用于治疗艰难梭菌相关感染和疾病的抗体

摘要

本发明提供了治疗由艰难梭菌细菌感染和由这些细菌所产生的肠毒素引起的艰难梭菌感染以及相关疾病状况和病理（例如艰难梭菌相关性腹泻）的试剂、组合物和疗法。具体而言，提供了抗体或它们的抗原结合片段，这些抗体或抗原结合片段特异性地结合到艰难梭菌毒素A和/或毒素B上并且中和这些毒素的活性；提供了包含此类抗体的组合物；以及使用这些抗体和组合物的方法。

说明书

相关申请

本申请在35U.S.C.§119下要求来自美国临时申请No.61/324503（2010 年4月15日提交）和61/381669（2010年9月10日提交）的优先权，每篇专 利文献的全部内容通过引用结合在此。

发明领域

本发明总体上涉及可以用来治疗艰难梭菌（C.difficile）感染以及艰难梭 菌相关性疾病状况及病理（如艰难梭菌相关性腹泻（CDAD））的组合物和 疗法，这些疾病可能因艰难梭菌细菌感染引起。本发明进一步涉及与艰难梭 菌毒素A和/或毒素B上的表位特异性结合的抗体或它们的抗原结合片段、包 含此类抗体的组合物、以及使用这些抗体或组合物的方法。

发明背景

艰难梭菌（或C.diff.）是一种革兰氏阳性、形成孢子的厌氧性细菌，它 代表了医院（医院获得性）抗生素相关性腹泻和伪膜性结肠炎的主导病因。 据估计，在美国每年艰难梭菌感染总计超过750,000个病例，并且它所导致的 死亡超过了所有其他肠道感染之和（1）。在许多医院里，艰难梭菌对患者构 成的风险比耐甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus） （MRSA）或任何其他细菌更大（2）。据估计，美国防治艰难梭菌相关性疾 病（CDAD）的年成本超过32亿美元（3）。最近暴发的毒力或抗生素耐药性 增加的艰难梭菌菌株已经导致治疗失败、复发更频繁以及死亡率增加（4）。

CDAD通常由使用抗生素如克林霉素、头孢菌素类和氟喹诺酮类（3,8） 破坏结肠菌群而引起。结肠微环境的扰动连同暴露于艰难梭菌孢子，导致移 生。所有出现移生的患者中有大约三分之一形成了CDAD（9），这可以导致 重度腹泻、结肠穿孔、结肠切除和死亡（10）。艰难梭菌获取和增殖之后， 在肠道内出现了CDAD，艰难梭菌细菌在这里产生了毒素A和毒素B这两种 CDAD的重要毒力因子。艰难梭菌的毒素A和B显示大量的序列和结构同源 性。二者均具有一个C端受体结合结构域，该结构域含有多个重复序列、一 个中央疏水结构域和一个N端糖基转移酶结构域。受体结合结构域介导了毒 素经由宿主受体与肠道上皮细胞的结合，这些宿主受体在人体中仍定义不 明。在经内体途径内化后，中央疏水结构域插入内体的膜中。内体的酸性pH 触发孔形成以及毒素的氨基端结构域易位至细胞溶胶中。胞质靶Rho GTP酶 的糖基化作用造成细胞骨架破坏和细胞死亡。毒素A和B显示出不同病理学 特征，在引起疾病方面存在潜在协同性。

最近，艰难梭菌的一种超强毒力菌株暴发已经导致严重疾病比率增加、 复发更频繁并且死亡率增加。一个超强毒力菌株BI/NAP1/027毒素分型III， 是历史上罕有的，但目前却在流行。超强毒力菌株如B1/NAP1/027产生的毒 素A和毒素B比非超强毒力艰难梭菌菌株多几倍，这使得这些菌株在感染后 更难以治疗。由于超强毒力菌株对常用抗微生物药和抗生素的耐药性问题日 趋严重，使得这些菌株更难以治疗和约束（contain），所以需要额外的治疗 手段和更有力的疗法来对付与超强毒力艰难梭菌分离株相关的超强毒力和疾 病复发。

针对艰难梭菌感染的目前抗生素疗法包括使用万古霉素和/或甲硝唑；然 而这些抗生素由于应答率不完整以及和再感染率和复发率日益增加而受限。 自2000年以来，已经报道了甲硝唑疗法的失效率明显更高（23-25）。抗生素 治疗后的高复发率可以因正常结肠菌群的持续破坏所致，这为艰难梭菌在没 有多少竞争的情况下恢复的机会（26-28）。复发风险在已出现一次复发的患 者中增加，从初始发作后约20%上升至两次或多次复发后超过60% （29,30）。这种复发风险增加已经与不能引起足够的抗毒素抗体应答相关 （31）。实际上，在抗微生物疗法末期具有最高血清IgG抗毒素滴度的患者 其复发风险降低（32）。在一项单独的研究中，血清抗毒素B抗体水平与免 遭复发性CDAD的保护作用相关（33）。

艰难梭菌感染的流行已经骤然增加，尤其在经常虚弱的老年人群中。大 约三分之一的艰难梭菌感染患者通常在初始疾病的两个月内出现感染复发。 重复感染往往比原发疾病更严重；它们经常是更致命的。年老成人和免疫系 统削弱的人群尤其易于复发感染。若不迅速适当地治疗，艰难梭菌感染的并 发症包括脱水、肾衰竭、肠穿孔、可以导致结肠破裂的中毒性巨结肠、以及 死亡。

虽然在美国艰难梭菌感染是住院患者最常获得的感染，但这种感染也可 以在医院之外的社区中获得。据估计，每年在美国的社区中出现20,000例艰难 梭菌感染。国际上，发病率是高度变化的并且取决于多种因素，包括使用内 镜检查术来建立诊断的频率、抗微生物药使用模式以及流行病学模式。

因此，清楚的是，由艰难梭菌感染引起的疾病通常在医院环境和社区中 均能威胁所有年龄段的人群的生命。在当今世界，对于面临住院或处于长期 医院护理的人群存在着更为现实的艰难梭菌感染风险。由于在医院环境之外 还存在接触艰难梭菌感染的机会，所以幼儿和婴儿接触本疾病的可能性是很 大的。此外，存在着一种可能，即用来治疗艰难梭菌的当前抗生素方案可能 未达到最佳效果。表现出艰难梭菌相关性疾病的患者需要全面的住院患者护 理以及长期留院观察。与艰难梭菌相关性疾病患者所需要的高度支持性医院 护理和治疗相关的成本是庞大的，并且涉及昂贵的资源，例如更多医师和护 理人员、实验室检验和监测、合并用药和额外的支持性措施。

因此，为了预防性和治疗性益处，对于更有效的能针对艰难梭菌引起的 致命性疾病的药品、药物和疗法存在着需要，尤其是针对艰难梭菌产生的强 力毒素。对用于艰难梭菌相关性疾病的成功和长效疗法存在着未满足的医疗 需要，这些疗法提供了较低的耐药性形成可能性以及更高的患者成功应答和 疾病消除，使得疾病根除。

发明简述

本发明至少部分地提供了包含抗艰难梭菌毒素A和/或毒素B抗体的新 抗体试剂和组合物。这些试剂和组合物可以有益于治疗数目日益增加的患有 艰难梭菌相关性感染和疾病的受试者、提供改善的生活质量、消除CDAD和 艰难梭菌感染并且帮助这些感染个体存活。

在一个方面，提供了一种分离的抗体或它的一个抗原结合片段，该抗体 或抗原结合片段特异性地结合艰难梭菌毒素A并且与以ATCC登录号PTA- 9692、PTA-9694或PTA-9888保藏的杂交瘤细胞系所产生的一种单克隆抗体 交叉竞争结合艰难梭菌毒素A。在一个实施方案中，该杂交瘤细胞系以 ATCC登录号PTA-9692保藏。在一个实施方案中，该杂交瘤细胞系以ATCC 登录号PTA-9694保藏。在一个实施方案中，该杂交瘤细胞系以ATCC登录号 PTA-9888保藏。在一个实施方案中，该单克隆抗体或它的抗原结合片段处于 嵌合或人源化形式。

在一个方面，提供了一种分离的抗体或它的一个抗原结合片段，该抗体 或抗原结合片段特异性结合由一种单克隆抗体所定义的艰难梭菌毒素A表 位，该单克隆抗体由以ATCC登录号PTA-9692、PTA-9694或PTA-9888保藏 的杂交瘤细胞系产生。在一个实施方案中，该杂交瘤细胞系以ATCC登录号 PTA-9692保藏。在一个实施方案中，该杂交瘤细胞系以ATCC登录号PTA- 9694保藏。在一个实施方案中，该杂交瘤细胞系以ATCC登录号PTA-9888 保藏。在一个实施方案中，该单克隆抗体或它的抗原结合片段处于嵌合或人 源化形式。

在另一个方面，提供了一种分离的抗体或它的一个抗原结合片段，该抗 体或抗原结合片段特异性地结合艰难梭菌毒素B并且与以ATCC登录号PTA- 9693或PTA-9692保藏的杂交瘤细胞系所产生的一种单克隆抗体交叉竞争结 合艰难梭菌毒素B。在一个实施方案中，该杂交瘤细胞系以ATCC登录号 PTA-9693保藏。在一个实施方案中，该杂交瘤细胞系以ATCC登录号PTA- 9692保藏。在一个实施方案中，该单克隆抗体或它的抗原结合片段处于嵌合 或人源化形式。

在一个方面，提供了一种分离的抗体或它的一个抗原结合片段，该抗体 或抗原结合片段特异性地结合一种单克隆抗体所定义的艰难梭菌毒素B表 位，该单克隆抗体由以ATCC登录号PTA-9693或PTA-9692保藏的杂交瘤细 胞系产生。在一个实施方案中，该杂交瘤细胞系以ATCC登录号PTA-9693保 藏。在一个实施方案中，该杂交瘤细胞系以ATCC登录号PTA-9692保藏。在 一个实施方案中，该单克隆抗体或它的抗原结合片段处于嵌合或人源化形 式。在一个实施方案中，该分离的抗体或它的抗原结合片段中和了艰难梭菌 毒素B的体内毒性。在一个实施方案中，该抗体或它的抗原结合片段以从0.1 至1000μg的量值中和了艰难梭菌毒素B的体内毒性。

在另一个方面，提供了单克隆抗体PA-39（ATCC登录号9692）或它的 一个抗原结合片段。在另一个方面，提供了单克隆抗体PA-50（ATCC登录号 PTA-9694）或它的一个抗原结合片段。在另一个方面，提供了单克隆抗体 PA-38（ATCC登录号PTA-9888）或它的一个抗原结合片段。在另一个方 面，提供了单克隆抗体PA-41（ATCC登录号PTA-9693）或它的一个抗原结 合片段。在一个实施方案中，该单克隆抗体或它的抗原结合片段处于嵌合或 人源化形式。

在又一个方面，提供一种表达载体，它包含了编码如以上和在此所说明 的抗体或它们的抗原结合片段的至少一个核酸分子。在又一个方面，提供一 种表达载体，它包含了编码如以上或在此所说明的抗体或它们的抗原结合片 段的重链或其部分的一个核酸分子。在又一个方面，提供一种表达载体，它 包含了编码如以上或在此中所说明的抗体或它们的抗原结合片段的轻链或其 部分的一个核酸分子。在又一个方面，提供一种表达载体，它包含了编码如 以上或在此所说明的抗体或它们的抗原结合片段的重链或其部分、以及轻链 或其部分的至少一个核酸分子。

在另一个方面，提供一种宿主细胞，它由以上和在此所说明的任何一种 表达载体转化或转染而得。在另一个方面，提供了一种质粒，它编码了如以 上和在此所说明的任何一种抗体或它们的抗原结合片段。

在另一个方面，提供了如以上和在此所说明的分离的抗艰难梭菌毒素A 抗体或抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段中和了艰难梭菌毒素A的 体内毒性。在一个实施方案中，该抗体或抗原结合片段以0.1μg至1000μg、 或1μg/kg至100,000μg/kg的量值中和了艰难梭菌毒素A的体内毒性。在另 一个实施方案中，该分离的抗体或抗原结合片段以一个量值中和了艰难梭菌 毒素A的体内毒性，该量值选自从0.5μg至1000μg、或从5μg至250μg、 或从10mg/kg至50mg/kg。在一个实施方案中，该抗体是单克隆抗体PA-39 （ATCC登录号9692）或它的一个抗原结合片段。在一个实施方案中，该抗 体是单克隆抗体PA-50（ATCC登录号PTA-9694）或它的一个抗原结合片 段。在一个实施方案中，该抗体是单克隆抗体PA-38（ATCC登录号PTA- 9888）或它的一个抗原结合片段。在一个实施方案中，该单克隆抗体或它的 抗原结合片段处于嵌合或人源化形式。

在另一个方面提供了如以上和在此所说明的分离的抗艰难梭菌毒素B抗 体或抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段中和了艰难梭菌毒素B的体 内毒性。在一个实施方案中，该分离的抗体或它的抗原结合片段以一个量值 中和了艰难梭菌毒素B的体内毒性，该量值选自从0.5μg至1000μg、0.5 μg、5μg、40μg、50μg、100μg、200μg、1000μg或从10mg/kg至50 mg/kg。在一个实施方案中，该抗体是单克隆抗体PA-39（ATCC登录号 9692）或它的一个抗原结合片段。在一个实施方案中，该抗体是单克隆抗体 PA-41（ATCC登录号PTA-9693）或它的一个抗原结合片段。在一个实施方 案中，该单克隆抗体或它的抗原结合片段处于嵌合或人源化形式。

另一个方面提供了如以上和在此所说明的一种分离的抗艰难梭菌毒素A 抗体或抗原结合片段，其中当与特异性地结合和/或中和艰难梭菌毒素B的分 离的抗体或其抗原结合片段联合给予至艰难梭菌感染的受试者时，该抗体或 抗原结合片段治疗该受试者的CDAD和/或增加其存活率。在一个实施方案 中，该抗毒素A和抗毒素B抗体或它们的片段同时给予。在一个实施方案 中，该抗毒素A和抗毒素B抗体或它们的片段在不同时间给予。在一个实施 方案中，该抗毒素A和抗毒素B抗体或它们的片段依次给予。在一个实施方 案中，这些特异性地结合艰难梭菌毒素A的分离的抗体或抗原结合片段是以 ATCC登录号PTA-9692、PTA-9694或PTA-9888保藏的杂交瘤细胞系所产生 的一种抗体、它的一个抗原结合片段、它的一种人源化形式、或一种进行交 叉反应用于结合毒素A的单克隆抗体。在一个实施方案中，这种特异性地结 合艰难梭菌毒素B的分离的抗体或抗原结合片段是以ATCC登录号PTA-9693 或PTA-9692保藏的杂交瘤细胞系所产生的一种抗体、它的一个抗原结合片 段、它的一种人源化形式、或一种进行交叉反应用于毒素B的单克隆抗体。

另一个方面提供了如以上和在此所说明的一种分离的抗艰难梭菌毒素B 抗体或抗原结合片段，其中当与特异性地结合和/或中和艰难梭菌毒素A的分 离的抗体或其抗原结合片段联合给予至艰难梭菌感染的受试者时，该抗体或 抗原结合片段治疗该受试者的CDAD和/或增加其存活率。在一个实施方案 中，该抗毒素A和抗毒素B抗体或它们的片段同时给予。在一个实施方案 中，该抗毒素A和抗毒素B抗体或它们的片段在不同时间给予。在一个实施 方案中，该抗毒素A和抗毒素B抗体或它们的片段依次给予。在一个实施方 案中，这种特异性地结合艰难梭菌毒素A的分离的抗体或抗原结合片段是以 ATCC登录号PTA-9692、PTA-9694或PTA-9888保藏的杂交瘤细胞系所产生 的一种抗体、它的一个抗原结合片段、它的一种人源化形式、或一种进行交 叉反应用于结合毒素A的单克隆抗体。在一个实施方案中，这种特异性地结 合艰难梭菌毒素B的分离的抗体或抗原结合片段是以ATCC登录号PTA-9693 或PTA-9692保藏的杂交瘤细胞系所产生的一种抗体、它的一个抗原结合片 段、它的一种人源化形式、或一种进行交叉反应用于结合毒素B的单克隆抗 体。

另一个方面提供了如以上和在此所说明的一种分离的抗艰难梭菌毒素A 抗体或抗原结合片段，其中当与特异性地结合艰难梭菌毒素B的分离的抗体 或其抗原结合片段联合给予至艰难梭菌感染的受试者时，该抗体或抗原结合 片段治疗该受试者的CDAD和/或改善其存活率。在一个实施方案中，该抗毒 素A抗体或它的抗原结合片段按照一个量值给药，该量值为1μg至1000 μg，或从1μg至250μg或从5μg至100μg，并且抗毒素B抗体或它的抗原 结合片段的剂量按照一个量值给药，该量值是从0.1μg至1000μg、或从1μg 至250μg或从5μg至100μg。在一个实施方案中，这种特异性地结合艰难梭 菌毒素A的分离的抗体或抗原结合片段是以ATCC登录号PTA-9692、PTA- 9694或PTA-9888保藏的杂交瘤细胞系所产生的一种抗体、它的一个抗原结 合片段、它的一种人源化形式、或一种进行交叉反应用于结合毒素A的单克 隆抗体。在一个实施方案中，这种特异性地结合艰难梭菌毒素B的分离的抗 体或抗原结合片段是以ATCC登录号PTA-9693或PTA-9692保藏的杂交瘤细 胞系所产生的抗体、它的一个抗原结合片段、它的一种人源化形式、或一种 进行交叉反应用于结合毒素B的单克隆抗体。

另一个方面提供了如以上和在此所说明的分离的抗艰难梭菌毒素A抗体 或抗原结合片段，其中当与特异性地结合艰难梭菌毒素B的分离的抗体或其 抗原结合片段联合给予至艰难梭菌感染的受试者时，该抗体或抗原结合片段 治疗该受试者的CDAD和/或改善其存活率。在一个实施方案中，该抗毒素A 抗体或它的抗原结合片段以50mg/kg的量值给药，该抗毒素B抗体或它的抗 原结合片段以50mg/kg的量值给药。在一个实施方案中，这种特异性地结合 艰难梭菌毒素A的分离的抗体或抗原结合片段是以ATCC登录号PTA-9692、 PTA-9694或PTA-9888保藏的杂交瘤细胞系所产生的一种抗体、它的一个抗 原结合片段、它的一种人源化形式、或一种进行交叉反应用于结合毒素A的 单克隆抗体。在一个实施方案中，这种特异性地结合艰难梭菌毒素B的分离 的抗体或抗原结合片段是以ATCC登录号PTA-9693或PTA-9692保藏的杂交 瘤细胞系所产生的一种抗体、它的一个抗原结合片段、它的一种人源化形 式、或一种进行交叉反应用于结合毒素B的单克隆抗体。

另一个方面提供了如以上和在此所说明的分离的抗艰难梭菌毒素A抗体 或抗原结合片段，其中当与特异性地结合艰难梭菌毒素B的分离的抗体或其 抗原结合片段联合给予至艰难梭菌感染的受试者时，该抗体或抗原结合片段 实现50%、60%、70%、80%、90%或100%的治愈率或存活率。在一个实施 方案中，该抗体或抗原结合片段以40-50mg/kg的剂量施用每2天1次×4。 在一个实施方案中，这种特异性地结合艰难梭菌毒素A的分离的抗体或抗原 结合片段是以ATCC登录号PTA-9692、PTA-9694或PTA-9888保藏的杂交瘤 细胞系所产生的一种抗体、它的一个抗原结合片段、它的一种人源化形式、 或与以ATCC登录号PTA-9692、PTA-9694或PTA-9888保藏的一种或多种单 克隆抗体交叉竞争结合毒素A的单克隆抗体。在一个实施方案中，这种特异 性地结合艰难梭菌毒素B的分离的抗体或抗原结合片段是以ATCC登录号 PTA-9693或PTA-9692保藏的杂交瘤细胞系所产生的一种抗体、它的一个抗 原结合片段、它的一种人源化形式、或与以ATCC登录号PTA-9692或PTA- 9693保藏的一种或多种单克隆抗体交叉竞争结合毒素B的单克隆抗体。

在另一个方面提供了如在此说明的分离的抗艰难梭菌毒素A或抗艰难梭 菌毒素B抗体或它们的抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段处于一种 或多种单克隆抗体、人源化抗体、人抗体或嵌合抗体的形式或来自以上抗 体。

在另一个方面提供了如在此说明的分离的抗艰难梭菌毒素A或抗艰难梭 菌毒素B抗体或它们的抗原结合片段，其中该抗体或它的抗原结合片段处于 双特异性或双功能性抗体的形式、或包含于该抗体中。

另一个方面提供了一种双特异性抗体或它的一个抗原结合片段，该抗体 或抗原结合片段包含(i)以ATCC登录号PTA-9692、PTA-9694或PTA-9888 保藏的杂交瘤细胞系所产生的一种单克隆抗体、它的一个抗原结合片段、该 抗体或其抗原结合片段的一种人源化形式、该抗体或其抗原结合片段的一个 重链可变区、和/或该抗体或其抗原结合片段的一个轻链可变区；以及(ii)以 ATCC登录号PTA-9693或PTA-9692保藏的杂交瘤细胞系所产生的一种单克 隆抗体、它的一个抗原结合片段、该抗体或其抗原结合片段的一种人源化形 式、该抗体或其抗原结合片段的一个重链可变区、和/或该抗体或其抗原结合 片段的一个轻链可变区。

另一个方面提供了一种双特异性抗体或它的抗原结合片段，其中该抗体 包含(i)以ATCC登录号PTA-9692保藏的杂交瘤细胞系所产生的一种单克隆 抗体、它的一个抗原结合片段、该抗体或其抗原结合片段的一种人源化形 式、该抗体或其抗原结合片段的一个重链可变区、和/或该抗体或其抗原结合 片段的一个轻链可变区；以及(ii)以ATCC登录号PTA-9693或PTA-9692保 藏的杂交瘤细胞系所产生的一种分离的单克隆抗体、它的一个抗原结合片 段、该抗体或其抗原结合片段的一种人源化形式、该抗体或其抗原结合片段 的一个重链可变区、和/或该抗体或其抗原结合片段的一个轻链可变区。

在多种实施方案中，如以上和在此所说明的抗体或它的抗原结合片段， 其中该抗原结合片段选自Fab片段、F(ab')₂片段和Fv片段。在另一个方面， 提供了如以上和在此所说明的分离的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或 其抗原结合片段是一种单链抗体或包含该抗体。

在另一个方面，提供了一种组合物，该组合物包含如以上和在此所说明 的本发明的抗体或其抗原结合片段中的一种或多种、以及一种药学可接受的 载体、赋形剂、运载体、或稀释剂。在一个实施方案中，该组合物包含本发 明的至少一种抗毒素A抗体，例如mAb PTA-9692、mAb PTA-9694、mAb  PTA-9888、它的一个抗原结合片段、或它的一种人源化形式，以及本发明的 至少一种抗毒素B抗体，例如mAb PTA-9692、mAb PTA-9693、它的一个抗 原结合片段、或它的一种人源化形式。在一个实施方案中，该组合物包含本 发明的一种抗毒素A抗体，例如mAb PTA-9888、它的一个抗原结合片段、 或它的一种人源化形式，以及本发明的一种抗毒素B抗体，例如mAb PTA- 9693、它的一个抗原结合片段、或它的一种人源化形式。在一个实施方案 中，该组合物包含本发明的一种抗毒素A抗体，例如mAb PTA-9694、它的 一个抗原结合片段、或它的一种人源化形式，以及本发明的一种抗毒素B抗 体，例如mAb PTA-9693、它的一个抗原结合片段、或它的一种人源化形式。 在一个实施方案中，每种mAb以相同的量值存在于这种组合物中。在一个实 施方案中，每种mAb相对于彼此按照以重量计1:1比率存在于这种组合物 中。在一个实施方案中，每种mAb以不同的量值存在于该组合物中。在一个 实施方案中，每种mAb相对于彼此按照以重量计除1:1之外的比率存在于这 种组合物中，其中该比率如在此所提供。在一个实施方案中，这种组合物进 一步包含一种额外的治疗药。在一个实施方案中，该额外的治疗药是一种抗 生素、抗菌药、杀菌剂、抑菌剂或它们的一种组合。在一个实施方案中，该 额外的治疗药是甲硝唑、万古霉素、非达霉素或它们的一种组合。

在另一个方面，提供了一种组合物，该组合物包含如以上和在此所说明 的一种本发明的表达载体、以及一种药学可接受的载体、赋形剂、运载体、 或稀释剂。在另一个方面提供了一种组合物，该组合物包含了携带如以上和 在此所说明的一种本发明的表达载体的宿主细胞，以及一种药学可接受的载 体、赋形剂、运载体、或稀释剂。在另一个方面提供了一种组合物，该组合 物包含如以上和在此所说明的一种本发明质粒、以及一种药学可接受的载 体、赋形剂、运载体、或稀释剂。

另一个方面提供了一种包含至少2条多肽链的结合蛋白，该多肽链包含 用于结合艰难梭菌毒素A和毒素B的结合位点，其中至少一条多肽链包含一 个第一重链可变区、一个第二重链可变区、以及一个重链恒定区或其部分； 并且至少一条多肽链包含一个第一轻链可变区、一个第二轻链可变区、以及 一个轻链恒定区或其部分，其中这种包含多肽链的可变区形成了艰难梭菌毒 素A和毒素B的功能性结合位点。在一个实施方案中，该结合蛋白的第一重 链可变区和第一轻链可变区形成了艰难梭菌毒素A的功能性结合位点，并且 该结合蛋白的第二重链可变区和第二轻链可变区形成了艰难梭菌毒素B的功 能性结合位点。在一个实施方案中，该结合蛋白的第一重链可变区和第一轻 链可变区形成了艰难梭菌毒素B的功能性结合位点，并且该结合蛋白的第二 重链可变区和第二轻链可变区形成了艰难梭菌毒素A的功能性结合位点。在 一个实施方案中，该结合蛋白包含Fc区。在一个实施方案中，该结合蛋白中 和了艰难梭菌毒素A和毒素B的毒性。在多个实施方案中，该结合蛋白针对 毒素A或毒素B的结合速率常数（Kon）选自至少10²M^-1s^-1；至少10³M^-1s^-1；至少10⁴M^-1s^-1；至少10⁵M^-1s^-1；至少10⁶M^-1s^-1；或至少10⁷M^-1s^-1，正如 表面等离子体共振法所测量。在多个实施方案中，该结合蛋白针对毒素A或 毒素B的脱离速率常数（Koff）选自最多10^-3s^-1；最多10^-4s^-1；最多10^-5s^-1；或最多10^-6s^-1，正如表面等离子体共振法所测量。在多个实施方案中，该 结合蛋白针对毒素A或毒素B的解离常数（K_D）选自最多10^-7M；最多10^-8M；最多10^-9M；最多10^-10M；最多10^-11M；最多10^-12M；或最多10^-13M。

在另一个方面，提供了一种组合物，该组合物包含如以上和在此所说明 的结合蛋白以及一种药学可接受的载体、赋形剂、运载体、或稀释剂。在一 个实施方案中，该组合物进一步包含一种额外的治疗药。在一个实施方案 中，该组合物的额外治疗药是一种抗生素、抗菌药、杀菌剂、抑菌剂或它们 的一种组合。在一个实施方案中，该组合物的额外治疗药是甲硝唑、万古霉 素、非达霉素、硝唑尼特、利福昔明、雷莫拉宁或它们的一种组合。

在另一个方面，提供了以ATCC登录号PTA-9692、PTA-9693、PTA- 9494或PTA-9888保藏的杂交瘤细胞系。

另一个方面提供了一种治疗患有艰难梭菌感染或艰难梭菌相关性疾病的 受试者的方法，包括向该受试者给予如在此所说明的至少一种组合物。在一 个实施方案中，这些组合物包括本发明的一种或多种抗体，优选处于人源化 形式。在一个实施方案中，这些组合物含有在此提供的处于人源化形式的至 少一种抗毒素A抗体、或它的一个抗原结合片段，以及本发明的处于人源化 形式的至少一种抗毒素B抗体、或它的一个抗原结合片段。在多个实施方案 中，在这些组合物中可能包含一种或多种额外的治疗性试剂、药物、化合物 或成分。在一个实施方案中，这些组合物进一步包括一种药学可接受的载 体、稀释剂、运载体、或赋形剂。在一个实施方案中，这些组合物以一个量 值来给药，该量值有效地治疗艰难梭菌感染或艰难梭菌相关性疾病，例如艰 难梭菌相关性腹泻（CDAD）。在一个实施方案中，两种组合物以一个量值 给予该受试者，该量值有效地治疗艰难梭菌感染或艰难梭菌相关性疾病。在 一个实施方案中，这两种组合物在相同时间给予。在一个实施方案中，这两 种组合物在不同时间给予。

另一个方面提供了一种抑制或中和艰难梭菌毒素A和毒素B对细胞所致 毒性的方法，该方法包括使该细胞经历一个有效的艰难梭菌毒素A抑制或中 和剂量的本发明的抗毒素A单克隆抗体或它的一个抗原结合片段、以及一个 有效的艰难梭菌毒素B抑制或中和剂量的本发明的抗毒素B单克隆抗体或它 的一个抗原结合片段。在一个实施方案中，该抗毒素A抗体和该抗毒素B抗 体处于人源化形式。在一个实施方案中，该抗毒素A抗体和抗毒素B抗体处 于嵌合形式。在一个实施方案中，这些抗体或它们的抗原结合片段在相同时 间给予。在一个实施方案中，这些抗体或它们的抗原结合片段在不同时间给 予。在该方法的一个实施方案中，该细胞存在于受试者体内，并且这些抗体 或他们的抗原结合片段以一个量值该受试者，该量值有效抑制或中和艰难梭 菌毒素A和毒素B。

另一个方面提供了一种抑制或中和艰难梭菌毒素对细胞所致毒性的方 法，该方法包括使该细胞经历一个有效的艰难梭菌毒素抑制或中和剂量的如 在此所说明的本发明的至少一种组合物。在该方法的一个实施方案中，该细 胞经历了一个有效的艰难梭菌毒素抑制或中和剂量的两种组合物，其中之一 包含一种抗毒素A抗体或其抗原结合片段，并且另一种包含一种抗毒素B抗 体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，这些抗体是人源化的。在一个实 施方案中，这些抗体是嵌合的。在实施方案中，这两种组合物在相同或不同 时间给予。在一个实施方案中，该细胞存在于受试者体内并且该至少一种组 合物以一个有效抑制或中和艰难梭菌毒素的量值给予该受试者。

另一个方面提供了一种中和由艰难梭菌超强毒力菌株所产生的毒素的方 法，该方法包括向有需要的受试者给予一个量值的(i)本发明的一种抗体或其 抗原结合片段，其中该抗体结合并且中和艰难梭菌毒素A，以及(ii)本发明的 一种抗体或其抗原结合片段，其中该抗体结合并且中和艰难梭菌毒素B，该 量值有效地中和了由该超强毒力菌株产生的毒素。在一个实施方案中，(i)和 (ii)的抗体是人源化抗体。在一个实施方案中，(i)和(ii)的抗体是嵌合抗体。 在实施方案中，这些抗体或它们的抗原结合片段在相同时间或不同时间给 予。在一个实施方案中，该超强毒力菌株的毒素是毒素A和毒素B。在一个 实施方案中，该艰难梭菌超强毒力菌株是BI/NAP1/027、CCL676、 HMC553、Pitt45、CD196、蒙特利尔5或蒙特利尔7.1中的一种或多种。在一 个实施方案中，该抗毒素A抗体或它的抗原结合片段具有一种针对艰难梭菌 超强毒力菌株所产生的毒素A的中和活性，如由2.6^-12M至7.7^-11M或7.7^-12M至4.8^-8M的EC₅₀值所确定。在一个实施方案中，该抗毒素B抗体或它的 抗原结合片段具有一种针对艰难梭菌超强毒力菌株所产生的毒素B的中和活 性，如由从1.1^-11M至6.5^-10M的EC₅₀值所确定。

在另一个方面，提供一种试剂盒，该试剂盒包含本发明和如在此所说明 的一种抗体或它的抗原结合片段，尤其是处于人源化形式，以及使用说明 书。在一个实施方案中，这些抗体或抗原结合片段被放置在该试剂盒中同一 容器内。在一个实施方案中，这些抗体或抗原结合片段被放置在该试剂盒中 单独的容器内。在一个实施方案中，该试剂盒包含一种用于偶联这些抗体或 其抗原结合片段的连接物。在一个实施方案中，该试剂盒包含一种额外的治 疗药，该治疗药可以是一种抗生素、抗菌药、杀菌剂、或抑菌剂。在一个实 施方案中，该额外的治疗药是甲硝唑、万古霉素、非达霉素、硝唑尼特、利 福昔明、雷莫拉宁、或它们的一种组合。

在另一个方面，提供了中和艰难梭菌超强毒力菌株的毒素A或毒素B的 一种单克隆抗体或其抗原结合片段，特别处于人源化形式。在一个实施方案 中，该单克隆抗体由ATCC登录号PTA-9692、PTA-9694、PTA-9888、或 PTA-9693命名，并且该抗体分别由以ATCC登录号PTA-9692、PTA-9694、 PTA-9888、或PTA-9693保藏的杂交瘤细胞系产生。在一个实施方案中，这 种由以ATCC登录号PTA-9692、PTA-9694、PTA-9888、PTA-9693、或PTA- 9692保藏的杂交瘤细胞系所产生的抗体已经被人源化或处于嵌合形式。在一 个实施方案中，该艰难梭菌超强毒力菌株是BI/NAP1/027、CCL676、 HMC553、Pitt45、CD196、蒙特利尔5以及蒙特利尔7.1中的一种或多种。

在另一个方面，提供了一种治疗无症状、但却易遭受接触性艰难梭菌感 染或存在这种患病风险的受试者的方法，该方法包括：给予该受试者一个量 值的(i)在此中提供并且如在此所说明的一种抗艰难梭菌毒素A抗体或其抗原 结合片段以及(ii)在此中提供并且如在此所说明的一种抗艰难梭菌毒素B抗 体或其抗原结合片段，该量值有效地治疗该受试者。在该方法的一个实施方 案中，该受试者住院。

在另一个方面，提供了一种针对艰难梭菌毒素A产生的人源化单克隆抗 体。在一个实施方案中，这种抗艰难梭菌毒素A抗体由两条重链多肽组成， 其中每条重链含有一个包含如在SEQ ID NO:1中给出的氨基酸序列的VH区 和一个人CH区，以及两条轻链多肽，其中每条轻链含有一个包含如在SEQ  ID NO:3中给出的氨基酸序列的VL区和一个人CL区。在一个实施方案中， 这种抗艰难梭菌毒素A抗体由两条重链多肽组成，其中每条重链含有一个包 含如在SEQ ID NO:2中给出的氨基酸序列的VH区和一个人CH区，以及两 条轻链多肽，其中每条轻链含有一个包含如在SEQ ID NO:3中给出的氨基酸 序列的VL区和一个人CL区。在一个实施方案中，这种抗艰难梭菌毒素A抗 体由两条重链多肽组成，其中每条重链含有一个包含如在SEQ ID NO:1中给 出的氨基酸序列的VH区和一个人CH区，以及两条轻链多肽，其中每条轻链 含有一个包含如在SEQ ID NO:4中给出的氨基酸序列的VL区和一个人CL 区。在一个实施方案中，这种抗艰难梭菌毒素A抗体由两条重链多肽组成， 其中每条重链含有一个包含如在SEQ ID NO:2中给出的氨基酸序列的VH区 和一个人CH区，以及两条轻链多肽，其中每条轻链含有一个包含如在SEQ  ID NO:4中给出的氨基酸序列的VL区和一个人CL区。在一个实施方案中， 这种抗艰难梭菌毒素A抗体由两条重链多肽组成，其中每条重链含有一个包 含如在SEQ ID NO:5中给出的氨基酸序列的VH区和一个人CH区，以及两 条轻链多肽，其中每条轻链含有一个包含如在SEQ ID NO:7中给出的氨基酸 序列的VL区和一个人CL区。在一个实施方案中，这种抗艰难梭菌毒素A抗 体由两条重链多肽组成，其中每条重链含有一个包含如在SEQ ID NO:6中给 出的氨基酸序列的VH区和一个人CH区，以及两条轻链多肽，其中每条轻链 含有一个包含如在SEQ ID NO:7中给出的氨基酸序列的VL区和一个人CL 区。

在另一个方面，提供了一种针对艰难梭菌毒素B产生的人源化单克隆抗 体。在一个实施方案中，这种抗艰难梭菌毒素B抗体由两条重链多肽组成， 其中每条重链含有一个包含如在SEQ ID NO:8中给出的氨基酸序列的VH区 和一个人CH区，以及两条轻链多肽，其中每条轻链含有一个包含如在SEQ  ID NO:10中给出的氨基酸序列的VL区和一个人CL区。在一个实施方案 中，这种抗艰难梭菌毒素B抗体由两条重链多肽组成，其中每条重链含有一 个包含如在SEQ ID NO:9中给出的氨基酸序列的VH区和一个人CH区，以 及两条轻链多肽，其中每条轻链含有一个包含如在SEQ ID NO:10中给出的 氨基酸序列的VL区和一个人CL区。

在另一个方面，提供了一种针对艰难梭菌毒素A而产生的单克隆抗体或 它的一个片段，其中该抗体由两条重链多肽和两条轻链多肽组成，每条重链 含有一个VH区和一个人CH区，每条轻链含有一个VL区和一个人CL区。 编码SEQ ID NO:14抗体重链多肽的氨基酸序列的核酸序列（或cDNA）在 SEQ ID NO:15中给出（图38B）；编码SEQ ID NO:16抗体轻链多肽的氨基 酸序列的核酸序列（或cDNA）在SEQ ID NO:17中给出（图38A）。

在另一个方面，提供了一种针对艰难梭菌毒素A而产生的单克隆抗体或 它的一个片段，其中该抗体由两条重链多肽和两条轻链多肽组成，每条重链 含有一个VH区和一个人CH区，每条轻链含有一个VL区和一个人CL区。 编码SEQ ID NO:18抗体重链多肽的氨基酸序列的核酸序列（或cDNA）在 SEQ ID NO:19中给出（图39B）；编码SEQ ID NO:20抗体轻链多肽的氨基 酸序列的核酸序列（或cDNA）在SEQ ID NO:21中给出（图39A）。

在另一个方面，提供了一种针对艰难梭菌毒素B而产生的单克隆抗体或 它的一个片段，其中该抗体由两条重链多肽和两条轻链多肽组成，每条重链 含有一个VH区和一个人CH区，每条轻链含有一个VL区和一个人CL区。 编码SEQ ID NO:22抗体重链多肽的氨基酸序列的核酸序列（或cDNA）在 SEQ ID NO:23中给出（图40B）；编码SEQ ID NO:24抗体轻链多肽的氨基 酸序列的核酸序列（或cDNA）在SEQ ID NO:25中给出（图40A）。

在指向本发明的前述人源化单克隆抗体中任一种的多种实施方案中，该 单克隆抗体的CH区选自IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgG4、IgA、IgE或 IgM。在一个实施方案中，该CH区是IgG1。在一个实施方案中，该CL区选 自κ或λ同种型。在一个实施方案中，噶CL区是κ同种型。在其他实施方案 中，包括了如在此说明的人源化抗体或它们的抗原结合片段的CDR，即 CDR1、CDR2和/或CDR3，以便结合和/或中和根据本发明的产品和方法中的 艰难梭菌毒素A和/或毒素B。

