双丹酰基化合物及制备方法及作为汞离子荧光探针的应用及汞离子浓度的检测方法

摘要

本发明公开了双丹酰基化合物，其化学结构如下式所示：

说明书

技术领域

本发明涉及一种双丹酰基化合物及制备方法及作为汞离子荧光探针的应用及汞离子浓度的检测方法。 

背景技术

重金属污染一直都是十分严重的全球性问题，而在众多重金属污染中，汞污染尤为严重。它们进入环境后不会像有机污染物那样在环境中被快速分解，而会长期残留于环境中，产生经久不衰的污染。与此同时，它们还严重威胁着人类的身体健康。汞与生物体内蛋白质的巯基（-SH）有高度的亲和力，结合以后生成硫醇盐，可以使一系列含巯基酶的活性丧失以及蛋白质的表达受到抑制，以至它们的功能发生变化而中毒。因此，汞污染在生物、环境中的分析和检测，已经成为生命科学、环境化学以及化学等多学科的重要课题。 

汞污染的来源广泛，如煤矿和金矿采矿业、固体废弃物焚烧、造纸业、石化燃料燃烧、化工生产、火山爆发、海洋运动以及森林大火等人为活动或自然来源。它们主要通过对水源的污染来对人类产生毒害作用。汞污染在水体环境中经常会以二价汞离子的形式存在，因此水体环境下快速、便捷地检测汞离子的就具有重要的意义。 

在众多的检测方法中，荧光探针方法具有高灵敏度、高选择性、快速响应以及能够通过荧光成像对其检测进行实时观察等一系列优点，这使得荧光探针方法相对其它传统检测手段比如原子吸收光谱、等离子体发射光谱、电化学方法（电势、电流、电导等）等更有优势。 

但是，由于重金属离子多具有很强的电荷、电子或能量转移能力而经常表现出荧光猝灭性能，在实际检测中它们很容易会对汞离子的检测产生干扰，这也为汞离子荧光探针的开发设置了障碍。而以荧光发射峰的位移作为荧光响应信号则可以不用过多考虑荧光吸收峰的强，只要关注荧光发射峰的位置变化，这就提高了荧光探针的抗干扰能力，因为外部环境对荧光发射位置的扰动通常要远小于对荧光强度的影响；与此同时，它对不同浓度重金属离子“荧光位移”的响应信号可以在荧光颜色上表现出差别，可以起到类似“荧光试纸”的作用。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种双丹酰基化合物及制备方法及作为汞离子荧光探针的应用及汞离子浓度的检测方法。 

本发明所采取的技术方案是： 

双丹酰基化合物，其化学结构如式（Ⅰ）所示：

；

其中，R为H原子或者。

制备双丹酰基化合物的方法，当R为原子时，其制备方法如下： 

在无氧条件以及缚酸剂存在的情况下，将赖氨酸甲酯盐酸盐与丹酰氯在室温下于无水溶剂中进行充分反应即可；

当R为H原子时，其制备方法如下： 

在无氧条件以及缚酸剂存在的情况下，将1,5-戊二胺盐酸盐与丹酰氯在室温下于无水溶剂中进行充分反应即可。

所述的缚酸剂为胺类缚酸剂。 

双丹酰基化合物作为汞离子荧光探针的应用。 

一种汞离子浓度的检测方法，包括以下步骤： 

1）制作具有不同汞离子浓度的系列双丹酰基化合物溶液，在对应的激发波长下，测定系列双丹酰基化合物溶液的荧光强度，绘制荧光图谱，记录各自的荧光发射峰；其中，在所述的系列双丹酰基化合物溶液中，其中一份是汞离子浓度为0的空白溶液，其余为非空白溶液；

2）记录非空白溶液的荧光发射峰相对于空白溶液的荧光发射峰的峰位变化值，拟合确定峰位变化值与汞离子浓度的函数关系；

3）在对应激发波长下，测量汞离子浓度为未知的双丹酰基化合物的溶液的荧光强度，计算其荧光发射峰相对于步骤1）中的空白溶液的峰位变化值，根据此峰位变化值与步骤2）中得到的函数关系计算汞离子的浓度。

