用于肝细胞癌诊断的含微RNA生物标记的诊断试剂盒和方法

摘要

本发明提供了微RNA生物标记和包含多种编码所述微RNA生物标记的核酸分子的诊断试剂盒，用于鉴别展现出肝细胞癌的一或多种目标血浆。本发明还提供了用于诊断和治疗肝细胞癌的方法，以及用于预防和治疗肝细胞癌的药物组合物。

说明书

发明领域

本发明涉及用于肝细胞癌(hepatocellular cancer)血浆中的微RNA(microRNA)表达谱分析的组合物和方法。 

发明背景 

肝细胞癌(也称作肝细胞癌症(hepatocellular carcinoma，HCC))是世界范围内最常见的实体恶性肿瘤之一。其代表了肝癌的主要组织学类型，可能占所有肝癌病例的70%-85%。世界每年有大约500,000个新病例，和几乎相同数目的死亡病例，这反映出对这种疾病缺乏有效的早期检测和治疗选择(Thorgeirsson,S.S.and Grisham,J.W.(2002)Nat.Genet.31,339-346；Parkin,D.M.et al.(2005)CA Cancer J.Clin.55,74-108)。 

肝细胞癌因此是一类预后极差的癌症。患者预后取决于癌症确诊时的分期。肝细胞癌患者未进行手术的5年生存率<5%，而术后5年生存率为60%-70%。当肿瘤大小<2cm时行手术切除，5年生存率可达到86%。但是早期肝癌患者(肿瘤大小<5cm)未行任何治疗者的3年生存率仅17%-21%。这表明癌症早发现对于治疗和患者生存很重要。(Tang,Z.Y.(2001)World J Gastroenterol 7,445-454;Chambers,A.F.et al.(2002)Nat Rev Cancer 2,563-572;Mola-Kuba D.et al.(2006)Annals of Hepatology 5,16-24). 

尽管近年来肝细胞肿瘤的早发现和手术切除显著提高了患者存活率，但是大多数肿瘤并不能在其发生期即非致命阶段发现。然而，目前仅大约10%-20%的肝细胞癌患者符合外科手术条件，所述肝细胞癌的手术条件是通过可利用的临床分期系统根据相对正常的肝功能和可处理的肿瘤损害等参数而确定。此外，进行切除术的患者通常具有高频率的转移/复发，术后5年存活率仅为30%-40%。肝癌的确诊通常依靠组织学证据。组织采样通过穿刺针吸出或活检。然而一些肝癌分化良好，也就是说它们是由几乎完全发育的成熟的肝细胞组成，因此这些肝癌组织在显微镜下酷似非癌肝组织。而且并不是所有的病理医师都被训练得可以辨别分化良好的肝癌和正 常肝组织之间的细微区别。还有一些病理医师会将肝细胞癌误诊为肝腺癌。腺癌是肝癌的另外一种类型，它一般起源于肝外。更重要的是，转移性腺癌其治疗与原发性肝癌截然不同。因此早期诊断这些在患者身上表现为一种类型的肝细胞癌的肿瘤对于区分不同类型的肿瘤并且指导不同的治疗方案是可取的，因而可显著改善远期存活率。 

肝组织穿刺或活检最常见的危险是出血，尤其因为肝癌是富含脉管的肿瘤(容纳许多血管)。有许多病例可能没有必要通过穿刺或活检进行组织学诊断。如果一个患者有发生肝癌的危险因素(例如肝硬化、慢性乙型肝炎或慢性丙型肝炎)并且血液中α-胎甲球蛋白(AFP)显著提高，医生几乎可以不通过活检就能确定这个患者发生了肝癌。目前，仅有一种血清标记(a-甲胎蛋白，AFP)通常用于早期检测肝细胞癌(Mizejewski,G.J.(2003)Expert Rev.Anticancer Ther.2,709-735；Paul,S.B.et al.(2007)Oncology 72,Suppl.1,117-123)。然而这个单一标记具有低特异性，且通常由于假阳性结果而是不合适的。血清AFP检验仅在60%的患者中可易于检测出肝细胞肿瘤。另一方面，在大量的肝硬化患者中，在不存在癌症状态时AFP也可升高。因此，我们仍然需要确定一些可供选择的分子标记并且开发一些敏感的血液学检测来早期发现和鉴别诊断肝细胞癌。 