在另一个方面，提供了一种抗艰难梭菌毒素A抗体或它的一个片段，其 中L链的V区包含一个序列，该序列选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4以及 SEQ ID NO:7中的一个或多个。还提供了一种抗艰难梭菌毒素B抗体或它的 一个片段，其中L链的V区包含如SEQ ID NO:10中给出的一个序列。还提 供了一种抗艰难梭菌毒素A抗体或它的一个片段，其中H链的V区包含一个 序列，该序列选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5以及SEQ ID  NO:6中的一个或多个。还提供了一种抗艰难梭菌毒素B抗体或它的一个片 段，其中H链的V区包含一个序列，该序列选自SEQ ID NO:8或SEQ ID  NO:9中的一个或多个。

在另一个方面，提供了一种分离的抗体或它的一个抗原结合片段，该抗 体或抗原结合片段(i)特异性地结合艰难梭菌毒素A并且与以ATCC登录号 PTA-9692保藏的杂交瘤细胞系所产生的单克隆抗体交叉竞争结合艰难梭菌毒 素A，或(ii)特异性地结合以ATCC登录号PTA-9692保藏的杂交瘤细胞系所 产生的单克隆抗体来定义的艰难梭菌毒素A表位，其中这种由以ATCC登录 号PTA-9692保藏的杂交瘤细胞系所产生的单克隆抗体来定义的表位包括一个 在艰难梭菌毒素A的受体结合结构域外部的区域，例如易位结构域。在一个 实施方案中，该抗体处于人源化形式。在一个实施方案中，该抗体处于嵌合 形式。

在另一个方面，提供了一种分离的抗体或它的一个抗原结合片段，该抗 体或抗原结合片段(i)特异性地结合艰难梭菌毒素A并且与以ATCC登录号 PTA-9694保藏的杂交瘤细胞系所产生的单克隆抗体交叉竞争结合艰难梭菌毒 素A，或(ii)特异性地结合以ATCC登录号PTA-9694保藏的杂交瘤细胞系所 产生的单克隆抗体来定义的艰难梭菌毒素A表位，其中这种由以ATCC登录 号PTA-9694保藏的杂交瘤细胞系所产生的单克隆抗体来定义的表位包括在艰 难梭菌毒素A的受体结合结构域内的至少两个位点，例如C端受体结合表 位。在一个实施方案中，该抗体处于人源化形式。在一个实施方案中，这种 抗体处于嵌合形式。

在另一个方面，提供了一种分离的抗体或它的一个抗原结合片段，该抗 体或抗原结合片段(i)特异性地结合艰难梭菌毒素A并且与以ATCC登录号 PTA-9888保藏的杂交瘤细胞系所产生的单克隆抗体交叉竞争结合艰难梭菌毒 素A，或(ii)特异性地结合以ATCC登录号PTA-9888保藏的杂交瘤细胞系所 产生的单克隆抗体来定义的艰难梭菌毒素A表位，其中这种由以ATCC登录 号PTA-9888保藏的杂交瘤细胞系所产生的单克隆抗体来定义的表位包括艰难 梭菌毒素A的C端受体结合表位。在一个实施方案中，该抗体处于人源化形 式。在一个实施方案中，该抗体处于嵌合形式。

在另一个方面，提供了一种分离的抗体或它的一个抗原结合片段，该抗 体或抗原结合片段(i)特异性地结合艰难梭菌毒素B并且与以ATCC登录号 PTA-9693保藏的杂交瘤细胞系所产生的单克隆抗体交叉竞争结合艰难梭菌毒 素B结合，或(ii)特异性地结合以ATCC登录号PTA-9693保藏的杂交瘤细胞 系所产生的单克隆抗体来定义的艰难梭菌毒素B表位，其中这种由以ATCC 登录号PTA-9693保藏的杂交瘤细胞系所产生的单克隆抗体来定义的表位包括 艰难梭菌毒素B的N端酶结构域。在一个实施方案中，这种由以ATCC登录 号PTA-9693保藏的杂交瘤细胞系所产生的单克隆抗体来定义的表位包含通过 胱天蛋白酶1处理毒素B所产生的一个63kDa片段，该片段包含艰难梭菌毒 素B的N端酶结构域。在一个实施方案中，这种由以ATCC登录号PTA- 9692保藏的杂交瘤细胞系所产生的单克隆抗体来定义的表位包含艰难梭菌毒 素B的易位结构域。

在一个实施方案中，这种由以ATCC登录号PTA-9692保藏的杂交瘤细 胞系所产生的单克隆抗体来定义的表位包含通过胱天蛋白酶1处理毒素B所 产生的一个167kDa片段以及一种63kDa蛋白质，该蛋白质包含未处理的毒 素B。在一个实施方案中，该抗体处于人源化形式。在一个实施方案中，该 抗体处于嵌合形式。

在另一个方面，提供了一种产生结合并且中和艰难梭菌毒素A或毒素B 的单克隆抗体的方法，该方法涉及用无活性的类毒素A以周期性间隔来免疫 一只或多只受体动物；用增加量值的活性毒素A或活性毒素B以周期性间隔 对这些动物加强免疫；从与一种合适的永生化细胞系融合的经免疫和加强免 疫动物的免疫细胞中获得杂交瘤细胞，其中该杂交瘤细胞产生并且分泌抗毒 素A抗体（该抗体结合并且中和艰难梭菌毒素A）或抗毒素B抗体（该抗体 结合并且中和艰难梭菌毒素B）。在一个实施方案中，这种抗艰难梭菌毒素 A中和的单克隆抗体和/或抗艰难梭菌毒素B中和的单克隆抗体被分离。在该 方法的实施方案中，这些免疫步骤和加强免疫步骤包括一种佐剂。在一个实 施方案中，该佐剂是Quil A。在该方法的其他实施方案中，这些免疫步骤和 加强免疫步骤按照每3周的周期性间隔进行。在其他实施方案中，这些受体 动物用2个或3个剂量的类毒素A免疫，之后跟随用3个至5个递增剂量的 活性毒素A或活性毒素B加强免疫。

在另一个方面，提供了一种分离的抗体或它的抗原结合片段，该抗体或 抗原结合片段通过抑制、阻断、或防止毒素A内化以及细胞毒性而抑制、阻 断、或防止艰难梭菌毒素A毒性。在一个实施方案中，该抗体是一种单克隆 抗体。在一个实施方案中，该抗体是一种人源化或嵌合抗体。在一个实施方 案中，该抗体是PA-39（ATCC登录号PTA-9692）或人源化PA-39。在一个 实施方案中，该抗体是PA-50（ATCC登录号PTA-964）或人源化PA-50。在 其他实施方案中，该抗体与PA-39、人源化PA-39、PA-50、或人源化PA-50 竞争结合毒素A。在一个实施方案中，该抗体结合了一个位于毒素A的受体 结合结构域外部的毒素A区域内的单一位点。在一个实施方案中，该抗体通 过结合一个位于毒素A的受体结合结构域外部的毒素A区域内的单一位点而 与PA-39或其人源化形式竞争。在一个实施方案中，该抗体与毒素A的受体 结合结构域内的至少两个位点结合。在一个实施方案中，该抗体通过与毒素 A的受体结合结构域内的至少两个位点结合而与PA-50或其人源化形式竞 争。在一个实施方案中，该抗体经由一种混合竞争性作用机制而抑制毒素A 的毒性。在一个实施方案中，该抗体经由一种竞争性作用机制而抑制毒素A 的毒性。以上所有实施方案旨在涵盖该抗体的抗原结合片段。

在另一个方面，提供了一种分离的抗体或它的抗原结合片段，该抗体或 抗原结合片段通过与毒素B的N端酶区域内的表位位点结合而抑制、阻断、 或防止艰难梭菌毒素B的毒性。在一个实施方案中，该抗体是单克隆抗体。 在一个实施方案中，该抗体是一种人源化或嵌合抗体。在一个实施方案中， 该抗体是PA-41（ATCC登录号PTA-9693）或PA-41的一种人源化形式。在 一个实施方案中，该抗体与PA-41或人源化PA-41竞争结合艰难梭菌毒素B 的N端酶区域。在一个实施方案中，该抗体与PA-41或人源化PA-41竞争结 合艰难梭菌毒素B的N端酶区域内的一个单一位点。在一个实施方案中，该 抗体经由一种混合竞争性作用机制而抑制毒素B的毒性。

另一个方面提供了一种疫苗或免疫原，该疫苗或免疫原包含艰难梭菌毒 素A和/或毒素B的部分、片段或肽，它们含有由以下各项中的一种或多种所 识别和/或结合的表位区域：单克隆抗体PA-39（ATCC登录号PTA-9692）、 PA-39的一种人源化形式、单克隆抗体PA-50（ATCC登录号PTA-9694）、 PA-51的一种人源化形、单克隆抗体PA-41（ATCC登录号PTA-9693）、PA- 41的一种人源化形式、一种与单克隆抗体PA-39或其人源化形式竞争结合毒 素A的抗体、一种与单克隆抗体PA-50或其人源化形式竞争结合毒素A的抗 体、一种与单克隆抗体PA-41或其人源化形式竞争结合毒素B的抗体。在一 个实施方案中，该疫苗或免疫原包含艰难梭菌毒素A和毒素B的部分、片 段、或肽，它们含有由以下各项中的一种或多种所识别和/或结合的表位区 域：单克隆抗体PA-39（ATCC登录号PTA-9692）、PA-39的一种人源化形 式、或一种与单克隆抗体PA-39或其人源化形式竞争结合毒素A和毒素B的 抗体。在一个实施方案中，该疫苗或免疫原的毒素A和/或毒素B的含有表位 的部分、片段或肽通过蛋白酶剪切而衍生自毒素A或毒素B蛋白。在一个实 施方案中，该疫苗或免疫原的毒素A的部分、段片或肽通过肠激酶的蛋白酶 剪切而产生。在一个实施方案中，该疫苗或免疫原的毒素B部分、段片或肽 通过胱天蛋白酶（胱天蛋白酶1）的蛋白酶剪切而产生。在一个实施方案中， 该疫苗或免疫原的含有表位的部分或片段是化学或重组合成的毒素A或毒素 B蛋白的肽。在一个实施方案中，该疫苗或免疫原的、含有由该抗体识别和 结合的毒素A和/或毒素B的一个或多个表位区域的片段、部分或肽衍生自以 下一个或多个区域：毒素A的氨基端；毒素B的氨基端；毒素A的羧基端； 毒素B的羧基端；毒素A的受体结合结构域；毒素A的受体结合结构域之外 的区域；毒素B的受体结合结构域；毒素B的N端酶区域；毒素A的糖基转 移酶结构域；毒素B的糖基转移酶结构域；毒素A的蛋白酶解性结构域；毒 素B的蛋白酶解性结构域；毒素A的疏水性成孔结构域；或毒素B的疏水性 成孔结构域。在一个实施方案中，毒素A或毒素B的含有表位的片段或部分 其大小为小于300kDa、约158-160kDa、约100-105kDa（例如103kDa）、 约90-95kDa（例如91kDa）、和/或约63-68kDa（例如63kDa或68 kDa）。在一个实施方案中，毒素A的含有表位的片段或部分其大小是约 158-160kDa；约90-95kDa（例如91kDa）和/或约63-68kDa（例如68 kDa）。在一个实施方案中，毒素B的含有表位的片段或部分其大小是约 100-105kDa（例如，103kDa）和/或约63-68kDa（例如，63kDa）。在这些 疫苗或免疫原实施方案的任一个中，毒素A或毒素B或它们的片段、部分或 肽是在此提供的菌株中的任一种。

另一个方面提供了一种在有需要的受试者体内抵消、抑制、阻断、减 少、改善、治愈、或治疗艰难梭菌感染或艰难梭菌相关性疾病的方法，包括 给予该受试者一个有效量的以上说明的疫苗或免疫原。在该方法的一个实施 方案中，在给予疫苗或免疫原后，针对艰难梭菌毒素A和/或毒素B的体液应 答在受试者中激发，从而产生抗毒素A和/或抗毒素B抗体，这些抗体可以在 受试者体内特异性地中和、抑制、阻断、减少、改善、治愈、或治疗艰难梭 菌相关性疾病或CDAD，包括轻度至重度腹泻以及在某些情况下伴随而来的 严重、致命性并发症，例如伪膜性结肠炎、中毒性巨结肠、肠穿孔、败血症 和死亡。在该方法的一个实施方案中，经由该受试者的体液应答而激发的抗 体包括与本发明的mAb具有相似或相同特异性和作用机制的抗体、或在中和 艰难梭菌毒素A和/或毒素B的方面与本发明mAb竞争、或在涉及到中和艰 难梭菌毒素A和/或毒素B的方面与本发明mAb竞争的抗体。

在另一个方面，提供了一种在易感于艰难梭菌感染的细胞内或针对该细 胞抵消、抑制、或阻断毒素A和/或毒素B活性的方法，包括使该细胞与根据 本发明的一种抗体或它的抗原结合片段相接触，其中该抗体或它的抗原结合 片段通过一种竞争性或混合竞争性作用机制在该细胞中或针对该细胞中和、 抑制、或阻断毒素A和/或毒素B活性。在该方法的一个实施方案中，该抗体 是单克隆抗体、人源化抗体、或嵌合抗体中的一种或多种。在该方法的一个 实施方案中，该细胞（例如，肠道上皮细胞）处于受试者体内，并且该抗体 或它的抗原结合片段以一个有效量给予该受试者。在该方法的一个实施方案 中，该毒素是毒素A。在该方法的一个实施方案中，该毒素是毒素B。在该 方法的一个实施方案中，该毒素是毒素A，并且作用机制是一种竞争性抑制 作用机制。在该方法的一个实施方案中，该抗体或它的抗原结合片段是PA- 50（ATCC登录号PTA-9694）、它的一种人源化形式、或一种与PA-50竞争 中和毒素A活性的抗体或其片段。在该方法的一个实施方案中，该毒素是毒 素A，并且作用机制是一种混合竞争性抑制作用机制。在该方法的一个实施 方案中，该抗体或它的抗原结合片段是PA-39（ATCC登录号PTA-9692）、 它的一种人源化形式、或一种与PA-39竞争中和毒素A活性的抗体或其片 段。在该方法的一个实施方案中，该毒素是毒素B，并且作用机制是一种混 合竞争性抑制作用机制。在一个实施方案中，该抗体或它的抗原结合片段是 PA-41（ATCC登录号PTA-9693）、它的一种人源化形式、或一种与PA-41 竞争中和毒素B活性的抗体或其片段。

本发明的这些方面和其他方面将联系本发明的详细说明而进一步详细描 述。

附图说明

图1A-1C经由ELISA显示出本发明的抗艰难梭菌毒素mAb针对毒素A 和/或毒素B的特异性。ELISA平板在4°C用毒素A（实心圆圈）或毒素B （空心正方形）包被过夜。在洗涤和封闭平板后，将鼠mAb PA-38(A)、PA- 39(B)、或PA-41(C)滴定并且添加至该平板。用HRP偶联的山羊抗小鼠 IgG-Fc检测单克隆抗体结合。在SpectraMax M5平板读数仪（Molecular  Devices）上测量OD。

图2A-2D提供了使用鼠mAb PA-38、PA-39、PA-41以及PA-50的Biacore 结合表征测定结果。使用Biacore 3000仪（GE Healthcare）确定结合特异性。 根据制造商用于胺偶联的说明书，将这些mAb（PA-38(2A)、PA-39(2B)、 PA-50(2C)、PA-41(2D)或非特异性mAb作为对照）以大约10,000个共振单位 （RU）共价地固定到CM5传感器芯片（GE Healthcare）表面上。结合实验在 25°C在PBS中进行。将纯化的毒素A或毒素B（List Biological Laboratories）以 30nM流过对照（非特异性mAb）和测试流动室，流速为5μL/分钟并伴以结 合相（PA-38、PA-39和PA-41为600s；并且PA-50为300s）和解离相（PA- 38、PA-39和PA-41为300s；并且PA-50为600s）。展示出RU随时间变化的图 形。

图3A-3E和3F-3H显示了如Biacore所测定的抗体-毒素结合动力学的结 果。对于图3A-3E，使用以Biacore小鼠抗体捕获试剂盒而准备的CM5传感 器芯片，捕获鼠mAb。然后，毒素以变化的浓度（0.4-100nM，两倍递增） 以30μL/分钟的流速通过流动室。所有mAb浓度均一式两份检测，并且每轮 后使用试剂盒中特定的条件将芯片表面再生。记录RU的变化并且使用Bia  Evaluation Software 1:1（Langmuir）结合模型分析，该模型计算mAb对毒素 的KD。图3A：PA-38与毒素A结合；图3B：PA-50与毒素A结合；图3C： PA-39与毒素A结合；图3D：PA-39与毒素B结合；以及图3E：PA-41与毒 素B结合。对于图3F-3H，如以上所示，鼠mAb，即mPA-50、mPA-41、或 mPA-39，通过胺偶联方法与CM5传感器芯片共价连接。毒素A（命名为 “（红）”的线）或毒素B（命名为“（蓝）”的线）以30nM以5μL/分钟 的测试流动室（mPA-50、mPA-41、或mPA-39）。这些结果显示mPA-50选 择性地与毒素A结合（图3F），而mPA-41选择性地与毒素B结合（图 3G）。mPA-39优选地与毒素A结合，但还显示出与毒素B的交叉反应性 （图3H）。

图4显示了使用纯化的鼠mAb PA-39时在CHO-K1细胞上毒素A的体 外中和活性。为了测量细胞毒性，将毒素A在37°C与变化浓度的PA-39孵育 1小时（实例3A）。随后将mAb-毒素混合物添加至CHO-K1细胞中，这些 细胞以2,000个细胞/孔铺种于96孔板中并孵育72小时。在处理和未处理的 培养物中比较细胞的存活，并且计算50%中和细胞毒性（EC₅₀）所要求的 mAb浓度。通过CellTiter-Blue确定细胞活力；将原始数据依照未处理的对照 孔进行归一化。使用Prism将这些数值作图，并且使用S型剂量应答（可变斜 率）模型计算曲线。随后使用该曲线测定mAb的EC₅₀。这些数据点代表了同 一平板上3个孔的平均值。

图5显示出使用纯化的鼠mAb PA-41时在CHO-K1细胞上毒素B的体 外中和活性。为了测量细胞毒性，将毒素B在37°C与变化浓度的PA-41孵育 1小时（实例3B）。随后将mAb-毒素混合物添加至CHO-K1细胞，这些稀 薄啊以2,000个细胞/孔铺种在96孔板中并孵育72小时。在处理和未处理的 培养物中比较细胞的存活，并且计算50%中和细胞毒性（EC₅₀）所要求的 mAb浓度。通过CellTiter-Blue确定细胞活力；将原始数据依照未处理的对照 孔进行归一化。使用Prism将这些值作图，并且使用S型剂量应答（可变斜 率）模型计算曲线。随后使用该曲线测定mAB的EC₅₀。这些数据点代表了同 一平板上3个孔的平均值。

图6显示出使用纯化的鼠mAb PA-38和PA-50时在T-84细胞上毒素A 的体外中和活性。（实例3C）。将T-84细胞接种于96孔平板内（15,000个 细胞/孔），并且用滴定的mAb（PA-38（■）或PA-50（▲））和毒素A（60 ng/mL）的组合来处理。在孵育（72小时）后，在处理和未处理的培养物中 比较细胞的存活，并且计算50%中和细胞毒性（EC₅₀）所要求的mAb浓度。 通过CellTiter-Blue确定细胞活力；将原始数据依据未处理的对照孔进行归一 化。使用Prism将这些数值作图，并且使用S型剂量应答（可变斜率）模型计 算曲线。随后使用该曲线测定mAb的EC₅₀。这些数据点代表了同一平板上3 个孔的平均值。

图7显示出测试鼠mAb PA-38（■）或PA-50（▲）阻断或阻止毒素A 诱导的兔红细胞（RBC）血凝作用的能力的结果。毒素A（2μg/ml)与PA-38 或PA-50的多种稀释物相组合，并且将混合物添加至含有50μL兔红细胞的 平板中。将平板在4°C孵育4小时。使用ImageQuant 400（GE Healthcare） 点阵列分析法将血凝集定量为颜色强度。将该数据视为对照%，其中100%代 表无血凝集。这些数据点代表了在同一平板上所测定的3个孔的平均值。

图8显示出本发明的抗艰难梭菌毒素mAb在阻止Caco-2细胞单层被毒 素A破坏方面的活性。将Caco-2细胞接种于96孔Multiscreen Caco-2测定平 板（Millipore）的上室（25,000个细胞/孔）。在孵育10至14天后，通过使 用上皮伏欧计（World Precision Instruments）测量跨上皮细胞电阻（TEER） 证实了紧密单层的形成。在确立并测定该单层的完整性后，将毒素A（25 ng/mL）和连续稀释的鼠mAb（PA-38（■）或PA-50（▲））添加至该测定 平板的上室。将平板孵育18至24小时，并且使用伏欧计测量TEER值。在 未处理和毒素处理的孔中比较单层的完整性。使用GraphPad Prism软件，将 抑制数据拟合成一条非线性回归、S型剂量-反应曲线，以便测定50%毒素抑 制（EC₅₀）所要求的mAb浓度。

图9A-9C显示出抗毒素A mAb PA-38（9A）和PA-50（9B）在体内中 和毒素A活性的能力。雌性Swiss Webster小鼠（6-8周龄，5只小鼠/组）在 第0天以所示量值注射（腹内）鼠mAb PA-38或鼠mAb PA-50、或PBS （200μl）。按照所示的抗体量值来评估一种比较物抗毒素A单克隆抗体（在 此称作CDA-1）的中和活性（9C）。通过合成（DNA2.0）编码3D8的重链 和轻链可变区的核酸而产生抗毒素A比较物mAb CDA-1（WO2006/121422和 US2005/0287150），它被克隆至全长人IgG1表达载体（pCON-γ1和pCON- κ）中。CDA-1比较物mAb在CHO-KSV1细胞中表达并产生，并且按照在此 的实例部分所说明的进行纯化。随后，这些小鼠在第1天注射100ng毒素A （200μl），每天监测持续首个72小时，并且此后每周监测。结果显示，在2 μg mAb/动物的单个剂量后，PA-38和PA-50mAb均能够充分抑制毒素A相 关性毒性，而比较物CDA-1mAb（5μg/动物）未能充分抑制艰难梭菌毒素A 相关性毒性。

图10显示出mAb PA-41在体内中和毒素B活性的能力。雌性Swiss  Webster小鼠（6-8周龄，5只小鼠/组）在第0天以所示量值注射（腹内）鼠 mAb PA-41或PBS（200μl）。随后，这些小鼠在第1天注射100ng毒素B （200μl），每天监测持续首个72小时，并且此后每周监测。该实验的结果 显示，在5μgmAb/动物的单个剂量后，PA-41mAb完全抑制了艰难梭菌毒素 B相关性毒性。使用一种比较物抗毒素B单克隆抗体（在此称作CDB-1比较 物mAb）进行相似的实验。通过合成（DNA2.0）编码124的重链和轻链可变 区的核酸而产生抗毒素B比较物mAb CDB-1（WO2006/121422和 US2005/0287150），它被克隆至全长人IgG1表达载体（pCON-γ1和pCON- κ）中。CDB-1比较物mAb在CHO-KSV1细胞中表达和产生，并且如在此实 例部分中所说明进行纯化。这些实验的结果显示比较物CDB-1mAb没有毒素 B中和活性，即使以250μg的量值也是如此。

图11显示出本发明的鼠mAb PA-38和PA-41（PA-38+PA-41）的组合 在体内中和毒素A和毒素B活性的能力。雌性Swiss Webster小鼠（6-8周 龄，5只小鼠/组）在第0天注射（腹内）PA-38+PA-41mAb组合或PBS （200μl）。随后，这些小鼠在第1天注射100ng的毒素A和毒素B的组合 （200μl），每天监测持续首个72小时，并且此后每周监测。单独的毒素 PA-38曲线（空心圆圈）和单独的毒素PA-41曲线（实心菱形）在图中重 叠。结果显示，单独的PA-38mAb（空心圆圈）和PA-41mAb（实心菱形） 均不足以抑制两种毒素的作用，并且不能保护动物免遭艰难梭菌感染。相比 之下，PA-38和PA-41（PA-38+PA-41）的组合以每种50μg（开口的倒三角 形）能够保护感染的动物，并且5只试验动物中防止4只发生毒素相关性死 亡。PA-38和PA-41（PA-38+PA-41）的组合以每种5μg（实心圆圈）在感 染的试验动物中提供了对抗艰难梭菌毒素A和毒素B毒性的一些保护作用。

图12A和图12B显示出PA-38和PA-41在仓鼠体内的药物代谢动力学 （PK）结果。仓鼠以2mg/kg（○）或10mg/kg（■）的mAb PA-38（12A） 或PA41（12B）进行腹内给药。将动物以设定的间隔采血，并且使用ELISA 分析血清，该ELISA使用毒素包被的平板以及HRP偶联的山羊抗小鼠IgG用 于检测。所得的曲线展示了每种抗体在2mg/kg和10mg/kg队列中的剂量依 赖应答。对每条曲线进行WinNonLin分析。两种单克隆抗体均具有超过6天 的终末半衰期。

图13显示出实例5B中所说明的仓鼠研究的存活结果。在这项研究中， 仓鼠用克林霉素治疗，并且接种艰难梭菌（■感染的对照，组3）并且随后用 万古霉素（◆20mg/kg，组4）、鼠mAb PA-38+PA-41的组合（Δ50，50 mg/kg，组6）或mAb PA-39+PA-41的组合（○50，40mg/kg，组7）治 疗。未感染的对照（组1）中的所有动物以及山羊多克隆Ab治疗的对照（组 5）均存活。用本发明的抗毒素A和抗毒素B mAb的组合治疗的动物存活， 并且它们在研究持续期间受到保护免遭艰难梭菌毒性影响。

图14显示出来自实例5B中所说明的仓鼠的平均体重（克）。动物治疗 组如下：未感染的对照（◆，组1）；万古霉素治疗的对照（■，组4）；PA- 38+PA-41鼠mAb组合治疗组（x，组6）、或PA-39+PA-41鼠mAb组合治 疗组（●，组7）。感染的对照组（组3）中的动物没有存活5天；因此，不 能对组3进行感染后的体重测量。

图15A-15D描述了来自实例5B中所说明的仓鼠研究的死后尸体剖检结 果。评估了来自每一相关研究组的代表性动物：(A)组1，未感染的对照；(B) 组3，感染的对照；(C)组6，PA-38+PA-41鼠mAb组合治疗组；和(D)组 7，PA-39+PA-41鼠mAb组合治疗组。箭头指示每只仓鼠的盲肠。盲肠在感 染的对照组3(B)中明显地发红并出现炎症。相比之下，组6(C)和组7(D) 中仓鼠的盲肠与健康未感染的对照动物组1(A)中的盲肠相似。

图16A和图16B-1和B-2。图16A展示了实例5C中所说明的仓鼠研究 的存活结果。在这项研究中，仓鼠用克林霉素治疗、接种艰难梭菌（■感染的 对照，组1），并且随后不同组的动物用以下各项治疗：万古霉素（◆20 mg/kg，组2）、鼠mAb PA-39+PA-41组合（▲50+50mg/kg，组3）、单 独的鼠mAb PA-41（○50mg/kg，组4）、单独的鼠mAb PA-38（50 mg/kg，组5）、单独的鼠mAb PA-39（□50mg/kg，组6）、或单独的鼠 mAb PA-50（◇50mg/kg，组7）。在这项研究过程中，未感染的对照（组 1）中所有动物均存活。图16B-1展示出实例5E中所说明的仓鼠研究的动物 存活结果。显示了以下动物的Kaplan-Meier存活曲线，这些动物用治疗克林 霉素治疗并且随后接种艰难梭菌（■，感染的对照，组2）；用万古霉素（◇ 20mg/kg，组3）治疗；用人源化PA-50+PA-41mAb的1:1组合（（hPA- 50+hPA-41），Δ，50+50mg/kg，组4）治疗；用人源化PA-50+PA-41 mAb的1:1组合（（hPA-50+hPA-41），○，20+20mg/kg，组5）治疗； 用比较物mAb CDA-1+CDB-1的1:1组合（（CDA-1+CDB-1），50+ 50mg/kg，组6）治疗；或用比较物mAb CDA-1+CDB-1的1:1组合 （（CDA-1+CDB-1），□，20+20mg/kg，组7）治疗。图16B-2展示出实 例5E中所述的仓鼠研究的体重变化结果。与未感染的对照动物相比，图 16B-1中描述了不同治疗组中随时间推移的动物平均（±SD）体重。

图17A-17C显示了胱天蛋白酶1处理的艰难梭菌毒素B。(A)：全长艰难 梭菌毒素B和其结构域。(B)：毒素B（TcdB）和胱天蛋白酶1处理的毒素B 的3％-8%Tris-乙酸盐SDS-PAGE（还原性）分析。观察到4种毒素片段： 193、167、103和63kDa。(C)：在胱天蛋白酶1处理毒素B后产生的可能片 段。

图18A-18C显示了使用抗毒素B mAb，艰难梭菌毒素B片段的SDS- PAGE（A）和蛋白质印迹（B、C）检测。(A)：通过胱天蛋白酶1处理所产 生的毒素B片段的SDS-PAGE分析（与图17B相同）；(B)：使用mAb PA- 41，毒素B片段的蛋白质印迹检测。(C)：使用鼠mAb PA-39，毒素B片段的 蛋白质印迹检测。

图19A-19E显示了通过Biacore结合法所表征的抗艰难梭菌毒素鼠 mAb。评估了抗毒素mAb的竞争性结合。(A)：mAb PA-41结合了毒素B上 的一个单一表位。(B)：mAb PA-39结合了毒素A上的一个单一表位。(C)： mAb PA-39和PA-41与毒素B上的不同表位结合。mAb PA-41与毒素B的结 合在表位方面不同于比较物CDB-1抗毒素B抗体与毒素B的结合。(D)固定 在CM5芯片上的mPA-41捕获毒素B，但是不能结合额外的mA-41，因此这 表明仅存在一个mPA-41结合表位。比较物mAb CDB-1的添加产生了一个增 加的信号，表明mPA-41和比较物mAb CDB-1结合了毒素B上的不同表位。 (E)使用未处理或用胱天蛋白酶1处理的毒素B的蛋白质印迹分析，表明 mPA-41和比较物mAb CDB-1具有不同的结合模式并且结合毒素B上不同的 表位。

图20A-20C显示出使用肠激酶（EK）的艰难梭菌毒素A切割。(A)：全 长艰难梭菌毒素A和其结构域。(B)：毒素A（TcdA）和EK1处理的毒素A 的3%-8%Tris-乙酸盐SDS-PAGE（还原性）分析。(C)：在25°C用EK处理 毒素A48小时后所产生的可能片段。

图21A-21C显示出使用抗毒素A鼠mAb，艰难梭菌毒素A片段的考马 斯蓝染色（SDS-PAGE）（A）和蛋白质印迹（B、C）检测。(A)：通过EK 处理所产生的毒素A片段的SDS-PAGE分析（与图20B相同）。(B)：使用 mAb PA-50，毒素A片段的蛋白质印迹检测。(C)：使用mAb PA-39，毒素A 片段的蛋白质印迹检测。在图21B和图21C中，kDa条带是约158kDa并且 可以视为约158-160kDa。

图22A-1和A-2-图22F。图22A-1和A-2-图22D显示出使用Biacore结 合分析法，结合艰难梭菌毒素A的鼠抗毒素A mAb的表征。图22A-1：观察 到PA-50mAb结合毒素A上的多个位点。图22A-2：将PA-50mAb固定到传 感器芯片上，并且随后依次与纯化的毒素A、额外的PA-50以及比较物mAb  CDA-1接触（WO/2006/121422；US2005/0287150）。图22B：由Biacore芯 片上比较物mAb CDA-1所捕获的毒素A进一步结合额外的CDA-1和PA-50 mAb，显示出这些抗体所结合的毒素A表位的差异。图22C：毒素A上的 PA-39mAb结合表位与毒素A上的比较物mAb CDA-1结合表位不同。图 22D：使用Biacore进行鼠mAb PA-50和PA-39与毒素A的竞争性结合。固 定在CM5芯片上的MAb PA-50捕获了毒素A，它可结合额外的mPA-50并且 还结合mPA-39，这表明在毒素A上存在着mPA-50表位的多个拷贝并且 mPA-50和mPA-39与毒素A上不同的表位结合。图22E和22F：使用未经处 理或用酶肠激酶（EK）处理的毒素A，通过蛋白质印迹分析证实Biacore结 果。(E)：mPA-39和比较物mAb CDA-1显示出对EK处理的毒素A的不同结 合模式（泳道：TcdA/EK），因此显示出毒素A上的不同结合结构域和表 位。(F)：mPA-50和比较物mAb CDA-1结合到毒素A的相同结构域上，但与 不同表位结合。

图23A和23B显示出PA-41在体外针对一系列不同的20个艰难梭菌产 毒临床分离株的中和活性，该分离株包括6个BI/NAP1/027分离株、3个参考 菌株（VPI 10463、ATCC 43596和630）、2个毒素A阴性/毒素B阳性 （toxA-/toxB+）分离株、3个门诊患者分离株、以及6个其他常见的临床分离 株。图23A显示出鼠mAb PA-41在CHO-K1细胞上针对上清液的中和活性， 该上清液从如实例8、表6中所提出的不同艰难梭菌临床分离株培养物中产 生。将纯化的mAb PA-41连续稀释并且随后与一种上清液混合，该上清液具 有可以引起大于90%细胞死亡的预定义稀释倍数。将混合物在37°C孵育1小 时并且随后添加至CHO-K1细胞。将这些细胞孵育72小时，并且使用Cell- Titer Blue测量细胞活力。图23B显示出人源化mAb hPA-41以及比较物mAb  CDB-1针对2个艰难梭菌参比菌株（VPI 10463和ATCC 43596）以及6个艰 难梭菌BI/027/027菌株（CCL678、HMC553、Pitt 45、CD196、蒙特利尔5.1 和蒙特利尔7.1）的中和活性。显示了hPA-41mAb（实心正方形）和比较物 mAb CDB-1（实心三角形）在CHO-K1细胞上针对上清液的中和活性，这些 上清液来自参比菌株（VPI 10483和ATCC 43596）和BI/NAP1/027菌株 （CCL678、HMC553、Pitt 45、CD196、蒙特利尔5.1和蒙特利尔7.1）。

图24A和24B显示出对图23A和B所说明的mAb PA-50在体外针对艰 难梭菌产毒临床分离株的中和活性。图24A显示出鼠mAb PA-50在T-84细 胞上针对上清液的中和活性，这些上清液从如实例8、表6中所提出的不同艰 难梭菌临床分离株培养物中产生。将纯化的mAb PA-50连续稀释并且随后与 一种上清液混合，该上清液具有可以引起大于90%细胞死亡的预定义稀释因 子。将混合物在37°C孵育1小时并且随后添加至T-84细胞。将这些细胞孵 育72小时，并且使用Cell-Titer Blue测量细胞活力。图24B显示了使用人源 化mAb hPA-50和比较物mAb CDA-1在T-84细胞上进行的相似实验的结 果。显示了hPA-50（实心正方形）和CDA-1比较物（实心三角形）在T-84 细胞上针对上清液的中和活性，这些上清液从6个BI/NAP1/027菌株 （CCL678、HMC553、Pitt 45、CD196、蒙特利尔5.1和蒙特利尔7.1）产 生。对于图24A：*：N/A：不可用；没有毒素A从毒素A-/毒素B+菌株 F1470、8864、CCL13820和CCL14402中产生；"：毒素A滴度十分低；使用 上清液，没有可测量的对T-84的细胞毒；^：不可用；没有毒素A从毒素A-/ 毒素B+菌株中产生或浓度太低。

图25A-25D显示了多种艰难梭菌菌株所产生的毒素的中和作用。图25A 和25B显示了鼠mAb PA-39在T-84细胞上针对上清液的中和活性，这些上 清液从如实例8、表6中所提出的不同艰难梭菌临床分离株培养物中产生。将 mAb PA-39（杂交瘤上清液）连续稀释并且显示每种上清液的稀释倍数。图 25B显示了使用鼠mAb PA-39和比较物CDA-1mAb在T-84细胞上进行的相 似实验的结果。显示了PA-39（实心正方形）和比较物CDA-1mAb（实心三 角形）在T-84细胞上针对上清液的中和活性，这些上清液从6个 BI/NAP1/027菌株（CCL678、HMC553、Pitt 45、CD196、蒙特利尔5.1和蒙 特利尔7.1）产生。对于图25A：*：N/A：不可用；没有毒素A从毒素A-/毒 素B+菌株F1470、8864、CCL13820和CCL14402中产生；"：毒素A滴度十 分低；使用上清液，没有可测量的对T-84的细胞毒性；^：不可用；没有毒 素A从毒素A-/毒素B+菌株中产生或浓度太低。在图25C中，测试了人源化 抗毒素A mAb PA-50和比较物抗毒素A mAb CDA-1对艰难梭菌培养上清液 针对T-84的细胞毒性的中和作用。（实例8，表7）。在图25D中，测试了 人源化抗毒素B mAb PA-41和比较物抗毒素A mAb CDB-1对艰难梭菌培养上 清液针对T-84的细胞毒性的中和作用。（实例8，表7）。

图26显示，与对应物鼠mAb PA-41相比，嵌合mAb PA-41（cPA-41 mAb）有效地中和了艰难梭菌毒素B对CHO-K1的毒性。产生了两种嵌合 PA-41mAb；一种嵌合mAb去除了VL区中的一个名为cPA-41（NG）的糖 基化位点，并且另一种嵌合mA没有去除糖基化位点，该点在图中命名为 cPA-41（G）。cPA-41(NG)和cPA-41（G）显示了在CHO-K1细胞上针对毒 素B的相似的中和水平（2pg/mL，TechLab），并且两种嵌合mAb均以与亲 本鼠mAb（mPA-41）相似的水平中和了毒素B。

图27显示，与亲本鼠PA-39（mPA-39）mAb相比，嵌合PA-39（cPA- 39）mAb有效地中和了艰难梭菌毒素A对CHO-K1细胞的毒性（1μg/ml， Listlab)。

图28显示，与亲本鼠PA-50（mPA-50）mAb相比，嵌合PA-50（cPA- 50）mAb有效地中和了艰难梭菌毒素A对T-84细胞细胞的毒性（60ng/mL， TechLab）。

图29显示，鼠PA-41（mPA-41）和人源化PA-41（hPA-41）mAb针对 艰难梭菌毒素B的体外中和活性。使用CellTiter Blue测量与对照相比的细胞 存活百分比。hPA-41mAb以6pM的EC₅₀有效地中和了毒素B对CHO-K1细 胞的毒性（2pg/mL，Techlab），并且实际上与亲本鼠单克隆抗体（mPA- 41）等效。

图30显示了鼠PA-39（mPA-39）和PA-39（hPA-39）mAb针对艰难梭 菌毒素A的体外中和活性。hPA-39mAb以50pM的EC₅₀有效地中和了毒素 A对CHO-K1细胞的毒性（20ng/mL,TechLab），并且实际上与亲本鼠单克 隆抗体（mPA-41）等效。

图31A-31H显示了使用所说明的mAb，体外中和活性和作用机制 （MOA）研究的结果。使用CHO-K1细胞和T-84细胞的基于细胞的测定法 如实例1、3和7中所说明来进行。图31A显示，与亲本鼠PA-50mAb （mPA-50）相比，人源化的PA-50（hPA-50）mAb有效地中和了毒素A对 T-84细胞的毒性（60ng/mL,TechLab）。图31B-D显示了与比较物抗毒素A mAb CDA-1相比，抗毒素A mAb PA-39和PA-50的中和活性。EC₅₀和最大抑 制百分比值如实例7C的表A中所展示。图31E和F显示了与比较物抗毒素 B mAb CDB-1相比，抗毒素B mAb PA-41的中和活性。EC₅₀和最大抑制百分 比值如实例7C的表B中所展示。图31G和H显示了一种ELISA方法和结 果，用于评估抗毒素A mAb阻断毒素A内化入细胞的能力和，并且用于评价 这些mAb相对于多克隆山羊抗毒素A抗体对照以及无抗体对照而言阻止毒素 A内化的活性。