本发明的有益效果是：本发明的检测汞离子浓度的方法准确方便。 

具体来说：双丹酰赖氨酸甲酯和双丹酰基戊二胺可以方便地配制成水溶液，用于汞离子浓度检测时，操作更为方便。 

汞离子可以使双丹酰赖氨酸甲酯和双丹酰基戊二胺表现出明显的荧光发射峰的位移，而且其他常见金属离子对双丹酰赖氨酸甲酯和双丹酰基戊二胺的荧光发射峰的位置和荧光强度几乎都没有影响，这样可以更为准确的检测出溶液中汞离子含量。 

双丹酰赖氨酸甲酯和双丹酰基戊二胺在特异性识别汞离子的时候可以不用过多地考虑荧光吸收峰的强度，这就提高了其抗干扰的能力。双丹酰赖氨酸甲酯和双丹酰基戊二胺对不同浓度汞离子“荧光位移”的响应信号还可以在荧光颜色上表现出差别，可以起到类似“荧光试纸”的作用。 

附图说明

图1 双丹酰赖氨酸甲酯的核磁图谱； 

图2 是双丹酰基戊二胺的核磁图谱；

图3是加入不同量的汞离子时双丹酰赖氨酸甲酯的荧光光谱图（激发波长为340 nm）；

图4是不同金属离子在不同的浓度下与双丹酰赖氨酸甲酯作用显示的荧光光谱变化（激发波长为340 nm）；

图5是不同金属离子与汞离子同时存在时双丹酰赖氨酸甲酯的荧光峰位变化值（激发波长为340 nm）；

图6 是双丹酰基赖氨酸甲酯作为荧光探针的峰位变化值与汞离子浓度的标准曲线；

图7是加入不同量的汞离子时双丹酰基戊二胺的荧光光谱图（激发波长为340 nm）；

图8是不同金属离子在不同的浓度下与双丹酰基戊二胺作用显示的荧光光谱变化（激发波长为340 nm）；

图9是不同金属离子与汞离子同时存在时双丹酰基戊二胺的荧光峰位变化值（激发波长为340 nm）。

图10是双丹酰基戊二胺作为荧光探针的峰位变化值与汞离子浓度的标准曲线。 

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明： 

实施例1 ：双丹酰赖氨酸甲酯的合成

双丹酰赖氨酸甲酯的合成路线如式(Ⅱ)所示，具体合成步骤如下：

    双丹酰基赖氨酸甲酯的合成：

1）将赖氨酸甲酯盐酸盐(0.10 g, 0.46 mmol)溶于无水苯(20.0 ml)中，冰盐浴下通入氮气5 min，再滴加NEt₃ (0.15 ml, 1.1 mmol)；

2）将丹酰氯(0.26 g, 0.51 mmol)溶于无水苯中，滴加到步骤1）中得到的溶液中并不断搅拌，继续通入氮气5 min；将混合体系温度恢复至室温，再搅拌反应32 h；

反应过程中，使用薄层色谱监测反应进程。待反应结束后，蒸发掉溶液中的苯，粗产物使用二氯甲烷做展开剂进行硅胶柱层析分离提纯。得到浅绿色固体产物，产率为66.8 %；

如图1为合成产物的核磁图谱。

实施例2 ：双丹酰基戊二胺的合成

双丹酰基戊二胺的合成路线如式(Ⅲ)所示，具体合成步骤如下：

双丹酰基戊二胺的合成

1）将1,5-戊二胺盐酸盐(0.028 g, 0.16 mmol)溶于无水苯(20.0 ml)中，冰盐浴下通入氮气5 min，滴加NEt₃ (0.60 ml, 4 mmol)；

2）将丹酰氯(0.10 g, 0.37 mmol)溶于无水苯中，滴加到步骤1）得到的溶液中并不断搅拌，继续通入氮气5 min；将混合体系温度恢复至室温后搅拌反应24 h；