解决这个问题的一种途径可以基于一些小的调节性RNA分子，特别是基于微RNA(miRNA)，它们是一类进化保守的内源表达的小的非编码RNA，大小为20-25个核苷酸(nt)，可以介导靶mRNA的表达。自从它们在大约10年前被发现就被认为在细胞发育、分化、增殖和凋亡中有重要功能。(Bartel,D.P.(2004)Cell 116,281-297,Ambros,V.(2004)Nature 431,350-355;He,L.et al.(2004)Nat Rev Genet 5,522-531)。而且miRNA在作为癌症生物标记上比mRNA有优势，因为它们在体外很稳定而且在体内寿命长。(Lu,J.et al.,(2005)Nature 435,834-838;Lim,L.P.et al.,(2005)Nature 433,769-773). 

miRNA是从初级转录物产生的，初级转录物被RNase III Drosha加工为茎-环结构前体(pre-miRNA)。在转运到细胞质后，另一种称为Dicer的RNase III切割pre-miRNA发夹的环以形成短双链(ds)RNA，其中一条链作为成熟miRNA掺入miRNA-蛋白质(miRNP)中。miRNA指导miRNP到达它们的靶mRNA，在此它们发挥功能(Bartel,D.P.(2004)Cell 23,281-292； He,L.and Hannon,G.J.(2004)Nat.Rev.Genet.5,522-531)。 

根据miRNA与其靶之间的互补性程度，miRNA可以指导不同的调节过程。与miRNA高度互补的靶mRNA通过与RNA干扰(RNAi)相同的机制被特异切割。因此，在这种情况中，miRNA的功能是作为短干扰RNA(siRNA)。与miRNA互补性较低的靶mRNA要么被指引进入细胞降解途径要么被翻译性阻遏而不影响mRNA水平。但是，miRNA如何阻遏它们的靶mRNA的翻译的机制尚有争论。 

高通量的miRNA定量技术，例如miRNA生物芯片技术，实时的基于RT-PCR的TaqMan miRNA分析，为全球整个癌症基因组miRNA轮廓研究提供了强大的的工具。可获得的现有数据表明miRNA表达的调节异常(dysregulation)可能与某些类型癌症的发生和/或发展相关。例如，已表明两种miRNA，miR-15及miR-16-1定位在慢性淋巴性白血病(CLL)中缺失的遗传基因座上，并且发现在大约70%的CLL患者中，两种miRNA基因被缺失或下调。另外，在结肠直肠瘤形成中观察到miR-143及miR-145的下调，而miRNA let-7的表达在肺癌中经常降低(Michael,M.Z.et al.(2003)Mol.Cancer Res.1,882-891；Mayr,C.et al.(2007)Science 315,1576-1579)。事实上，基于miRNA表达中的癌症相关改变和miRNA通常位于参与癌症的基因组区域的观察推测miRNA可能既作为肿瘤阻抑基因也作为癌基因(Esquela-Kerscher,A.and Slack,F.J (2006)Nat.Rev.Cancer 6,259-269；Calin,G.A.and Croce,C.M.(2007)J.Clin.Invest.117,2059-2066；Blenkiron,C.and Miska,E.A.(2007)Hum.Mol.Genet.16,R106-R113)。提示这些人类癌症组织中异常表达的miRNA突出了它们作为诊断和预后的生物标记的潜能。 

一些研究报道了人肝细胞癌中的miRNA的表达谱(Murakami,Y.et al.(2006)Oncogene 25,2537-2545;Li,W.et al.(2008)Int J Cancer 123,1616-1622;Huang,Y.S.et al.(2008)Hepatology 23,87-94;Ladeiro,Y.et al.(2008)Hepatology 47,1955-1963;Jiang,J.et al.(2008)Clin Cancer Res 14,419-427)。此外，这些研究已经显示出，与非恶性的肝细胞或组织相比，在恶性的细胞或组织中，特定的miRNA异常表达。因此，此类miRNA可以提供对涉及到恶性转变和进展中的细胞过程的了解。 