图32A和32B描述了人源化PA-39（hPA-39）VH区的氨基酸序列， SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。氨基酸残基以单字母代码显示。序列上方的 数字表示根据Kabat等人的位置。将CDR的位置加下划线。

图33A和33B描述了人源化PA-39（hPA-39）VL区的氨基酸序列， SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。氨基酸残基以单字母代码显示。序列上方的 数字表示根据Kabat等人的位置。将CDR的位置加下划线。

图34A和34B描述了人源化PA-50（hPA-50）VH区的氨基酸序列， SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6。氨基酸残基以单字母代码显示。序列上方的 数字表示根据Kabat等人的位置。将CDR的位置加下划线。

图35描述了人源化PA-50VL区的氨基酸序列，SEQ ID NO:7。氨基酸 残基以单字母代码显示。序列上方的数字表示根据Kabat等人的位置。将 CDR的位置加下划线。

图36A和36B描述了人源化PA-41（hPA-41）VH区的氨基酸序列， SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9。氨基酸残基以单字母代码显示。序列上方的 数字表示根据Kabat等人的位置。将CDR的位置加下划线。

图37描述了人源化PA-41VL区的氨基酸序列，SEQ ID NO:10。氨基 酸残基以单字母代码显示。序列上方的数字表示根据Kabat等人的位置。将 CDR的位置加下划线。

图38A和38B显示了一种人源化抗艰难梭菌毒素A单克隆抗体的核酸序 列和编码的氨基酸序列。图38A描述了如在SEQ ID NO:16中给出的人源化 抗毒素A单克隆抗体的轻链氨基酸序列，它由如在SEQ ID NO:17中给出的 核酸序列编码。图38B描述了如SEQ ID NO:14中给出的人源化单克隆抗体 的轻链氨基酸序列，它由如在SEQ ID NO:15中给出的核酸序列编码。

图39A和39B显示了一种人源化抗艰难梭菌毒素A单克隆抗体的核酸序 列和编码的氨基酸序列。图39A描述了如在SEQ ID NO:20中给出的人源化 抗毒素A单克隆抗体的轻链氨基酸序列，它由如在SEQ ID NO:21中给出的 核酸序列编码。图39B描述了如在SEQ ID NO:18中给出的人源化抗毒素A 单克隆抗体的重链氨基酸序列，它由如在SEQ ID NO:19中给出的核酸序列 编码。

图40A和40B显示了一种人源化抗艰难梭菌毒素B单克隆抗体的核酸序 列和编码的氨基酸序列。图40A描述了如在SEQ ID NO:24中给出的人源化 抗毒素B单克隆抗体的轻链氨基酸序列，它由如在SEQ ID NO:25中给出的 核酸序列编码。图40B描述了如在SEQ ID NO:22中给出的人源化抗毒素B 单克隆抗体的重链氨基酸序列，它由如在SEQ ID NO:23中给出的核酸序列 编码。

图41A-41C显示了与对应完整抗体的效力相比，鼠mAb的Fab片段针 对艰难梭菌毒素A或毒素B的体外中和活性。(A)：CHO-K1细胞上的鼠mAb  PA-39和PA-39Fab中和活性；毒素A（Techlab，60ng/mL）；(B)：CHO-K1 细胞上的鼠mAb PA-41和PA-41Fab中和活性；毒素B（Techlab，2 pg/ml）；(C)：T-84细胞上鼠mAb PA-50和PA-50Fab中和活性；毒素A （Techlab，60ng/mL）。

图42A和42B显示了在此在实例13中说明的药物代谢动力学（PK）研 究的抗体浓度谱。图42A描述了29天内来自以下动物的PK结果（血清抗体 浓度的单位是μg/ml），这些动物在第0天接受了浓度为1mg/kg（▲）或5 mg/kg（■）的一个单一剂量的纯化的、人源化的抗毒素A mAb PA-50。图 42B描述了29天内来自以下动物的PK结果（血清抗体浓度单位是μg/ml）， 这些动物在第0天接受了浓度为1mg/kg（▲）或5mg/kg（■）的一个单一剂 量的纯化的、人源化的抗毒素B mAb PA-41。

具体实施方案

本发明涵盖了提供非抗生素疗法的抗体和抗原结合片段以及阻断艰难梭 菌感染致病作用的治疗，并且优选地为结肠康复和/或重新建立胃肠道（例 如，结肠、肠（bowel）、肠（intestine）等）正常微生物区系提供时间。如 在此说明的单克隆抗体、它们的抗原结合片段（例如它们的人源化或嵌合形 式）提供了治疗活性疾病并防止复发性疾病的非抗生素治疗和药品，从而使 患有艰难梭菌感染和CDAD的患者解除疾病，而不复发成其他疾病或更严重 的疾病或症状。在一个实施方案中，本发明的抗体具有针对由受试者感染艰 难梭菌引起或与之相关的活性疾病的治疗活性。在一个实施方案中，本发明 的抗体解决了由受试者感染艰难梭菌引起或与之相关的活性疾病。在一个实 施方案中，本发明的抗体在受试者体内具有减少由艰难梭菌感染引起或与之 相关的活动性疾病的持续时间和/或严重程度。在一个实施方案中，本发明的 抗体或它们的部分或片段可以与抗生素治疗组合提供。

如在此所说明，已经产生了针对艰难梭菌毒素A和B的单克隆抗体 （mAb）。抗毒素mAb在体外测定中以及艰难梭菌体内感染的临床前动物模 型中显示出强大活性。更具体地，本发明的mAb在艰难梭菌感染的相关和苛 刻仓鼠模型中有力并持久地保护仓鼠免于死亡。

这些抗体非抗生素方法用于治疗CDAD，并且可以允许停用抗生素并且 阻断艰难梭菌毒素的致病作用，从而为结肠康复和重新建立正常肠道微生物 区系提供时间。如在此所述的mAb可以通过它们中和艰难梭菌毒素的能力来 提供治疗益处，并且可以按照被动或主动的策略来使用以便治疗多次复发艰 难梭菌的患者。具体而言，这些mAb可以用于防止感染复发、用于治疗严重 的活性疾病、并且用于治疗多次艰难梭菌相关性疾病复发的患者患者。如在 此所述的mAb可以提供一种有效手段以中和艰难梭菌毒素A和B，从而防 止、阻断或抑制的感染复发和/或严重和活性形式的疾病和多次复发。

如在此所使用，“毒素A”和“毒素B”指由微生物艰难梭菌产生的细 胞毒性肠毒素。毒素A和B是艰难梭菌的主要毒力决定因素，并且毒素阴性 菌株是不致病的。毒素A和B从一个致病性基因座转录，该致病性基因座包 括毒素基因tcdA（毒素A）和tcdB（毒素B）和3个调节基因，其中之一 （tcdC）编码了毒素转录的一种推定性负向调节物。TcdC蛋白似乎在细菌生 活周期的早期、指数生长期就抑制了毒素转录。对于毒素B，已经说明了亮 氨酸₅₄₃和甘氨酸₅₄₄之间的自催化切割位点。切割由宿主胞质磷酸肌醇活化天 冬氨酰蛋白酶结构域所致，并且释放出活性的糖基转移酶结构域。

在此提供了特异性地结合艰难梭菌毒素A和/或毒素B的抗体和其抗原 结合片段、含有这些抗体或其抗原结合片段中一种或多种的组合物、含有编 码这些抗体或其抗原结合片段的核酸序列的载体、产生这些抗体的杂交瘤细 胞系、以及使用这些抗体或其抗原结合片段用于治疗或预防艰难梭菌感染或 艰难梭菌相关性疾病的方法。

应当理解，当术语“抗体”或“免疫球蛋白”在此在描述本发明及其多 个方面和实施方案时使用，该术语总体上还意在包括这些抗体或免疫球蛋白 的抗原结合片段，从而避免了当提及术语“抗体”或“免疫球蛋白”时过多 重复相关的短语“抗原结合片段”。因此，本发明不仅涵盖了针对艰难梭菌 毒素A和毒素B（即毒素A抗原和毒素B抗原）的抗体，还包括这些抗体的 片段，它们结合艰难梭菌毒素A抗原和毒素B抗原，如在此进一步说明。在 实施方案中，这些抗原结合片段能够以与完整抗体相似的方式中和毒素A和/ 或毒素B的毒性。

本发明所包括的抗体包括分离的抗体，这些抗体特异性地结合艰难梭菌 毒素A并且竞争性地抑制一种分离的单克隆抗体与艰难梭菌毒素A的特异性 结合、或与该结合交叉竞争，该分离的单克隆抗体由以ATCC登录号PTA- 9692、PTA-9694或PTA-9888保藏的杂交瘤细胞系产生。这些抗体还包括分 离的抗体，这些抗体与艰难梭菌毒素A特异性地结合并且特异性地结合艰难 梭菌毒素A上的由一种分离的单克隆抗体所定义的表位，该分离的单克隆抗 体由以ATCC登录号PTA-9692、PTA-9694或PTA-9888保藏的杂交瘤细胞系 产生。在一些实施方案中，该表位位于tcdA的C端受体结合结构域内。在这 些实施方案的某些中，这些抗体竞争性地抑制PA-50与tcdA结合、或与该结 合交叉竞争。在其他实施方案中，该表位位于tcdA的易位结构域内。在这些 实施方案的某些中，这些抗体竞争性地抑制PA-39与tcdA结合、或与该结合 交叉竞争。这些分离的抗体可以包括单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、 人抗体、人源化抗体、以及它们的抗原结合片段或部分。

如在实例6中所说明进行试验，这些实验使用毒素A的酶促（肠激酶） 蛋白酶解来评估本发明的抗艰难梭菌毒素A单克隆抗体的特异性。毒素A上 由mAb PA-39识别和结合的表位位于一个区域内，该区域与毒素A的受体结 合结构域不同，即在毒素A受体结合结构域外部，并且与一种人抗毒素A抗 体结合的表位不同，据报道该抗体结合了毒素A的C端受体结合结构域 （7）。如在此在实例6和7中所说明并且在图22和31中所示，Biacore测定 支持毒素A上存在着PA-39的一个单一结合位点。酶促消化的毒素A的蛋白 质印迹检测显示，PA-39结合了毒素A上的一个区域，该区域与PA-50和 CDA-1比较物mAb所结合的区域相分离。PA-39在毒素效力测定中的体外活 性显示出当将更多毒素A加入培养物时，EC₅₀和最大抑制百分比均偏移，这 显示出PA-39的一种混合竞争性抑制机制。100倍过量的PA-39保护后的毒 素A的ELISA检测证实，PA-39对毒素的抑制通过阻止毒素内化以及不利的 细胞毒素作用（例如，细胞毒性）而发生。

另外，如在此说明的实例6和7中以及在图22和31中所示，Biacore测 定支持毒素A上存在着PA-50的至少两个结合位点。酶促消化的毒素A的蛋 白质印迹检测显示，PA-50结合了毒素A上与比较物mAb CDA-1所结合的区 域相似的区域。PA-50在毒素效力测定中的体外活性显示出当更多毒素A加 入至培养物时EC50的偏移，这显示出PA-50的竞争性抑制机制。100倍过量 的PA-50保护后的毒素A的ELISA检测证实，PA-50对毒素的抑制通过阻止 毒素内化和后续细胞毒性而发生。

本发明的抗体还包括分离的抗体，这些抗体特异性地结合艰难梭菌毒素 B并且竞争性抑制一种分离的单克隆抗体与艰难梭菌毒素B的特异性地结 合、或与该结合交叉竞争，该分离的单克隆抗体由以ATCC登录号PTA-9693 或PTA-9692保藏的杂交瘤细胞系产生。这些抗体还包括分离的抗体，这些抗 体与艰难梭菌毒素B特异性结合并且与艰难梭菌毒素B上由一种分离的单克 隆抗体所定义的表位特异性结合，该分离的单克隆抗体由以ATCC登录号 PTA-9693或PTA-9692保藏的杂交瘤细胞系产生。在一些实施方案中，该表 位位于tcdB的N端酶结构域内。在这些实施方案的某些中，这些抗体竞争性 地抑制PA-41结合至tcdB上、或与该结合交叉竞争。在其他实施方案中，该 表位位于tcdB的易位结构域（例如，氨基酸850-1330）内。在这些实施方案 的某些中，这些抗体竞争性地抑制PA-39结合至tcdB、或与该结合交叉竞 争。

如实例6中所说明进行了实验，这些实验使用毒素B的酶促（胱天蛋白 酶1）蛋白酶解来评估本发明的抗艰难梭菌毒素B单克隆抗体的特异性。 mAb PA-41（PTA-9693）显示出识别大约103kDa和63kDa的片段，这些片 段衍生自毒素B的N端酶结构域。主要消化片段的N端序列分析证实这种分 析。mAb PA-41显示在N端酶结构域内部结合了毒素B的一个独特表位，该 表位与人抗毒素B抗体所结合的毒素B的C端受体结合结构域不同（7）。 如在此说明的实例6和7并且在图19和图31E和图31F中所示，Biacore测 定支持毒素B上存在着PA-41的一个单一结合位点。酶促消化的毒素B的蛋 白质印迹检测显示，PA-41结合了毒素B上一个不同区域，该区域与比较物 mAb CDB-1所结合的区域不同。PA-41在毒素效力测定中的体外活性显示出 当添加更多毒素B至培养物时EC₅₀和最大抑制百分比均偏移，这显示PA-41 的混合竞争性抑制机制。

在此提供的抗体包括由杂交瘤产生的单克隆抗体，它们被保藏并给予以 下专利保藏物命名：PTA-9692（用于PA-39）、PTA-9693（用于PA-41）、 PTA-9694（用于PA-50）和PTA-9888（用于PA-38）。根据并且满足《布达 佩斯条约》对用于专利程序目的的微生物保藏的国际承认要求，这些杂交瘤 在2009年1月6日（对于PTA-9692、PTA-9693、PTA-9694）和2009年3月 24日（对于PTA-9888）保藏于作为国际保藏权威的美国典型培养物保藏中心 （“ATCC”），P.O.Box 1549,Manassas,VA 20108USA并且取得前述专利 保藏物的命名。如在此所使用，保藏的杂交瘤和由这些杂交瘤产生的单克隆 抗体均可以通过相同的ATCC保藏物命名或ATCC保藏物命名内部存在的数 字而指称。例如，PTA-9888或9888可以用来指保藏的杂交瘤或由这种杂交 瘤所产生的单克隆抗体。因此，在此所述的单克隆抗体的名称可以与产生它 们的杂交瘤的名称互换使用。本领域的普通技术人员当该名称旨在指称该抗 体或产生抗体的杂交瘤时应当明白。在此提供的抗原结合片段包括前述保藏 的抗体的抗原结合片段。

本发明的抗体显示了多个有益的特征。例如，该抗毒素A抗体在体外和 体内均中和或抑制毒素A的毒性。在使用IMR-90细胞的体外中和研究中，人 源化PA-39和人源化PA-41在这些细胞上分别展示出针对毒素A的46pM中和效 力（即EC₅₀值）和针对毒素B的5pM中和效力。当与文献中所报道的由人抗毒 素A和抗毒素B单克隆抗体的中和作用的数值相比时（WO/2006/121422； US2005/0287150；Babcock等人，Infect.Immun.,2006）（7），hPA-39的46 pM EC₅₀中和值似乎高于人抗毒素A mAb所报道的EC₅₀中和值，并且hPA-41的 5pM EC₅₀中和值似乎高于对人抗毒素B mAb所报道的EC50中和值。因此，在 此所说明的研究中，与已报道的其他抗毒素抗体的那些中和特征相比，本发 明的人源化抗艰难梭菌毒素A和抗艰难梭菌毒素B单克隆抗体，尤其这些单克 隆抗体的人源化形式，显示出增加的抗毒素中和特征。

在一个实施方案中，本发明的一种抗毒素A抗体以一个有效剂量中和或 抑制了艰难梭菌毒素A的体内毒性。在另一个实施方案中，该抗毒素B抗体抑 制了毒素B的体内毒性。在一个实施方案中，将有效剂量的本发明的一种或多 种抗毒素A抗体提供给艰难梭菌感染受试者。在一个实施方案中，将有效剂量 的本发明的一种或多种抗毒素A抗体与一个有效剂量的本发明的一种或多种抗 毒素B抗体相组合以提供给艰难梭菌感染的受试者。在一个实施方案中，将本 发明的抗毒素A抗体与本发明的抗毒素B抗体以1:1相组合提供一个有效剂量 给艰难梭菌感染的受试者。在一个实施方案中，本发明的抗毒素A抗体和抗毒 素B抗体的一个有效剂量可以是例如提供给艰难梭菌感染受试者的1/2:1、1: 1、2:1、3:1、4:1等组合的抗体。在一个实施方案中，这些抗体是人源化 的。在一个实施方案中，这些抗体包含于一种组合物中。说明性地，该抗毒 素A和/或抗毒素B抗体的一个有效剂量可以是0.1μg至1000毫克（mg）。这些 抗毒素A抗体和抗毒素B抗体或它们的抗原结合片段可以按以下剂量给予受试 者，例如0.1mg/kg至150mg/kg；0.5mg/kg至75mg/kg的量；1mg/kg至100 mg/kg的量；1mg/kg至50mg/kg的量；2mg/kg至40mg/kg的量；2mg/kg至50 mg/kg的量；5mg/kg至50mg/kg的量；5mg/kg至25mg/kg的量；10mg/kg至40 mg/kg的量；10mg/kg至50mg/kg的量；10mg/kg至25mg/kg的量；或15mg/kg 至50mg/kg的量。在一个实施方案中，前述量可以包括组合提供的比率可变的 抗毒素A抗体和抗毒素B抗体。

如在此所使用，“中和”指减少、抑制、阻断、改善或消除这些抗体特 异性结合的毒素的不良作用。这些毒素的不良作用的中和包括1)延迟、减 少、抑制、或防止艰难梭菌感染或艰难梭菌相关性腹泻或疾病的发作或进 展，2)与未曾用这种或这些抗体治疗并且患有艰难梭菌感染或艰难梭菌相关 性疾病的受试者的中位数存活相比，增加了受试者的存活，3)消除与艰难梭 菌感染或艰难梭菌相关性腹泻或疾病相关的一个或多个症状或不良作用、或 减少其严重程度，4)允许感染或已经感染艰难梭菌的受试者其胃肠道正常微 生物区系的再增殖，5)防止已经患有艰难梭菌感染或艰难梭菌相关性疾病的 受试者体内艰难梭菌感染或艰难梭菌相关性疾病的复发，6)在患有艰难梭菌 感染或艰难梭菌相关性疾病的受试者体内实现至少50%、55%、60%、65%、 70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%的治愈率， 和/或7)防止由于与艰难梭菌感染相关的CDAD或其他不良事件所致的死亡。

本发明的抗艰难梭菌毒素A和毒素B抗体可以用来治疗很多物种的受试 者，包括人类（人）和其他非人类（哺乳动物）动物。根据本发明可治疗的 受试者包括人类、非人灵长类、犬、猫、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、牛、山 羊、绵羊、猪、马等。人类受试者在此也可以被称作患者或个体。具体而 言，受试者包括具有艰难梭菌感染或艰难梭菌相关性疾病的人类患者。这类 人类患者包括老年人或免疫受损的患者。

根据本发明，抗艰难梭菌毒素A和毒素B抗体可以解除艰难梭菌相关性疾 病并且增加受试者的存活。在一个实施方案中，与未曾用抗体治疗并且患有 艰难梭菌感染或艰难梭菌相关性疾病的受试者的中位数存活相比，一种或多 种抗毒素A抗体和/或一种或多种抗毒素B抗体当给予受试者时改善受试者的存 活。

在一些实施方案中，一种或多种抗毒素A或抗毒素B抗体的剂量或量值可 以是例如0.2μg-250μg或2μg-50μg或5μg-50μg，例如基于小鼠体内研究。在 一些实施方案中，一种或多种抗毒素A或抗毒素B抗体、并且尤其是一种抗毒 素A抗体和一种抗毒素B抗体组合的剂量或量值可以是以下范围内，例如2 mg/kg-40mg/kg、2mg/kg-50mg/kg、5mg/kg-40mg/kg、5mg/kg-50mg/kg、 10mg/kg-40mg/kg、或10mg/kg-50mg/kg，例如基于小鼠体内研究。

作为另一个实例，本发明的抗体可以实现至少50%、55%、60%、65%、 70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%或99%的治愈率或存活率。作为另 一个实例，这些抗体可以实现100%的治愈率或存活率。在一个实施方案中， 当与一种或多种抗毒素B抗体一起给予受试者时，一种或多种抗毒素A抗体实 现了50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、 99%、或100%的治愈率或存活率。如在此所使用，“治愈率”指在一个患有 感染或疾病的受试者群体中被临床医生确定为不再患有该感染或疾病的受试 者的百分比，其中该受试者群体被给予了本发明的一种或多种抗体、或它们 的一种或多种组合物。如在此所使用，“存活率”指被给予本发明的一种或 多种抗体、或它们的一种或多种组合物的受试者群体中存活持续一段所希望 时间的受试者的百分比。在此在其他地方提供了这类所希望的时间段的实 例。

由本发明提供的抗毒素A和抗毒素B抗体可以允许感染了艰难梭菌感染 的受试者体内正常肠道菌群的恢复。按照这种方式，这些抗体可以解除接受 治疗的患者体内的疾病。本发明的抗毒素A和抗毒素B抗体也可以显示有益 的体内药物代谢动力学。本发明的抗毒素A和抗毒素B抗体也可以为已感染 艰难梭菌的受试者提供延长或长效的疗法。如在此所使用，“长效的”指在 停止治疗1个月或更长时间后导致艰难梭菌感染或艰难梭菌相关性疾病不存 在的疗法。优选地，这种疗法导致艰难梭菌感染或艰难梭菌相关性疾病不存 在持续两个或多个月。在一些实施方案中，采用本发明mAb的疗法导致治疗 或抑制活性艰难梭菌感染并且导致降低或削弱感染的顽固性。在其他实施方 案中，由本发明提供的疗法导致受试者体内艰难梭菌感染或艰难梭菌相关性 疾病不存在持续1、2、3、4、5或6个月。在其他实施方案中，由本发明提 供的疗法导致受试者体内艰难梭菌感染或艰难梭菌相关性疾病不存在超过6 个月。本发明的抗毒素A和抗毒素B抗体可以防止艰难梭菌感染和/或艰难梭 菌相关性疾病的复发。

CDAD的复发性质因超强毒力BI/NAP1/027菌株的出现而加重，已发现该 菌株耐受最终求助的较新抗生素中的两种，即左氧氟沙星和莫西沙星。这些 菌株已经横跨美国、加拿大和西欧，造成爆发频率增加。超强毒力菌株包含 一组密切相关的分离株，这些分离株的特点为北美洲脉冲场型1（NAP1）、 限制性酶分析型“BI”以及PCR核糖体核酸型027，它们被统称为 BI/NAP1/027（5）。BI/NAP1/027菌株的超强毒力已经至少部分地归结于毒素 A和B（DAD的两种毒力因素）的产生增加（6）。BI/NAP1/027分离株比其他 菌株产生的毒素A和B的水平高出16-23倍（6）。这些菌株明显的适应性产生 了世界范围传播的威胁，损害抗生素治疗其他疾病的潜力，并且增加CDAD 的复发率和严重程度。虽然正在开发用于治疗CDAD的抗生素，如硝唑尼 特、利福昔明、雷莫拉宁和非达霉素，但是已经报道了耐受利福昔明的艰难 梭菌临床分离株。在最近完成的一项III期试验中（91），与万古霉素相比， 非达霉素明显降低CDAD总体复发率，但是对于BI/NAP1/027菌株却并不如 此。超强毒力BI/NAP1/027菌株的暴发已经造成住院期、治疗失败、复发频繁 以及死亡率这些问题的增加（3）。在此开发并说明的新颖mAb提供了新疗法 以对付日益增加的CDAD发生率和严重程度。

在一个实施方案中，本发明的mAb用于治疗由多个艰难梭菌菌株引起的 感染。在一个实施方案中，这些艰难梭菌菌株是高度感染性的，并且它们的 毒素被本发明的mAb中和。在一个实施方案中，艰难梭菌超强毒力菌株（包 括BI/NAP1/027）的毒素被本发明的mAb中和。在一个实施方案中，本发明的 mAb在中和来自广泛范围的毒性临床分离株（包括来自门诊患者分离株的菌 株）的毒素方面提供治疗效果。优选地，这些mAb中和了超强毒力分离株 （如BI/NAP1/027）以及至少90%或更多的其他临床相关的艰难梭菌分离株的 毒素。特别地并且如在此如实例8中所示，本发明的mAb已经显示显著地中和 了19种不同的艰难梭菌临床分离株的毒性/活力，该临床分离株包括 BI/NAP1/027以及其他超强毒力艰难梭菌菌株，例如，CCL676、HMC553、 Pitt45、CD196、蒙特利尔5和蒙特利尔7.1。根据本发明，提供了中和艰难梭 菌超强毒力菌株毒素A和毒素B的抗体，例如而不限于，如范围从7.7^-12M至 4.8^-8M的抗毒素A的EC₅₀值所确定以及范围从1.1^-11M至6.5^-10M的抗毒素B mAb的EC₅₀值所确定。此外，提供了本发明的mAb用于中和艰难梭菌超强毒 力菌株，包括衍生自医院和非医院的分离株，作为艰难梭菌感染和其相关疾 病的治疗。

在其他实施方案中并且通过非限制性实例，本发明的mAb显示用于中和 毒素A的处于93pM-30nM范围内的EC₅₀中和值或46pM的EC₅₀、以及用于中 和毒素B的处于4pM-9.5pM范围内的EC₅₀值或5pM的EC₅₀，这取决于所使用 的基于体外细胞的测定。如在此实例3中所说明，在使用8μg/ml毒素A的包含 CHO-K1细胞的测定中，本发明的抗毒素A mAb显示出93pM的EC₅₀值。在使用 8pg/ml毒素B的包含CHO-K1细胞的测定中，本发明的抗毒素B mAb显示出9.2 pM的EC₅₀值。在使用240ng/mL毒素A的包含T-84细胞的测定中，本发明的抗 毒素A mAb显示出146pM和175pM的EC₅₀值。在基于Caco-2细胞的测定中， 本发明的抗毒素A mAb以196pM和485pM的EC₅₀水平中和了毒素A的毒性。 在使用8μg/ml毒素A的红细胞血凝集测定中，本发明的抗毒素A mAb的EC₅₀中 和值是1.8nM和30nM，用于防止RBC血凝集。

本发明的抗体可以具有前述特征中的任一个、它的组合或全部。

如在此实例中所说明，本发明的mAb在最可获得的CDAD临床前模型中 显示出优越的体外和体内毒素中和效力。此外，本发明的mAb对多种 BI/NAP1/027菌株来源的毒素显示出独特广泛并且有力的中和作用。另外，这 类mAb已经在高度严格的CDAD仓鼠模型中展示出免于死亡的完全和持久保 护作用。这些结果支持本发明的mAb按照一种方式高效并且有效地阻断艰难 梭菌毒素致病作用的能力，该方式能够使结肠康复、重新建立正常肠道微生 物区系并且消除CDAD疾病和/或艰难梭菌感染。

在一个实施方案中，针对毒素A的抗体包括以下抗体，它们竞争性地抑 制一种分离的单克隆抗体与艰难梭菌毒素A的特异性地结合、或与其交叉竞 争与艰难梭菌毒素A的特异性地结合，其中该分离的单克隆抗体由以ATCC 登录号PTA-9692、PTA-9694或PTA-9888保藏的杂交瘤细胞系产生。针对毒 素B的优选抗体包括以下抗体，它们竞争性地抑制一种分离的单克隆抗体与 艰难梭菌毒素B的特异性结合、或与其交叉竞争与艰难梭菌毒素B的特异性 结合，其中该分离的单克隆抗体由以PTA-9693或PTA-9692保藏的杂交瘤细 胞系产生。在一些实施方案中，抗体包括以下抗体，它们竞争性地抑制一种 分离的单克隆抗体与艰难梭菌毒素A的特异性结合、或与其它交叉竞争与艰 难梭菌毒素A的特异性结合，其中该分离的单克隆抗体由以ATCC登录号 PTA-9692、PTA-9694或PTA-9888保藏的杂交瘤细胞系产生，并且竞争性抑 制一种分离的单克隆抗体与艰难梭菌毒素B的特异性结合、或与其交叉竞争 与艰难梭菌毒素B的特异性结合，其中该分离的单克隆抗体由以PTA-9693或 PTA-9692保藏的杂交瘤细胞系产生。所有实施方案进一步涵盖了在ATCC登 录号PTA-9692、PTA-9694、PTA-9888或PTA-9693下的以上说明的抗体的人 源化形式。

为了确定竞争性抑制或结合的交叉竞争，可以使用本领域的普通技术人 员已知的多种测定。例如，交叉竞争测定可以用来测定一种抗体是否竞争性 地抑制另一种抗体与毒素A和/或毒素B的结合。这类方法可以是使用流式细 胞术或固相结合分析的基于细胞的方法。也可以使用评价抗体在固相或在溶 液相中交叉竞争结合毒素A和/或毒素B的能力的其他测定。本发明所涵盖的 抗体或它们的抗原结合片段的实例包括竞争性地抑制特异性结合达至少约 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%的抗 体。抑制可以按照多种摩尔比或质量比来评估；例如，竞争性结合实验可以 用相对于第二抗体的2倍、3倍、4倍、5倍、7倍、10倍或更多倍摩尔过量 的第一抗体实施。

本发明所涵盖的其他抗体包括以下抗体，它们与艰难梭菌毒素A上的由 一种分离的单克隆抗体所定义的表位特异性结合，其中该分离的单克隆抗体 由以ATCC登录号PTA-9692、PTA-9694或PTA-9888保藏的杂交瘤细胞系产 生。仍由本发明所涵盖的其他抗体或抗原结合片段包括以下抗体，它们与艰 难梭菌毒素B上的由一种分离的单克隆抗体所定义的表位特异性结合，其中 该分离的单克隆抗体由以ATCC登录号PTA-9693或PTA-9692保藏的杂交瘤 细胞系产生。仍由本发明所涵盖的其他抗体或抗原结合片段包括以下抗体， 它们与艰难梭菌毒素A上的由一种分离的单克隆抗体所定义的表位特异性结 合，其中该分离的单克隆抗体由以ATCC登录号PTA-9692、PTA-9694或 PTA-9888保藏的杂交瘤细胞系产生，并且与艰难梭菌毒素B上的由一种分离 的单克隆抗体所定义的表位特异性结合，其中该分离的单克隆抗体由以 ATCC登录号PTA-9693或PTA-9692保藏的杂交瘤细胞系产生。

为了确定表位，可以使用本领域内已知的标准表位定位方法。例如，结 合一种抗体的毒素片段（肽）（优选是合成肽）可以用来确定某个候选抗体 或其抗原结合片段是否结合同一表位。对于线性表位，可以合成具有限定长 度（例如，8个或更多氨基酸）的重叠肽。这些肽优选地以1个氨基酸开始， 从而制备一系列覆盖毒素序列的每8个氨基酸片段的肽。可以通过使用较大 的起始数，例如2或3个氨基酸，制备更少的肽。此外，可以合成较长的肽 （例如，9、10或11聚物）。可以使用标准方法学（包括表面等离子体共振 法（例如，Biacore)和ELISA测定）来确定肽至抗体的结合。为了检验在一些 实施方案中提供的抗体与之结合的构象表位，可以使用较大的肽片段。已经 说明并能够使用采用质谱法来定义构象表位的其他方法（见，例如，Baerga- Ortiz et al.,Protein Science 11:1300-1308,2002和其中引用的参考文献）。用于 表位确定的其他方法在标准的实验室参考著作中提供，如Current Protocols in  Immunology,Coligan,Coligan等人，（编著），John Wiley & Sons的第6.8单 元（“Phage Display Selection and Analysis of B-cell Epitopes（噬菌体展示选择 和B-细胞表位的分析）”）和单元9.8（“Identification of Antigenic  Determinants Using Synthetic Peptide Combinatorial Libraries（使用合成肽组合 文库鉴定抗原决定簇）”）。表位可以通过以下方法来证实：将一个或多个 点突变或缺失导入一个已知的表位中、并且随后测试与一种或多种抗体的结 合以便确定哪一种突变减少抗体的结合。

由本发明提供的抗体或抗原结合片段可以按照亚纳摩尔亲和力特异性地 结合毒素A和/或毒素B。这些抗体或抗原结合片段的结合亲和力可以是约1× 10^-9M或更小、约1×10^-10M或更小、或约1×10^-11M或更小。在一个具体的 实施方案中，该结合亲和力小于约5×10^-10M。

这些抗体或抗原结合片段可以具有以下针对毒素A或毒素B的结合速率 常数（Kon）：至少10²M^-1s^-1；至少10³M^-1s^-1；至少10⁴M^-1s^-1；至少10⁵M^-1s^-1；至少10⁶M^-1s^-1；或至少10⁷M^-1s^-1，如表面等离子体共振法所测量。这些 抗体或抗原结合片段可以具有以下针对毒素A或毒素B的脱离速率常数 （Koff）：最多10^-3s^-1；最多10^-4s^-1；最多10^-5s^-1；或最多10^-6s^-1，如表面等 离子体共振法所测量。这些抗体或抗原结合片段可以具有以下针对毒素A或 毒素B的的解离常数（K_D）：最多10^-7M；最多10^-8M；最多10^-9M；最多 10^-10M；最多10^-11M；最多10^-12M；或最多10^-13M。

如在此所使用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”包括糖蛋白，这些糖蛋 白包含由二硫键相互连接的至少两条重链（H）多肽和两条轻链（L）多肽。 每条重链由一个重链可变区（在此缩写为HCVR或V_H）和一个重链恒定区 （C_H）组成。该重链恒定区由3个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链 由一个轻链可变区（在此缩写为LCVR或V_L）和一个轻链恒定区（C_L）组 成。该轻链恒定区由一个结构域C_L组成。V_H和V_L区可以进一步划分为超变 区，它被命名为互补性决定区（CDR），其间插入名为框架区（FR）的更加 保守的区域。每个V_H和V_L由3个CDR和4个FR组成，按照从氨基端至羧 基端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。连同 一起，这些重链多肽和轻链多肽的可变区含有或形成了与一种抗原相互作用/ 结合的结合结构域。这些抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因 子（包括免疫系统的各种细胞（例如，效应细胞）以及经典的补体系统的第 一组分（C1q））相结合。

本发明进一步提供其他形式的抗体，如单链抗体、重组产生的抗体、双 特异性、异特异性、或多聚体抗体、双体抗体等，如在此进一步说明。

如在此所使用的术语抗体的“抗原结合片段”是指一种抗体的一个或多 个部分，它们保留了与一种抗原（例如，毒素A、毒素B、毒素A和毒素B 等）或与一种抗原的表位区域特异性结合的能力。已经显示，抗体的抗原结 合功能可以由全长抗体的片段执行。在一个实施方案中，这些单克隆抗体片 段按照与完整的对应物单克隆抗体相似的方式发挥作用。在一个实施方案 中，这些单克隆抗体片段与完整的对应物单克隆抗体交叉反应。在一个实施 方案中，这些单克隆抗体片段可以与完整的对应物单克隆抗体互换使用。术 语抗体的“抗原结合片段”所涵盖的结合片段的实例包括(i)一个Fab片段，一 种由V_L、V_H、C_L和CH₁结构域组成的单价片段；(ii)一个F(ab′)₂片段，一种 包含由二硫键在铰链区连接的两个Fab片段的双价片段；(iii)一个由V_H和 CH1结构域组成的Fd片段；(iv)一个由抗体单臂的V_L和V_H结构域组成的Fv 片段；(v)一个由V_H结构域组成的dAb片段（Ward et al.,（1989）Nature 341: 544-546）；以及(vi)一种分离的互补性决定区（CDR）。此外，虽然Fv片段 的两个结构域V_L和V_H由单独的基因进行编码，但是使用重组方法，可以通 过能够使这两个结构域成为一条单一蛋白链的合成性接头将它们连接，在该 单一蛋白链中V_L区和V_H区配对形成单价分子（称为单链Fv（scFv）；见例 如，Bird et al.（1988）Science 242:423-426；和Huston et al.（1988）Proc. Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883）。术语抗体的“抗原结合片段”也旨在涵 盖这种单链抗体。使用常规方法，如蛋白酶解性片段化方法，如J. Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,第98-118页（N.Y. Academic Press 1983）（该文献通过引用结合在此）中所述，获得了这些抗体 片段，并且通过本领域的普通技术人员已知的其他技术获得。按照与完整抗 体相同的方式筛选这些片段的活性或用途。

在一个实施方案中，产生了本发明的mAb的Fab片段并且在基于细胞的 测定中测试它们的中和活性，如在此实例10中所说明。因此，本发明的mAb 的抗体片段，如Fab片段，也可以用来结合并且中和艰难梭菌毒素A和/或毒 素B。

如在此所使用，“分离的抗体”意指一种抗体，该抗体基本上不含具有 不同抗原性特异性的其他抗体（例如，与毒素A特异性结合的分离的抗体是 基本上不含特异性结合除毒素A之外的抗原的抗体）。然而，与毒素A或毒 素B的表位、同工型或变体特异性结合的一种分离的抗体总体上与其他相关 抗原（例如，来自其他艰难梭菌菌株的相关抗原）具有交叉反应。此外，与 毒素A的表位、同工型或变体特异性结合的一种分离的抗体也可以特异性地 结合毒素B，并且与毒素B的表位、同工型或变体特异性结合的一种分离的 抗体也可以特异性地结合毒素A。然而，在一些实施方案中，这种与毒素A 的表位、同工型或变体特异性结合的分离的抗体或其抗原结合片段也并不特 异性地结合毒素B。仍在其他实施方案中，这种与毒素B的表位、同工型或 变体特异性结合的分离的抗体或其抗原结合片段也并不特异性地结合毒素 A。另外，分离的抗体可以基本上不含其他细胞物质和/或化学品。基本上不 含具有不同抗原性特异性的其他抗体、或其他物质和/或化学品和/或蛋白质的 抗体可以是分离和/或纯化的抗体。抗体可以通过本领域的普通技术人员经常 进行的方法（例如，亲和层析法、蛋白A层析法等）纯化。如在此所使用， “特异性结合”是指抗体与一种预先确定或同族的抗原结合。典型地，该抗 体按照以下亲和力结合，该亲和力比该抗体与除该预定抗原或密切相关抗原 之外的一种非特异性抗原（例如，BSA、酪蛋白）结合的亲和力大至少两 倍。在一个实施方案中，本发明的抗体可以结合靶抗原（例如，毒素A和/或 毒素B）的线性表位。在一个实施方案中，本发明的抗体可以结合该靶抗原 （例如，毒素A和/或毒素B）的一个构象表位。

本发明的分离的抗体涵盖了多种抗体（免疫球蛋白）重链和轻链同种 型，如重链类别或同种型IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、 IgAsec、IgD、IgE及其亚型，例如，IgG2a、IgG2b；以及轻链同种型κ和λ 及其亚型。在一个实施方案中，该分离的抗体是IgG2a或IgG1κ同种型。如 在此所使用，“同种型”指由重链恒定区基因及轻链恒定区基因编码的抗体 类别（例如，IgM或IgG1或λ1)。这些抗体或其抗原结合片段可以是全长或 可以仅包括一个抗原结合片段，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、 IgA2、IgAsec、IgD或IgE的抗体恒定和/或可变区，或者可以由Fab片段、 F(ab')₂片段和Fv片段组成。