反应过程中，使用薄层色谱监测反应进程。待反应结束后，蒸发掉溶液中的苯，粗产物使用二氯甲烷做展开剂进行硅胶柱层析分离提纯。得到浅绿色固体产物，产率为65.4 %。

图2是合成的产物的核磁图谱。 

实施例3 ：双丹酰基赖氨酸甲酯作为汞离子荧光探针的应用

将汞离子的浓溶液滴定到浓度为10.0 × 10^-6 mol/L的双丹酰基赖氨酸甲酯的缓冲溶液中（pH 6.5，缓冲剂为磷酸二氢钠和磷酸氢二钠）中使得汞离子的浓度分别为0.00, 0.10, 0.17, 0.25, 0.33, 0.38, 0.42, 0.50, 0.56, 0.63, 0.71, 0.83, 1.25, 1.67, 2.50, 5.00, 10.00, 15.00, 20.00, 25.00 μM，并分别检测它们在激发波长为340 nm下的荧光强度，绘制荧光光谱图，得到的荧光光谱图如图3所示。

重复上述汞离子荧光测定实验，对14种常见重金属离子按类似的方法进行荧光测试，取不同浓度金属离子存在时双丹酰赖氨酸甲酯荧光发射峰位移的变化值Δλ=λ-λ₀作图，结果如图4所示，其中λ₀表示金属离子浓度为0.0 μM时双丹酰赖氨酸甲酯荧光发射峰的波长，λ代表不同浓度的金属离子存在时双丹酰赖氨酸甲酯的荧光发射峰的波长。 

由图3可知，Cd²⁺、Cu²⁺、Cu²⁺等14种金属离子对双丹酰赖氨酸甲酯的荧光发射性质没有任何影响，只有Hg²⁺可以使双丹酰赖氨酸甲酯表现出强烈的荧光发射峰的位移，双丹酰赖氨酸甲酯对汞离子表现出非常高的选择性识别作用。 

为了验证双丹酰赖氨酸甲酯对汞离子的识别作用的抗干扰能力，进行了离子干扰实验。在含有2.5 μM（即2.5 μmol/L） Hg²⁺的5.0 μM双丹酰赖氨酸甲酯溶液中分别加入25.0 μM的Cd²⁺、Cu²⁺、Cu²⁺等14种金属离子，对比汞离子和其他金属离子同时存在时与单独添加汞离子的荧光光谱图，并按照以上的方法测定Δλ，由图5可知，双丹酰赖氨酸甲酯对汞离子的识别几乎不受其他金属离子的影响。说明双丹酰赖氨酸甲酯对汞离子的识别作用具有较强的抗干扰能力。  

实施例4：

双丹酰基赖氨酸甲酯用于检测未知浓度汞离子

将汞离子的浓溶液滴定到浓度为10.0 × 10^-6 mol/L的双丹酰基赖氨酸甲酯的缓冲溶液中（pH 6.5，缓冲剂为磷酸二氢钠和磷酸氢二钠）中使得汞离子的浓度分别为0.00, 0.10, 0.25, 0.50, 0.83, 1.25, 2.50, 5.00 μM, 并分别检测出它们在激发波长为340 nm下的荧光发射峰的峰位变化值，拟合得到标准曲线, 该标准曲线的函数关系式为y= -7.832+47.764/(1+10^{(0.3723-x)*2.0983})，其中x值为汞离子的浓度，y值为发射峰的峰位变化值，拟合得到的标准曲线见图6。

将含有未知浓度的汞离子溶液5 μL滴定到浓度为10.0 × 10^-6 mol/L的双丹酰基赖氨酸甲酯的缓冲溶液中（pH 6.5，缓冲剂为磷酸二氢钠和磷酸氢二钠）中，测得发射峰的位移变化值为16 nm, 代入函数关系式计算得到x值为0.38 μM。 

准确性实验

为了探究以上荧光实验的准确性，将3份已知浓度的汞离子溶液分别滴定到浓度为10.0 × 10^-6 mol/L的双丹酰基赖氨酸甲酯的缓冲溶液中（pH 6.5，缓冲剂为磷酸二氢钠和磷酸氢二钠）中，分别测出峰位变化值，测得的峰位变化值分别为5 nm，17 nm，32 nm，然后通过标准曲线函数关系式y= -7.832+47.764/(1+10^{(0.3723-x)*2.0983})分别计算出汞离子的浓度，将计算出来的浓度跟已知浓度进行比较。结果如表1所示。