在许多可能的样本类型中，血液被认为是最理想的来监测高危的个体，导向早发现、早诊断、监控、和有效地治疗癌症，因为血样易于用微创的 方法采集。已被证实肿瘤衍生的miRNA以相当稳定的形式存在于人血浆或血清中，因为它们被保护而不受内源性RNA酶活性影响。这些存在于血清或血浆中的衍生于肿瘤的miRNA的水平足够作为癌症检测的生物标记。而且血浆或血清中的miRNA有强的相关性，表明不管是血浆还是血清样本都适于临床应用miRNA作为癌症诊断的生物标记。(Mitchell,P.S.et al.(2008)Proc Natl Acad Sci USA 105,10513–10518;Gilad,S.et al.(2008)PLoS ONE 3,e3148;Chen,X.et al.(2008)Cell Res 18,997-1006)。至今，还没有基于血样的miRNA生物标记在肝细胞癌患者的血浆或血清中确定。 

因此，急需基于血液的诊断标记，特别是“表达特征(expression signature)”或“分子足迹(molecular footprint)”形式的诊断标记，以使得可以快速、可靠和节约成本地诊断肝细胞癌。而且仍然需要一致的方法来在高危个体中筛选早期肝细胞癌(early stage-HCC)，鉴别诊断HCC，早发现肝癌复发，和/或监测肝癌治疗。 

发明目的和概述 

本发明的目的是提供用于诊断肝细胞癌、监测癌治疗、和/或治疗癌的新方法，其中通过测定血中的多种核酸分子，每种核酸分子均编码微RNA(miRNA)序列，其中所述多种核酸分子的一或多种在肝细胞癌的血浆中经分析与健康对照相比和/或与健康个体、结直肠癌和肺癌相比差异表达，其中所述一或多种差异表达的核酸分子一起代表核酸表达特征，该核酸表达特征指示肝细胞癌的存在，其中所述核酸表达特征包括肿瘤相关特征(tumor-related signature)和血浆特异性特征(plasma-specific signature)。 

此外，本发明的目的是提供用于在展现肝细胞癌的血液中鉴别一或多种核酸表达特征的相应方法。更具体地，本发明的目的是提供用于与健康对照、和/或健康个体、结直肠癌和肺癌相比较来区分肝细胞癌的方法。 

这些及其它目的从以下描述将变得清楚，其通过独立权利要求的主题来达成。本发明的一些优选实施方案则通过从属权利要求的主题来限定。 

在第一方面，本发明涉及用于鉴别一或多种展现出肝细胞癌的目标血浆的血液中分子标记物的诊断试剂盒，所述试剂盒包含多种核酸分子，每种核酸分子编码微RNA序列，其中所述多种核酸分子的一或多种在目标血浆中和在一或多种对照血浆中差异表达，其中所述一或多种差异表达的核 酸分子源于肿瘤相关或血浆特异性特征，其中所述一或多种差异表达的核酸分子一起代表核酸表达特征，所述核酸表达特征指示肝细胞癌的存在。 

本文限定的核酸表达特征可包括至少三十二种核酸分子，优选至少十二种核酸分子，特别优选至少六种核酸分子。 

在优选的实施方案中，所述核酸表达特征包含至少一种编码微RNA序列的核酸分子，其表达在一或多种目标血浆中与一或多种健康对照相比被上调；及包含至少一种编码微RNA序列的核酸分子，其表达在一或多种目标血浆中与一或多种健康对照相比被下调。 

在优选的实施方案中，所述核酸表达特征包含编码肿瘤相关特征hsa-miR-122、hsa-miR-199b-3p、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-139-3p、hsa-miR-10a、hsa-miR-103、hsa-miR-181d、hsa-miR-125b-2*、a-miR-125a-3p；血浆特异性特征hsa-miR-34a、hsa-miR-136、hsa-miR-151-5p、hsa-miR-193b*、hsa-miR-124、hsa-miR-936、hsa-miR-198、hsa-miR-149*、hsa-miR-138、hsa-miR-601、hsa-miR-769-3p、hsa-miR-513c、hsa-miR-525-5p、hsa-miR-654-5p、hsa-miR-518c*、hsa-miR-500、hsa-miR-181c*、hsa-miR-1226*、hsa-miR-202、hsa-miR-629*和内部稳定的对照hsa-miR-1238和hsa-miR-1228的任意一种或多种核酸分子。 