本发明的抗体可以是多克隆抗体、单克隆抗体、或多克隆抗体与单克隆 抗体的混合物。这些抗体可以通过本领域四平熟知的多种技术产生。用于产 生多克隆抗体的方法是熟知的。作为一个非限制性实例，通过皮下给予毒素 A和/或毒素B蛋白至新西兰白兔（这些兔子已经首先采血以获得免疫前血 清），产生多克隆抗体。该毒素A和/或毒素B可以按每个部位总体积100μl 在6个不同的部位注射，典型地伴有一种或多种佐剂。随后，这些兔子在第 一次注射后两周采血并且每6周用相同的抗原周期性加强免疫3次。在每次 加强免疫后10天收集血清样品。从血清回收多克隆抗体，优选地通过亲和层 析进行，使用毒素A和/或毒素B以捕获该抗体。这种方法和用于产生多克隆 抗体的其他方法在Harlow,E.和Lane,D.，（编著），Antibodies:A Laboratory  Manual（1988），Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY 中描述，该文献其内容通过引用结合在此。

可以通过本领域还熟知的技术实现单克隆抗体的产生。如在此所使用， 术语“单克隆抗体”指单一分子组合物的抗体分子的制备物。单克隆抗体展 示出针对一种给定抗原或免疫原的特定表位的单一结合特异性和亲和力。单 克隆抗体生产的过程涉及获得具有产生抗体潜力的免疫体细胞，尤其是B淋 巴细胞，这些细胞之前已经用感兴趣的抗原在体内或体外、或以这两种方式 免疫，并且适于与B-细胞骨髓瘤系融合。单克隆抗体可以使用来自不同物种 的免疫细胞和骨髓瘤细胞（如鼠细胞和人细胞）以及细胞系、或例如在已经 被基因修饰以携带人类免疫系统的小鼠系中产生，如以下进一步说明。

虽然针对毒素A和毒素B的单克隆抗体已经典型地通过用类毒素（毒素 A和毒素B的非活性形式）和/或这些毒素的无活性片段来免疫动物而产生， 但是本发明的mAb是通过设计并且使用一种新免疫策略而产生的。根据本发 明，通过用类毒素免疫动物、之后跟随用活性（非类毒素）形式的毒素A和/ 或毒素B加强免疫动物来产生在此说明和保藏的mAb（见在此的实例1）。 用活性形式的毒素A或毒素B加强免疫可以鉴定已经借助于这种新免疫方案 而形成的独特保护性抗体的免疫动物。不希望被理论所约束，该活性毒素A 和/或毒素B加强免疫方案在受体动物中具有更高程度的免疫原性。耐受增加 加强免疫剂量的活性毒素A或毒素B（它们典型地对未免疫动物具有致死 性）的那些动物产生了高度有效的中和抗体，这些抗体保护这些动物并且对 它们的存活做出贡献，尽管这些动物已经接受活性毒素。来自发动一种针对 毒素A或毒素B的有效免疫应答的动物的杂交瘤的生产产生了高度有效力的 抗毒素A和抗毒素B单克隆抗体，这些单克隆抗体在体外和体内均提供高水 平的保护。在产生抗体（包括多克隆和单克隆抗体）时，可以使用佐剂。适 于使用的佐剂的非限制性实例包括弗氏不完全佐剂、磷酸盐铝、氢氧化铝、 Ribi（即，单磷酸酯类脂A、海藻糖二霉菌酸酯、分枝杆菌属 （Mycobacterium）细胞壁骨架和80，附带2%鲨烯）、皂素、Quil A 或明矾。可以通过将毒素（或其片段、无活性衍生物或类似物）与脂类（例 如像，三棕榈酰-S-甘油酰半胱氨酸-丝氨酰-丝氨酸）相偶联来激发细胞毒T 淋巴细胞（CTL）应答。

在其他实施方案中，额外的免疫方法可以用于产生针对毒素A和/或毒素 B的单克隆抗体。例如，可以用所希望的类型和量值的蛋白质或多肽，例如 类毒素或毒素来实施动物（例如，小鼠）的体内免疫。这类免疫作用按照需 要以达到几周的间隔期进行重复，以便获得足够滴度的抗体。一旦免疫，动 物可以用作产生抗体的淋巴细胞来源。在最终抗原加强免疫后，将动物处死 并且取出脾细胞。小鼠淋巴细胞与在此所说明的小鼠骨髓瘤系产生了更高百 分比的稳定融合物。在这些小鼠中，BALB/c小鼠系是合适的。然而，也可以 使用其他小鼠品系、兔、仓鼠、绵羊、山羊和蛙类作为宿主用于制备产生抗 体的细胞。见；Goding（in Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,第2 版,第60-61页,orlando,Fla.,Academic Press,1986）。具体而言，可以使用在 基因组中插入人免疫球蛋白基因（并且不能产生小鼠免疫球蛋白）的小鼠品 系。实例包括由Medarex产生的HumAb小鼠系（现在的Bristol Myers  Squibb）/GenPharm International和由Abgenix产生的XenoMouse品系。这类 小鼠产生应答于免疫作用的全长人免疫球蛋白分子。

处于分裂的浆母细胞阶段的那些产生抗体的细胞优选地融合。体细胞可 以例如从抗原激发的动物的淋巴结、脾和外周血获得，并且淋巴细胞的选择 很大程度上取决于该特定融合系统中的经验性用途。随后，分泌抗体的淋巴 细胞与能够在细胞培养下无限增殖的（小鼠）B细胞骨髓瘤细胞或转化细胞 融合，从而产生一种永生的分泌免疫球蛋白的细胞系。培养得到的融合细胞 或杂交瘤，并且对得到的集落筛选所希望的单克隆抗体的产生。将产生这类 抗体的集落克隆、亚克隆，并且在体内（作为腹水）或体外培育以产生大量 的抗体。杂交瘤方法学和技术的描述可以在Kohler and Milstein,Nature 256:495(1975)或Harlow,E.和Lane,D.,(编著),Antibodies:A Laboratory  Manual(1988),Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY中 找到，该文献的内容通过引用结合在此。

可替代地，能够产生抗体的人类体细胞、特别是B淋巴细胞，适于与骨 髓瘤细胞系融合。尽管可以使用来自一个个体的活组织检查的脾、扁桃体或 淋巴结的B淋巴细胞，但是优选可更容易获得的外周血B淋巴细胞 （PBL）。此外，人类B细胞可以由Epstein-Barr病毒直接永生化（Cole et al., 1995,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss,Inc.,第77-96 页）。虽然体细胞杂交方法在原则上是优选的，但是可以使用产生单克隆抗 体的其他技术，如B淋巴细胞的病毒性转化或致癌性转化。

适合在产生杂交瘤的融合操作中使用的骨髓瘤细胞优选地不产生抗体、 具有高度融合效率、以及使得它们不能在支持所希望的杂交瘤生长的某些选 择性培养基中生长的酶缺陷。可以用于产生融合细胞系的这类骨髓瘤细胞系 的实例包括衍生自小鼠的P3-X63/Ag8、X63-Ag8.653、NS1/1.Ag 4.1、Sp2/0- Ag14、FO、NSO/U、MPC-11、MPC11-X45-GTG 1.7、S194/5XX0Bul；衍生 自大鼠的R210.RCY3、Y3-Ag 1.2.3、IR983F和4B210；以及衍生自人类的U- 266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2、UC729-6（Goding，引自 Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,第2版,第65-66页,Orlando, Fla.,Academic Press,1986；Campbell,引自Monoclonal Antibody Technology, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology第13卷,Burden 和Von Knippenberg编著,第75-83页,Amsterdam,Elseview,1984）。

通过标准和熟知的技术，例如通过使用聚乙二醇（“PEG”）或其他融 合剂（见Milstein and Kohler,Eur.J.Immunol.6:511(1976)，该文献通过引用 结合在此）实现了与能够在细胞培养下无限增殖的哺乳动物骨髓瘤细胞或其 他融合物伴侣的融合。

在其他实施方案中，这些抗体可以是重组抗体。如在此所使用，术语“重 组抗体”旨在包括通过重组手段所制备、表达、产生或分离的抗体，例如从一 种动物（例如，小鼠）分离的抗体（该动物相对于另一物种的免疫球蛋白基 因是转基因）、使用被转染至宿主细胞中的重组表达载体所表达的抗体、从 重组的组合抗体文库中分离的抗体、或通过涉及将免疫球蛋白基因序列剪接 至其他DNA序列的任何其他手段所制备、表达、产生或分离的抗体。

在其他实施方案中，这些抗体可以是嵌合或人源化抗体。如在此所使 用，术语“嵌合抗体”指将一个鼠免疫球蛋白（Ig）的可变区或高变区与人Ig 恒定区或恒定以及可变框架区相组合的抗体。在一些实施方案中，该嵌合抗 体包含在此提供的所保藏抗体中任一种的可变区以及一个人类恒定区。在一 些实施方案中，该人类恒定区是一个人类IgG恒定区，例如人类IgG1恒定 区。嵌合抗体可以通过以下在实例中提供的方法或通过本领域的普通技术人 员所知的任一方法产生。如在此所使用，术语“人源化抗体”指基本上仅保 留与人类框架区结合的来自亲本抗体（例如，鼠单克隆抗体）的抗原结合 CDR的抗体（见，例如，Waldmann,1991,Science 252:1657）。保留鼠抗体的 结合特异性、但却具有人类Ig恒定区的嵌合或人源化抗体预期在体内给予时 具有降低的免疫原性。因此，这些嵌合和人源化抗体优选地保留所提供的单 克隆抗体的毒素中和活性并且适于反复给药（例如，在人类中）。本领域的 普通技术人员可以使用已知的方法（例如，基于细胞的体外测定）以便将人 源化抗体的活性与在此提供的所保藏的单克隆抗体相比较并且确定这些人源 化抗体是否治疗一种已建立的艰难梭菌感染和/或防止其复发。本领域的普通 技术人员也可以使用在此说明的方法，包括以下说明的艰难梭菌感染仓鼠模 型。

可以通过以下说明性的非限制性方法来设计人源化mAb的序列。首先， 鉴定对CDR结构重要的框架氨基酸残基。同时，从已知的人类免疫球蛋白 （种系）序列中分别选出与鼠V_H和V_L具有高度同源性的人类V_H和V_L序 列。将来自鼠mAb的CDR序列连同对维持CDR结构重要的框架氨基酸残基 一起移植到所选择的人类框架序列中。此外，将所发现的在相应的V区亚组 中不常见的人类框架氨基酸残基置换为常见残基以便减少所得到的人源化 mAb的潜在免疫原性。将这些人源化V_H和V_L区分别克隆至表达载体中，例 如，pCONγ1和pCONκ（Lonza Biologics,Berkshire,UK）。这些载体编码了 人类免疫球蛋白重链和轻链基因的恒定区。293T细胞可以使用Effectene系统 （Qiagen,Valencia,CA）用这些表达载体瞬时转染。可以在转染后（例如，3 天后）收集含有分泌型嵌合mAb的细胞上清液，并且使用蛋白A层析法将其 纯化。其他表达载体和宿主细胞可以用来重组地产生所说明的抗体，正如本 领域的普通技术人员所理解的。

用于使抗体或抗原结合片段人源化的其他方法是本领域熟知的，并且包 括在例如，美国专利号5,585,089；5,693,761；5,693,762；和6,180,370中提供 的方法之中。在这些专利中提供的用于进行人源化的方法其全部内容通过引 用结合在此。在此还提供了根据这些专利中提供的方法而人源化的抗体或抗 原结合片段。

在一个实施方案中，本发明的一种人源化抗艰难梭菌毒素A mAb （hmAb）涵盖了一种免疫球蛋白蛋白或它的一个片段，该免疫球蛋白蛋白或 其片段以下各项组成：(i)两条重（H）链多肽，其中每条重链含有一个包含 如在SEQ ID NO:1中给出的氨基酸序列的VH区和一个人CH区（例如， IgG1C区），以及(ii)两条轻（L）链多肽，其中每条轻链含有一个包含如在 SEQ ID NO:3中给出的氨基酸序列的VL区和一个人CL区（例如，κ链C 区）。在一个实施方案中，本发明的一种人源化抗艰难梭菌毒素A mAb涵盖 了一种免疫球蛋白蛋白或它的一个片段，该免疫球蛋白蛋白或其片段由以下 各项组成：(i)两条重（H）链多肽，其中每条重链含有一个包含如在SEQ ID  NO:2中给出的氨基酸序列的VH区和一个人CH区（例如，IgG1C区），以 及(ii)两条轻（L）链多肽，其中每条轻链含有一个包含如在SEQ ID NO:3中 给出的氨基酸序列的VL区和一个人CL区（例如，κ链C区）。在一个实施 方案中，本发明的一种人源化抗艰难梭菌毒素A mAb涵盖了一种免疫球蛋白 蛋白，该免疫球蛋白蛋白由以下各项组成：(i)两条重（H）链多肽，其中每 条重链含有一个包含如在SEQ ID NO:1中给出的氨基酸序列的VH区和一个 人CH区（例如，IgG1C区），以及(ii)两条轻（L）链多肽，其中每条轻链 含有一个包含如在SEQ ID NO:4中给出的氨基酸序列的VL区和一个人CL 区（例如，κ链C区）。在一个实施方案中，本发明的一种人源化抗艰难梭 菌毒素A mAb涵盖了一种免疫球蛋白蛋白，该免疫球蛋白蛋白由以下各项组 成：(i)两条重（H）链多肽，其中每条重链含有一个包含如在SEQ ID NO:2 中给出的氨基酸序列的VH区和一个人CH区（例如，IgG1C区），以及(ii) 两条轻（L）链多肽，其中每条轻链含有一个包含如在SEQ ID NO:4中给出 的氨基酸序列的VL区和一个人CL区（例如，κ链C区）。这类人源化的抗 艰难梭菌毒素A mAb包括本发明的hPA-39mAb。

在一个实施方案中，本发明的一种人源化抗艰难梭菌毒素A mAb涵盖了 一种免疫球蛋白蛋白，该免疫球蛋白蛋白由以下各项组成：(i)两条重（H） 链多肽，其中每条重链含有一个包含如在SEQ ID NO:5中给出的氨基酸序列 的VH区和一个人CH区（例如，IgG1C区），以及(ii)两条轻（L）链多肽 组成，其中每条轻链含有一个包含如在SEQ ID NO:7中给出的氨基酸序列的 VL区和一个人CL区（例如，κ链C区）。在一个实施方案中，本发明的一 种人源化的抗艰难梭菌毒素A mA涵盖了一种免疫球蛋白蛋白，该免疫球蛋 白蛋白由以下各项组成：(i)两条重（H）链多肽，其中每条重链含有一个包 含如在SEQ ID NO:6中给出的氨基酸序列的VH区和一个人CH区（例如， IgG1C区），以及(ii)两条轻（L）链多肽，其中每条轻链含有一个包含如在 SEQ ID NO:7中给出的氨基酸序列的VL区和一个人CL区（例如，κ链C 区）。这类人源化的抗艰难梭菌毒素A mAb包括本发明的hPA-50mAb。

在一个实施方案中，本发明的一种人源化的抗艰难梭菌毒素B mAb涵盖 了一种免疫球蛋白蛋白，该免疫球蛋白蛋白由以下各项组成：(i)两条重 （H）链多肽，其中每条重链含有一个包含如在SEQ ID NO:8中给出的氨基 酸序列的VH区和一个人CH区（例如，IgG1C区），以及(ii)两条轻（L） 链多肽组成，其中每条轻链含有一个包含如在SEQ ID NO:10中给出的氨基 酸序列的VL区和一个人CL区（例如，κ链C区）。在一个实施方案中，本 发明的一种人源化的抗艰难梭菌毒素B mAb涵盖了一种免疫球蛋白蛋白，该 免疫球蛋白蛋白由以下各项组成：(i)两条重（H）链多肽，其中每条重链含 有一个包含如在SEQ ID NO:9中给出的氨基酸序列的VH区和一个人CH区 （例如，IgG1 C区），以及(ii)两条轻（L）链多肽，其中每条轻链含有一个 包含如在SEQ ID NO:10中给出的氨基酸序列的VL区和一个人CL区（例 如，κ链C区）。这类人源化的抗艰难梭菌毒素A mAb包括本发明的hPA-41 mAb。

本发明的上述人源化抗体的L链和H链C区可以包含人类κL链C区 （C_L）和人IgG1H链C区（C_H），这些区域具有分别包含于Genbank登录 号NW 001838785以及Genbank登录号MW 001838121中的序列。在其他实 施方案中，这些人源化的抗体包含选自IgG2a、IgG2b、IgG3或IgG4同种型 的人类H链C区。

在一个说明性的实施方案中，本发明包括一种针对艰难梭菌毒素A产生 的单克隆抗体或它的一个片段，其中该抗体由两条重链多肽和两条轻链多肽 组成，每条重链含有一个VH区和一个人CH区，并且每条轻链含有一个VL 区和一个人CL区。编码SEQ ID NO:14抗体重链多肽的连续氨基酸序列的核 酸序列（或cDNA）在SEQ ID NO:15中给出（图38B）；编码SEQ ID NO: 16抗体轻链多肽的连续氨基酸序列的核酸序列（或cDNA）在SEQ ID NO:17 中给出（图38A）。

在一个说明性的实施方案中，本发明包括一种针对艰难梭菌毒素A产生 的单克隆抗体或它的一个片段，其中该抗体由两条重链多肽和两条轻链多肽 组成，每条重链含有一个VH区和一个人CH区，并且每条轻链含有一个VL 区和一个人CL区。编码SEQ ID NO:18重链多肽的连续氨基酸序列的核酸序 列（或cDNA）在SEQ ID NO:19中给出（图39B）；编码SEQ ID NO:20轻 链多肽的连续氨基酸序列的核酸序列（或cDNA）在SEQ ID NO:21中给出 （图39A）。

在一个说明性的实施方案中，本发明包括一种针对艰难梭菌毒素B产生 的单克隆抗体或它的一个片段，其中该抗体由两条重链多肽和两条轻链多肽 组成，每条重链含有一个VH区和一个人CH区，并且每条轻链含有一个VL 区和一个人CL区。编码SEQ ID NO:22重链多肽的连续氨基酸序列的核酸序 列（或cDNA）在SEQ ID NO:23中给出（图40B）；编码SEQ ID NO:24轻 链多肽的连续氨基酸序列的核酸序列（或cDNA）在SEQ ID NO:25中给出 （图40A）。

本发明还涵盖了以上说明的抗艰难梭菌毒素A和抗毒素B人源化抗体的 部分或片段。这些部分或片段包括H链和L链多肽的V区的互补性决定区 （CDR），正如可以由本领域的普通技术人员常规确定；F(ab)片段、F(ab’) 片段、F(ab’)2片段、Fc片段、Fd片段等。在一个实施方案中，含有V区或 其功能性部分的人源化抗体的部分或片段将与相应的毒素最佳结合并且中和 该毒素的活性。在一个实施方案中，这些人源化抗体的功能性部分或片段以 最佳地与完整人源化抗体相似（如果不优于的话）的水平中和毒素活性。

根据本发明，提供了针对艰难梭菌毒素A或毒素B经分子克隆的人源化 mAb。这类人源化mAb按照在此实例9中的第D和E部分所说明进行分离和表 征。在一个实施方案中，每种人源化抗体的轻链恒定区（CL）是κ（κ）类 的。在一个实施方案中，每种人源化抗体的重链恒定区（CH）是IgG1同种型 的。在其他实施方案中，这些人源化抗体的CH区是IgG2a、IgG2b、IgG3、 IgG4、IgA、IgE、IgA或IgM同种型的。含有独特可变（V）区的人源化mAb 被发现结合并且中和艰难梭菌毒素A或毒素B的活性。这些人源化mAb的VL和 VH区可以形成一种完整免疫球蛋白（Ig）或抗体分子的部分，或它们可以用 作该抗体的部分或片段，尤其是具有结合和/或中和活性的部分或片段。抗体 片段的非限制性实例包括Fab、F(ab)₂和F（ab’)或F（ab’)₂片段。在另一个方 面，本发明的实施方案指向具有针对艰难梭菌毒素A的活性的抗艰难梭菌毒素 A人源化mAb或其片段，其中L链的V区选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和 SEQ ID NO:7中的一个或多个。在一个实施方案中，本发明指向在所说明的 抗体的VH和VL区中的CDR，即CDR1、CDR2和/或CDR3。本发明的实施方案 指向具有针对艰难梭菌毒素B的活性的抗艰难梭菌毒素B人源化mAb或其片 段，其中L链的V区在SEQ ID NO:10中给出。在另一个方面，本发明的实施方 案指向具有针对艰难梭菌毒素A的活性的抗艰难梭菌毒素A人源化mAb或其片 段，其中H链的V区选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5和SEQ  ID NO:6中的一个或多个。在另一个方面，本发明的实施方案指向具有针对艰 难梭菌毒素B的活性的抗艰难梭菌毒素B人源化mAb或其片段，其中H链的V区 选自SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9中的一个或多个。在一个实施方案中，本 发明指向在说明的抗体的VH和VL区中的CDR，即CDR1、CDR2和/或CDR3。

在其他实施方案中，本发明涵盖了以下核酸，这些核酸编码了本发明的 抗艰难梭菌毒素A和/或抗毒素B抗体的抗原结合部分、CDR或可变（V）区。 在多种实施方案中，这些部分、CDR或V区是衍生自PA-38、PA-39、PA-41、 或PA-50或其人源化形式，如在此所说明。在其他的实施方案中，本发明涵盖 了由相应的核酸所编码的抗原结合部分、CDR、或V区的氨基酸序列。

根据另一个实施方案，可以将本发明的单克隆抗体进行修饰以便形成一 种双特异性抗体、双功能抗体、多特异性抗体、或异功能性抗体。双特异性 和异特异性抗体以及用于制造这类抗体的方法的非限制性实例可以在多个说 明性的出版物中发现，例如，UA20090060910、WO2009/058383、 WO2009/030734、WO2007/093630、USP 6,071,517、WO2008/024188、 UA20070071675、USP 7,442,778、USP 7,235,641、USP 5,932,448和USP 5,292,668。术语“双特异性抗体”旨在包括任一试剂，例如蛋白质、肽、或 蛋白质或肽复合物，该试剂具有两种不同的结合特异性并且结合(a)艰难梭菌 毒素A和以及(b)艰难梭菌毒素B结合、或与其相互作用。在一个实施方案 中，该双特异性抗体包含PA-39或PA-50或它的一个抗原结合片段，以及 PA-41或它的一个抗原结合片段。在一个实施方案中，该双特异性抗体包含 嵌一种合或人源化形式的PA-39或PA-50或它的一个抗原结合片段，以及 PA-41或它的一个抗原结合片段。因此，包含PA-39和PA-41、或它的嵌合或 人源化形式、或它的一个抗原结合片段的双特异性抗体将同时结合艰难梭菌 毒素A和毒素B。类似地，包含PA-50和PA-41、或它们的嵌合或人源化形 式、或它的一种抗原结合片段的双特异性抗体将同时结合艰难梭菌毒素A和 毒素B。术语“多特异性抗体”旨在包括任一试剂，例如蛋白质、肽、或蛋白质 或肽复合物，该试剂具有超过两种不同的结合特异性并且结合(a)艰难梭菌毒 素A以及(b)艰难梭菌毒素B、以及(c)至少一种其他组分结合，或与它们相 互作用。因而，该发明包括但不限于双特异性抗体、三特异性抗体、四特异 性抗体、以及其他多特异性抗体。在一个实施方案中，这些双特异性或多特 异性抗体的抗体或抗原结合片段是人源化的。

术语“双特异性抗体”进一步包括双体抗体。双体抗体提供了具有双重 特异性并且能够用一种单一分子靶向多个不同表位的治疗性抗体。双体抗体 是双价的双特异性抗体，其中V_H和V_L结构域在一条单一多肽链上表达，但 是使用了一种过短的连接物以至于不允许这两个结构域之间在同一链上配 对，从而迫使这些结构域与另一条链的互补结构域配对并且产生两个抗原结 合位点（见，例如，Holliger,P.,et al.(1993)Proc Natl Acad Sci USA 90:6444- 6448；Poijak,R.J.,et al.(1994)Structure 2:1121-1123）。双特异性抗体的两个 抗原结合区域经化学连接或通过基因修饰而产生该双特异性抗体的细胞来表 达。（总体上见，Fanger et al.,1995Drug News & Perspec.8(3):133-137）。在 一个实施方案中，一个有效量的双特异性抗体可以给予患有艰难梭菌感染和/ 或艰难梭菌相关性疾病的受试者，并且高双特异性抗体中和了该受试者体内 毒素A和毒素B的毒性。

在某些实施方案中，这些抗体可以是人类抗体。如在此所使用，术语“人 类抗体”旨在包括具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变Ig区和恒定Ig区 的抗体。这些人类抗体可以包括并非由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸 残基（例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变导入的 突变）。然而，如在此所使用，术语“人类抗体”并非旨在包括以下抗体， 在这些抗体中从另一种哺乳动物物种（如小鼠）的种系中衍生的CDR序列移 植到人类框架序列上（在此被称为“人源化抗体”）。可以使用转基因小鼠 来产生针对毒素A和/或毒素B的人类抗体，这些小鼠经基因修饰并且育种以 表达人类免疫系统（而非小鼠系统）的组分。

完全人类单克隆抗体也可以通过将对于人类免疫球蛋白重链基因座和轻 链基因座中的大部分而言是转基因的小鼠来制备。见，例如，美国专利 5,591,669、5,598,369、5,545,806、5,545,807、6,150,584以及其中引用的参考 文献，其内容通过引用结合在此。这些动物已经进行基因修饰，这样使得内 源性（例如，鼠）抗体的产生存在着功能缺失。这些动物被进一步修饰以便 含有全部或一部分的人种系免疫球蛋白基因座，这样使得这些动物的免疫作 用导致产生针对所感兴趣的抗原的完全人类抗体。在对这些小鼠（例如， XenoMouse（Abgenix）、HumAb小鼠（Medarex/GenPharm））进行免疫 后，根据标准的杂交瘤技术制备了单克隆抗体。这些单克隆抗体具有人类免 疫球蛋白氨基酸序列，并且因此当给予人类时将不诱导人类抗小鼠抗体 （HAMA）的应答。

本领域的普通技术人员应当理解，在此还提供了编码所说明的抗体或其 抗原结合片段的核酸和多核苷酸。还应当理解，在此提供了包含一个序列的 核酸和多核苷酸，该序列编码了这些抗体或其抗原结合片段。因此，本发明 提供了经工程化处理以便含有和/或表达编码抗体的核酸和多核苷酸的载体和 质粒。如在此所使用，“编码区”是指编码了一个多肽序列的核苷酸序列区 域；该编码区可以包括编码蛋白质的一部分（随后被切除）（如信号肽）的 区域。在一些情况下，这些核苷酸和氨基酸序列可以包含编码或作为信号肽 的序列。本发明包括这些序列中的每一个，具有或不具有编码或作为一种信 号肽的序列的部分。

在此提供的抗体可以使用以下方法连同本领域的普通技术人员已知的其 他方法进行克隆。如一个非限制性实例，从杂交瘤细胞产生总RNA并且使用 寡-dT引物逆转录成cDNA。RNA酶H可以用来除去RNA以产生单链 cDNA。离心柱纯化法可以用来除去游离的核苷酸。随后，可以将末端转移酶 添加到3’聚-dG尾部。可以使用一种寡-dC引物外加一种恒定区的简并引物进 行PCR扩增。对于稳健的重链扩增，可以进行大约40个循环。随后可以进行 PCR产物的直接测序。

在某些实施方案中，这种抗体或其抗原结合片段是由与前述核酸分子高 度同源的核酸分子所编码的。该同源核酸分子可以包含与在此提供的核苷酸 序列至少约90%相同的核苷酸序列。同源核酸分子可以包含一种核苷酸序 列，该序列与在此提供的核苷酸序列至少约95%相同、至少约97%相同、至 少约98%相同、或至少约99%相同。可以使用本领域的普通技术人员所熟知 的多种公众可获得的软件工具计算同源性。示例性的工具包括可以从美国国 立健康研究所的国家生物技术信息（NCBI）中心获得的BLAST系统。

一种鉴定高度同源的核苷酸序列的方法是借助于核酸杂交。在此还提供 了具有毒素A和/或毒素B结合特性以及在此说明的其他功能特性的抗体，这 些抗体由在高严格性条件下与编码本发明抗体的核酸分子杂交的核酸分子所 编码。也可以使用适于克隆相关核酸序列的聚合酶链反应（PCR）和其他扩 增技术来实现相关序列的鉴定。对于这类技术，典型地选择PCR引物以扩增 所感性的核酸序列的部分，如CDR。

如在此所使用的术语“高严格性条件”是指本领域所熟悉的参数。核酸 杂交参数可以在编纂此类方法的参考文献中找到，例如，Molecular Cloning: A Laboratory Manual,J.Sambrook等人编著,第2版,Cold Spring Harbor  Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1989或Current Protocols in  Molecular Biology,,F.M.Ausubel等人,编著,John Wiley & Sons,Inc.,New  York。高严格性条件的一个非限制性实例是在65°C在杂交缓冲液（3.5X SSC，0.02%Ficoll，0.02%聚乙烯吡咯烷酮，0.02%牛血清白蛋白，2.5mM NaH₂PO₄（pH7），0.5%SDS，2mM EDTA）中杂交。SSC是0.15M氯化钠 /0.015M柠檬酸钠，pH7；SDS是十二烷基硫酸钠；并且EDTA是乙二胺四乙 酸。杂交后，洗涤其上转移了该核酸的膜，例如在室温于2X SSC中并且随后 在达到68°C的温度于0.1-0.5X SSC/0.1X SDS中。

在此提供了载体（例如，表达载体）或质粒，这些载体质粒包含除其他 核酸序列之外所说明的核酸分子，例如为了表达蛋白质，多肽或肽所要求的 ORI、启动子、增强子、终止序列。这些载体可以用来转化或转染宿主细胞， 以便产生具有在此所说明的抗体或抗原结合片段的结合特异性和/或特征的抗 体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，这些载体可以包含一种分离的核 酸分子，该核酸分子编码了所提供的抗体和抗原结合片段的重链或其部分。 在另一个实施方案中，这些载体可以包含编码该轻链或其部分的核酸序列。 在又一个实施方案中，本发明的载体可以包含一个重链序列或其部分、以及 一个轻链序列或其部分。在又一个实施方案中，给出了产生在此说明的抗体 或抗原结合片段的质粒。

还提供修饰形式的本发明的抗体。将一种抗体或其抗原结合片段典型地 修饰成编码该抗体或其抗原结合片段的核酸，并且可以包括缺失、点突变、 截短、氨基酸置换以及添加氨基酸部分或非氨基酸部分。可替代地，可以对 多肽直接进行修饰，例如通过切割、添加连接物分子、添加可检测的部分 （如生物素）、添加脂肪酸等。修饰也包括融合蛋白，这些融合蛋白包含该 抗体或抗原结合片段的氨基酸序列的全部或部分。修饰进一步包括将该抗体 与另一种药剂（例如细胞毒药物、药物或治疗药）偶联或接合。

经修饰的多肽包括以下多肽，这些多肽被特异性地修饰以改变该多肽与 其生理学活性无关的特征。例如，可以置换或缺失半胱氨酸残基以防止不想 要的二硫键。类似地，可以改变某些氨基酸以便通过消除表达系统中由蛋白 酶所致的蛋白酶解作用来增强多肽的表达（例如，在存在着KEX2蛋白酶活 性的酵母表达系统中的双碱性氨基酸残基）。另外，可以改变（特别在Ig恒 定区内）一个或多个氨基酸，以防止抗体在某些给药途径（例如，口服给 药）后被酶以蛋白酶解的方式降解，如在例如2006年7月6日公布的 WO2006/071877中所说明。

通过改变编码多肽的核酸分子便利地完成了修饰。对编码多肽的一种核 酸的突变优选地保留了该编码序列的氨基酸可读框，并且优选地不在该核酸 中产生可能杂交形成二级结构的区域，例如发夹或环，它们可以不利于经修 饰的多肽表达。

可以通过选择一种氨基酸置换、或通过随机诱变编码这种肽的核酸中一 个经选择的位点来对这些抗体或其抗原结合片段中的任一种进行修饰。随 后，可以表达经修饰的多肽并且测试一种或多种活性以确定哪种突变是带有 所希望特性的经修饰的多肽。可以对经修饰的多肽（或对未修饰的多肽）进 一步突变，这些突变就该多肽的氨基酸序列而言是沉默的，但是它们为在特 定宿主中进行翻译而提供了优选的密码子。用于核酸在例如大肠杆菌（E. coli）中翻译的优选密码子是本领域的普通技术人员熟知的。仍可以对一种序 列或cDNA克隆的非编码序列进行其他突变以便增强多肽的表达。可以通过 以下方式测试经修饰多肽的活性：将编码该经修饰多肽的基因克隆至一个表 达载体中，将该载体导入适宜的宿主细胞中，表达这种经修饰的多肽，并且 如在此所披露测试这些多肽的功能性能力。前述操作是本领域的普通技术人 员熟知的。

技术人员还应当认识到，可以在多肽中进行保守性氨基酸置换以便提供 功能等效的多肽。如在此所使用，“保守性氨基酸置换”是指一种氨基酸置 换，该置换不改变其中进行氨基酸置换的蛋白质其相对电荷或大小的特征。 经修饰的多肽可以根据如本领域的普通技术人员已知的用于改变多肽序列的 方法制备，例如可以在编纂此类方法的参考文献中找到，例如，Molecular  Cloning:A Laboratory Manual,J.Sambrook等人,编著,第2版,Cold Spring  Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1989或Current  Protocols in Molecular Biology,,F.M.Ausubel,等人,编著,John Wiley & Sons, Inc.,New York。氨基酸的保守性置换包括在以下示例性组内的氨基酸之间进 行的置换：(a)M、I、L、V；(b)F、Y、W；(c)K、R、H；(d)A、G；(e)S、 T；(f)Q、N；以及(g)E、D。

典型地通过改变编码一种多肽的核酸在多肽中进行保守性氨基酸置换。 这类置换可以通过本领域的普通技术人员已知的多种方法进行。例如，可以 通过PCR定向突变、位点定向诱变、或通过化学合成编码多肽的基因来进行 氨基酸置换。当对多肽的小片段进行氨基酸置换时，可以通过直接合成该肽 进行置换。可以通过以下方式测试功能等效的多肽片段的活性：将编码该改 变的多肽的基因克隆至一个细菌或哺乳动物表达载体中，将该载体导入一种 适宜的宿主细胞中，表达该改变的多肽、并且如在此所披露测试多肽的功能 能力。

本发明的一种抗毒素抗体、或它的抗原结合部分可以衍生至或连接另一 种功能分子，例如另一种肽或蛋白质。另外，该抗体或抗体部分可以例如通 过化学偶联、遗传融合、非共价结合等方式功能性地连接一种或多种其他分 子实体，如另一种抗体、一种可检测的试剂、细胞毒试剂、治疗药、药物试 剂、和/或可以介导与另一种分子结合的蛋白质或肽（例如，链霉亲和素核心 区或多组氨酸标签）。

可以通过将相同或不同类型的两种或更多蛋白质或抗体交联或偶联，产 生衍生化的蛋白质或抗体。合适的交联剂或偶联剂包括以下试剂，这些试剂 是异源双功能的、具有被一个适宜的间隔物分隔的两个不同反应性基团（例 如，间-马来酰亚胺基苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯）或同源双功能的（例 如，二琥珀酰亚胺基辛二酸酯），并且是可商业获得的（Pierce Chemical  Company,Rockford,IL）。本发明的一种抗毒素抗体或其抗原结合片段可以与 另一个分子实体（如标记物）偶联。可衍生或标记一种蛋白质的可检测试剂 或标记物包括荧光化合物、酶类、辅基（例如，链霉亲和素和抗生物素蛋 白）、化学发光物质、生物发光物质、化学实体和放射性物质。可检测的荧 光化合物的实例包括荧光素、荧光素异硫氰酸酯（FITC）、罗丹明和藻红蛋 白。蛋白质或抗体也可以用可检测的酶类，例如碱性磷酸酶（AP）、辣根过 氧化物、β-半乳糖苷酶、乙酰胆碱酯酶、葡萄糖氧化酶等衍生化。一旦添加 这种酶的特异性底物从而产生一种可检测的反应产物时，这类酶促衍生化的 蛋白质或抗体变得可检测。用辅基（如生物素）衍生化的蛋白质可以通过间 接测量抗生物素蛋白或链霉亲和素结合而检测到。

可以使用经标记的蛋白质和抗体作为诊断物质和/或实验物质或试剂，以 便通过标准技术（例如亲和层析或免疫沉淀法）分离一种已知或预先确定的 抗原，或以便检测一种已知或预先确定的抗原，从而确定组织中的蛋白质水 平，作为临床检验操作的一部分，例如以便监督一种给定治疗方案的功效。 在一个实施方案中，待检测的抗原可以是细胞裂解物中或患者样品中的毒 素。

在一个具体的实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段被联合使用， 例如作为包含两种或更多不同抗体或其抗原结合片段（例如，一种或多种针 对毒素A，并且一种或多种针对毒素B，两种或更多针对毒素A、或两种或 更多针对毒素B，等等）的药物组合物。抗体或其抗原结合片段的组合可以 在一个单一疗法中组合（即，同时给药）以实现所希望的治疗效果。可替代 地，这些抗体或其抗原结合片段可以分开（即，在不同时间）给药。因此， 随之而来的是可以将这些抗体或其抗原结合片段一起或分别贮存。这些抗体 或其抗原结合片段可以在水性介质中贮存或者作为一种冻干形式贮存，可以 在使用前重构。

在另一个实施方案中，提供了包含一种或多种分离的抗体或其抗原结合 片段的组合物。还提供了包含前述抗体或其抗原结合片段中一种或多种的组 合的组合物。还提供了以下组合物，这些组合物各自含有前述抗体或其抗原 结合片段中的一种或多种，这些组合物旨在组合使用。这类组合物可以包括 一种生理学或药学可接受的载体、赋形剂、运载体、或稀释剂。这种生理学 或药学可接受的载体、赋形剂、运载体、或稀释剂可以与该分离的抗体或其 抗原结合片段混合。在一个实施方案中，这些组合物包括多种（例如，两种 或更多种）分离的抗体或其抗原结合片段的组合。在一个实施方案中，这种 组合物的抗体或其抗原结合片段中的一种或多种特异性地结合艰难梭菌毒素 A并且中和其毒性效应，而这些抗体或其抗原结合片段中的一种或多种特异 性地结合艰难梭菌毒素B并且中和其毒性效应。在一个实施方案中，特异性 地结合艰难梭菌毒素A并且中和其毒性效应的抗体或其抗原结合片段中的一 种或多种以及特异性地结合艰难梭菌毒素B并且中和其毒性效应的一种或多 种抗体或其抗原结合片段均是人源化的。

在一个具体的实施方案中，这种组合物包含一种如在此所说明的抗毒素 A抗体或其抗原结合片段以及一种如在此所说明的抗毒素B抗体或其抗原结 合片段的组合。在这种组合物中，该抗毒素A抗体和抗毒素B抗体可以按照 相等的量值或比例，例如1:1而存在。可替代地，在这种组合物中，该抗毒 素A抗体和抗毒素B抗体可以按照不同的量值或比例，例如1/2:1；2:1；3: 1；4:1等而存在。在一个实施方案中，该组合物的抗体是人源化的。在一个 实施方案中，该组合物包含mAb PTA-9888、它的一个抗原结合片段、或它的 一种人源化形式与mAb 9693、它的一个抗原结合片段、或它的一种人源化形 式的组合。在一个实施方案中，该组合物包含mAb PTA-9694、它的一个抗原 结合片段、或它的一种人源化形式与mAb 9693、它的一个抗原结合片段、或 它的一种人源化形式的组合。在一个实施方案中，该组合物包含以下各项中 任一种的组合：Mab PTA-9692、它的一个抗原结合片段、或它的一种人源化 形式与mAb 9693、它的一个抗原结合片段、或它的一种人源化形式；或mAb  PTA-9888、它的一个抗原结合片段、或它的一种人源化形式与mAb 9692、它 的一个抗原结合片段、或它的一种人源化形式；或mAb PTA-9694、它的一个 抗原结合片段、或它的一种人源化形式与mAb 9692、它的一个抗原结合片 段、或它的一种人源化形式。