实施例5：

双丹酰基戊二胺作为汞离子荧光探针的应用

将汞离子的浓溶液滴定到浓度为10.0 × 10^-6 mol/L的双丹酰基戊二胺的缓冲溶液中（pH 6.5，缓冲剂为磷酸二氢钠和磷酸氢二钠）中使得汞离子的浓度分别为0.00, 0.50, 1.00, 1.25, 1.67, 2.00, 2.50, 3.50, 5.00, 8.33, 10.00, 20.00 μM，并分别检测它们在激发波长为340 nm下的荧光强度，绘制荧光光谱图，得到的荧光光谱图如图7所示。

重复上述汞离子荧光测定实验，对14种常见金属离子按类似的方法进行荧光测试，取不同浓度金属离子存在时双丹酰基戊二胺荧光发射峰位移的变化值Δλ=λ-λ₀作图，结果如图8所示，其中λ₀表示金属离子浓度为0.0 μM时双丹酰基戊二胺荧光发射峰的波长，λ代表不同浓度的金属离子存在时双丹酰基戊二胺的荧光发射峰的波长。 

由图8可知，Cd²⁺、Cu²⁺、Cu²⁺等14种金属离子对双丹酰基戊二胺的荧光发射性质没有任何影响，只有Hg²⁺可以使双丹酰基戊二胺表现出强烈的荧光发射峰的位移，双丹酰基戊二胺对汞离子表现出很高的选择性识别作用。 

为了验证双丹酰基戊二胺对汞离子的识别作用的抗干扰能力，进行了离子干扰实验。在含有2.5 μM Hg²⁺的5.0 μM双丹酰基戊二胺溶液中分别加入25.0 μM的Cd²⁺、Cu²⁺、Cu²⁺等14种金属离子，对比汞离子和其他金属离子同时存在时与单独添加汞离子的荧光光谱图。由图9可知，双丹酰基戊二胺对汞离子的识别几乎不受其他金属离子的影响。说明双丹酰基戊二胺对汞离子的识别作用具有较强的抗干扰能力。  

实施例6双丹酰基戊二胺用于汞离子浓度的检测

将汞离子的浓溶液滴定到浓度为10.0 × 10^-6 mol/L的双丹酰基戊二胺的缓冲溶液中（pH 6.5，缓冲剂为磷酸二氢钠和磷酸氢二钠）中使得汞离子的浓度分别为0.00, 0.50, 1.00, 1.25, 2.50, 5.00, 10.00 μM, 并分别检测出它们在激发波长为340nm下的荧光发射峰的峰位变化值，拟合得到标准曲线, 该标准曲线的函数关系式为y= -2850.67+2888.18/1+10^{(-16.9588-x)*0.11105} ，其中x值为汞离子的浓度，y值为发射峰的峰位变化值，标准曲线见图10。

将含有未知浓度的汞离子溶液5 μL滴定到浓度为10.0 × 10^-6 mol/L的双丹酰基赖氨酸甲酯的缓冲溶液中（pH 6.5，缓冲剂为磷酸二氢钠和磷酸氢二钠）中，测得发射峰的位移变化值为24 nm, 代入函数关系式计算得到x值为4 μM。 

准确性实验

为了探究以上荧光实验的准确性，将3份已知浓度的汞离子溶液分别滴定到浓度为10.0 × 10^-6 mol/L的双丹酰基戊二胺的缓冲溶液中（pH 6.5，缓冲剂为磷酸二氢钠和磷酸氢二钠）中，分别测出峰位变化值，测得的峰位变化值分别为13 nm，22 nm，33 nm，然后通过标准曲线函数关系式y= -2850.67+2888.18/1+10^{(-16.9588-x)*0.11105}分别计算出汞离子的浓度，将计算出来的浓度跟已知浓度进行比较。结果如表2所示。