV-3细胞48h的半数抑制浓度(IC₅₀)分别为1.58μg/ml、3.01μg/ml、4.57μg/ml、5.69μg/ml、3.58μg/ml、4.74μg/ml、10.2μg/ml。 

不同浓度氮-(4，5-2氢异噁唑-3-基)-3-(4-(噻吩-2-基)-嘧啶-2-磺酰基)丙酰胺衍生物作用A549及HepG2细胞不同时间，细胞抑制率随作用时间逐渐升高(结果见图1和图2)。各剂量组与对照组相比，相对细胞增殖抑制率差异均有统计学意义(P＜0.05)。细胞增殖抑制实验结果显示氮-(5-甲基-4，5-2氢异噁唑-3-基)-3-(4-(噻吩-2-基)-6-(三氟甲基)嘧啶-2-磺酰基)丙酰胺能显著性抑制各种不同组织来源地肿瘤细胞的增值。 

表1氮-(4，5-2氢异噁唑-3-基)-3-(4-(噻吩-2-基)-嘧啶-2-磺酰基)丙酰胺衍生 

物对不同肿瘤细胞株的相对增殖抑制率(％) 

3流式细胞仪分析检测细胞凋亡 

3.1实验方法 

取对数生长期的HepG2细胞和PC-3细胞，按照每孔1×10⁵个细胞接种于6孔板中，培养24小时后，加入氮-(4，5-2氢异噁唑-3-基)-3-(4-(噻吩-2-基)-嘧啶-2-磺酰基)丙酰胺衍生物，使其终浓度分别为10，5，2.5，1.25，0.625g/ml，每个剂量组设3个复孔，37℃，5％CO₂培养。培养72小时后，收集不同处理组和对照组的细胞，用4℃预冷的PBS洗涤3次，加入70％冷乙醇固定细胞。离心之后加入含RNase的PI染料，半小时后上流式细胞仪检测。 

3.2实验结果 

HepG2和PC-3细胞经-作用后经流式细胞仪检测时发现，在G0/G1期峰前出现一亚二倍体，使用凋亡程序软件去除细胞碎屑后分析确认其为凋亡峰，此峰随药物浓度增大而升高呈现出较明显的剂量依赖性。处理组和对照组相比有显著性差异(P＜0.05)(结果见表2)，提示氮-(5-甲基-4，5-2氢异噁唑-3-基)-3-(4-(噻吩-2-基)-6-(三氟甲基)嘧啶-2-磺酰基)丙酰胺对A549和HepG2细胞的增值抑制作用可能是通过诱导细胞凋亡而实现。 

表2对不同细胞株的诱导凋亡比例(％) 

  浓度(μg/ml)   10   5   2.5   1.25   0.625   A549   61.5   62.1   56.9   31.4   13.3   HepG2   66.2   53.5   36.7   28.6   11.8

实施例二异噁唑噻吩嘧啶抑制肿瘤的实验 

一、异噁唑噻吩嘧啶的来源及理化性质 

本发明具体实施方式中使用的一种异噁唑噻吩嘧啶结构式如式III所示，购买自荷兰Specs公司(Specs，荷兰)，相对分子质量为448.05， 

式III 

该异噁唑噻吩嘧啶为浅黄色粉末，在水，乙醇等溶剂中溶解性差。 

其化学名为：N-(5-methyl-4，5-dihydroisoxazol-3-yl)-3-(4-(thiophen-2-yl)-6-(trifluoromethyl)pyrimidin-2-ylsulfonyl)propanamide 

中文名：氮-(5-甲基-4，5-异噁唑-3-基)-3-(4-(噻吩-2-基)-6-(三氟甲基)-2-丙磺酰基嘧啶。 

二实验材料 

1、主要试剂 

RPMI-1640、DMEM、胎牛血清、胰酶等购自Gibco BRL公司(Invitrogen Corporation，USA)，溴化噻唑蓝四唑(MTT)、碘化丙啶(PI)，二甲亚砜(DMSO)为Sigma公司(USA)产品。式II所示的异噁唑噻吩嘧啶购自荷兰Specs公司，为化学标准品，体外实验时用DMSO配制成10mg/ml储存液，置4℃冰箱避光保存备用，临用时用完全培养液稀释至所需浓度。 

2、细胞株及培养 

本实验所用的人肺癌细胞株(A549)，人肝癌细胞株(HepG2)，人乳腺癌细胞株(MCF-7)，人结肠癌细胞株(SW480)和人卵巢癌细胞株(SKOV-3)购于美国ATCC公司，常规保存。HepG2细胞及SW480细胞用含10％胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的DMEM完全培养基、5％CO₂、37℃培养。MCF-7细胞、SKOV-3细胞及A549细胞用含10％胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的RPMI-1640完全培养基、5％CO₂、37℃培养。 

3、动物饲养 

本实验所用的SPF级裸鼠购自北京华阜康公司，均为6到8周，饲养于恒温、恒湿的层流动物房。 

三实验方法和结果 

1 统计学方法 

实验数据用均数±标准差表示，采用SPSS13.0统计软件处理。计量资料采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。 

2 肿瘤模型治疗实验 

2.1实验方法 

收集培养的肿瘤细胞，双无培养基洗两次，用双无培养液调整细胞浓度为5×10⁷/ml，接种于裸鼠右侧背部，待肿瘤生长至50-100立方毫米后，每天一次腹腔注射治疗，药物浓度为1mg/kg，同时等体积的溶剂对照组，每组10只小鼠。每三天测量一次肿瘤体积，计算方法为：体积＝0.52×长×宽×宽。实验至少重复3次(因溶剂对照组无细胞细胞增殖抑制作用，故这里的对照组是指溶剂对照组)。 

2.2异噁唑噻吩嘧啶对细胞增殖抑制实验结果 

异噁唑噻吩嘧啶作用不同肿瘤模型，随药给药时间延长，肿瘤抑制率越明显，各给药组与对照组相比，肿瘤抑制率差异均有统计学意义(P＜0.05)。具体各肿瘤动物模型的结果为：A549肿瘤模型(结果见图3)、HepG2肿瘤模型(结果见图4)、MCF-7肿瘤模型(结果见图5)、SW480肿瘤模型(结果见图6)、SKOV-3肿瘤模型(结果见图7)肿瘤模型的抑瘤率分别为62％、59％、73％、34％、45％。