药物组合物也可以在联合疗法中给予，即与其他治疗药组合。例如，联 合疗法可以包括一种组合物，该组合物包含如在此与至少一种其他常规疗法 一起提供的一种或多种抗体或其抗原结合片段。这类额外的治疗药包括抗生 素治疗药和非抗生素治疗药。额外的治疗药包括艰难梭菌类毒素疫苗、氨苄 青霉素/阿莫西林、万古霉素、甲硝唑、非达霉素、利奈唑胺、硝唑尼特、利 福昔明、雷莫拉宁、艰难菌素（difimicin）（也称作PAR-101或OPT-80）、 克林霉素、头孢菌素（例如第二代和第三代头孢菌素）、氟喹诺酮类（例如 加替沙星或莫西沙星）、大环内酯类（例如，红霉素、克拉霉素、阿奇霉 素）、青霉素、氨基糖甙类、甲氧苄啶-磺胺甲噁唑、氯霉素、四环素、亚胺 培南、以及美罗培南。额外的治疗药也包括抗生素、抗菌药、杀菌剂或抑菌 剂。在一个实施方案中，这种额外的治疗药可以是靶向艰难梭菌和/或其毒素 的一种小分子或低分子量化学化合物。在一个实施方案中，这种额外的治疗 药是OPT-80。非抗生素治疗药包括托来伐姆，它是一种通过非特异性电荷机 制而结合毒素A和毒素B的高分子量阴离子聚合物。

作为一种替代物，构思了本发明的抗体或其抗原结合片段可以与其他抗 体或其抗原结合片段组合使用。其他额外的治疗药包括正常汇集的免疫球蛋 白、静脉内免疫球蛋白、或血清中的多克隆抗毒素A和抗毒素B免疫球蛋白。 其他抗体包括针对艰难梭菌毒素A或毒素B的人类mAb，如在所公布的文献 （例如，WO/2006/121422；US2005/0287150）中所描述并报道。

在此还涵盖了一种方法，该方法涉及使用本发明的抗体或其抗原结合片 段用于治疗或预防，即用来治疗、解除、改善、根除、阻止、或推迟艰难梭 菌感染或艰难梭菌相关性疾病、其病变或形成或进展。CDAD典型地通过使 用抗生素（例如克林霉素、头孢菌素类和氟喹诺酮类）破坏结肠菌群而突然 发生。结肠微环境的这种扰动连同暴露于艰难梭菌孢子，导致了在患病个体 体内的移殖。所有移殖的患者中有大约三分之一形成了CDAD，这可以导致 重度腹泻、结肠穿孔、结肠切除和死亡。因此，提供了多种方法，通过这些 方法，向受试者给予本发明的一种或多种抗体、或如在此所说明的组合物以 便治疗艰难梭菌感染或CDAD。

如在此所使用，“治疗”是指通过给予在此提供的抗体或一种组合物或 多种组合物的组合向患有艰难梭菌感染或艰难梭菌相关性疾病的受试者赋予 的任何益处。例如并且没有限制，这种益处可以是消除一种或多种症状或不 良作用、或减轻或改善由于这种感染或疾病所致的一种或多种症状或不良作 用的严重程度；这种感染或疾病的进展延迟、停顿、或逆转；胃肠道、结 肠、肠等的正常和天然微生物区系的再定居、复苏、或再增殖，或这种感染 或疾病的治愈（即，临床医生评价该受试者并确定该受试者不再患有这种感 染或疾病）。与艰难梭菌感染相关的症状或不良作用包括脱水、腹泻、绞 痛、肾衰竭、肠穿孔、可以导致结肠破裂的中毒性巨结肠、以及死亡。提供 的组合物可以用来减少、减弱、改善、或消除在此提供的症状或不良作用的 任一种或全部。

如在此所使用，“艰难梭菌感染”是指由于以下情况所产生的感染：艰 难梭菌在之前不存在艰难梭菌的肠道菌群中存在或艰难梭菌在肠道菌群中的 存在发生变化（例如，艰难梭菌的量值相对于一种或多种其他细菌等增 加），这导致或可以导致不良作用和/或毒素A和/或B在肠或其他器官和组 织（包括胃肠道）中的水平增加。典型地，CDAD由于肠道中获取和增殖艰 难梭菌而引起。在体内，毒素A和B显示出不同的病理学特征，在引起疾病 方面存在着潜在协同性。例如，在兔和小鼠中，毒素A是一种诱导腹泻的肠 毒素，而毒素B在这个物种中不引起液体应答。然而，毒素B在体外具有更 强烈的细胞毒性。毒素A阴性、毒素B阳性（A-B+）艰难梭菌菌株已经日 益增多。A-/B+菌株由于tcdA基因重复域的缺失而不能产生毒素A，但仍能 引起临床疾病。相比之下，迄今在人类中没有报道毒素A阳性、毒素B阴性 （A+/B-）菌株。

艰难梭菌感染通常表现为轻度至中度腹泻，偶尔伴发腹部绞痛。偶尔观 察到伪膜，它们是肠粘膜上的黏附性淡黄色-白色斑块。在罕见的病例中，艰 难梭菌感染的患者可以出现急性腹部和暴发性致命结肠炎，该病由于结肠中 正常细菌菌群被破坏、艰难梭菌移殖并且释放出造成粘膜炎症及损伤的毒素 而产生。抗生素疗法是改变这种结肠菌群的关键因素。正常肠道菌群持续移 殖并且生长超过艰难梭菌，而使用抗生素抑制了正常菌群，允许艰难梭菌细 菌增殖。艰难梭菌在2%-3%的健康成人中存在，并且在多达70%的健康婴儿 中存在。在其方面之一，本发明的mAb用于治疗无症状，但却易于接触艰难 梭菌感染、或存在这种风险并且患有其相关性疾病的受试者。这类受试者可 以住院或可以在医院环境之外。

艰难梭菌相关性疾病的主要风险因素是先前暴露于抗生素。艰难梭菌结 肠炎所牵涉的最常见抗生素包括头孢菌素（尤其是第二代和第三代）、氨苄 青霉素/阿莫西林和克林霉素。较不常见牵涉的抗生素是大环内酯类（即，红 霉素、克拉霉素、阿奇霉素）和其他青霉素。偶尔报道引起本疾病的化合物 或其他药物包括氨基糖甙类、氟喹诺酮类、甲氧苄啶-磺胺甲噁唑、甲硝唑、 氯霉素、四环素、亚胺培南、以及美罗培南。即便短暂暴露于任何单一抗生 素仍可以引起艰难梭菌结肠炎，尤其是当正常肠道菌群受到不利的影响或被 杀死时。延长抗生素疗程、或使用两种或多种抗生素增加了患病风险。传统 上用来治疗艰难梭菌结肠炎的抗生素已经显示出引起疾病。与难梭菌感染相 关的其他风险因素包括高龄（大于65岁）；免疫系统削弱；最近住院（尤其 与感染患者共住一间病房、重症监护单元停留并且住院期延长）；在疗养 院、安养院、或其他长期护理设施中生活；腹部手术；慢性结肠病（例如， 炎性肠病（IBD）或结直肠癌）；服用可以减少胃酸并且允许艰难梭菌更容易 进入肠的处方抗酸药或非处方抗酸药；以及之前的艰难梭菌感染。与艰难梭 菌相关性疾病相关的更多因素包括抗肿瘤药，主要是甲氨蝶呤、溶血尿毒综 合征综合征、恶性肿瘤、肠道局部缺血、肾衰竭、坏死性小肠结肠炎、 Hirschsprung病、IBD以及非外科胃肠道方法，包括鼻胃管。可以给予在此提 供的组合物的受试者包括存在艰难梭菌感染风险的任何所述受试者。

尽管大部分艰难梭菌结肠炎患者在没有特效疗法的情况下恢复，然而症 状可以延长并且使人虚弱。艰难梭菌相关性腹泻可以一种严重病况，该病况 在虚弱的年老患者中死亡率达到25%。关注更严重患病患者的报道指出死亡 率是10%-30%。艰难梭菌感染在老年人群中更常见，并且高龄可以促进移殖 和发病的易感性。尽管婴儿和幼儿经常携带艰难梭菌和其毒素，但是临床感 染并不常见。由艰难梭菌所致的交叉感染在新生儿中心常见，但是新生儿似 乎不发生艰难梭菌相关性腹泻。

在此提供了使用本发明的人源化抗体和/或在此提供的组合物的多种方 法。例如，提供了一种用于治疗受试者的方法，该患者患有艰难梭菌感染或 疾病、显示出在此提供的任何症状或不良作用、或患有在此提供的任何疾 病。在一个实施方案中，这种方法减少、减弱、或改善了受试者体内与艰难 梭菌感染或艰难梭菌相关性疾病相关的疾病的严重程度。作为另一个实例， 提供了一种治疗罹患艰难梭菌相关性腹泻的受试者的方法。

还提供了一种中和受试者体内艰难梭菌毒素A和/或毒素B的方法。作 为一个实例，提供了一种中和合并全身性艰难梭菌毒素A和/或毒素B的方 法。在一个实施方案中，通过给予一种人源化的抗毒素A抗体或其抗原结合 片段以及一种人源化抗毒素B抗体或其抗原结合片段、或包含这些抗体的组 合物来中和合并全身性艰难梭菌毒素A和毒素B。在另一个方面，通过给予 一种特异性地结合毒素A和毒素B的抗体或其抗原结合片段、或包含该抗体 （例如，处于人源化形式）的组合物来中和合并全身性艰难梭菌毒素A和毒 素B。在一些实施方案中，这种人源化的抗体或组合物与另一种靶向艰难梭 菌的治疗药一起给药。

作为另一个实施方案，还提供一种在患有艰难梭菌感染的受试者体内恢 复正常胃肠道菌群、从而有效治疗由艰难梭菌和/或和其毒素引起的感染的方 法。作为又一个实施方案，还提供一种减少受试者对艰难梭菌感染或艰难梭 菌相关性疾病的易感性的方法。作为另一个实施方案，提供了一种在受试者 体内防止艰难梭菌感染或艰难梭菌相关性疾病的方法。

在前述方法中，向该受试者给予在此提供的抗体或组合物中的一种或多 种（例如，包含针对艰难梭菌毒素A的一种单克隆抗体或其抗原结合片段的 组合物以及包含针对艰难梭菌毒素B的一种单克隆抗体或其抗原结合片段的 组合物）。这些组合物在相同时间或不同时间给予该受试者。这些组合物可 以作为一种组合物中的混合物给予该受试者，该组合物包含一种药学可接受 的载体、运载体或赋形剂，以及任选地有效对抗艰难梭菌和/或其肠毒素的另 一种抗生素、非抗生素、药物或治疗药。

可以在根据本发明所述的方法中的任一种中分别或一起使用一种人源化 抗毒素A单克隆抗体或其抗原结合片段和/或一种人源化抗毒素B单克隆抗体 或其抗原结合片段、或一种包含这些人源化抗体或其抗原结合片段的药学可 接受的组合物。

如在此所使用，“药学可接受的载体”或“生理可接受载体”包括生理 上相容性的任何和全部的盐类、溶剂、分散介质、涂料、抗菌药和抗真菌 药、等渗和吸收延迟剂等。优选地，该载体适于口服、静脉内、腹内、肌 内、皮下、肠胃外、脊髓或表皮给药（例如，通过注射或输注）。取决于给 药途径，该活性化合物（即，抗体）可以用一种材料包被，该材料保护该化 合物免遭可能使这种化合物失活的酸以及其他天然条件的作用。

当给药时，本发明的药物制剂以药学可接受的的量值并且在药学可接受 的组合物中施用。术语“药学可接受的”意指一种无毒的生理可接受的材 料，该材料不干扰有效成分其生物学活性的有效性。这类制剂可以例行地含 有盐类、缓冲剂、防腐剂、相容性载体、以及任选地其他治疗药，如补充性 免疫增强剂，包括佐剂、趋化因子以及细胞因子。当在药物中使用时，这些 盐类应当是药学可接受的，但非药学可接受的的盐类可以方便地用来制备它 们的药学可接受的盐类并且这些盐类不从本发明范围中排除。

盐保留了亲本化合物的所希望的生物学活性并且不引起任何不希望的毒 理作用（见，例如，Berge,S.M.,et al.,(1977)J.Pharm.Sci.66:1-19）。此类 盐类的实例包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐类包括衍生自以下各项的盐 类：无毒无机酸，例如氢氯酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷 酸等，以及无毒有机酸，例如脂族一元和二元羧酸、苯基取代的链烷酸、羟 基链烷酸、芳香酸、脂族和芳香磺酸等。碱加成盐类包括衍生自以下各项的 盐类：碱土金属，例如钠、钾、镁、钙等，以及无毒有机胺，例如N,N'-二苄 基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、乙二胺 四乙酸（EDTA）（具有或没有反离子（例如钠或钙））、普鲁卡因等。

若希望，本发明的任何组合物可以与一种药学可接受的的载体组合。如 在此所使用的术语“药学可接受的载体”是指适于给予人类的一种或多种相 容性固体或液体填料、稀释剂或包囊化物质。术语“载体”是指一种天然或 合成的有机或无机成分，该成分与有效成分组合以便促进应用。这些药物组 合物的组分也能够按照以下方式与所提供的组合物的分子混合并且彼此混 合，该方式使得不存在大幅度损害所希望的药物功效的相互作用。

这些药物组合物可以含有合适的缓冲剂，包括盐中的乙酸；盐中的柠檬 酸；盐中的硼酸和盐中的磷酸。

这些药物组合物也可以任选地含有合适的防腐剂，如苯扎氯铵；氯丁 醇；和尼泊金酯。

这些药物组合物可以便利地以单位剂量形式提供，并且可以采用制药领 域所熟知的任何方法制备。所有方法包括以下步骤：使有效物质与构成一种 或多种附属成分的载体结合。通常，按照以下方式制备这些组合物：使该活 性化合物与一种液体载体、精细分散的固体载体、或这两者均匀且密切地结 合，并且若需要随后将产物成形。

可以根据剂量方案提供本发明的抗毒素A和抗毒素B抗体或其部分，其 中可以调节这些剂量方案以便在个体受试者体内提供所希望的最佳应答，如 治疗性或预防性应答。说明性地，可以给予一种单次大丸剂，可以随时间推 移给予几个分开的剂量，或这个剂量可以按照特定治疗状况所示按比例减少 或增加。为了方便给药和剂量的均匀性，肠胃外组合物可以按单位剂量形式 包装或制备。单位剂量形式是指为有待治疗的受试者提供成单一剂量的物理 上分开的单元，其中每个单元含有一种经计算以产生所希望治疗效果的预定 量的活性化合物，该活性化合物与所要求的药用载体、运载体、赋形剂或稀 释剂结合。用于本发明的单位剂量形式的说明书由以下各项因素决定并且完 全取决于此：(a)这些活性化合物的独特特征以及有待实现的特定治疗效果以 及(b)在现有技术中配制这种活性化合物用于治疗个体敏感性的固有的限制作 用。

适于肠胃外给药的组合物便利地包含一种无菌的水性或非水性制品，该 制品优选地与接受者的血液等渗。这种制品可以根据已知的方法，使用合适 的分散剂或润湿剂和助悬剂来配制。无菌可注射制品也可以是一种在无毒肠 胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液剂或混悬剂，如，1,3-丁二醇 中的溶液。水、林格液和等渗氯化钠溶液属于可以使用的可接受的运载体和 溶剂。此外，无菌的固定油被常规地用作溶剂或助悬介质。出于这个目的， 可以使用任何一种刺激性低的固定油，包括合成性单酰甘油或二酰甘油。此 外，脂肪酸如油酸可以用于注射剂的制备。适于口服、皮下、腹内、静脉 内、肌内等给药的载体配置品可以在Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co.,Easton,PA中找到。

活性组分可以连同保护这些组分免于快速释放的载体一起制备，这些载 体例如控释配置品，包括植入物以及微胶囊化的递送体系。可以使用生物可 降解、生物相容性的聚合物，如乙烯-乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原 蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备此类配置品的多种方法是专利授权的或 总体上是本领域的普通技术人员已知的。见，例如，Sustained and Controlled  Release Drug Delivery Systems（持续释放和控释放药物递送系统），J.R. Robinson,编著,Marcel Dekker,Inc.,New York,1978。

本发明的抗体和组合物作为治疗药可以通过任何一种常规途径进行给 药，包括注射或通过跨时间梯度输注。作为非限制性实例，给药途径可以是 口服、静脉内、皮下、腹内、肌内、鞘内、腔内、眶后、阴道、直肠、吸 入、呼气、皮肤、通过栓剂或经皮。

本发明的抗体和组合物以有效的量值或剂量给药。“有效量”是指如在 此提供的抗体或其抗原结合片段或组合物（单独或与其他剂量、或其他治疗 药一起）的量值在受试者体内产生所希望的应答，例如治疗、改善、根除、 解除、或防止艰难梭菌感染、腹泻或艰难梭菌相关性疾病。这可以仅涉及在 一段持续的时间内减慢感染、腹泻或疾病的进展，例如超过1周、2周、3 周、1个月、2个月、3个月、或超过3个月。然而，这类有效量最佳地永久 治疗或停顿感染、腹泻、或疾病的进展。这可以通过例行方法监测。该疾病 或病况治疗的所希望的应答也可以是延迟发作或甚至防止感染或疾病的发 作。

当然，有效量将取决于正在治疗的特定感染或疾病、感染或疾病的严重 程度、个体患者的参数（包括年龄、身体状况、体格大小、重量）、治疗持 续期、同期疗法的性质（如果存在的话）、特定给药途径和健康从业者的知 识和专业知识范围内的类似因素。这些因素是本领域的普通技术人员所熟知 的，并且可以在不超过例行检验或实验的情况下解决。通常优选使用各个组 分或其组合的最大剂量，即根据正确医学判断的最高安全剂量。然而，本领 域的普通技术人员应当理解，出于医学原因、生理原因或实际上出于任何其 他原因，患者可以坚持一种较低的剂量或可耐受的剂量。

在以上方法中所使用的药物组合物优选地是无菌的，并且含有一个有效 量的在此提供的一种或多种抗体或抗原结合片段用于以一个适于给予患者的 重量或体积单位产生所希望的应答。可以例如通过确定该组合物的生理效应 （如疾病症状的减少）来衡量该应答。其他测定应当是本领域的普通技术人 员已知的并且可以用于测量该应答的水平。

可以根据不同的参数，尤其是根据所使用的给药模式和受试者的状态来 选择给予该受试者的组合物的剂量或量值。其他因素包括所希望的治疗时 间。当受试者体内的应答在施用的初始剂量不充分时，可以使用更高的剂量 （或借助一种不同的更为局限化的递送途径所致的有效更高剂量）达到患者 耐受性允许的程度。

通常，剂量或量可以是约1μg/kg至约100,000μg/kg的范围内。构成本 发明的一种抗体、抗体部分、或组合物的治疗性或预防性有效量的剂量范围 的非限制性实例包括0.1mg/kg-100mg/kg；0.1mg/kg-60mg/kg；0.5mg/kg-75 mg/kg；0.5mg/kg-25mg/kg；0.75mg/kg-40mg/kg；1mg/kg-50mg/kg；或1 mg/kg-5mg/g。应当理解，对于任何特定的个体、患者、或受试者而言，应 当根据个体的需要以及给予抗体和/或组合物或监督其给药的技术人员的专业 判断，随时间来调节特定的剂量和剂量方案。这类剂量的范围仅是示例性 的，并且并不旨在以任何方式限制本发明的范围或实施。基于这种组合物， 剂量可以连续地（如通过连续泵）或以周期性间隔递送。特定组合物的多个 剂量的所希望的时间间隔可以由本领域的普通技术人员确定，不需要进行过 多实验。用于给予这些组合物的其他操作方案应当是本领域的普通技术人员 已知的，其中给药量、给药计划、给药部位给药用模式等不同于之前所述。

例如为测试目的或兽医治疗性目的，将这些组合物给予人类之外的哺乳 动物在基本上与以上所说明相同的条件下实施。

在此还提供了试剂盒，这些试剂盒包含本发明的抗体或包含本发明抗体 的组合物以及使用说明书。这些试剂盒可以进一步含有至少一种额外的试 剂，例如一种额外的治疗药或如在此提供的一种或多种额外的抗体或抗原结 合片段（例如，当试剂盒中的第一抗体或其抗原结合片段是针对毒素B的抗 体或其抗原结合片段时针对毒素A的抗体或其抗原结合片段，并且反之亦 然）。

试剂盒的组分可以在水性介质中或以冻干的形式包装。当这些抗体或它 们的抗原结合片段在试剂盒中按照偶联物的形式（例如，双特异性抗体偶联 物）使用时，这类偶联物的组分可以按完全偶联的形式、按中间体的形式、 或作为由使用者偶联的独立部分、或根据所提供的使用说明书的试剂盒。

试剂盒可以包含一种载体，该载体经区室化以便在其中封闭的界限内接 受一个或多个容器工具或一系列容器工具，如试管、小瓶、烧瓶、瓶子、注 射器等。第一容器工具或系列容器工具可以含有一种或多种抗体或其抗原结 合片段。第二容器工具或系列容器工具可以含有一种或多种抗体或其抗原结 合片段，其中这些抗体或其抗原结合片段与该第一容器工具中的那些或一些 其他额外的治疗药不同。在此提供的试剂盒可以进一步包含一个第三容器， 该容器含有一种分子，该分子连接着该第一和第二容器中所包含的抗体或抗 原结合片段。

如在此所使用，就多肽、蛋白质或其片段而言，“分离的”意指从其天 然环境中分离并且以允许对其鉴定或使用的足够量而存在。当提及蛋白质或 多肽时，分离例如意指：(i)通过表达克隆选择性地产生或(ii)如通过色谱或 电泳纯化。分离的蛋白质或多肽可以是基本上纯的，但是不需要如此。术语 “基本上纯的”意指是这些蛋白质或多肽基本上不含可以在自然界中或从体内 系统中找到的其他物质，其程度对于它们的预期用途而言是可行并且适合 的。基本上纯的多肽可以通过本领域熟知的技术产生。因为一种分离的蛋白 质可以与一种药物制品中的药学可接受的载体混合，所以按重量计这种蛋白 质可以仅占该制品很小的百分比。然而，该蛋白质是分离的，因为它已经与 可能在活系统中与这种蛋白质天然结合的物质分开，即与其他天然存在的蛋 白质隔离。

还提供了用于评价一种候选药物在治疗艰难梭菌感染或艰难梭菌相关性 疾病方面功效的方法。这类方法可以包含以下步骤：用增加受试者体内艰难 梭菌感染或艰难梭菌相关性疾病的风险的药物治疗受试者、用艰难梭菌接种 该受试者、用该候选药物治疗该受试者，并且评价用候选药物治疗的功效。 如在此所使用，“增加艰难梭菌感染或艰难梭菌相关性疾病的风险的试剂” 是被认为促进艰难梭菌感染或艰难梭菌相关性疾病发作和进展的任何药物。 这种药物可以是一种抗生素或非抗生素药物。例如，该药物可以是在此所说 明的抗生素中的任一种。说明性地，这种抗生素可以是甲硝唑、万古霉素、 非达霉素、硝唑尼特、利福昔明、雷莫拉宁或它们的的一种组合。

在这些方法中，该候选药物可以在用艰难梭菌接种之前或之后给予该受 试者。该候选药物可以是被认为具有治疗或防止艰难梭菌感染或艰难梭菌相 关性疾病的潜力的任何药物。这些候选药物（它可以是抗生素或非抗生素） 包括特异性地结合艰难梭菌毒素A和/或毒素B的抗体或其抗原结合片段。

这些方法包括在此实例中说明的体外和体内方法中的任一种。

CDAD治疗的最终目标是停用所有抗生素并且允许正常肠道微生物区系 的恢复。根据本发明，在此所说明的抗毒素A和毒素B mAb可以提供非抗生 素疗法，这些疗法经设以便阻断艰难梭菌毒素的致病作用，允许停用抗生 素，并且从而为结肠康复和重新建立正常肠道微生物区系提供时间。本发明 的单克隆抗体已经在高严格性的CDAD仓鼠模型中展示出完全和持久的保护 作用（超过37天）。基于它们的杰出特征和特性，本发明的抗艰难梭菌毒素 A和毒素B mAb为现存疗法治疗不佳的患者（包括患有最严重疾病病例的那 些个体）提供新的治疗选项和药物。

本发明进一步涵盖了一种疫苗或免疫原，该疫苗或免疫原包含艰难梭菌 毒素A和/或毒素B的部分、片段或肽，它们含有由以下各项中的一种或多种 所识别和/或结合的表位区域：单克隆抗体PA-39（ATCC登录号PTA- 9692）、PA-39的一种人源化形式、单克隆抗体PA-50（ATCC登录号PTA- 9694）、PA-50的一种人源化形、单克隆抗体PA-41（ATCC登录号PTA- 9693）、PA-41的一种人源化形式、与单克隆抗体PA-39或其人源化形式竞 争结合毒素A的抗体、与单克隆抗体PA-50或其人源化形式竞争结合毒素A 的抗体、或与单克隆抗体PA-41或其人源化形式竞争结合毒素B的抗体。在 一个实施方案中，这种疫苗或免疫原包含艰难梭菌毒素A和毒素B的部分、 片段或肽，它们含有由以下各项中的一种或多种所识别和/或结合的表位区 域：单克隆抗体PA-39（ATCC登录号PTA-9692）、PA-39的一种人源化形 式、或与单克隆抗体PA-39或其人源化形式竞争结合毒素A和毒素B的抗 体。在一个实施方案中，这些疫苗或免疫原的毒素A和/或毒素B的含有表位 的部分、片段或肽通过蛋白酶剪切衍生自毒素A或毒素B蛋白。在一个实施 方案中，通过肠激酶的蛋白酶剪切产生了这些疫苗或免疫原的毒素A部分、 段片或肽。在一个实施方案中，通过胱天蛋白酶（胱天蛋白酶1）的蛋白酶剪 切产生了这些疫苗或免疫原的毒素B部分、段片或肽。在一个实施方案中， 这种疫苗或免疫原的含有表位的部分或片段是毒素A或毒素B蛋白的化学或 重组合成的肽。在一个实施方案中，该疫苗或免疫原含有由该抗体识别和结 合的毒素A和/或毒素B的一个或多个表位区域的片段、部分或肽衍生自以下 各项中的一个或多个区域：毒素A的氨基端；毒素B的氨基端；毒素A的羧 基端；毒素B的羧基端；毒素A的受体结合结构域；在毒素A的受体结合结 构域之外的区域；毒素B的N端酶区域；毒素A的糖基转移酶结构域；毒素 B的糖基转移酶结构域；毒素A的蛋白酶解性结构域；毒素B的蛋白酶解性 结构域；毒素A的疏水性成孔结构域；或毒素B的疏水性成孔结构域。

在一些实施方案中，含有由这些抗体识别并结合的一个或多个表位区域 的片段衍生自毒素A或毒素B的氨基端。在一些实施方案中，含有由这些抗 体识别并结合的一个或多个表位区域的片段衍生自毒素A或毒素B的羧基 端。在一些实施方案中，含有由这些抗体识别并结合的一个或多个表位区域 的片段衍生自毒素A或毒素B的糖基转移酶结构域。在一些实施方案中，含 有由这些抗体识别并结合的一个或多个表位区域的片段衍生自毒素A或毒素 B的蛋白酶解性结构域。在一些实施方案中，含有由这些抗体识别并结合的 一个或多个表位区域的片段衍生自毒素A或毒素B的疏水性成孔结构域。在 一些实施方案中，含有由这些抗体识别并结合的一个或多个表位区域的片段 衍生自毒素A的受体结合结构域。在一些实施方案中，含有由这些抗体识别 并结合的一个或多个表位区域的片段衍生自毒素B的受体结合结构域。在一 些实施方案中，含有由这些抗体识别并结合的一个或多个表位区域的片段衍 生自毒素A的受体结合结构域之外的区域。在一些实施方案中，含有由这些 抗体识别并结合的一个或多个表位区域的片段衍生自毒素B的N端酶区域。 在一个实施方案中，毒素A和/或毒素B的含有表位的片段或部分其大小是小 于300kDa。在其他的实施方案中，毒素A和/或毒素B的含有表位的片段或 部分其大小是约158-160kDa、约100-105kDa（例如103kDa）、约90-95 kDa（例如，91kDa）、和/或约63-68kDa（例如，63kDa或68kDa）。在其 他的实施方案中，毒素A的含有表位的片段或部分其大小是约158-160kDa； 约90-95kDa（例如，91kDa）和/或约63-68kDa（例如，68kDa）。在其他 的实施方案中，毒素B的含有表位的片段或部分其大小是约100-105kDa（例 如，103kDa）和/或约63-68kDa（例如，63kDa）。

这些毒素的此类部分、片段或肽当以疫苗或免疫原的形式给予感染艰难 梭菌或患有艰难梭菌相关性疾病的受试者时，可以在受试者体内激发体液应 答，即对毒素A和/或毒素B具有特异性的抗体，从而允许该受试者针对这些 毒素发动免疫应答并且中和、阻断、减少、改善、治愈、或治疗受试者体内 的艰难梭菌相关性疾病、感染或CDAD。因此，另一个实施方案提供了一种 在有需要的受试者体内中和、阻断、减少、改善、治愈、或治疗艰难梭菌感 染或艰难梭菌相关性疾病的方法，包括向该受试者给予一个有效量的上述疫 苗或免疫原。在一个实施方案中，该受试者激发了针对艰难梭菌毒素A和/或 毒素B的体液应答，从而中和、阻断、减少、改善、治愈、或治疗受试者体 内的艰难梭菌相关性疾病或CDAD。在另一个实施方案中，该受试者激发了 针对艰难梭菌毒素A和/或毒素B的细胞免疫应答。在另一个实施方案中，该 受试者激发了针对艰难梭菌毒素A和/或毒素B的体液和细胞免疫应答。

在另一个实施方案，本发明涵盖了一种在易感于艰难梭菌感染的细胞中 或针对该细胞来中和、抑制、或阻断毒素A和/或毒素B活性的方法，该方法 包括将该细胞与本发明的一种抗体或其抗原结合片段接触，其中该抗体或其 抗原结合片段通过一种竞争性或混合竞争性作用机制在该细胞中或针对该细 胞中和、抑制、或阻断毒素A和/或毒素B的活性。在一个实施方案中，该抗 体是单克隆抗体、人源化抗体或嵌合抗体中的一种或多种。在一个实施方案 中，该细胞处于受试者体内并且该抗体或其抗原结合片段以一个有效量给予 该受试者。在一个实施方案中，该细胞处于受试者的胃肠道内部，例如，一 种肠上皮细胞。在一个实施方案中，该毒素是毒素A。在一个实施方案中， 该毒素是毒素B。在一个实施方案中，该毒素是毒素A并且这种抗体的作用 机制是一种竞争性抑制作用机制。在一个实施方案中，该毒素是毒素A并且 这种抗体或其抗原结合片段是PA-50（ATCC登录号PTA-9694）、它的一种 人源化形式、或与PA-50竞争中和毒素A活性的抗体或其片段。在一个实施 方案中，该毒素是毒素A并且这种抗体的作用机制是一种混合竞争性抑制作 用机制。在一个实施方案中，毒素是毒素A并且这种抗体或其抗原结合片段 是PA-39（ATCC登录号PTA-9692）、它的一种人源化形式、或与PA-39竞 争中和毒素A活性的抗体或其片段。在一个实施方案中，该毒素是毒素B并 且这种抗体的作用机制是一种混合竞争性抑制作用机制。在一个实施方案 中，该毒素是毒素B并且这种抗体或其抗原结合片段是PA-41（ATCC登录 号PTA-9693）、它的一种人源化形式、或与PA-41竞争中和毒素B活性的抗 体或其片段。

如在此所使用，术语毒素的“竞争性抑制剂”是指一种毒素中和抑制 剂，例如一种抗体、试剂、或小分子或化学实体，该抑制剂在中和曲线中显 示出向右的EC₅₀偏移，而最大中和百分比随培养物中毒素浓度增加并不变 化。因此，竞争性抑制剂典型地能够通过添加更多的抑制剂来克服毒素的细 胞毒效应。术语毒素的“非竞争性抑制剂”是指一种毒素中和抑制剂，该抑 制剂展示出最大中和百分数的下降而浓度不变，随培养物中毒素的浓度增加 而产生一种最大半数应答（EC₅₀）。因此，非竞争性抑制剂典型地不能够通 过添加更多的抑制剂而完全克服毒素的细胞毒效应。术语毒素的“混合竞争 性抑制剂”是指一种毒素中和抑制剂，该抑制剂随培养物中毒素的浓度增加 而显示出某种程度竞争性和非竞争性抑制作用。例如，毒素的一种混合竞争 性抑制剂可以与毒素结合，并且通过阻断毒素与细胞的结合并且通过阻断该 毒素的其他细胞毒效应而发挥作用；从而产生一种混合竞争性作用机制。

实例

实例1

产生针对艰难梭菌毒素A和/或毒素B的中和单克隆抗体

A.免疫原制备

通过用艰难梭菌毒素A类毒素（非活性形式的毒素）并且用活性形式的 毒素A和/或毒素B来免疫小鼠而产生针对艰难梭菌毒素A和/或毒素B的中 和单克隆抗体。通过用类毒素A免疫动物、之后跟随用活性形式的毒素A和/ 或毒素B免疫，产生了鼠mAb（PA-38:抗毒素A mAb，ATCC#PTA-9888； PA-39:抗毒素A和B mAb，ATCC#PTA-9692；PA-41:抗毒素B mAb， ATCC#PTA-9693；和PA-50:抗毒素A mAb，ATCC#PTA-9694）。毒素A类 毒素、毒素A、毒素B（List Biological Laboratories Inc.,Campbell,CA）和毒 素A（Techlab Inc.,Blacksburg,VA）贮存在4°C直至使用。这些毒素和类毒 素衍生自菌株VPI 10463，这是一个常用的艰难梭菌参比菌株。将Quil A佐 剂（Accurate Chemical,Westbury,NY）添加至所要求体积的类毒素或毒素并 且混合。将这种混合物在60分钟的免疫作用内制备和贮存在冰上直至准备好 免疫。对于融合之前的终末加强免疫，将所要求的毒素在PBS中稀释并且贮 存在冰上直至用于免疫。

B.免疫和融合

30只雌性BALB/c小鼠（Charles River Labs,Wilmington,MA）以3周的 间隔期在皮下接受2个免疫剂量（对于PA-50而言）或3个免疫剂量（对于 PA-38、PA-39和PA-41而言）的毒素A类毒素(10μg)，之后还按照3周的间 隔接受用增加剂量的活性毒素A或活性毒素B进行加强免疫。对于PA-38，1 只小鼠每隔3周接受毒素A（List Biological Laboratories Inc.）的加强免疫， 总计3次，每次加强的剂量从500ng递增至2μg，并且在脾切除术之前3天 接受一次毒素A的最终加强（8μg）。对于PA-39和PA-41，2只小鼠每隔3 周分别接受3次或5次毒素B的加强免疫，每次加强的剂量从2μg递增至 12.5μg，并且在脾切除术之前3天接受一次毒素B的最终加强（20μg）。对 于PA-50，1只小鼠每隔3周接受毒素A（Techlab Inc.）的加强免疫，总计4 次，每次加强的剂量从20ng递增至2.5μg，并且在脾切除术之前3天接受一 次毒素A的最终加强（10μg）。免疫剂量和加强免疫剂量的类毒素和毒素分 别与佐剂（例如，Quil A(10μg)）一起给药。用活性形式的毒素A或毒素B 进行加强免疫可以鉴定可能已经形成保护性抗体的动物。将来自免疫动物的 血清连续稀释并且如以下所说明在CHO-K1细胞上测试毒素A细胞毒效应的 中和作用。选择具有最高中和抗体滴度的动物用于融合并且用毒素在没有佐 剂的情况下加强免疫。

在加强免疫后，将动物处死，并且使用标准方法将分离的脾细胞与 Sp2/0细胞系融合。将杂交瘤悬浮于选择培养基RPMI-1640、10%FBS、10% BM Condimed-H1（Roche Applied Science,Indianapolis,IN）和β-巯基乙醇 （对于PA-38和PA-39）或杂交瘤-SFM以及10%FBS（对于PA-41和PA- 50）中，该选择培养基含有100μM次黄嘌呤、1μg/ml偶氮丝氨酸和16μM 胸苷用于选择性压力。将这些杂交瘤铺种至96孔平底组织培养平板（BD  Biosciences,San Jose,CA）中。将平板在37°C孵育3天，之后添加HT生长 培养基（不含偶氮丝氨酸的选择培养基）。继续再孵育4-7天，之后筛选杂 交瘤上清液的中和活性。

在针对PA-38的初步筛选中，检测608份杂交瘤上清液在CHO-K1细胞 （ATCC#CCL-61,Manassas,VA）上中和毒素A（List Laboratories）的细胞 毒效应的能力。在针对PA-39和PA-41的初步筛选中，检测2416份杂交瘤 上清液在CHO-K1细胞上中和毒素B（List Laboratories）的细胞毒效应的能 力。在针对PA-50的初步筛选中，检测1440份杂交瘤上清液在T-84细胞上 中和毒素A（Techlab Inc.）的细胞毒效应的能力。第二测定检验了对毒素A 介导的兔红细胞凝集的抑制作用。从筛选操作起，分离了4个mAb，这些 mAb被命名为PA-38（抗毒素A）、PA-39（抗毒素A/B）、PA-50（抗毒素 A）和PA-41（抗毒素B）并且在筛选测定中有效地抑制或中和艰难梭菌毒 素。通过有限稀释法克隆了产生这些mAb的杂交瘤细胞系以便生成克隆性细 胞系。使用IsoStrip小鼠单克隆抗体同种型分型试剂盒（Roche Applied  Science,Indianapolis,IN），确定PA-38,PA-39,PA-41和PA-50mAb分别是 同种型IgG2a，κ、IgG1,κ、IgG1,κ和IgGI,κ。产生mAb的杂交瘤细胞系由它 们产生的mAb的同一名称来命名。

C.筛选：毒素A或B在细胞上的细胞毒效应的中和

对杂交瘤上清液筛选在细胞上中和毒素A或毒素B的细胞毒效应的能 力。开发了一种高通量方法以便一次处理上千份杂交瘤上清液。这种细胞毒 性测定使用了CHO-K1细胞（对于PA-38、PA-39和PA-41）或T-84细胞 （对于PA-50）。使用Biomek FX机器人系统（Beckman Coulter,Brea, CA），将这些细胞添加至测定平板（96孔，白色不透明壁，透明平底板； Perkin Elmer,Waltham,MA）。将测定平板在37°C孵育4小时以便允许细胞 贴附于孔。对于T-84测定，将毒素A稀释至240ng/mL。对于CHO-K1测 定，将毒素A稀释至2μg/ml或将毒素B稀释至6ng/mL。在生物安全柜 （BSC）中将稀释的毒素手动添加至试剂稀释平板（96孔圆底平板；BD, Franklin Lakes,NJ）。手动收获杂交瘤上清液，并且使用Biomek FX系统将其 添加至试剂稀释平板的孔内。将上清液和毒素混合物在37°C孵育1小时，并 且使用Biomek FX系统添加至含有细胞的测定平板。在37°C 72小时孵育 后，将20μL/孔CellTiter-Blue（Promega,Madison,WI）添加至每个孔。将平 板再孵育4小时，并且随后使用激发波长560nm和发射波长590nm，在 SpectraMax M5平板读数仪（Molecular Devices,Sunnyvale,CA）上读数。比 较未处理的和毒素处理的培养物中的细胞存活。将细胞存活百分比对浓度作 图。