特别优选地，与一或多种健康对照相比，在所述一或多种目标血浆中：编码hsa-miR-122、hsa-miR-199b-3p、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-10a、hsa-miR-103、hsa-miR-34a、hsa-miR-136、hsa-miR-151-5p的任意一种或多种核酸分子的表达被上调；编码hsa-miR-139-3p、hsa-miR-193b*、hsa-miR-124、hsa-miR-181d、hsa-miR-125b-2*、hsa-miR-125a-3p、hsa-miR-936、hsa-miR-198、hsa-miR-149*、hsa-miR-138、hsa-miR-601、hsa-miR-769-3p、hsa-miR-513c、hsa-miR-525-5p、hsa-miR-654-5p、hsa-miR-518c*、hsa-miR-500、hsa-miR-181c*、hsa-miR-1226*、hsa-miR-202、hsa-miR-629*的任意一种或多种核酸分子表达被下调；hsa-miR-1238和hsa-miR-1228没有变化。 

在更优选的实施方案中，核酸表达特征包括编码肿瘤相关特征hsa-miR-122、hsa-miR-199b-3p、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-139-3p、hsa-miR-10a、hsa-miR-103和编码血浆特异性特征hsa-miR-34a、hsa-miR-136、hsa-miR-151-5p、hsa-miR-193b*、hsa-miR-124的任意一种或 多种核酸分子。 

特别优选地，与一种或多种健康对照相比，在一种或多种目标血浆中：编码hsa-miR-122、hsa-miR-199b-3p、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-10a、hsa-miR-103、hsa-miR-34a、hsa-miR-136、hsa-miR-151-5p的任意一或多种核酸分子表达被上调；而编码hsa-miR-139-3p、hsa-miR-193b*、hsa-miR-124的任意一种或多种核酸分子表达被下调。 

在另一优选的实施方案中，核酸表达特征包含编码肿瘤相关特征hsa-miR-122、hsa-miR-199b-3p、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-139-3p和血浆特异性特征hsa-miR-34a的任意一种或多种核酸分子。 

特别优选地，与一种或多种健康对照相比，在一种或多种目标血浆中：编码hsa-miR-122、hsa-miR-199b-3p、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-34a的任意一种或多种核酸分子的表达被上调，而编码hsa-miR-139-3p的任意一种或多种核酸分子的表达被下调。 

在特别优选的实施方案中，核酸表达特征包括编码hsa-miR-34a/hsa-miR-193b*、hsa-miR-21/hsa-miR-936、hsa-miR-192/hsa-miR-124、hsa-miR-122/hsa-miR-193b*、hsa-miR-34a/hsa-miR-138、hsa-miR-34a/hsa-miR-198、hsa-miR-122/hsa-miR-124、hsa-miR-103/hsa-miR-139-3p、hsa-miR-192/hsa-miR-193b*、hsa-miR-122/hsa-miR-138、hsa-miR-34a/hsa-miR-139-3p、hsa-miR-122/hsa-miR-198、hsa-miR-122/hsa-miR-769-3p、hsa-miR-103/hsa-miR-193b*、hsa-miR-34a/hsa-miR-124、hsa-miR-192/hsa-miR-139-3p、hsa-miR-34a/hsa-miR-769-3p、hsa-miR-192/hsa-miR-936、hsa-miR-10a/hsa-miR-193b*、hsa-miR-122/hsa-miR-601、hsa-miR-21/hsa-miR-769-3p、hsa-miR-199b-3p/hsa-miR-193b*、hsa-miR-103/hsa-miR-138、hsa-miR-103/hsa-miR-198、hsa-miR-199b-3p/hsa-miR-139-3p、hsa-miR-21/hsa-miR-139-3p和hsa-miR-21/hsa-miR-193b*的任意一种或多种核酸分子的组合。 

在第二方面，本发明涉及用于将肝细胞癌与健康个体、结直肠癌和肺癌的区别开的诊断试剂盒。所述试剂盒包含多种核酸分子，每种核酸分子编码微RNA序列，其中所述多种核酸分子的一或多种在目标血浆中和在一 或多种健康个体、结直肠癌和肺癌中差异表达，而其中所述一或多种差异表达的核酸分子一起代表核酸表达特征，所述核酸表达特征指示肝细胞癌的存在。 