D.本发明的鼠mAb的产生

使用体内和体外的产生方法来获得分离和/或纯化的本发明mAb。为了 在体内产生鼠mAb，通过将适宜的杂交瘤细胞系注射至姥鲛烷激发的 BALB/c小鼠的腹腔中来制备腹水。通过用硫酸铵沉淀之后跟随蛋白A层析， 将mAb纯化至超过95%均一。将纯化的抗体重悬于磷酸盐缓冲盐水（PBS） 中。

对于小规模（小于100mg）的体外生产，从培养物中生出的杂交瘤上清 液纯化鼠mAb。杂交瘤在杂交瘤-SFM（Invitrogen）和10%FBS中培养。将 细胞系在T-150瓶中每周3次传代并扩增以确保细胞浓度不超过2x10⁶个细 胞/ml。将含有PA-39(IgG1,κ)、PA-41(IgG1,κ)和PA-50(IgG1,κ)的上清液通 过以2000转/分钟离心10分钟来澄清并且过滤。将澄清的材料稀释成一种终 浓度的运行缓冲液（60mM甘氨酸/3M NaCl，pH 8.5），并且加载到一根用 运行缓冲液平衡的蛋白A柱上。洗涤该柱后，PA-39或PA-41mAb用0.1M 乙酸钠，pH 5.5洗脱并且中和至pH 7.0。将含有PA-38(IgG2a,κ)的上清液通 过以2000转/分钟离心10分钟来澄清并且过滤。将澄清的材料调节成25mM 磷酸钠缓冲液/100mM NaCl、pH 7.0的终浓度，并且加载到一种用50mM磷 酸钠缓冲液/0.5M NaCl平衡的蛋白A柱上。将该柱洗涤；PA-38mAb用0.1 M乙酸钠，pH 3.0洗脱，并且将所洗脱的抗体中和至pH 7.0。

为了体外产生大量（超过100mg）mAb，将杂交瘤接种至WAVE生物 反应器中（GE Healthcare,Piscataway,NJ），初始密度是2x 10⁵个细胞/ml含 有5%超低IgG FBS的杂交瘤-SFM。每天监测细胞计数和活力。截止约第6 或7天，当抗体的产生达到稳定水平时，终止培养。将培养物澄清并且随后 通过切线流过滤将其浓缩10-20倍。在用pH 8.5的60mM甘氨酸3M NaCl平 衡的蛋白A柱上加载该抗体。该柱用同一缓冲液洗涤并且该抗体用50mM乙 酸盐，pH 3.5洗脱。汇集的抗体用1M Tris中和pH 7.4，浓缩至10mg/mL、 并且渗滤入PBS中。将纯化的mAb无菌过滤并且贮存在-80°C。

实例2

本发明的抗艰难梭菌毒素A和/或毒素B mAb针对毒素A和/或毒素B的特异 性和亲和力

A.确定mAb针对毒素A和/或毒素B的特异性的ELISA

ELISA平板（BD Biosciences）在4°C用50ng/孔毒素A（List  Laboratories）或25ng/孔毒素B（List Laboratories）包被过夜。在用PBS- （无钙或镁的PBS，0.05%Tween 20）洗涤平板后，将各孔在37°C用200μl 封闭缓冲液（无钙或镁的PBS，0.1%Tween 20，2.5%脱脂乳）封闭1小时。 重复洗涤步骤，并且加入杂交瘤上清液或纯化的mAb，在37°C持续1小时。 将平板洗涤并且在37°C与辣根过氧化物（HRP）偶联的山羊抗小鼠IgG-Fc （Jackson Immunoresearch,West Grove,PA）一起孵育1小时。该平板用 ABTS过氧化物酶底物系统（KPL,Gaithersburg,MD）显色，用ABTS过氧化 物酶终止溶液（KPL）终止、并且在SpectraMax平板读数仪（Molecular  Devices）上在405nm读数。

图1A-C中显示了滴定数据。图1A显示，PA-38与毒素A结合并且不与 毒素B结合。图1B显示，PA-39可以与毒素A和毒素B结合。图1C显示， PA-41与毒素B结合并且不与毒素A结合。

B.Biacore中mAb对毒素A和B的反应性

Biacore 3000仪（GE Healthcare）用来确定本发明的mAb对毒素A和/或毒 素B的结合特异性。根据制造商用于胺偶联的说明书，将mAb以大约10,000个 共振单位（RU）共价地固定到CM5传感器芯片（GE Healthcare）上。使用具 有不相关特异性的同种型匹配抗体的参比表面（Southern Biotech）作为对 照。结合实验在25°C在基于HEPES的HPS-EP缓冲液（GE Healthcare）中进 行。使经纯化的毒素A或毒素B（30nM；List Biological Laboratories）流过对 照和测试流动室，速率为5μL/分钟。。当显示时，额外的mAb(100nM)随后 流过流动室，速率为5μL/分钟，以便检验多价或竞争性结合

如图2A-D中所示，mAb PA-38（图2A）和mAb PA-50（图2C）与毒 素A特异性地结合；mAb PA-41（图2D）与毒素B特异性地结合；并且 mAb PA-39（图2B）优选地与毒素A结合，还显示与毒素B结合。来自这些 数据的结果与ELISA数据（图1A-C）一致，并且显示本发明的mAb对毒素 A和/或毒素B的结合特异性。

C.结合亲和力

Biacore分析还用来确定本发明想mAb对其相应毒素的结合亲和力。使 用依靠Biacore小鼠抗体捕获试剂盒而准备的CM5传感器芯片，捕获mAb。 然后，毒素以变化的浓度通过流动室（0.4-100nM，两倍递增）。所有毒素浓 度均一式两份检测，并且每轮后使用试剂盒中所限定的条件使芯片表面再 生。记录RU变化，并且使用Bia Evaluation Software 1:1(Langmuir)结合模 型进行分析，该结合模型计算了mAb对毒素的KD。图3A-E中显示出结合和 解离数据以及拟合结果。

通过Biacore分析确定了mAb对毒素A的K_D，对于PA-38是1.0nM， 对于PA-38是0.16nM，并且对于PA-38是0.16nM。mAb对毒素B的K_D被 确定为对于PA-39是2.4nM，并且对于PA-41是0.59nM。这些结果表明， 本发明的mAb以纳摩尔和亚纳摩尔亲和力结合毒素A和/或毒素B。

实例3

基于细胞的体外中和测定

使用CHO-K1细胞或T-84细胞的基于细胞的细胞毒性测定用来评价所 说明的抗毒素A和抗毒素B mAb的中和活性。

A.CHO-K1细胞上毒素A细胞毒效应的中和

将CHO-K1细胞接种于测定平板（96孔，白色不透明壁，透明平底板 (Perkin Elmer)）中（2,000个细胞，50μL/孔）。在处理前，允许细胞贴附4 小时。相同体积（35μL）的2μg/ml毒素A（List Biological Laboratories）以 及连续稀释的mAb在37°C在试剂稀释平板（96孔圆底平板(Falcon)）中混合 1小时，并且随后将50μl混合物添加至平板的每个孔。在孵育72小时后，将 20μl/孔CellTiter-Blue（Promega）添加至每个孔。将平板再孵育4小时，随 后使用激发波长560nm和发射波长590nm，在SpectraMax M5平板读数仪 （Molecular Devices）上读数。比较未处理的和毒素处理的培养物中的细胞存 活。将细胞存活百分比对mAb的浓度作图。使用GraphPad Prism软件，将抑 制数据拟合成一条非线性回归、S型剂量-反应曲线，并且计算50%中和细胞 毒性（EC₅₀）所要求的mAb浓度。如图4中所示，mAb PA-39在CHO-K1细 胞上以93pM的EC₅₀充分中和了毒素A活性。

B.CHO-K1细胞上毒素B细胞毒效应的中和

CHO-K1细胞毒性测定用来评价抗毒素B特异性mAb的中和活性。与评 价抗毒素A mAb相似，将毒素B（8pg/mL,TechLab）在37°C与连续稀释的 mAb孵育1小时，之后在96孔板中添加CHO-K1（2,000个细胞/孔）。在72 小时后，将20μl/孔CellTiter-Blue（Promega）添加至每个孔。将平板再孵育 4小时，并且随后使用激发波长560nm和发射波长590nm，在SpectraMax M5平板读数仪（Molecular Devices）上读数。使用CellTiter-Blue测定细胞活 力；在处理的和未处理的培养物之间比较细胞存活。使用GraphPad Prism软 件，将抑制数据拟合成一条非线性回归、S型剂量-反应曲线，并且计算50% 中和细胞毒性（EC₅₀）所要求的mAb浓度。如图5中所示，PA-41显示出在 CHO-K1细胞上中和毒素B细胞毒性的高度活性（EC₅₀为9.2pM）。

虽然基于ELISA和Biacore分析，mAb PA-39显示出与毒素B结合，但 是这个mAb在CHO-K1和其他基于细胞的测定中的确没有针对毒素B的体外 活性。已经报道了在体外细胞测定中与毒素A和毒素B均结合、但是在中和 毒素A或毒素B方面没有功能性活性的抗体（46、92和93）。本发明涵盖了 一种新颖的mAb，它具有结合毒素A和毒素B的双重能力并且还中和了一种 艰难梭菌毒素（即毒素A）的细胞毒性。

C.T-84细胞上毒素A细胞毒效应的中和

T-84细胞毒性测定用来评价所说明的抗毒素A mAb的中和活性。将T- 84细胞接种于测定平板（96孔，白色不透明壁，透明平底板(Perkin Elmer)） （15,000个细胞，50μL/孔）。在处理前，允许细胞贴附4小时。相同体积 （35μL）的240ng/mL毒素A(Techlab)和连续稀释的mAb在37°C在试剂稀 释平板（96孔圆底平板(Falcon)）中混合1小时，并且随后将50μl混合物添 加至测定平板的每个孔。在孵育72小时后，将20μL/孔CellTiter-Blue （Promega）添加至每个孔。将平板再孵育4小时，随后使用激发波长560nm 和发射波长590nm，在SpectraMax M5平板读数仪（Molecular Devices）上读 数。比较未处理的和毒素处理的培养物中的细胞存活。使用GraphPad Prism 软件，将抑制数据拟合成一条非线性回归、S型剂量-反应曲线，并且计算 50%中和细胞毒性（EC₅₀）所要求的mAb浓度。如图6中所示，mAb PA-38 和PA-50在T-84细胞上分别以175pM和146pM的EC₅₀充分中和了毒素A 活性。在T-84细胞测定中，mAb PA-39显示出针对毒素A的极小活性并且 PA-41无活性。

D.兔红细胞（RBC）血凝集作用

使用血凝集测定来评估本发明的mAb阻断毒素A与细胞受体结合的能 力。对于该测定，将等体积（30μL/孔）的毒素A(8μg/mL；TechLab)和连续 稀释的mAb在试剂稀释平板（96孔圆底平板(Falcon)）中在4°C混合1小 时。兔红细胞(RBC)(Colorado Serum Co.,Denver,CO)用PBS洗涤3次并且重 悬于PBS中。将60μL的1%RBC悬液添加至含有毒素A-mAb混合物的96 孔板孔中，并且将这些平板在4°C孵育4小时。游离的毒素A引起RBC的血 凝集作用。因此，加入与毒素A结合的抗毒素A mAb预期阻止血凝集作用。 使用ImageQuant 400仪来确定血凝集作用的程度；与悬液中的RBC相比，完 全的血凝集作用产生出更强的信号。使用GraphPad Prism非线性回归，S型剂 量-反应曲线拟合，从抑制数据计算EC₅₀值。如图7中所示，mAb PA-38（实 心正方形）和mAb PA-50（实心三角形）在RBC细胞上分别以30nM和1.8 nM的EC₅₀充分中和了毒素A活性。PA-38和PA-50似乎通过阻断毒素A与 其受体的结合而中和毒素A。已发现mAb PA-39和PA-41在该测定中无活 性。

E.Caco-2单层测定

将Caco-2细胞接种于96孔Multiscreen Caco-2平板（Millipore Billerica, MA）的上室（25,000个细胞，75μL/孔），将250μL培养基添加至下室。允 许细胞生长10天，每隔3-4天周期性更换培养基。在孵育10-14天后，通过 使用上皮伏欧计（型号：EVOMX，World Precision Instruments）测量跨上皮 细胞电阻（TEER），证实紧密单层的形成。在确立并测定单层的完整性后， 将等体积（60μl）的毒素A（以50ng/mL）和连续稀释的mAb在37°C混合 1小时，并且随后添加至测定平板的上室。将这些平板孵育18-24小时，并且 随后使用伏欧计测量TEER值。在未处理和毒素处理的孔中比较单层的完整 性。如图8中所示，使用GraphPad Prism软件，将抑制数据拟合成一条非线 性回归、S型剂量-反应曲线，以便测定50%中和（EC₅₀）所要求的mAb浓 度。mAb PA-38和PA-50分别以485pM和196pM的EC₅₀中和了毒素A对 Caco-2单层的破坏作用。已发现其他mAb在该测定中无活性。

尽管不希望被理论所约束，但基于细胞的体外结果显示，PA-38和PA- 50似乎代表一类抗毒素A mAb，而PA-39代表另一类抗毒素A mAb。mAb  PA-38和PA-50似乎结合了一个对受体结合重要的毒素A表位；mAb PA-39 似乎以更直接阻断毒素A体外细胞毒效应的方式结合毒素。

实例4

评价本发明的抗艰难梭菌毒素A和毒素B mAb在小鼠中的体内功效。

使用一个体内小鼠模型来测量在此说明的mAb在动物体内中和循环的艰 难梭菌毒素的能力。在试验动物中测试单独或组合给予mAb PA-38、PA-39、 PA-41、或PA-50的体内中和活性对抗组合的全身性艰难梭菌毒素A和毒素B (Techlab)的作用。

在这些实验中使用了雌性Swiss Webster 4-6只小鼠/组（年龄：研究开始 时约6-8周；Charles River Laboratories）。这些小鼠在设施中适应最少4天， 并且在使用前检查动物的健康状况。动物实验在IACUC批准的操作方案下进 行。

进行初始实验以确定毒素A和毒素B在小鼠中的毒性。动物以0、20、 100、500、2500ng毒素/动物腹内(i.p.)给药，并且选择使动物致死的剂量用 于后续的抗体中和实验中。用PBS注射的对照小鼠未受影响。选择100ng毒 素A(TechLab)的剂量用于中和实验，因为这是所发现的在注射后24小时内 使小鼠100%死亡的最低剂量水平。类似地，选择100ng毒素B(TechLab)的 剂量用于中和实验，因为这是所发现的在注射后24小时内使小鼠100%死亡 的最低剂量水平。

为了评价抗毒素mAb的中和活性，在第0天将每种mAb以不同的剂量 水平单次腹内注射给予小鼠（每组5只），随后在第1天腹内给予100ng/200 μl的毒素A或毒素B。每天观察动物持续3天，并且随后每周观察直至给予 毒素后21天。动物的存活是本研究的主要终点。

对于中和实验，抗体的所有剂量均在无钙或镁的PBS(PBS-，Invitrogen, Carlsbad,CA)中配制。在第0天将mAb PA-38、PA-39、PA-41或PA-50以不 同的剂量水平腹内（200μl/剂量/动物）给予单次注射，随后在第1天注射毒 素（在不同于抗体注射部位的部位腹内）。起初3-4天每天监测动物的健康状 况，并且随后每周观察二次直至毒素给予后21天。记录动物的笼旁观察结果 （例如，蜷缩体姿，被毛缠结、不活跃）以及存活。

评估PA-38的不同剂量水平（每只动物0.2μg至250μg）和PA-50的不 同剂量水平（每只动物0.2μg至100μg）。在这个模型中，已发现PA-38和 PA-50中和100ng剂量的毒素A，并且在低至每只动物2μgmAb的剂量水平 上能够实现100%存活，如图9A和B中所显示。相比之下，比较物人抗毒素 A单克隆抗体（WO/2006/121422和US2005/0287150)（在此称作CDA-1比较 物mAb）在每只动物5μg时没有像本发明的mAb那样保护动物免于毒素相 关性死亡（图9C）。评估了从0.5μg至250μg范围内的PA-41剂量，并且 发现每只动物5μgmAb的单一剂量在动物中完全中和了100ng剂量的毒素B 毒性，如图10中所示。没有观察到MAb PA-39（每只动物100μg）提供针对 毒素A或B引起小鼠的毒素相关性死亡延迟。

在体内清晰地展示出针对毒素A(PA-38、PA-50)或针对毒素B(PA-41) 的各个抗体的中和活性后，在相同的体内小鼠模型中实施一项实验以便检测 mAb的组合（PA-38+PA-41）以各自mAb 5μg和50μg的剂量水平对抗一个 组合致死剂量的毒素（100ng毒素A和100ng毒素B）。此外，包括了单个 的单克隆抗体作为对照。如图11中所示，与单独每种mAb的活性（所有动 物在给予毒素24小时内均死亡）相比，PA-38和PA-41mAb的组合在50μg/ 动物（4/5存活）和5μg/动物（1/5存活）时显示出免于毒素组合的保护作 用。

实例5

在金色叙利亚仓鼠中以艰难梭菌相关性腹泻（CDAD）模型评价本发明的抗 艰难梭菌毒素A和毒素B mAb

仓鼠中的CDAD模型复制了CDAD疾病在人类体内的关键方面。一旦 使用抗生素处理，正常结肠菌群被根除并且仓鼠变得很容易感染艰难梭菌。 感染导致重度腹泻、伪膜性结肠炎和死亡。使用这种仓鼠CDAD模型来评价 本发明mAb防止与活艰难梭菌细菌攻击动物相关的疾病和死亡的潜在功效。 这些实验在IACUC批准的操作方案下进行。

A.药物代谢动力学分析

使用感染艰难梭菌微生物的仓鼠，在仓鼠模型中进行功效研究之前，对 正常未感染的仓鼠中进行了药物代谢动力学研究。金色叙利亚仓鼠（Harlan） 用0.2mg/动物、或1mg/动物的纯化mAb PA-38或mAb PA-41腹内注射。在 0.125、0.25、1、2、4、7、10、14和21天通过眶后或心脏穿刺（终末）采血 技术收集血样。将血样以8000转/分钟离心10分钟以获得血清。

通过ELISA来测定血清中的mAb浓度。96孔ELISA平板（BD  Biosciences）用毒素A(Techlab)或毒素B(Techlab)以250ng/孔在4°C包被过 夜。平板用PBS/0.05%(PBS-T)洗涤3次，并且在室温用200μl封 闭缓冲液（无钙或镁的PBS，0.1%Tween2.5%脱脂乳）封闭1小时。 抗体参比标准物（纯化的mAb PA-38或mAb PA-41）在1%汇集的未作实验 的仓鼠血清中稀释以产生一条0.3-1000ng/mL范围的标准曲线。稀释的测试 样品和标准品在室温孵育1小时。

将平板洗涤（如上文）并且在室温与HRP偶联的Fcγ特异性山羊抗小鼠 IgG(Jackson Immunoresearch)一起孵育1小时。将平板用ABTS过氧化物 酶底物系统（KPL,Gaithersburg,MD）显色，用ABTS过氧化物酶终止溶液 （KPL）终止，并且在SpectraMax平板读数仪（Molecular Devices）上在405 nm读数。使用标准曲线计算每只仓鼠中在不同时间点的mAb浓度。大约 10%的样品没有抗体滴度，这可能是因为错误注射或没有吸收；在PK参数计 算中不包括这些样品。使用WinNonLin,版本4.0（Pharsight Corp.,Mountain  View,CA）进行非区室药物代谢动力学分析，并且数据在表1和在图12A和 B中显示。如所示，Cmax和曲线下面积（AUC）是剂量依赖性的。这些抗体 中的每一个均显示出超过6天的终末半衰期，它在以下说明的功效研究中确 保抗体保存。

表1.mAb在仓鼠中的PK参数

B.在金色叙利亚仓鼠中以艰难梭菌相关性腹泻（CDAD）模型评价组合的本 发明抗艰难梭菌毒素A和毒素B mAb

进行了一项功效实验，以便在仓鼠中以艰难梭菌相关性腹泻的体内模型 评价本发明的鼠抗毒素A和抗毒素B影响感染动物存活性的能力。金色叙利 亚雄性仓鼠（约90g）(Crl:LVG(SYR))(Charles River Laboratories,Inc., Kingston,NY)用50mg/kg单一皮下剂量的克林霉素（Sigma,St.Louis，在 PBS中配制，5mg/ml）预处理以便破坏正常结肠菌群。在第二天，相关试验 组中的仓鼠接受了一个口服剂量（0.5mL中的1x10⁷CFU）的艰难梭菌 （ATCC 43596菌株）悬浮液。菌株43596之前已经在仓鼠模型中用于评价中 和抗体。将动物每周称重，并且每天监测健康状况和存活。

这些试验抗体包含本发明的鼠mAb组合，即mAb PA-38和PA-41的组 合或mAb PA-39和PA-41的组合。包括山羊抗艰难梭菌毒素A和毒素B多克 隆抗体（Techlab）作为阳性对照。这些mAb和对照试剂按照表2所说明进行 给药。

表2.仓鼠功效研究中的治疗组

^*不可用

组1中的仓鼠在本研究中自始至终未接受处理。组2-7中的仓鼠用单一 皮下剂量的磷酸克林霉素以50mg/kg（第1天）预处理。组5-7中的仓鼠在克 林霉素处理后立即通过腹内给药按照表2所给出的给予多克隆山羊抗体（组 5）或mAb的组合（组6和组7）。在24小时后，组3-7中的每只仓鼠通过 口服管饲用0.5mL适宜的艰难梭菌ATCC 43596悬浮液（10⁶-10⁷CFU/mL） （第0天）接种。在第1天用抗体初步治疗后，这些组的后续3个治疗每隔 一天在第1、3和5天进行，每天一次。万古霉素（20mg/kg，一天两次）在 第1至5天经口服管饲给予组4的动物，每天两次，间隔大约6小时。万古霉 素（组4的动物）的给药在动物已经用艰难梭菌接种后大约20-24小时开始。

在图13中显示了mAb治疗组和对照组的存活结果。表3中提供了所有 组的仓鼠死亡率总结。发现在没有任何治疗情况下感染艰难梭菌的所有仓鼠 （感染的对照，组3）在研究的第2天或第3天死亡。在万古霉素治疗组（组 4）中，发现8只仓鼠中有7只在第15和19天之间死亡。如在这个模型中通 常所观察到的，大部分（88%）万古霉素治疗的仓鼠在停止治疗后两周内复 发和死于艰难梭菌感染。相比之下，用mAb PA-39+PA-41的组合治疗的所 有仓鼠（组7）以及用mAb PA-39+PA-41（组7）的组合治疗的8仓鼠中有 7只（组6）存活，直至研究结束（感染后37天）。此外，在研究结束时， 用山羊多克隆抗体（组5）治疗的组中所有动物是活的。所有存活的仓鼠在死 后尸体剖检时具有正常的胃肠道（见图15A、C和D）。

表3每组中死亡率和仓鼠死亡日

这些结果表明，mAb PA-39和PA-41的组合与mAb PA-38和PA-41的组 合有效地并且持久地保护仓鼠免于重度疾病，从开始时并且从疾病的的后续 复发时即如此。来自mAb治疗的益处的持续期（37天）显著地超过在仓鼠模 型中用克林霉素处理后建立艰难梭菌感染的窗口期（两周）。

在图14中显示了在多克隆治疗组及mAb治疗组以及对照组中动物的体 重。未感染的对照组（组1）中仓鼠稳定地增加重量，范围是在研究过程从 13g至29g。所有感染的对照动物在接种后首次体重测量之前均死亡。用万 古霉素、山羊多克隆抗体、PA-38+PA-41mAb组合、以及PA-39+PA-41 mAb组合治疗的动物的平均体重在感染后第一周期间显著下降。此后，mAb 治疗组中以及多克隆抗体治疗组中的平均体重稳定增加，并且到研究结束时 与未感染的对照相似，这表明不存在明显的毒性。

总体上在这项仓鼠研究中，证明了本发明的mAb的组合在艰难梭菌感染 的一个相关并且严格仓鼠模型中有效地并且持久地保护仓鼠免于死亡。这些 研究结果支持以下机制，通过该机制，mAb组合保护动物免于艰难梭菌相关 性疾病持续一段时间，这段时间长到与未感染的动物相比足够允许正常肠道 菌群在mAb治疗的动物中生长和再增殖（图15A-D）。因此，本发明的mAb 对感染的动物提供了治疗性保护，并且实现了艰难梭菌相关性疾病的消除、 恢复胃肠道健康并存活。

C.在金色叙利亚仓鼠中以艰难梭菌相关性腹泻(CDAD)模型评价本发明单 个的抗艰难梭菌毒素A和/或毒素B mAb

在仓鼠中进行了一个额外研究，以便与组合给予的mAb相比，评价给予 感染动物的本发明单个的鼠mAb的功效。表4中提出了该项研究的治疗组。

表4.与mAb组合相比单个mAb的仓鼠功效研究

¹不可用

在这项研究中，组1-7中的仓鼠用单一皮下剂量的磷酸克林霉素以50 mg/kg（第1天）预处理。组3-7中的仓鼠在克林霉素处理后立即通过腹内给药 给予mAb。在24小时后，组1-7中的每只仓鼠通过口服管饲用0.5mL的艰难梭 菌悬液（第0天）接种，如以上B部分中所说明。将试验mAb治疗剂以单一剂 量在第1、3和5天给予组3-7中的动物。将万古霉素在第1-5天每天两次给予动 物（组2）。每天两次观察仓鼠的活力。每周一次记录体重。对发现死亡或在 研究期间经安乐死的动物进行尸体剖检。在研究结束时（接种后40天），对 所有剩余的仓鼠进行最终尸体剖检。

在图16A中描述了mAb治疗组和对照动物组的存活，并且在表5中总 结了所有组中仓鼠的死亡日期。

表5.死亡率数据和死亡日期

在感染的对照组（组1）中，发现所有7只仓鼠在第2天死亡。所有这 些仓鼠在死后检验时具有发炎的胃肠道。在万古霉素治疗组（组2）中，所有 7只仓鼠中有7只在研究的第12天和19天之间死亡。这些死亡的时间与之前 已经在这种模型中用万古霉素治疗而观察到的时间相似。死后检验表明，所 有仓鼠均具有指示艰难梭菌感染的发炎胃肠道。

在这项研究中，PA-39+PA-41mAb组合治疗（组3）在保护感染的仓鼠 方面是十分有效的。组3中的7只仓鼠有6只存活直至研究结束。发现1只仓 鼠在研究的第12天死亡。死后检验表明，这只仓鼠具有艰难梭菌感染特征的 发炎胃肠道。

在单一抗体治疗（组4-7）当中，单独的mAb PA-39（组6）在治疗的动 物中显示出一些保护活性。发现这组的仓鼠在第2天至第12天死亡。在用单 独mAb PA-41（组4）、PA-38（组5）或PA-50（组7）治疗的组中，发现 仓鼠在第2天和第3天死亡。在最终尸体剖检时，这些组中所有仓鼠均具有 指示艰难梭菌感染的发炎胃肠道。相比之下，存活的所有经治疗的仓鼠具有 正常的胃肠道。

这项研究的结果表明，用mAb组合PA-39+PA-41进行治疗成功地保护 仓鼠在治疗停止后免于发展疾病超过1个月，并且与实例5B的以上研究中所 获得的结果相同，在这些结果中用PA-39+PA-41的组合治疗的8只仓鼠中有 8只均在艰难梭菌感染时存活。在这项研究中，mAb PA-39作为单一mAb治 疗剂在保护艰难梭菌仓鼠免于艰难梭菌相关性疾病方面显示出一些活性。

D.测定来自终末血液的抗体浓度并且评价终末仓鼠盲肠样品中艰难梭菌的存 在

从研究期间发现濒死的动物体内收集血液。在研究结束时，还从仍活着 的所有动物体内收集血液。除非下文另外指出，否则处理血样以收集血清。 处理的样品在低于-70°C冷冻，用于可能的进一步分析。

在以上说明的仓鼠体内功效研究后，检验在这些研究中从动物所采集的 终末血液内mAb的存在。对于实例5B中所说明的mAb组合研究，在研究的 第37天将已经接受1个剂量（每2天1次x4）的mAb PA-39(50mg/kg)+ mAb PA-41(40mg/kg)组合的8只组7动物终末放血。在从这种终末放血收集 的血清中，检测到PA-39处于3.3±3.4μg/mL水平，并且检测到PA-41处于 2.4±1.7μg/mL水平。对于实例5C中所说明的单个mAb研究，在研究的第 40天将已经接受1个剂量（每2天1次x 4）的mAbPA-39(50mg/kg)+mAb PA-41(50mg/kg)组合的6只组3动物终末放血，并且处理血样以获得血浆。 在从这种终末放血收集的血浆中，检测到PA-39处于1.8±1.4μg/mL水平， 并且检测到PA-41处于3.4±3.2μg/mL水平。在这些分析中抗体的检测限是 1.6ng/mL。因此，mAb的可检测水平是在几周的时间范围内在动物中测量 的。它支持了以下作用模式，其中这些mAb在一个治疗方案的过程期间并且 在使用最后剂量的mAb后提供了治疗益处。

在来自实例5C中组3的终末尸体剖检时，暴露每只仓鼠的盲肠并且每 一条盲肠显得正常。没有观察到炎症或发红，并且盲肠的内容物在一致性方 法是相对坚实的。用无菌的一次性解剖刀切开每条盲肠的壁。将新解剖刀用 于每只仓鼠以避免交叉污染。用无菌棉拭子从盲肠取出少量粪便并且置于无 菌试管中。使用10-μL接种环来收集这个管中的粪便样品，并且将该样品在 含有CCFA连同对艰难梭菌具有选择性的马血液培养基（Remel，批号 735065）的琼脂平板上划线。将这些平板置于厌氧培养箱中并且在37°C孵育 48小时。将一块平板用来自贮存培养物的艰难梭菌ATCC 43596划线，并且 沿着粪便划线一起孵育以便进行菌落比较。在来自所有6只仓鼠的平板上观 察到类似的艰难梭菌菌落。这些实验的结果表明，用本发明的mAb治疗的存 活动物仍携带艰难梭菌，但是它们的正常菌群已经重新定居，从而恢复正常 肠道微生物平衡，这有助于这些动物的总体存活。

E.在金色叙利亚仓鼠中以艰难梭菌相关性腹泻（CDAD）模型评价本发明的 抗艰难梭菌毒素A和/或毒素B人源化mAb以及比较物抗毒素A和抗毒素B mAb

在仓鼠中又进行了一项研究以便评价当相应的抗体组合被给予艰难梭菌 感染的动物时，与人类抗毒素A比较物mAb（CDA-1）以及人类抗毒素B比 较物mAb（CDB-1）的组合相比，本发明的人源化抗毒素A和抗毒素B mAb 组合的体内功效。表5A中提出该项研究的治疗组。

表5A.仓鼠对比性功效研究中的治疗组

¹不可用

测试抗体包含本发明的人源化mAb组合，即人源化抗毒素A mAb PA- 50与人源化抗毒素B mAb PA-41(hPA-41+hPA-50)的组合、或比较物人抗毒 素A mAb（称作CDA-1比较物mAb）与比较物人抗毒素B mAb（称作CDB- 1比较物mAb）的组合（CDA-1+CDB-1），其量值如表5A中所示。将这些 比较物mAb（DNA2.0）基于3D8和124的公布的重链和轻链区域 （WO2006/121422和US2005/0287150）合成，克隆至全长IgG1表达载体 （pCON-γ和pCON-κ）中，在CHO-KSV1细胞中表达并且使用在此所说明的 方法纯化。这些mAb组合和对照治疗剂如表5A中所说明进行给药。

治疗方法基本上如以上这个实例的B部分所说明。简言之，在该实例5E 研究中使用金色叙利亚仓鼠（Charles River Laboratories,Stone Ridge,NY,50 天龄）。对照组1中的仓鼠是未感染的（并且未治疗）。组2-7中的动物用单 一皮下剂量的磷酸克林霉素以50mg/kg预处理以破坏正常结肠菌群（第1 天）。组4-7动物在克林霉素处理后立即通过腹内给予进行给药。在24小时 后，组2-7中的每只动物通过口服管饲（即，口服给药）用0.5mL艰难梭菌 （ATCC 43596，菌株545）悬浮液（第0天）接种。测试治疗剂的额外给药 以单一剂量在第1、3和5天给予组4-7中的动物。万古霉素在第1-5天给予 组4的动物，每天两次，间隔大约6小时。将动物每周称重，并且每天监测 健康状况和存活，持续39天。尸体剖检在处死时进行，并且在选择培养基中 在37°C厌氧培养48小时后测定艰难梭菌微生物的盲肠滴度。检测限是20 CFU/g盲肠内容物。这项研究和以上说明的仓鼠研究在Ricerca Biosciences （Concord,OH）根据研究机构动物护理和使用委员会指南进行。

在图16B-1中显示了mAb治疗组和对照组的存活结果。下表5B中提出 了这项研究的死亡率数据。下表5C中提供了仓鼠存活的总结。

表5B.每组中死亡率数据和仓鼠死亡日

如在表5B中观察到，所有4只未感染的对照仓鼠（组1）存活直至研究 结束。所有感染的对照（组2）动物均在第2和3天死亡。在万古霉素治疗组 （组2）中，所有研究动物均在第13和22天之间死亡。对于hPA-50+hPA- 41（50,50mg/kg）组4，10只动物有9只存活至研究结束。在第8天发现这 个组的1只仓鼠濒死，胃肠道发红褪色，而这个组中的剩余9只存活动物具 有正常胃肠道。组5中所有10只仓鼠存活直至研究结束，胃肠道正常。在比 较物mAb组中，以50mg/kg给药的10只动物（组6）有9只在第5和14天 之间死亡；1只动物直至研究第28天死亡。用20mg/kg比较物mAb组合治 疗的所有10只仓鼠（组7）均在研究的第5和第14天之间死亡。

表5C.用本发明人源化mAb和比较物mAb治疗的动物的中位数存活期和总存 活期

^*不可用

如表5C中观察到，未感染的对照组1中的所有4只动物存活直至研究 结束（40天）。在没有任何治疗的情况下感染艰难梭菌的所有仓鼠（感染的 对照，组2）具有2天中位数存活期；在研究结束时这个组中没有一只存活。 在万古霉素治疗组（组3）中，中位数存活期是20天，到第10天没有存活的 动物。两种hPA-50+hPA-41mAb组合治疗在这项研究中均有效保护感染的动 物（组4和组5）。用人源化mAb PA-50+PA-41（每只20mg/kg；组5）组 合治疗的所有（100%）仓鼠（组7）、以及用人源化mAb PA-50+PA-41（每 只50mg/kg；组4）组合治疗的90%仓鼠存活直至研究结束（感染后40 天）。所有存活的仓鼠在死后尸体剖检时具有基本上正常的胃肠道。相比之 下，对于两种剂量的比较物mAb而言，接受比较物抗毒素A与抗毒素B mAb 组合的动物的中位数存活期是相似的；用这种比较物mAb组合治疗的两组所 有动物均死亡。特别地，对于接受CDA-1+CDB-1（每只50mg/kg；组6） 组合的动物，中位数存活期是14天，而接受CDA-1+CDB-1（每只20 mg/kg；组7）组合的动物，中位数存活期是11天。

本研究中的额外评价包括体重测量、大体尸体剖检以及在研究终止时艰 难梭菌微生物的盲肠滴度。用万古霉素或PA-50/PA-41组合治疗的动物其平 均体重在感染后第一周期间下降并且随后恢复（图16B-2）。到第39天，用 PA-50/PA-41组合治疗的动物其平均体重与平行饲养的健康、未感染动物的平 均体重相似（P>0.05）。用CDA1/CDB1比较物抗体的组合治疗的动物其平 均体重在研究期间稳定下降。

在第39天，19只用PA-50/PA-41组合治疗的存活动物其胃肠道似乎与 未感染动物的那些胃肠道相似；并且艰难梭菌的盲肠滴度是检测不到的（小 于1.3log₁₀CFU，n=11）或低（4.15±0.76log₁₀CFU，n=8）。相比之下， 在死亡时在其他治疗组中的一些或所有动物中观察到发炎的胃肠道。在4只 未治疗的动物中有4只检测出艰难梭菌（相对于PA-50/PA-41，平均CFU= 8.96±0.59log₁₀,P<0.0001），并且在4只进行盲肠分析的万古霉素治疗动物 中有4只检测出艰难梭菌（相对于PA-50/PA-41，平均CFU=6.01±0.93log₁₀, P<0.017）。大部分用CDA1/CDB1比较物抗体组合治疗的仓鼠其盲肠内容物 很少或没有，这导致无法进行艰难梭菌滴度的定量分析。

对于这项研究和以上研究中的统计分析，使用GraphPad Prism(v.4.0 GraphPad软件,San Diego,CA)，将中和数据拟合成一个四参数对数等式。双 侧t检验或对数秩检验分别用于均值或存活数据的比较。

研究的结果表明，用人源化的mAb PA-50和PA-41组合在两个剂量水平 上治疗艰难梭菌感染的动物有效地并且持久地保护仓鼠免于重度疾病，从开 始时并且从疾病的的后续复发时即如此。与作为对照的万古霉素或比较物抗 毒素A和抗毒素B mAb治疗相比，来自人源化的mAb组合治疗益处的持续 期（40天）显著地改善了动物的长期存活。

如体内动物研究所验证，采用人源化的PA-50/PA-41mAb组合的联合治 疗在用于CDI和疗法的充分建立的金色叙利亚仓鼠模型中高度有效对抗艰难 梭菌感染。与未接受治疗、接受标准抗生素疗法、或比较物mAb的动物的 0%存活相比，用PA-50/PA-41治疗的短期治疗在感染后第39天产生95%存 活。在感染后第39天，用PA-50/PA-41治疗的动物具有正常体重，并且没有 明显的胃肠道损害。不能从大部分动物回收艰难梭菌，这反映出相对于未治 疗的动物大于7-log₁₀清除率。对于这些研究结果的一种可能解释是，mAb介 导的毒素中和作用在抗生素不存在的情况下允许一种保护性微生物菌群在动 物的胃肠道中重新建立。

已经报道单独的毒素A或毒素B能够在CDI的仓鼠模型中引起致命性疾 病，并且最大治疗功效总体上要求针对两种毒素的mAb。在以上说明的研究 中，在鼠模型中以50mg/kg的剂量单独使用时，鼠mAb PA-50和PA-41未显 示出存活益处，因此突出了联合治疗的要求。

总体上在这项仓鼠研究中，与使用鼠mAb组合的以上研究结果相似，证 明了本发明的人源化mAb的组合在艰难梭菌感染的严格仓鼠模型中有效地并 且持久地保护仓鼠免于死亡。不希望被理论约束，这些研究结果支持以下作 用机制，借助于该作用机制，这些人源化mAb组合保护动物免于艰难梭菌相 关性疾病、和/或允许动物至发动一种针对艰难梭菌感染的应答持续一段时 间，这段时间足够长以便允许正常肠道菌群在人源化mAb治疗的动物中的生 长和再增殖，因此提供对感染动物的治疗性保护、有效消除艰难梭菌相关性 疾病、以及恢复胃肠道健康和存活。

实例6

mAb与艰难梭菌毒素A和毒素B的区域结合

进行多项实验以确定与本发明的mAb结合的艰难梭菌毒素A和毒素B 的表位区域。由艰难梭菌产生的两种毒素A和毒素B为大约300kDa，并且 共有巨大的序列和结构同源性。两者均具有一个含有梭状芽孢杆菌重复寡肽 （CROP）的C端受体结合结构域、一个中央疏水结构域（该结构域据信引起 孔的形成并且介导毒素插入内体膜中的）以及一个切割N端酶结构域的蛋白 酶解性结构域（从而允许糖基转移酶进入细胞溶胶）。编码艰难梭菌毒素以 及其他艰难梭菌蛋白的核酸序列已经公布，并且还可以在美国国立生物技术 信息中心（NCBI）数据库（即，www.ncbi.nlm.nih.gov）中获得。例如，对于 艰难梭菌菌株VPI 10463，可以在NCBI登录号x92982下找到编码毒素A和 毒素B的DNA序列；另外，NCBI登录号NC_009089，区域795842-803975 提供了来自艰难梭菌630染色体全基因组序列的毒素A的DNA序列，而 NCBI登录号NC_009089，区域787393-794493提供提供了编码来自艰难梭菌 630染色体序列的毒素B的DNA序列。

A.艰难梭菌毒素B的抗体结合结构域定位

全长艰难梭菌毒素B由三个主要结构域组成：一个加工糖基转移酶 （GT）活性的N端酶结构域（63kDa）以及一个C端细胞受体结合结构域 （59kDa），它们位于一个推定性易位结构域（148kDa）的任一端上（图 17A和C）。使用酶胱天蛋白酶1通过酶促切割全长毒素B，产生几种毒素B 片段（图17C）。将毒素B用酶胱天蛋白酶1（酶/毒素比率约1U/μg毒素） 在37°C处理96小时后，产生4种主要片段，包括两个含有C端的片段（193 和167kDa）和两个含有N端的片段（103和63kDa），如通过SDS-PAGE 所检测（图17B）还似乎产生了其他更小的片段（如26kDa和14kDa），但 是在3%-8%Tris-乙酸盐凝胶分析中不是可检测的。

对未处理或用胱天蛋白酶1处理的毒素B进行SDS-PAGE和蛋白质印迹 分析（图18A-C）。mAb PA-41识别胱天蛋白酶1处理的毒素B的103kDa 片段和63kDa片段（图18B中的右侧泳道），因此表明PA-41与毒素B的N 端酶结构域结合。N端测序分析证实，PA-41与毒素B的63kDa N端酶结构 域结合。有趣地指出，未处理的毒素B中的63kDa条带（左侧泳道，图 18B）不由PA-41识别，这表明这些泳道中具有相同分子量（63kDa）的两个 片段似乎是不同的蛋白质。

MAb PA-39结合胱天蛋白酶1处理的毒素B的167kDa片段（图18C， 右侧泳道），并且未处理的毒素B制备物中的63kDa蛋白（图18C，左侧泳 道），因此表明PA-39结合了毒素B的易位结构域中的表位。因此，根据胱 天蛋白酶1处理的艰难梭菌毒素B的SDS-PAGE/蛋白质印迹分析的结果，观 察到mAb PA-41和PA-39与毒素B差异性地相互作用。尽管发现mAb PA-41 结合毒素B的N端酶结构域中的表位，然而发现mAb PA-39结合该毒素的易 位结构域中的表位（氨基酸850-1330）。这些研究结果还通过SDS-PAGE/蛋 白质印迹分析、使用肠激酶消化产生的毒素B片段得以证实。

使用Biacore，还进行抗毒素B mAb对毒素B的竞争性结合。如图19A- E所见，mAb PA-39和PA-41结合毒素B的不同表位区域。观察到鼠mAb PA-39和PA-41与毒素B上的一个单一位点或表位结合；发现这些mAb不与 C端细胞受体结合（CRB）结构域结合。对于鼠PA-41，结合毒素B的亲和 力是0.59mM。另外，毒素B上由PA-41结合的位点并不阻断比较物抗毒素 B mAb CDB-1的结合（WO/2006/121422；US2005/0287150)（图19D）。这 些研究结果与来自蛋白质印迹分析的结果一致。如图19C和E中所观察，比 较物抗毒素B mAb CDB-1与毒素B在不同于mAb PA-39和PA-41的表位进 行结合。

B.艰难梭菌毒素A的抗体结合结构域定位

全长艰难梭菌毒素A的分子量是310kDa（图20A）并且含有3个主要 结构域：一个具有糖基转移酶（GT）活性的N端酶加工结构域（约63kDa） 和一个C端CRB结构域（约101kDa），它们位于一个疏水结构域（约144 kDa）的任一末端处。

使用酶肠激酶（EK）通过酶促切割全长毒素，产生几种毒素B片段。用 肠激酶在25°C处理毒素A（酶/毒素比率：约3mU/μg毒素）48小时后，产 生9种主要片段，包括4个C端片段（约223kDa，约158-160kDa，约91 kDa、以及约68kDa）和3个N端片段（约195kDa、约181kDa和约127 kDa）还观察到更小的片段（约53kDa和约42kDa）。（图20B和C）。

对未处理或用肠激酶处理的毒素A进行SDS-PAGE和蛋白质印迹分析 （图21A-C）。全长毒素A和其片段（具有约223kDa、约158-160kDa、约 91kDa、以及约68kDa分子量）由mAb PA-50识别（图21B）；N端测序证 实68kDa片段含有C端受体结合(CRB)结构域的部分。mAb PA-50的结合模 式表明，mAb与毒素A的含有C端的片段结合。总之，这些结果表明mAb PA-50与毒素A上的C端受体结合表位结合。mAb PA-39结合含有C端的片 段（约223kDa和约158-160kDa）、以及约181kDa含有N端片段（图 21C），因此表明mAb PA-39结合在毒素A的受体结合结构域之外的区域内 表位。使用Biacore测定，在mAb PA-50和毒素A相互作用研究中还鉴定出 多个结合位点（至少两个结合位点)（图22A-1）。在使用Biacore分析的比较 研究中，固定的鼠PA-50以0.16nM的亲和力与毒素A特异性结合。还发现 由鼠mAb PA-50捕获到传感器芯片上后，毒素A能够结合额外的PA-50，并 且随后结合比较物抗毒素A mAb CDA-1(WO/2006/121422；US2005/0287150) （图22A-2）。另外，由Biacore芯片上比较物抗毒素A mAb CDA-1所捕获 的毒素A进一步结合额外的CDA-1和PA-50mAb，这表明比较物mAb CDA- 1与毒素A上的多个重复序列结合，这些重复序列与毒素A上的PA-50mAb 结合表位不同（图22B）。因此，如从这些结果所确定，PA-50mAb表位在毒 素A上以多个副本存在时并且不与CDA-1的表位重叠。另外，PA-39mAb结 合了毒素A上不同于由比较物CDA-1mAb所结合的毒素A的表位（图 22C）。发现mAb PA-39和PA-50结合毒素A上的不同表位（图22D）。蛋 白质印迹分析显示，PA-39和比较物mAb CDA-1对EK处理的毒素A显示不 同的结合模式，因此显示在毒素A上的不同结合结构域和不同表位（图 22E）。蛋白质印迹分析显示，PA-50和比较物mAb CDA-1与EK处理的毒 素A的相同结构域结合（图22F），但是与不同表位结合（图22B）。

如这个实例的A和B中所说明，通过毒素的有限蛋白酶解随后进行蛋白 质印迹，将鼠mAb PA-50和PA-41的结合位点定位至毒素的特定区域。鼠 mAb PA-50识别全长毒素A和几种肠激酶切割产物，包括大223kDa片段和 大小为68kDa、91kDa和160kDa的羧基端片段（图22F）。N端测序证 实，68kDa片段对应于毒素A的羧基端结构域。相同的片段由CDA-1比较物 mAb识别。鼠mAb PA-41结合了全长毒素B以及由胱天蛋白酶-1消化产生的 63kDa和103kDa氨基端片段（图18B），而CDB-1比较物mAb识别了一组 不同的胱天蛋白酶-1切割产物。N端测序证实，63kDa片段对应于毒素B的 氨基端结构域。总之，这些数据表明mPA-50结合毒素A的受体结合结构域 内部的多个位点，并且mPA-41结合毒素B的酶结构域内部的一个单一位 点。

实例7

抗艰难梭菌毒素A和毒素B mAb--作用机制研究

A.用于作用机制研究的基于细胞的体外测定

为了评价抗毒素mAb的作用机制，使用不同浓度的毒素A或毒素B进 行体外测定。如以上实例3中所说明，这些测定使用CHO-K1细胞或T-84细 胞。

简言之，CHO-K1测定用来评价抗毒素A和抗毒素B mAb(PA-39和PA- 41)的中和效力。将CHO-K1细胞在96孔板中接种（2,000个细胞/孔）。在 处理之前，允许细胞贴附4小时。将不同浓度（60、30、15或6ng/mL）的 艰难梭菌毒素（菌株VPI 10463）与连续稀释的mAb孵育，在37°C在96孔 圆底平板中混合1小时，并且随后将混合物添加至细胞培养物平板。在孵育 72小时后，添加20μL/孔CellTiter-Blue；将混合物再孵育4小时；并且测量 了相对于对照品的细胞存活百分比。

T-84细胞毒性测定也用来评价抗毒素A mAb的中和效力。将T-84细胞 （人结肠癌细胞系）在96孔板中接种（15,000个细胞/孔）。在处理之前，允 许细胞贴附4小时。将不同浓度（240、120、60或30ng/mL）的艰难梭菌毒 素（菌株VPI 10463）与连续稀释的mAb孵育，在37°C在96孔圆底平板中 混合1小时，并且随后将混合物添加至细胞培养物平板。在孵育72小时后， 添加20μL/孔CellTiter-Blue；将混合物再孵育4小时；并且测量了与对照相 比的细胞存活百分比。

B.显示抗毒素A mAb阻止毒素A内化至细胞中的ELISA

在设计旨在进一步评估抗艰难梭菌毒素mAb作用机制的实验中，将每种 测试抗体（PA-39、PA-50、比较物抗毒素A mAb CDA-1与抗毒素A山羊多 克隆抗体对照）以其100倍EC₉₀值与用于Vero细胞的CC₉₀浓度的毒素A混 合并孵育1小时，以便在毒素A的高度细胞毒性浓度下确保完全中和。随后 将混合物在37°C与Vero细胞孵育15分钟。随后将细胞用PBS洗涤、固定和 透明。使用一种抗毒素A抗体（辣根过氧化物酶（HRP）标记的（PA-38）， 它并不与所测试的抗体竞争结合）来探测内化的毒素A并且使用化学发光法 检测。（图31G）。在这种测定中，探针将仅检测到已经结合并内化至细胞 中的毒素，因此基于HRP化学发光反应产生化学发光信号。化学发光检测法 使用了在导致可见光生成的过氧化物的存在下催化HRP酶和其底物之间反应 （即，由过氧化物所致的鲁米诺的催化氧化）的一种酶。氧化的鲁米诺在它 衰变成基态时发射光线。一旦底物受HRP催化，则通过光度计需要定量光信 号。

C.中和活性研究和MOA研究的结果

抗毒素A mAb

在用来评价抗毒素A抗体的中和活性和作用机制法的细胞毒性细胞测定 中，将毒素A以增加的浓度添加至细胞，如上文在实例的A部分中所说明。 评估其中毒素A被抗毒素A mAb PA-39、PA-50、以及比较物mAb CDA-1中 和的这些实验的结果，并且将它们在图31B-D和下表A中显示。

表A.毒素A效力实验结果和最大抑制百分比

^*：在曲线未达到100%对照的情况下，将EC₅₀计算为50%最大抑制百分比。

如从表A中提供的数据见到，mAb PA-39在毒素效力测定中的体外活性 显示当添加更多的毒素A至培养物时EC₅₀和最大抑制百分比的偏移，这显示 PA-39的混合竞争性抑制机制。100倍过量的PA-39保护后对毒素A的 ELISA检测证实，PA-39对毒素的抑制作用通过阻止毒素内化和细胞毒素作 用而发生。mAb PA-50在毒素效力测定中的体外活性当添加更多毒素A至培 养物时显示EC₅₀的偏移，从而显示PA-50的竞争性抑制机制。100倍过量的 PA-50保护后对毒素A的ELISA检测证实，PA-50对毒素的抑制通过阻止毒 素内化而发生。

抗毒素B mAb

在用来评价抗毒素B抗体的中和效力和作用机制的细胞毒性细胞测定 中，将毒素B以增加的浓度添加至细胞中，如在该实例的A部分中所说明。 评估其中毒素B被抗毒素B mAb PA-41与比较物mAb CDB-1中和的效力实 验的结果，并且将它们在图31E和F以及下表B显示。如从表格中提供的数 据所见，PA-41在毒素效力测定中的体外活性显示出当添加更多毒素B至培 养物时，EC50和最大抑制百分比均偏移，从而显示PA-41的混合竞争性抑制 机制。

表B.毒素B效力实验结果和最大抑制百分比

^*：在曲线未达到100%对照的情况下，将EC₅₀计算为50%最大抑制百分比。

基于这个实例中的以上说明的测定，具有仅通过添加更大浓度的抑制剂 而完全中和增加浓度的毒素A或毒素B的能力的抑制剂将在当更多抗体结合 并且中和了更高浓度的毒素时显示EC₅₀偏移，并且因此将视为一种竞争性抑 制剂。不能克服增加浓度的毒素的毒性效应的抑制剂将在抑制剂的较高浓度 时显示降低的最大效应百分比，但是将不显示EC₅₀的偏移并且因此将视为一 种非竞争性抑制剂。另外，在毒素的较高浓度时显示因增加浓度的抑制剂所 致的EC₅₀偏移和降低的最大效应百分比的抑制剂应当被视为一种混合竞争性 抑制剂。某种程度上，使用细胞毒性细胞测定来评价作用机制必须在考虑涉 及测定重复性以及不含抑制剂的对照孔中所观察到的背景细胞毒性的误差时 进行，其中该误差影响最大抑制百分比的稳定水平。因此，当毒素浓度由于 这些效应而增加时，可以观察到EC₅₀值的略微右移。

根据前述内容，就毒素A中和作用和MOA而言，将PA-39mAb视为一 种混合竞争性抑制剂，原因是EC₅₀偏移以及PA-39细胞毒性曲线所观察到的 降低的稳定水平（图31B），以及表A中所计算的降低的最大效应百分比。 这些数据由ELISA结果支持（图31H），ELISA结果显示在高浓度PA-39时 细胞毒效应的程度，因此表明PA-39MOA的至少某些在胞内出现。据观察， PA-50mAb是一种竞争性抑制剂，如由在细胞毒性测定曲线中观察到的EC₅₀值右移（图31C）以及由表A中提出的显示最大抑制百分比变化极小的数据 所确认。这些数据由ELISA结果支持，这些结果显示在高浓度的PA-50时完 全抑制毒素A结合和内化（图31H）。

如图31D中所观察，比较物mAb CDA-1显示出EC₅₀的最小移动，但是 当毒素增加时最大效应百分比的大幅度降低。当图31D中所示的结果与表A 中提出的数据一起考虑时，CDA-1比较物mAb显示出一种非竞争性作用机 制，因为它的所有活性均在细胞外部观察到。毒素结合和细胞内化的立体位 阻作用有可能是产生图31D中数据曲线的原因，从而支持CDA-1比较物 mAb的非竞争性MOA。

根据对毒素B中和作用和MOA的前述内容，PA-41mAb被认为显示出 一种混合竞争性作用机制，原因是在图31E和表B中提出的数据内观察到的 EC₅₀值右移以及降低的最大效应百分比。

对mAb PA-41所观察到的结果与对比较物mAb CDB-1所观察到的那些 结果相反，这些结果显示出降低的最大效应百分比，但是较小程度的EC₅₀偏 移。在此情况下，比较物mAb针对毒素B的活性的作用机制是较不清楚的， 特别鉴于以上提到的误差考虑。

实例8

测试针对一组艰难梭菌分离株或菌株（包括超强毒力分离株或菌株）的本发 明mAb

为了评价本发明的艰难梭菌抗毒素A和抗毒素B mAb中和来自大范围 的艰难梭菌相关分离株的毒素的能力，针对20株产毒临床艰难梭菌分离株或 菌株（包括超强毒力BI/NAP1/027分离株）的集合测试了这些mAb的中和活 性。由于艰难梭菌在编码毒素A和毒素B的基因中显示出巨大的株间异质 性，所以进行这些研究以便检验所说明的mAb并且尤其是mAb PA-50和PA- 41中和毒素作用的宽度。

基于来自一份艰难梭菌分离株的国际集合或TechLab(Blacksburg,VA)维 持的菌株的毒素分型、核糖体核酸型和限制性核酸内切酶分析结果，针对地 理及遗传多样性选择一组产毒临床艰难梭菌分离株（表6）。

如表6中分类，艰难梭菌菌株包括3个参比菌株（VPI 10463(ATCC 43255)、630(ATCC BAA-1382)和545(ATCC 43596)、6个医院衍生的 BI/NAP1/027菌株（CCL678、HMC553、Pitt45、CD196、5、7.1）、2个毒素 A-/毒素B+(tcdA-tcdB+)菌株(F1470、8864)、3个门诊患者分离株（MH5、 CCL13820和CCL14402）和其他常见的临床分离株（Pitt2、CCL14137、 UVA17、UVA30/TL42、Pitt102、Pitt7）。另外，在表6中分别分类为“门诊 患者分离株”和“常见临床分离株（除核糖体核酸型027之外）”的分离株 13(CCL13820)和19(Pitt102)也是toxA-/toxB+菌株。含有这些艰难梭菌毒素 的培养清液在TechLab产生、过滤消毒并且贮存在4°C。使用艰难梭菌毒素/ 抗毒素试剂盒（TechLab）和细胞毒性测定来证实毒素在培养上清液中的存 在。

通过用滴定的培养上清液处理细胞，评估CHO-K1细胞（用来测定培养 上清液的毒素A活性的）和T-84细胞（用来测定培养上清液的毒素B活性） 每种含有毒素的培养上清液的细胞毒活性。

表6.用于产生上清液的艰难梭菌分离株/菌株

为了检验本发明mAb的中和活性，按照导致大于等于95%细胞活力丧 失的最大稀释度使用含有毒素的培养上清液。毒素上清液与多种浓度的mAb 预混1小时，并且随后被添加至细胞中以便在37°C孵育72小时。使用Cell- Titer Blue(Promega)测量细胞活力。将经处理的孔的存活百分比与未处理的对 照孔比较，并且作图以计算mAb的体外中和活性（EC₅₀）。在第一系列实验 中，图23A显示出使用CHO-K1细胞时mAb PA-41在中和毒素上清液方面的 活性。PA-41有力地（EC₅₀范围从1.1^-11M至6.5^-10M）中和了艰难梭菌所有产 毒菌株（包括所有超强毒力菌株，例外是3个毒素A-/毒素B+菌株）的上清 液。已经报道在来自艰难梭菌常规菌株的毒素A-/毒素B+的酶结构域中存在 显著序列差异。因为PA-41与毒素B的酶结构域结合，所以这个结构域中的 序列多样性可以解释PA-41针对两个毒素A-/毒素B+菌株的毒素B的较小有 效中和活性。

还进行实验以便在CHO-K1细胞系中评价hPA-41和比较物人抗毒素B  mAb CDB-1(WO/2006/121422；US2005/0287150)针对艰难梭菌超强毒力菌株 的活性。在这些研究中，观察到hPA-41针对来自所有6个BI/NAP1/027菌株 的上清液显示出明显的中和活性，而比较物mAb CDB-1显示极小活性（图 23B）。另外，在这些研究中，观察到hPA-41mAb的中和活性在中和 BI/NAP1/027菌株的毒性方面比该比较物mAb CDB-1超过1,000倍。图23B 中显示了hPA-41和CDB-1比较物mAb针对2个参比菌株（VPI 10463和 ATCC 43596）和6个BI/027/027菌株（CCL678、HMC553、Pitt45、 CD196、蒙特利尔5.1和蒙特利尔7.1）的中和活性。在这些研究中，发现 hPA-41对呈现毒素A-/B+的3个核糖体核酸型017分离株无活性（表6），尽 管针对该组中的其他菌株，hPA-41抗毒素B mAb比该比较物mAb显示出显 著更大的中和活性。

使用T-84细胞时，mAb PA-50在中和艰难梭菌培养物的含有毒素A的 上清液方面的活性是2.6^-12M至7.7^-11M，如图24A中所显示。PA-50充分中和 了来自所有可获得的产生毒素A的菌株（包括超强毒力菌株）的上清液。PA- 50不中和4个毒素A-/毒素B+菌株（F1470、8864、CCL 13820、CCL 14402），因为这些菌株不产生任何毒素A。hPA-50还在中和该组中剩余菌株 的活性方面明显更有效。在其他对比研究中，发现hPA-50针对产生毒素A的 艰难梭菌的所有6个BI/NAP1/027菌株的中和活性比该比较物mAb CDA-1 (WO/2006/121422；US2005/0287150)超过100倍（图24B）。hPA-50还针对 产生艰难梭菌毒素A的参比菌株VPI 10463和545显示大于比较物mAb  CDA-1的中和活性。类似地，mAb PA-39以范围从7.7^-12M至4.8^-8M的EC₅₀值中和艰难梭菌培养物的上清液中的毒素A，如图25A中所示。如对mAb  PA-50所见，PA-39不中和4个毒素A-/毒素B+菌株。另外，对比研究的结果 显示，mAb PA-39针对所有6个BI/NAP1/027菌株的中和活性大于该比较物 人抗毒素A mAb CDA-1超过100倍；PA-39还针对该组中的其他菌株显示明 显更大的中和活性（图25B）。应当指出，1个毒素菌株CCL 14402没有充分 减少T-84细胞的活力以便足以允许在测定中精确测量mAb中和活性。

在这些研究中，在CHO-K1细胞系上，hPA-41针对来自所有6个 BI/NAP1/027菌株的上清液显示高水平的中和活性，而比较物mAb CDB-1显示 极小活性。观察到人源化的PA-41在中和艰难梭菌超强毒力BI/NAP1/027菌株 方面具有大于比较物mAb CDB-1超过1,000倍的中和活性。图23B中显示了 hPA-41和CDB-1在这些研究中针对2个参比菌株（VPI 10463和ATCC 43596） 和6个BI/027/027菌株（CCL678、HMC553、Pitt 45、CD196、蒙特利尔5.1和 蒙特利尔7.1）的中和活性。类似地，与比较物mAb CDB-1相比，hPA-41在这 些研究中显示出针对这个组中的其他菌株的明显更高的中和活性，例外是呈 现毒素A-/B+的3个核糖体核酸型017分离株。进行相似的实验以便在T-84细胞 上评估hPA-39以及比较物人抗毒素A mAb CDA-1的中和活性。结果显示PA- 39对所有6个BI/NAP1/027菌株的中和作用大于比较物mAb CDA-1超过100倍 （图25B）。在这些研究中，人源化PA-39针对这个组中的剩余菌株还显示出 显著大于比较物mAb CDA-1的中和活性。因此，hPA-41和hPA-39mAb针对所 测试的所有菌株显示出高水平的抗艰难梭菌超强毒力菌株中和活性。这表明 这些人源化mAb所识别的表位在多种菌株之间是高度保守的。

与表6相似，表7提供了以上体外艰难梭菌毒素中和实验的结果，这些 结果显示一组从北美洲和欧洲分离的产毒艰难梭菌菌株以及由人源化抗毒素 mAb和比较物mAb CDA-1和CDB-1产生的所得EC₅₀值。这个组按照临床上 观察到的近似比率包括核糖体核酸型001、002、003、012、014、017、027 和078(94、95)，例外是核糖体核酸型017tcdA^-tcdB⁺菌株，这些菌株在本组 中过度存在。使用来自tcdA^-tcdB⁺菌株的上清液作为鉴定细胞的工具，其中这 些细胞抵抗由仅含有毒素B的上清液所致的杀死作用、并且因此将适于检验 由毒素A介导的细胞毒性。在这个组中包括VPI 10463，并且它允许比较用纯 化和未纯化的毒素所获得的结果。

在这些研究中，人源化的mAb PA-50以菌株非依赖方式中和毒素A。中 位数EC₅₀值是32pM（范围：20至127pM，表7），并且观察到陡峭剂量- 反应曲线，该曲线具有典型地般大于2的Hill斜率（图25C）。针对每个试 验分离株，PA-50比CDA1更有活性。对于超强毒力027菌株和对于这个组 中所包括的核糖体核酸型078菌株观察到效力的最大差异，其中对于超强毒 力027菌株，PA-50比CDA1更有力大约1,000倍（P=0.0002）。

人源化mAb PA-41以中位数EC₅₀值23pM（范围：7.7至129pM，表 7）有力地抑制了每一个tcdA⁺tcdB⁺菌株，并且在更高的浓度观察到基本上完 全的中和作用（图25D）。PA-41总体上比CDB1更有效地对抗tcdA⁺tcdB⁺菌 株，并且针对超强毒力027菌株是大约500倍更有力的（P=0.003）。CDB1 而非PA-41是在中和来自核糖体核酸型017tcdA^-tcdB⁺菌株的毒素B方面有效 的。最后，PA-41和PA-50显示出针对来自参比菌株VPI 10463的粗制和纯化 形式的相似活性（表7和图25C和25D）。

表7体外中和来自多种艰难梭菌菌株的毒素

如这个实例中所示，人源化的mAb PA-50和PA-41分别显示出针对来自 当前CDI流行的遗传多样性菌株代表的艰难梭菌毒素A和B的高水平中和活 性。鉴于毒素内部的基因型变异和表型变异，这些mAb的活性的宽度是引人 注目的。具体而言，PA-50和PA-41以皮摩尔活性中和了由超强毒力耐受抗 生素的027菌株产生的毒素，同时观察到比较物mAb具有纳摩尔活性。这种 结果可以反映CDA-1对来自027菌株的毒素A的结合降低，如之前所报道 (90)。相对于其他艰难梭菌菌株，来自027菌株的毒素B显示出明显的序列趋 异性。序列差异集中在羧基端受体结合结构域内部，并且与增加的体外细胞 毒性相关。然而，这类序列趋异性不影响PA-41的中和活性，PA-41结合毒 素B的氨端结构域内部的表位。PA-50和PA-41以皮摩尔效力中和这个组中 的所有6个027菌株，包括比027流行最近增加早的菌株CD196。总之，这 些研究结果表明，PA-50和PA-41的表位在整个027谱系内是大范围保守 的。

CDI典型地由产生毒素A和B的艰难梭菌菌株引起。然而，tcdA^-tcdB⁺菌株也与疾病有关。临床上相关的tcdA^-tcdB⁺菌株优势地是核糖体核酸型 017。已经报道核糖体核酸型017菌株在仓鼠中显示降低的致病性，并且编码 了一个非典型tcdB，它的氨基端区域与来自VPI 10463的tcdB和索氏梭菌(C. sordellii)的致死毒素（tcsL）具有70%-80%的序列同一性。在表型上，核糖体 核酸型017tcdB具有杂合特征并且分别显示典型tcdB和tcsL毒素的受体结合 特征和糖基化特异性。017tcdB的非典型氨基端区域为这种毒素在这项研究 中为何不被PA-41中和提供一种可能的解释。虽然017菌株可以具有区域流 行性并且引起局部CDI暴发，但是总体上确定它们占据小于2%的在治疗CDI 的研究性疗法的最近国际III期临床研究中的菌株(94、95)。

实例9

嵌合mAb的产生

产生并表征了包含亲本小鼠mAb可变区和人IgG1恒定区的嵌合单克隆 抗体。产生嵌合mAb以确保克隆了具有正确抗毒素活性和结合特异性的鼠可 变区，并且确保与人恒定区一起构建鼠可变区没有显著地改变每个克隆的 mAb的结合特性和中和特性。嵌合mAb典型地显示与亲本小鼠mAb相同的 结合活性。

MAb PA-38、PA-39、PA-41和PA-50均含有κ轻链。为产生嵌合 mAb，将编码重链可变区及轻链可变区的核酸序列分别插入合适的表达载 体，例如但不限于pCONγ1和pCONκ(Lonza Biologics,Berkshire,UK)。合适 的质粒编码了人κ轻链的恒定区或人IgG1重链的恒定区。为了产生嵌合 mAb，将每个mAb的重链可变区克隆到pCONγ1质粒中。将完整重链基因亚 克隆到含有轻链基因的质粒中，以便产生一种编码重链基因和轻链基因的单 一质粒。使用Effectene(Qiagen,Valencia,CA)根据制造商建议的操作方案， 将293F细胞用这种表达载体瞬时转染。使用蛋白A层析法进行转染和纯化后 7天，收集含有分泌型嵌合mAb的细胞上清液。在细胞毒性测定和血凝集测 定中，将嵌合mAb的效力和活性与鼠mAb的效力和活性比较。

根据以上方法，基于亲本小鼠PA-39和PA-41mAb，产生嵌合mAb (cPA-39和cPA-41)。这些嵌合mAb在原始细胞上清液中的浓度是约2-11 μg/ml。具体而言，来自产生cPA-39的转染的293F细胞培养物的原始上清液 含有10.6μg/ml的嵌合mAb，而来自产生cPA-41的几个转染的293F细胞培 养物的原始上清液含有9.6-10.9μg/ml的嵌合mAb。

通过进行如之前所说明的细胞毒性测定（cPA-39：CHO-K1细胞，cPA- 41：CHO-K1细胞和cPA-50：T-84细胞)（实例3），将这些嵌合mAb与它 们的相应亲本小鼠比较体外中和艰难梭菌毒素的能力。与它们的鼠亲本mAb 相比时，发现所有嵌合mAb是同等有效的，如图26(PA-41)、图27(PA-39) 和图28(PA-50)中所示。这些结果显示成功嵌合化并且产生出有功能的嵌合 mAb，这些嵌合mAb具有与亲本小鼠mAb等同的毒素中和效力。

实例10

鼠mAb的人源化和测试本发明人源化mAb的体外毒素中和效力

已经通过本领域已知的方法产生人源化的mAb。多种人源化mAb的实 例和说明包括，例如，Zenapax(65、66)、Synagis(67-69)、赫赛汀(70-72)、 麦罗塔(Mylotarg)(73、74)、Xolair(75-77)、Raptiva(78-80)、阿瓦斯汀(81、 82)和Tysabri(83)。可以产生有效使免疫原性最小化的人源化单克隆抗体，这 样使得在人类体内的mAb活性没有不利地受到影响。(84-87)。优选地，这些 人源化mAb显示出处于亲本小鼠mAb的两倍范围内的毒素活性。另外，人 源化mAb在艰难梭菌感染的仓鼠模型中最佳地显示有力功效。

建立的互补性区域（CDR）移植方法用来产生如在此所说明的鼠抗毒素 A和/或抗毒素B的人源化形式。将这些人源化的mAb与亲本小鼠mAb比较 体外和体内毒素活性。根据本发明，这些人源化mAb可以保留亲本鼠mAb 的抗毒素活性并且可以适于人类体内反复给药。

A.鼠mAb的重链基因和轻链基因的分子克隆

将建立的方法用于克隆抗体基因。(88)。简言之，使用TRIzol试剂 (Invitrogen)根据制造商建议的操作方案从1x10⁷个杂交瘤细胞纯化总RNA。使 用SuperScript II逆转录酶（Invitrogen）使用一种寡-dT引物，将5μg总RNA逆 转录。所得到的cDNA用RNA酶H处理以除去RNA模板，并且随后使用一个 QIAquick PCR纯化试剂盒（Qiagen）纯化以除去游离的核苷酸和引物。接下 来，在dGTP的存在下根据制造商建议的操作方案使用酶终端转移酶 （NEB），将胍核苷酸尾添加至cDNA的3'末端。随后，使用一条与重链或轻 链的恒定区复性的引物以及一条与cDNA上的鸟嘌呤尾复性的通用引物，将所 得到的加尾cDNA经历PCR。对于重链和轻链，使用以下通用引物 5’TATATCTAGAATTCCCCCCCCCCCCCCCCC3’SEQ ID NO:11。为了扩增 轻链，使用引物 5’TATAGAGCTCAAGCTTGGATGGTGGGAAGATGGATACAGTTGGTGC3’( SEQ ID NO:12)，同时使用引物 5’TATAGAGCTCAAGCTTCCAGTGGATAGAC(CAT)GATGGGG(GC)TGT(T C)GTTTTGGC3’(SEQ ID NO:14)扩增重链，其中括号内的序列表示碱基简并 性。所得到的PCR扩增的DNA使用QIAquick PCR纯化试剂盒（Qiagen）纯化 并且测序。进行PCR反应并且一式三份进行测序，以确保在扩增大约500个碱 基对的DNA片段期间不引入错误。

B.mAb可变区的人源化作用

为了产生人源化mAb的序列，首先鉴定了对CDR结构重要的框架氨基 酸残基。同时，从已知的人免疫球蛋白序列中选出分别与鼠V_H和V_L具有高 度同源性的人V_H和V_L序列。如果需要，将来自鼠mAb的CDR序列连同对 维持CDR结构重要的任何框架氨基酸残基一起移植入选择的人类框架序列 中。此外，据发现在相应V区亚组中不典型的人类框架氨基酸残基置换为常 见残基，以便努力减少所得到的人源化mAb的潜在免疫原性。将这些人源化 V_H和V_L区克隆分别入表达载体，例如但不限于pCONγ1和pCONκ(Lonza  Biologics,Berkshire,UK)。这些载体编码人免疫球蛋白重链和轻链基因的恒定 区。使用Effectene系统（Qiagen,Valencia,CA），将293F细胞用这些表达载 体瞬时转染。转染并且使用蛋白A层析法进行纯化后7天，收集含有分泌的 人源化mAb的细胞上清液。

C.产生表达人源化mAb的克隆的稳定CHO细胞

稳定CHO细胞系的产生允许生产足够量的mAb，以便在体外细胞测定中 以及在金色叙利亚仓鼠的艰难梭菌相关性腹泻（CDAD）模型中测试。作为 但只是一个实例，可以使用来自Lonza Biologics(Berkshire,UK)的CHO K1 SV 细胞，该公司使用谷氨酰胺合成酶选择和扩增系统（GS）来产生稳定转染的 CHO细胞。Lonza GS系统典型地产生可以产生可观量的人源化mAb的高产量 CHO细胞系。

CHO K1 SV细胞在补充有1X谷氨酰胺（Invitrogen）和1X H/T补充物 （Invitrogen）的CD CHO细胞培养基（Invitrogen）中扩充。将1x10⁷个活细 胞以290V、无穷电阻和960uF随40μg重悬于100μl无菌TE缓冲液中的线性化 质粒DNA一起电穿孔。将这些细胞转移至含有50ml完全CD CHO培养基的T- 150瓶，并且在37°C和8.0%CO₂时孵育大约48小时。将细胞离心并且在含有 100μM的MSX(Sigma)的GS选择培养基（CD CHO+1X GS补充物(JRH  Biosciences)+1X H/T补充物）中重悬至最终密度3.3x 10⁵个细胞/ml，以5000 个活细胞/孔铺种在96孔平板（Corning）中并且孵育大约3-4周直至原代细胞 集落（转染细胞的克隆）开始出现。通过小心地取出20μl上清液并且以96孔 形式进行ELISA测定，对大约300个细胞集落（克隆）采样分析重组mAb产 生。简言之，96孔板用一种捕获抗体（山羊抗人抗体）包被，并且随后添加 来自克隆的CHO转染子的上清液（1:800稀释）以允许结合与平板结合的捕 获抗体。在洗涤后，将第二抗体(与碱性磷酸酶偶联的山羊抗人抗体)添加至平 板，并且允许与样品中的人类抗体结合，此后进行洗涤以消除非特异性结 合。随后使用1-步法PNPP试剂盒（Thermo,Rockford,IL）测定平板的碱性磷 酸酶活性以鉴定产生最大量的分泌型抗体的克隆。产生大量mAb的克隆在补 充有1X谷氨酰胺和1X H/T补充物的CD CHO细胞培养基中扩充。收集含有分 泌型人源化mAb的细胞上清液并且使用蛋白A纯化之。显示最佳生产量的克隆 通过有限稀释法亚克隆并且放大以产生克量的重组人源化单克隆抗体。

D.人源化mAb hPA-39、hPA-41和hPA-50

将分子克隆的人源化mAb如以上所说明进行分离和表征（见下文E部 分）。每种人源化抗体的轻链(L)恒定区(CL)是κ(κ)类的；每种人源化抗体 的重链(H)恒定区(CH)是IgG1同种型的。发现含有独特可变(V)区的人源 化mAb结合毒素A或艰难梭菌毒素B和中和其活性。这些人源化mAb的L 链和H链的VL区可以形成一种完整免疫球蛋白(Ig)或抗体分子的部分，它 由两条H链多肽和两条L链多肽组成，典型地由二硫键连接，或它们可以是 抗体的分立部分或片段，尤其是结合毒素A和/或毒素B和/或中和毒素活性 的抗体部分或片段。含有V区的合适免疫球蛋白片段或部分的非限制性实例 包括F(ab)、F(ab’)或F(ab’)₂片段。

根据以上说明的操作产生人源化抗艰难梭菌毒素A和毒素B mAb。人源 化过程产生了与毒素A结合并且中和毒素A在易感细胞上活性的几种抗艰难 梭菌毒素A人源化mAb(hmAb)。这类hmAb的实例包括人源化抗艰难梭菌毒 素A mAb，它包含一个H链多肽序列和一个L链多肽序列，其中该H链多肽 序列包含SEQ ID NO:1的VH区（图32A）和一个人IgG1C区，该L链多肽 序列包含SEQ ID NO:3的VL区（图33A）和一个人κC区；抗艰难梭菌毒素 A hmAb，它包含一个H链多肽序列和一个L链多肽序列，其中该H链多肽 序列包含SEQ ID NO:2的VH区（图32B）和一个人IgG1C区，该L链多肽 序列包含SEQ ID NO:3的VL区（图33A）和一个人κC区；抗艰难梭菌毒素 A hmAb，它包含一个H链多肽序列和一个L链多肽序列，其中该H链多肽 序列包含SEQ ID NO:1的VH区（图32A）和一个人IgG1C区，该L链多肽 序列包含SEQ ID NO:4的VL区（图33B）和一个人κC区；以及抗艰难梭菌 毒素A hmAb，它包含一个H链多肽序列和一个L链多肽序列，其中该H链 多肽序列包含SEQ ID NO:2的VH区（图32B）和一个人IgG1C区，该L链 多肽序列包含SEQ ID NO:4的VL区（图33B）和一个人κC区。这类人源化 抗艰难梭菌毒素A mAb包括本发明的hmAb(hPA-39)。可以在共表达并且分 泌hPA-39H链多肽和hPA-39L链多肽的宿主细胞中产生具有两条L链和两 条H链的完整hPA-39免疫球蛋白，其中hPA-39H链多肽由本发明的一个 VH区（例如，SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:2）和一个合适（例如IgG1同种 型）的CH区（如Genbank登录号NW_001838121内部所含有）组成，hPA- 39L链多肽由本发明的一个hPA-39VL区（例如，SEQ ID NO:3；SEQ ID  NO:4）和一个合适（例如κ亚型）的CL区（如GenBank登录号 NW_001838785NW_001838785内部所含有）组成。