本文限定的核酸表达特征可包括至少十六种核酸分子，优选至少六种核酸分子。 

在优选的实施方案中，所述核酸表达特征包括至少一种编码微RNA序列的核酸分子，其表达在一或多种目标血浆中与一或多种健康个体、结直肠癌和肺癌相比被上调；以及包括至少一种编码微RNA序列的核酸分子，其表达在一或多种目标血浆中与一或多种健康个体、结直肠癌和肺癌相比被下调。 

在优选实施方案中，核酸表达特征包含编码：肿瘤相关特征hsa-miR-122、hsa-miR-192、hsa-miR-215、hsa-let-7c、hsa-miR-103、hsa-miR-139-3p、hsa-miR-26b;血浆特异性特征hsa-miR-936、hsa-miR-193b*、hsa-miR-124、hsa-miR-34a、hsa-miR-198、hsa-let-7g、hsa-miR-363和内部稳定对照:has-miR-1228和hsa-miR-1238的任意一种或多种核酸分子。 

特别优选地，与健康个体、结直肠癌和肺癌相比，一或多种目标血浆中编码hsa-miR-122、hsa-miR-192、hsa-miR-215、hsa-let-7c、hsa-miR-103、hsa-miR-26b、hsa-miR-34a、hsa-let-7g、hsa-miR-363的任意一种或多种核酸分子表达被上调，而编码hsa-miR-936、hsa-miR-193b*、hsa-miR-124、hsa-miR-139-3p、hsa-miR-198的任意一种或多种核酸分子表达被下调；hsa-miR-1238和hsa-miR-1228没有变化。 

在更优选的实施方案中，核酸表达特征包括编码肿瘤相关特征hsa-miR-122、hsa-miR-192、hsa-miR-215和血浆特异性特征hsa-miR-936、hsa-miR-193b*和hsa-miR-124的任意一种或多种核酸分子。 

特别优选地，与健康个体、结直肠癌和肺癌相比，一种或多种目标血浆中编码hsa-miR-122、hsa-miR-192和hsa-miR-215的任意一种或多种核酸分子表达被上调；而编码hsa-miR-936、hsa-miR-193b*和hsa-miR-124的任意一种或多种核酸分子表达被下调。 

在特别优选的方案中，核酸表达特征包括编码hsa-miR-122/hsa-miR-936,hsa-miR-34a/hsa-miR-193b*,hsa-miR-34a/hsa-miR- 198,hsa-miR-192/hsa-miR-936,hsa-miR-122/hsa-miR-193b*,hsa-miR-122/hsa-miR-198,hsa-miR-192/hsa-miR-124,hsa-miR-192/hsa-miR-193b*,hsa-miR-122/hsa-miR-124,hsa-miR-192/hsa-miR-198,hsa-miR-363/hsa-miR-936,hsa-miR-215/hsa-miR-193b*,hsa-miR-103/hsa-miR-936,hsa-miR-122/hsa-miR-139-3phsa-let-7c/hsa-miR-936,hsa-miR-215/hsa-miR-198,hsa-miR-192/hsa-miR-139-3p,hsa-miR-27b/hsa-miR-198,hsa-miR-26b/hsa-miR-936,hsa-let-7g/hsa-miR-936,hsa-miR-103/hsa-miR-198,hsa-let-7c/hsa-miR-193b*,hsa-miR-103/hsa-miR-193b*,hsa-miR-26b/hsa-miR-139-3p,hsa-let-7c/hsa-miR-198,hsa-miR-27b/hsa-miR-193b*,hsa-let-7g/hsa-miR-193b*,hsa-miR-363/hsa-miR-139-3p,hsa-let-7g/hsa-miR-198,hsa-miR-363/hsa-miR-198,hsa-miR-26b/hsa-miR-198,hsa-miR-103/hsa-miR-139-3p,hsa-miR-301a/hsa-miR-198,hsa-miR-26b/hsa-miR-193b*,hsa-let-7g/hsa-miR-139-3p,hsa-miR-363/hsa-miR-124,hsa-let-7c/hsa-miR-139-3p,hsa-miR-301a/hsa-miR-193b*,hsa-miR-301a/hsa-miR-139-3p,hsa-miR-26b/hsa-miR-124,hsa-let-7d/hsa-miR-198,hsa-let-7d/hsa-miR-139-3p,hsa-miR-103/hsa-miR-124,hsa-miR-363/hsa-miR-193b*和hsa-let-7d/hsa-miR-193b*的任意一种或多种核酸组合。 