本发明的人源化抗艰难梭菌毒素A mAb的其他实例包括人源化抗艰难梭 菌毒素A mAb，它包含一个H链多肽序列和一个L链多肽序列，该H链多肽 序列包含SEQ ID NO:5的VH区（图34A）和一个人IgG1C区，该L链多肽 序列包含SEQ ID NO:7的VL区（图35）和一个人κC区；以及人源化抗艰 难梭菌毒素A mAb，它包含一个H链多肽序列和一个L链多肽序列，该H链 多肽序列包含SEQ ID NO:6的VH区（图34B）和一个人IgG1C区，该L链 多肽序列包含SEQ ID NO:7的VL区（图35）和一个人κC区。这类人源化的 抗艰难梭菌毒素A mAb包括本发明的人源化PA-50(hPA-50)mAb。可以在共 表达并且分泌hPA-50H链多肽和hPA-50L链多肽的一种合适宿主细胞中产 生具有两条L链和两条H链的完整hPA-50免疫球蛋白，其中hPA-50H链多 肽由本发明的一个VH区（例如，SEQ ID NO:5；SEQ ID NO:6）和一个合适 （例如IgG1同种型）的CH区（如Genbank登录号NW_001838121内部所含 有）组成，hPA-50L链多肽由本发明的一个VL区(SEQ ID NO:7)和（例如κ 亚型的）CL区（如GenBank登录号NW_001838785内部所含有）组成。

人源化过程进一步产生了与毒素B结合并且中和毒素B在体外在易感细 胞上活性的抗艰难梭菌毒素B人源化mAb。这类hmAb的实例包括人源化抗 艰难梭菌毒素B mAb，它包含一个H链多肽序列和一个L链多肽序列，该H 链多肽序列包含SEQ ID NO:8的一个VH区（图36A）和一个人IgG1C区， 该L链多肽序列包含SEQ ID NO:10的一个VL区（图37）和一个人κC区； 以及人源化的抗艰难梭菌毒素B mAb，它包含一个H链多肽序列和一个L链 多肽序列，该H链多肽序列包含SEQ ID NO:9的一个VH区（图36B）和一 个人IgG1C区，该L链多肽序列包含SEQ ID NO:10的一个VL区（图37） 和一个人κC区。这类人源化抗艰难梭菌毒素A mAb包括本发明的人源化 PA-41(hPA-41)mAb。可以在共表达并且分泌hPA-41H链多肽和hPA-41L 链多肽的一种合适宿主细胞中产生具有两条L链和两条H链的完整hPA-41免 疫球蛋白，其中hPA-41H链多肽由本发明的一个hPA-41VH区（例如，SEQ  ID NO:8；SEQ ID NO:9）和一个合适（例如IgG1同种型）的CH区（如 Genbank登录号NW_001838121内部所含有）组成，hPA-41L链多肽由本发 明的一个hPA-41VL区(SEQ ID NO:10)和一个CL区（例如κ亚型的）（如 GenBank登录号NW_001838785内部所含有）组成。

此外，产生了人源化、克隆的mAb(hmAb)，它们与艰难梭菌毒素A或 毒素B结合并且强烈地中和毒素活性。抗艰难梭菌毒素A hmAb PA-50由两 条重链多肽和两条轻链多肽组成，每条重链含有一个VH区和一个人CH区， 每条轻链含有一个VL区和一个人CL区。编码SEQ ID NO:14的hPA-50重 链多肽的氨基酸序列的核酸序列（或cDNA）在SEQ ID NO:15中给出（图 38B）；编码SEQ ID NO:16的hPA-50轻链多肽的氨基酸序列的核酸序列(或 cDNA)在SEQ ID NO:17中给出。（图38A）。抗艰难梭菌毒素A hmAb PA- 39由两条重链多肽和两条轻链多肽组成，每条重链含有一个VH区和一个人 CH区，每条轻链含有一个VL区和一个人CL区。编码SEQ ID NO:18的 hPA-39重链多肽的氨基酸序列的核酸序列（或cDNA）在SEQ ID NO:19中给 出（图39B）；编码SEQ ID NO:20的hPA-39轻链多肽的氨基酸序列的核酸 序列（或cDNA）在SEQ ID NO:21中给出（图39A）。抗艰难梭菌毒素B  hmAb PA-41由两条重链多肽和两条轻链多肽组成，每条重链含有一个VH区 和一个人CH区，每条轻链含有一个VL区和一个人CL区。编码SEQ ID NO: 22的hPA-41重链多肽的氨基酸序列的核酸序列（或cDNA）在SEQ ID  NO:23中给出（图40B）；编码SEQ ID NO:24的hPA-41轻链多肽的氨基酸 序列的核酸序列（或cDNA）在SEQ ID NO:25中给出（图40A）。

制备单克隆抗体CDA-1和CDB1(7、89)用作比较物mAb。将编码3D8 和124的Ig重链轻链可变区和轻链可变区的DNA序列（WO2006/121422和 US2005/0287150）合成(DNA2.0)并且克隆至载体pCON-γ1和pCON-κ中。 将全长IgG1，κmAb在稳定转染的CHO-K1SV细胞中表达并且如以上所说明 纯化。当根据公开的方法(7)通过Biacore测试针对毒素A和B的结合亲和 力、测试对毒素介导的细胞病变效应的抑制、以及血凝集作用时，CDA1和 CDB1制备物显示出预期水平的活性。

E.人源化mAb的体外表征

在体外进行艰难梭菌毒素中和实验以便将人源化mAb的功能活性与亲本 小鼠mAb的功能活性比较。如图29中所示，与鼠PA-41mAb(mPA-41)的9 pM EC₅₀相比，人源化PA-41(hPA-41)mAb有力地中和毒素B的细胞毒性(6 pM EC₅₀)。类似地，据发现使用CHO-K1细胞或T-84细胞，人源化PA-39 mAb(hPA-39)和人源化PA-50mAb(hPA-50)分别与它们的鼠亲本mAb相比 时，在中和毒素A方面是同等有力的，如图30中对hPA-39所示和如图31中 对hPA-50所示。这些结果显示，亲本鼠mAb成功地进行人源化并且这些人 源化mAb是有功能和有效的。

在这些研究中检验的抗艰难梭菌毒素mAb中，PA-50显示出一条不同的 剂量-反应中和曲线，这条曲线具有典型地大于2、表示协同抑制作用的Hill 系数。协同相互作用是自然界中常见的并且经常以陡峭剂量-反应曲线并且大 于1的Hill系数为特征。显示协同活性的药物已经与治疗病毒感染时增强的 临床活性相关。此外，PA-50以多价方式(一种经常需要但是对于协同性并不 足够的状况)与毒素A结合。

实例11

产生本发明的鼠抗毒素mAb的Fab片段

A.Fab片段的制备

根据制造商的说明书，使用小鼠IgG1Fab和F(ab’)2制备试剂盒 （Pierce）和随试剂盒供应的试剂进行Fab片段化。相同的片段化操作方案用 于所有mAb；PA-39、PA-41和PA-50。简言之，在添加大约3mg mAb之 前，固定的无花果酶浆液（750μl）用消化缓冲液（75mM半胱氨酸，pH 5.6）洗涤，并且将混合物在37°C孵育4小时，伴以恒定的倾覆转动。一旦消 化完成，将这种浆液离心并且收集消化产物。将这种浆液用蛋白A结合缓冲 液洗涤3次，并且添加洗涤物质至完成的消化物。NAb蛋白A柱用蛋白A结 合缓冲液平衡并且添加消化的抗体样品。将柱和样品在室温孵育10分钟。将 柱以1000g离心1分钟以收集含有Fab片段的通流。将柱用蛋白A结合缓冲 液洗涤3次。将通流收集、交换缓冲液入PBS-内并且浓缩。

B.Fab片段的SDS-PAGE

使用Novex凝胶系统，通过SDS-PAGE(Invitrogen)分析样品，并且除非 另外说明，否则下文所列的所有试剂均来自Invitrogen。将样品与NuPage样 品缓冲液混合并且用DTT还原。将还原和未还原的样品在100°C孵育10分 钟。在将样品（4μg）载入4%-12%Bis Tris NuPage后，凝胶电泳以MOPS运 行缓冲液在180V进行60分钟。在电泳后，将凝胶与固定液（40%甲醇，10% 乙酸）孵育20分钟、用水淋洗；并且用单纯蓝染液染色过夜，伴以恒定转 动。

C.Fab的体外表征

进行体外艰难梭菌毒素中和实验以便基于结合位点数目，比较Fabs(▲) 的功能活性与完整mAbs(■)的功能活性。PA-39Fab与完整PA-39相比，强 烈地中和毒素A在CHO-K1细胞上的细胞毒性（EC₅₀分别是880pM和200 pM)（图41A）。发现PA-41Fab在中和毒素B在CHO-K1细胞上的活性方面 与完整PA-41同等有力EC₅₀，分别是88pM和80pM（图41B）。与完整PA- 50mAb在T-84细胞上中和毒素A时的EC₅₀值100pM相比，PA-50Fab具有 1.8nM的EC₅₀值（图41C）。

实例12

人源化抗艰难梭菌毒素mAb对人组织标本的免疫组织化学分析

免疫组织化学(IHC)在研究给定抗原表达方面的价值是在于它允许评价 正常组织和肿瘤组织中的微观解剖细节和异质性。IHC优于其他分析方法， 因为它可以直接将蛋白质定位至各个细胞类型。可以检测到正常组织和肿瘤 组织中的基因表达差异，同时指出细胞数目和组成的变化。这种技术的局限 性包括由于研究的分子的低水平表达所致的可能假阴性结果，以及由于抗体 与相似表位或其他抗原共有的那些表位结合所致的假阳性结果（交叉反 应）。为了解决这些局限性，这项研究以每种抗体的最低可能浓度进行，这 些最低可能浓度在阳性毒素特异性注射的小鼠对照标本上显示强烈的特异性 染色。

人源化mAbPA-41和PA-50进行生物素酰化以确定在冷冻人组织选项中 的免疫组织化学结合模式，它们包括肾上腺、膀胱、骨髓、乳腺、小脑、大 脑皮层、宫颈、结肠、食道、眼部、输卵管、心脏、回肠、空肠、肾、肝 脏、肺、淋巴结、肌肉、卵巢、外周神经、胰、甲状旁腺、垂体、胎盘、前 列腺、皮肤、小肠、脊髓、脾、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、输尿管、子宫和 白细胞。每一种前述37种不同人组织类型的一种组织用每种抗体染色。为两 种抗体开发工作用IHC测定法。包括一种不相关的人IgG1,κ同种型对照 抗体用于所有样品。

对于组织制备，将OCT混合物（最佳切削温度包埋混合物；Sakura, Torrance,CA）中包埋的冷冻标本以5微米切片并且和置于带正电荷的玻璃载 片上。开发、测试并且优化用于每种抗体和组织标本的IHC染色方法和条 件。使用新鲜的冷冻未固定的组织切片进行一项直接生物素酰化IHC方法。 从低温恒温器取出载玻片，允许其在室温晾干10分钟，在室温在95%乙醇中 固定5分钟并且随后在3个依次的Tris缓冲盐水/0.1%Tween-20洗涤缓冲液 （TBST；DakoCytomation）浴用洗涤3分钟。以这种方式进行所有后续洗 涤。采用在室温即用型过氧化物酶阻断剂（Peroxidase Block）孵育5分钟， 阻断内源过氧化物酶活性。在缓冲液洗涤后，采用与每种抗生物素蛋白孵育 15分钟来阻断内源生物素活性，每个步骤后是缓冲液洗涤。对于PA-41，将 载玻片在室温与Background Sniper蛋白质阻断试剂孵育10分钟，随后不进行 缓冲液洗涤。载玻片在室温与试验物品或阴性对照试剂（对于PA-41，1.25 μg/ml并且对于PA-50，10μg/ml）孵育30分钟。μμPA-50第一抗体以1:350 稀释于Dako稀释剂中，而PA-41第一抗体以1:3520稀释于含有添加至20 ml稀释剂（pH 7.7）的脯氨酸（250mM，0.576g，Genzyme,CA）和组氨酸 （15mM，0.046g，Genzyme,CA）的Dako稀释剂中。在TBST中洗涤后， 对于两种抗体测定，将ABC检测试剂（TBST中1:50）施加至组织切片并且 在室温孵育30分钟，随后进行缓冲液洗涤。通过在室温与3,3'-二氨基联苯胺 四盐酸盐(DAB)溶液孵育5分钟，显现免疫反应。′将载玻片用去离子水淋洗 (DI)3次，每次30-60秒，用改良Mayer苏木精(DakoCytomation)复染，在 0.2%氨中变蓝、通过乙醇梯度脱水，在二甲苯中透明化并且覆以盖玻片。通 过显微镜检查法进行染色载片的解读。通常，在抗体染色后，对载片上组织 的形态学评价决定是否存在足够量的组织并且命名的正常组织成分是否适当 地表现。由研究病理学从本分析中抛弃不能达到上述标准的样品。

评分系统包括染色强度的半定量性分析。相对于含有用阴性对照抗体染 色的相邻切片的组织对照载片的强度，判定试验物品的染色强度。将阴性试 剂对照标记的切片的染色视为“背景”染色。分数“0”表示相对于背景而言 无染色；“1+”表示弱染色；“2+”表示中等染色；并且“3+”表示强染 色。与标准病理学实践一致，染色强度以所有组织成分中观察到的最高强度 水平报告。

人源化PA-50和PA-41mAb的IHC分析结果是，在任一种测试的人 组织标本中没有显示阳性染色。在整个研究期间在注射毒素的小鼠腿部肌 肉对照组织(针对PA-50的毒素A和针对PA-41的毒素B)中显示一致的鲜 明染色(例如，3+)。对于PA-50，未见到任何组织样品的真阳性染色（即， 100%细胞显示0%染色）。对于PA-41，在测试的37种人组织中没有显示真 阳性染色，然而，在正常肝脏（归因于脂色素）、正常肺（带有外来物体的 肺巨噬细胞）和正常肌肉（与人为染色一致的反应）中见到弱(1+)阳性染色 作为最高染色强度。相对于所有对照并且就测定法内部的最小染色变异而 言，认为PA-41的这类弱染色值无关紧要。

实例13

人源化抗艰难梭菌毒素mAb在非人灵长类中的药物代谢动力学分析

使用纯化的人源化mAb PA-41或mAb PA-50，在非原初性食蟹猴中实施药物代谢动力学(PK)研究。在这项研究中，雄性非原初性食蟹 猴（Macaca fascicularis）是用1mg/kg/动物或5mg/kg/动物的纯化的人源化 mAb PA-41或mAb PA-50静脉内注射。这项研究根据研究机构动物护理和使 用委员会(IACUC)的政策和方法进行。

表8提供了PK研究形式，显示将每种mAb（浓度10mg/kg）以两种剂 量水平静脉内施用至非原初性动物。

表8非人灵长类中的人源化mAb PK研究

动物在研究开始时接受研究抗体的单次静脉内注射。此后，在29天内的 14个单独时间点（即，给药前；在第1天在0.5、2、6、12和24小时（给药 后）；和在第3、4、7、9、12、15、22和29天），通过静脉穿刺外周血管 从每只动物获得血样。将血样收集至血清分离管中并且在湿冰上维持直至凝 血。在凝血后，将血样在4°C以1800g离心10分钟以获得血清。血清样品贮 存在-70°C直至使用。

通过ELISA测定血清中的mAb浓度。96孔ELISA平板（Thermo Fisher  Scientific,Rochester,NY）用毒素A(Techlab)或毒素B(Techlab)以100ng/孔 在4°C包被过夜。平板用PBS/0.05%(PBS-T)洗涤3次，并且在室 温用200μl封闭缓冲液（无钙或镁的PBS，0.1%Tween1%酪蛋白）封 闭1小时。抗体参比标准物（纯化的mAb PA-41或mAb PA-50）在1%汇集 的未患病的食蟹猴血清（Bioreclamation）中稀释以产生0.3-4000ng/mL范围 的标准曲线。将稀释的测标样品和标准品一式三份测试并且在室温孵育1小 时。

将平板用PBS-T洗涤6次并且在室温与HRP偶联的山羊抗人IgG1(The  Binding Site,San Diego,CA)一起孵育1小时。平板用SureBlue TMB 1-组分过 氧化物酶底物（KPL）显色，用1N氢氯酸（Thermo Fisher Scientific）终止并 且在SpectraMax平板读数仪（Molecular Devices）上在450nm读数。使用标 准曲线计算每只猴中在不同时间点的mAb浓度。使用WinNonLin，版本4.0 (Pharsight Corp.,Mountain View,CA)进行非区室药物代谢动力学分析。图 42A中显示人源化mAb PA-50的PK结果；图42B中显示人源化mAb PA-41 的结果。对于剂量1mg/g和5mg/kg的PA-50，平均T_1/2(天)分别是14.5± 0.3和12.3±1.5。对于剂量1mg/kg和5mg/kg的PA-41，平均T_1/2(天)分别是 8.9±1.3和9.2±3.3。

参考文献

1.Bartlett,J.G.,T.W.Chang,M.Gurwith,S.L.Gorbach,and A.B.Onderdonk. 1978.Antibiotic-associated pseudomembranous colitis due to toxin-producing  clostridia.The New England Journal of Medicine 298:531-534.

2.Kyne,L.,R.J.Farrell,and C.P.Kelly.2001.Clostridium difficile. Gastroenterol.Clin North Am 30:753-777.

3.Kelly,C.P.and J.T.LaMont.2008.Clostridium difficile--more difficult than  ever.The New England Journal of Medicine 359:1932-1940.

4.MacCannell,D.R.,T.J.Louie,D.B.Gregson,M.Laverdiere,A.C.Labbe,F. Laing,and S.Henwick.2006.Molecular analysis of Clostridium difficile PCR  ribotype 027isolates from Eastern and Western Canada.J Clin Microbiol 44:2147- 2152.

5.McDonald,L.C.,G.E.Killgore,A.Thompson,R.C.Owens,Jr.,S.V. Kazakova,S.P.Sambol,S.Johnson,and D.N.Gerding.2005.An epidemic,toxin  gene-variant strain of Clostridium difficile.The New England Journal of Medicine 353:2433-2441.

6.Warny,M.,J.Pepin,A.Fang,G.Killgore,A.Thompson,J.Brazier,E.Frost  and L.C.McDonald.2005.Toxin production by an emerging strain of Clostridium  difficile associated with outbreaks of severe disease in North America and Europe. Lancet 366:1079-1084.

7.Babcock,G.J.,T.J.Broering,H.J.Hernandez,R.B.Mandell,K.Donahue, N.Boatright,A.M.Stack,I.Lowy,R.Graziano,D.Molrine,D.M.Ambrosino and  W.D.Thomas,Jr.2006.Human monoclonal antibodies directed against toxins A  and B prevent Clostridium diffcile-induced mortality in hamsters.Infect Immun 74:6339-6347.

8.Bartlett,J.G.1981.Antimicrobial agents implicated in Clostridium diffcile  toxin-associated diarrhea of colitis.Johns Hopkins Med J 149:6-9.

9.McFarland,L.V.,M.E.Mulligan,R.Y.Kwok and W.E.Stamm.1989. Nosocomial acquisition of Clostridium difficile infection.The New England Journal  of Medicine 320:204-210.

10.Zilberberg,M.D.,A.F.Shorr,and M.H.Kollef.2008.Increase in adult  Clostridium difficile-related hospitalizations and case-fatality rate,United States, 2000-2005.Emerg.Infect Dis 14:929-931.

11.Riley,T.V.,Codde,J.P.,and Rous,I.L.Increased length of hospital stay due  to Clostridium difficile-associated diarrhoea.Lancet 345,455-456.2-18-1995.

12.O'Brien,J.A.,B.J.Lahue,J.J.Caro,and D.M.Davidson.2007.The  emerging infectious challenge of clostridium difficile-associated disease in  Massachusetts hospitals:clinical and economic consequences.Infect Control Hosp  Epidemiol.28:1219-1227.

13.Redelings,M.D.,F.Sorvillo,and L.Mascola.2007.Increase in Clostridium  difficile-related mortality rates,United States,1999-2004.Emerg.Infect Dis 13:1417-1419.

14.Loo,V.G.,L.Poirier,M.A.Miller,M.Oughton,M.D.Libman,S.Michaud, A.M.Bourgault,T.Nguyen,C.Frenette,M.Kelly,A.Vibien,P.Brassard,S.Fenn, K.Dewar,T.J.Hudson,R.Horn,P.Rene,Y.Monczak,and A.Dascal.2005.A  predominantly clonal multi-institutional outbreak of Clostridium difficile-associated  diarrhea with high morbidity and mortality.The New England Journal of Medicine 353:2442-2449.

15.Warny,M.K.C.2003.Pathogenicity of Clostridium difficile toxins. Washington DC:ASM Press 366:503-524.

16.Kelly,C.P.,C.Pothoulakis和J.T.LaMont.1994.Clostridium difficile  colitis(艰难梭菌结肠炎).The New England Journal of Medicine 330:257-262.

17.Lyerly,D.M.,D.E.Lockwood,S.H.Richardson,and T.D.Wilkins.1982. Biological activities of toxins A and B of Clostridium difficile.Infect Immun. 35:1147-1150.

18.McFarland,L.V.,H.W.Beneda,J.E.Clarridge,and G.J.Raugi.2007. Implications of the changing face of Clostridium difficile disease for health care  practitioners.Am J Infect Control 35:237-253.

19.Drudy,D.,T.Quinn,R.O'Mahony,L.Kyne,P.O'Gaora,and S.Fanning. 2006.High-level resistance to moxifloxacin and gatifloxacin associated with a  novel mutation in gyrB in toxin-A-negative,toxin-B-positive Clostridium difficile.J  Antimicrob Chemother 58:1264-1267.

20.Rupnik,M.,N.Kato,M.Grabnar,and H.Kato.2003.New types of toxin A- negative,toxin B-positive strains among Clostridium difficile isolates from Asia.J  Clin Microbiol 41:1118-1125.

21.Voth,D.E.and J.D.Ballard.2005.Clostridium difficile toxins:mechanism  of action and role in disease.Clin Microbiol Rev 18:247-263.

22.Reineke,J.,S.Tenzer,M.Rupnik,A.Koschinski,O.Hasselmayer,A. Schrattenholz,H.Schil,and C.Eichel-Streiber.2007.Autocatalytic cleavage of  Clostridium difficile toxin B.Nature 446:415-419.

23.Aslam,S.,R.J.Hamill,and D.M.Musher.2005.Treatment of Clostridium  difficile-associated disease:old therapies and new strategies.Lancet Infect Dis 5:549-557.

24.Musher,D.M.,S.Aslam,N.Logan,S.Nallacheru,I.Bhaila,F.Borchert,and  R.J.Hamill.2005.Relatively poor outcome after treatment of Clostridium difficile  colitis with metronidazole.Clin Infect Dis 40:1586-1590.

25.Pepin,J.,M.E.Alary,L.Valiquette,E.Raiche,J.Ruel,K.Fulop,D.Godin, and C.Bourassa.2005.Increasing risk of relapse after treatment of Clostridium  difficile colitis in Quebec,Canada.Clin Infect Dis 40:1591-1597.

26.Fekety,R.and A.B.Shah.1993.Diagnosis and treatment of Clostridium  difficile colitis.JAMA 269:71-75.

27.Fekety,R.,L.V.McFarland,C.M.Surawicz,R.N.Greenberg,G.W.Elmer, and M.E.Mulligan.1997.Recurrent Clostridium difficile diarrhea :characteristics  of and risk factors for patients enrolled in a prospective,randomized,double- blinded trial.Clin Infect Dis 24:324-333.

28.Pothoulakis,C.and J.T.LaMont.1993.Clostridium difficile colitis and  diarrhea.Gastroenterol.Clin North Am 22:623-637.

29.McFarland,L.V.,C.M.Surawicz,R.N.Greenberg,R.Fekety,G.W.Elmer, K.A.Moyer,S.A.Melcher,K.E.Bowen,J.L.Cox,Z.Noorani,and.1994.A  randomized placebo-controlled trial of Saccharomyces boulardii in combination  with standard antibiotics for Clostridium difficile disease.JAMA 271:1913-1918.

30.McFarland,L.V.,G.W.Elmer,and C.M.Surawicz.2002.Breaking the  cycle:treatment strategies for 163cases of recurrent Clostridium difficile disease. Am J Gastroenterol.97:1769-1775.

31.Kyne,L.,M.Warny,A.Qamar,and C.P.Kelly.2000.Asymptomatic  carriage of Clostridium difficile and serum levels of IgG antibody against toxin A. The New England Journal of Medicine 342:390-397.

32.Kyne,L.,M.Warny,A.Qamar,and C.P.Kelly.2001.Association between  antibody response to toxin A and protection against recurrent Clostridium difficile  diarrhoea.Lancet 357:189-193.

33.Leav,B.,Blair,B.,Leney,M.,Knauber,M.,Reilly,C.,Lowy,I.,Kohberger, R.,Gerding,D.N.,Kelly,C.,Katchar,K.,Baxter,R.,and Ambrosino,D.2008. Serum anti-toxin B antibody correlates with protection from recurrent Clostridium  difficile associated diarrhea(CDAD).ICAAC/IDSA,Poster B-1295.2008.

34.Wilcox,M.H.,W.N.Fawley,C.D.Settle,and A.Davidson.1998. Recurrence of symptoms in Clostridium difficile infection--relapse or reinfection?J  Hosp Infect 38:93-100.

35.Jodlowski,T.Z.,R.Oehler,L.W.Kam,and I.Melnychuk.2006.Emerging  therapies in the treatment of Clostridium difficile-associated disease.Ann. Pharmacother 40:2164-2169.

36.Missaghi,B.,A.J.Valenti,and R.C.Owens,Jr.2008.Clostridium difficile  Infection:A Critical Overview.Curr.Infect Dis Rep 10:165-173.

37.Optimer Pharmaceuticals,News Release,November 10.2008.

38.Louie,T.J.,J.Peppe,C.K.Watt,D.Johnson,R.Mohammed,G.Dow,K. Weiss,S.Simon,J.F.John,Jr.,G.Garber,S.Chasan-Taber,and D.M.Davidson. 2006.Tolevamer,a novel nonantibiotic polymer,compared with vancomycin in the  treatment of mild to moderately severe Clostridium difficile-associated diarrhea. Clin Infect Dis 43:411-420.

39.Louie,T.G.M.G.D.e.al.,2007.Results of a phase III trial comparing  tolevamer,vancomycin and metronidazole in patients with Clostridium difficile- associated diarrhea(CDI).47th Interscience Conference on Antimicrobial Agents  and Chemotherapy.

40.Kelly,C.P.,C.Pothoulakis,J.Orellana,and J.T.LaMont.1992.Human  colonic aspirates containing immunoglobulin A antibody to Clostridium difficile  toxin A inhibit toxin A-receptor binding.Gastroenterology 102:35-40.

41.Salcedo,J.,S.Keates,C.Pothoulakis,M.Warny,I.Castagliuolo,J.T. LaMont,and C.P.Kelly.1997.Intravenous immunoglobulin therapy for severe  Clostridium difficile colitis.Gut 41:366-370.

42.Leung,D.Y.,C.P.Kelly,M.Boguniewicz,C.Pothoulakis,J.T.LaMont,and  A.Flores.1991.Treatment with intravenously administered gamma globulin of  chronic relapsing colitis induced by Clostridium diffcile toxin.J Pediatr 118:633- 637.

43.Medarex and Massachusetts Biologic Laboratories,News Release,November 3.2008.

44.Kamiya,S.,K.Yamakawa,X.Q.Meng,H.Ogura,and S.Nakamura.1991. Production of monoclonal antibody to Clostridium difficile toxin A which  neutralizes enterotoxicity but not haemagglutination activity.FEMS Microbiol Lett 65:311-315.

45.Kink,J.A.and J.A.Williams.1998.Antibodies to recombinant Clostridium  difficile toxins A and B are an effective treatment and prevent relapse of C. difficile-associated disease in a hamster model of infection.Infect Immun 66:2018- 2025.

46.Lyerly,D.M.,C.J.Phelps,J.Toth,and T.D.Wilkins.1986.Characterization  of toxins A and B of Clostridium difficile with monoclonal antibodies.Infect  Immun 54:70-76.

47.Harlow,E.and Lane,D.,Antibodies,a laboratory manual.Cold Spring harbor  Laboratory Press,Cold Spring harbor,New York.1988.

48.Clark,G.F.,H.C.Krivan,T.D.Wilkins,and D.F.Smith.1987.Toxin A  from Clostridium difficile binds to rabbit erythrocyte glycolipids with terminal Gal  alpha 1-3Gal beta 1-4GlcNAc sequences.Arch Biochem Biophys 257:217-229.

49.Anton,P.M.,M.O'Brien,E.Kokkotou,B.Eisenstein,A.Michaelis,D. Rothstein,S.Paraschos,C.P.Kelly,and C.Pothoulakis.2004.Rifalazil treats and  prevents relapse of clostridium difficile-associated diarrhea in hamsters.Antimicrob  Agents Chemother 48:3975-3979.

50.Boss,S.M.,C.L.Gries,B.K.Kirchner,G.D.Smith,and P.C.Francis.1994. Use of vancomycin hydrochloride for treatment of Clostridium difficile enteritis in  Syrian hamsters.Lab Anim Sci 44:31-37.

51.Freeman,J.,S.D.Baines,D.Jabes,and M.H.Wilcox.2005.Comparison of  the efficacy of ramoplanin and vancomycin in both in vitro and in vivo models of  clindamycin-induced Clostridium difficile  infection.J Antimicrob Chemother 56:717-725.

52.Kink,J.A.and J.A.Williams.1998.Antibodies to recombinant Clostridium  difficile toxins A and B are an effective treatment and prevent relapse of C. difficile-associated disease in a hamster model of infection.Infect Immun 66:2018- 2025.

53.Kokkotou,E.,A.C.Moss,A.Michos,D.Espinoza,J.W.Cloud,N.Mustafa, M.O'Brien,C.Pothoulakis,and C.P.Kelly.2008.Comparative efficacies of  rifaximin and vancomycin for treatment of Clostridium difficile-associated diarrhea  and prevention of disease recurrence in hamsters.Antimicrob Agents Chemother 52:1121-1126.

54.Kurtz,C.B.,E.P.Cannon,A.Brezzani,M.Pitruzzello,C.Dinardo,E.Rinard, D.W.Acheson,R.Fitzpatrick,P.Kelly,K.Shackett,A.T.Papoulis,P.J.Goddard, R.H.Barker,Jr.,G.P.Palace,and J.D.Klinger.2001.GT160-246,a toxin binding  polymer for treatment of Clostridium difficile colitis.Antimicrob Agents  Chemother 45:2340-2347.

55.Mc Vay,C.S.and R.D.Rolfe.2000.In vitro and in vivo activities of  nitazoxanide against Clostridium difficile.Antimicrob Agents Chemother 44:2254- 2258.

56.Razaq,N.,S.Sambol,K.Nagaro,W.Zukowski,A.Cheknis,S.Johnson,and  D.N.Gerding.2007.Infection of hamsters with historical and epidemic BI types of  Clostridium difficile.J Infect Dis 196:1813-1819.

57.Fernie,D.S.,R.O.Thomson,I.Batty,and P.D.Walker.1983.Active and  passive immunization to protect against antibiotic associated caecitis in hamsters. Developmental Biology Standard 53:325-332.

58.Giannasca,P.J.,Z.X.Zhang,W.D.Lei,J.A.Boden,M.A.Giel,T.P. Monath,and W.D.Thomas,Jr.1999.Serum antitoxin antibodies mediate systemic  and mucosal protection from Clostridium difficile disease in hamsters.Infect  Immun 67:527-538.

59.Kim,P.H.,J.P.Iaconis,and R.D.Rolfe.1987.Immunization of adult  hamsters against Clostridium difficile-associated ileocecitis and transfer of  protection to infant hamsters.Infect Immun 55:2984-2992.

60.Lyerly,D.M.,E.F.Bostwick,S.B.Binion,and T.D.Wilkins.1991.Passive  immunization of hamsters against disease caused by Clostridium difficile by use of  bovine immunoglobulin G concentrate.Infect Immun 59:2215-2218.

61.Kelly,C.P.,C.Pothoulakis,F.Vavva,I.Castagliuolo,E.F.Bostwick,J.C. O'Keane,S.Keates,and J.T.LaMont.1996.Anti-Clostridium difficile bovine  immunoglobulin concentrate inhibits cytotoxicity and enterotoxicity of C.difficile  toxins.Antimicrob Agents Chemother 40:373-379.

62.Delmee,M.,M.Homel,and G.Wauters.1985.Serogrouping of Clostridium  difficile strains by slide agglutination.J Clin Microbiol 21:323-327.

63.Delmee,M.,V.Avesani,N.Delferriere,and G.Burtonboy.1990. Characterization of flagella of Clostridium difficile and their role in serogrouping  reactions.J Clin Microbiol 28:2210-2214.

64.Barbut,F.,A.Richard,K.Hamadi,V.Chomette,B.Burghoffer,and J.C. Petit.2000.Epidemiology of recurrences or reinfections of Clostridium difficile- associated diarrhea.J Clin Microbiol 38:2386-2388.

65.Carswell,C.I.,G.L.Plosker,and A.J.Wagstaff.2001.Daclizumab:a review  of its use in the management of organ transplantation.BioDrugs 15:745-773.

66.Wiland,A.M.and B.Philosophe.2004.Daclizumab induction in solid organ  transplantation.Expert Opin Biol Ther 4:729-740.

67.Fenton,C.,L.J.Scott,and G.L.Plosker.2004.Palivizumab:a review of its  use as prophylaxis for serious respiratory syncytial virus infectio.Paediatr.Drugs 6:177-197.

68.Wu,H.,D.S.Pfarr,Y.Tang,L.L.An,N.K.Patel,J.D.Watkins,W.D. Huse,P.A.Kiener,and J.F.Young.2005.Ultra-potent antibodies against  respiratory syncytial virus:effects of binding kinetics and binding valence on viral  neutralization.J Mol Biol 350:126-144.

69.Romero,J.R.Palivizumab prophylaxis of respiratory syncytial virus disease  from 1998 to 2002:results from four years of palivizumab usage.Pediatr.Infect.Dis 22,S46-S54.2003.

70.Carter,P.,L.Presta,C.M.Gorman,J.B.Ridgway,D.Henner,W.L.Wong, A.M.Rowland,C.Kotts,M.E.Carver,and H.M.Shepard.1992.Humanization of  an anti-p185HER2 antibody for human cancer therapy.Proc Natl Acad Sci U S A 89:4285-4289.

71.Emens,L.A.2005.Trastuzumab:targeted therapy for the management of  HER-2/neu-overexpressing metastatic breast cancer.Am J Ther 12:243-253.

72.Finn,R.S.and D.J.Slamon.2003.Monoclonal antibody therapy for breast  cancer:herceptin.Cancer Chemother Biol Response Modif.21:223-233.

73.Giles,F.,E.Estey,and S.O'Brien.2003.Gemtuzumab ozogamicin in the  treatment of acute myeloid leukemia.Cancer 982095-2104.

74.Siemoneit,K.,S.Cardoso Mda,K.Koerner,A.Wolpl,and B.Kubanek.1995. Human monoclonal antibodies for the immunological characterization of a highly  conserved protein domain of the hepatitis C virus glycoprotein E1.Clin Exp  Immunol 101:278-83.75.

75 75 Casale,T.B.2004.Omalizumab:an effective anti-IgE treatment for  allergic asthma and rhinitis.Drugs Today(Barc.)40:367-376.

76.Holgate,S.T.,R.Djukanovic,T.Casale,and J.Bousquet.2005.Anti- immunoglobulin E treatment with omalizumab in allergic diseases:an update on  anti-inflammatory activity and clinical efficacy.Clin Exp Allergy 35:408-416.

77.Presta,L.G.,S.J.Lahr,R.L.Shields,J.P.Porter,C.M.Gorman,B.M. Fendly,and P.M.Jardieu.1993.Humanization of an antibody directed against IgE. The Journal of Immunology 151:2623-2632.

78.Jordan,J.K.2005.Efalizumab for the treatment of moderate to severe plaque  psoriasis.Ann.Pharmacother 39:1476-1482.

79.Werther,W.A.,T.N.Gonzalez,S.J.O'Connor,S.McCabe,B.Chan,T. Hotaling,M.Champe,J.A.Fox,P.M.Jardieu,P.W.Berman,and L.G.Presta. 1996.Humanization of an anti-lymphocyte function-associated antigen(LFA)-1 monoclonal antibody and reengineering of the humanized antibody for binding to  rhesus LFA-1.The Journal of Immunology 157:4986-4995.

80.Leonardi,C.L.2004.Current concepts and review of efalizumab in the  treatment of psoriasi.Dermatol.Clin 22:427-435.

81.Ferrara,N.,K.J.Hillan,H.P.Gerber,and W.Novotny.2004.Discovery and  development of bevacizumab,an anti-VEGF antibody for treating cancer.Nat Rev  Drug Discov.3:391-400.

82.Presta,L.G.,H.Chen,S.J.O'Connor,V.Chisholm,Y.G.Meng,L. Krummen,M.Winkler,and N.Ferrara.1997.Humanization of an anti-vascular  endothelial growth factor monoclonal antibody for the therapy of solid tumors and  other disorders.Cancer Res 57:4593-4599.

83.Steinman,L.2005.Blocking adhesion molecules as therapy for multiple  sclerosis:natalizumab.Nat Rev Drug Discov.4:510-518.

84.Fagnani,R.1994.The immunogenicity of foreign monoclonal antibodies in  human disease applications:problems and current approaches.Immunol Ser.61:3- 22.

85.Mateo,C.,E.Moreno,K.Amour,J.Lombardero,W.Harris,and R.Perez. 1997.Humanization of a mouse monoclonal antibody that blocks the epidermal  growth factor receptor:recovery of antagonistic activity.Immunotechnology.3:71- 81.

86.Reichert,J.M.,C.J.Rosensweig,L.B.Faden,and M.C.Dewitz.2005. Monoclonal antibody successes in the clinic.Nat Biotechnol 23:1073-1078.

87.Stephens,S.,S.Emtage,O.Vetterlein,L.Chaplin,C.Bebbington,A.Nesbitt, M.Sopwith,D.Athwal,C.Novak,and M.Bodmer.1995.Comprehensive  pharmacokinetics of a humanized antibody and analysis of residual anti-idiotypic  responses.Immunology 85:668-674.

88.Co,M.S.,N.M.Avdalovic,P.C.Caron,M.V.Avdalovic,D.A.Scheinberg, and C.Queen.1992.Chimeric and humanized antibodies with specificity for the  CD33antigen.J.Immunol.148:1149-1154.

89.Lowy,I.et al.2010.Treatment with monoclonal antibodies against  Clostridium difficile toxins.N.Engl.J Med.,362,197-205.

90.Babcock,G.J.et al.Human Monoclonal Antibodies Neutralize Toxins  Produced by Epidemic Strains of Clostridium difficile,the Infectious Diseases  Society of America 43rd Annual Meeting,October 6-9,2005;San Francisco, California.

91.Optimer Pharmaceuticals Reports Positive Data from its North American  Phase 3 CDI Study of OPT-80.Optimer Pharmaceuticals,Press Release(2008).

92.Rothman SW,Toxicon.1988;26(6):583-97.

93.WO2005US0047100 to Diversa

94.Cheknis,AK et al.Distribution of Clostridium difficile strains from a North  American,European and Australian trial of treatment for C.difficile infections: 2005-2007.Anaerobe 15:230-233(2009).

95.Gerding D,et al.Restriction endonuclease analysis(REA)typing of  Clostridium difficile in a phase 3 treatment trial of fidaxomicin vs vancomycin: Decreased cure rate for epidemic BI/NAP1/027strain.49th Interscience Conference  on Antimicrobial Agents and Chemotherapy,Abstract,L1-1642,San Francisco,CA, September 12-15,2009.

尽管出于说明的目的已经详细地说明了本发明，但应当理解的是这种细 节仅用于该目的并且本领域的普通技术人员可以进行变体而不脱离由以下权 利要求所限定的本发明的精神和范围。

本申请通篇所引用的全部参考文献、专利以及公开的专利申请其内容通 过引用结合在此。

任何参考文献的列表并不是承认该参考文献是现有技术。