第三方面，本发明涉及用于鉴别一或多种展现出肝细胞癌的血浆的方法，所述方法包括：(a)在所述一或多种目标血浆中确定多种核酸分子的表达水平，每种核酸分子编码微RNA序列；(b)在一或多种健康对照血浆中确定所述多种核酸分子的表达水平；(c)通过对比在步骤(a)和(b)中获得的各自的表达水平，从所述多种核酸分子中鉴别出在所述目标血浆和对照血浆中差异表达的一或多种核酸分子，其中所述差异表达的一或多种核酸分子一起代表本文所定义的特征(signature)，其指示肝细胞癌的存在。 

在本发明的优选实施方案中，所述方法包括(a)在一或多种目标血浆中确定核酸分子组合的表达水平，每种核酸分子均编码微RNA序列，并用特定的公式计算；(b)在一或多种健康对照血浆中确定所述核酸分子组合的表达水平，并用特定的公式计算；以及(c)通过比较在(a)和(b)步骤中所获得的各自的表达水平来鉴别所述组合在所述一或多种目标血浆中的差异,其中一或多种差异表达的组合一切代表特征，其指示肝细胞癌的存在。 

在更优选的实施方案中，本方法进一步用于将肝细胞癌与健康个体、结直肠癌和肺癌区别开。 

第四方面，本发明涉及用于监测肝细胞癌治疗的方法，所述方法包括：(a)通过使用本文所定义的方法在一或多种目标血浆中鉴别核酸表达特征；和(b)在血液中监测所述核酸表达特征所包含的编码微RNA序列的一或多种核酸分子的表达，所述监测以如下的方式进行，即其血浆中的表达在治疗前被上调的核酸分子的表达在治疗后被下调，而其血浆中的表达在治疗前被下调的核酸分子的表达在治疗后被上调。 

第五方面，本发明涉及用于预防或治疗肝细胞癌的方法，所述方法包括：(a)用本文限定的方法在血浆中鉴别核酸表达特征；和(b)在血液中改变所述核酸表达特征所包含的编码微RNA序列的一或多种核酸分子的表达，所述改变以如下的方式进行，即其表达在血液中被上调的核酸分子的表达被下调，而其表达在血液中被下调的核酸分子的表达被上调。 

第六方面，本发明涉及用于预防和/或治疗血液中的肝细胞癌的药物组合物，所述组合物包含一或多种核酸分子，每种核酸分子均编码序列，所述序列与如本文所定义的在来自肝细胞癌患者的血浆中其表达被上调的核酸分子所编码的微RNA序列至少部分互补，和/或所述序列对应于如本文所定义的在来自肝细胞癌患者的血浆中其表达被下调的核酸分子所编码的微RNA序列。 

最后，第七方面，本发明涉及所述药物组合物在制备用于预防和/或治疗肝细胞癌的药物中的用途。 

本发明的其它实施方案从以下详细描述中将变得明了。 

附图简述 

图1：示出流程图，其系统地阐明了参照本发明的方法来确定表达特征的基本方法步骤，用于鉴别一或多种展现出肝细胞癌的目标血浆。 

图2：示出包含在本发明的特别优选的表达特征中的人类miRNA，所述表达特征分别用于鉴别展现肝细胞癌的一或多种目标血浆。图中还示出与健康对照相比，在肝细胞癌血浆中这些miRNA的表达水平和准确性(即上调或下调)。在前五个六种不同miRNA的组合来作为诊断性生物标记鉴别肝细胞癌和健康对照中的准确性在87%-94% 

图3：示一例肝细胞癌和健康对照血浆中的两个肿瘤相关miRNA(hsa-miR-122和has-miR-139-3p)的ROC曲线分析(0：健康对照组；1：肝 细胞癌组)。结果显示这些miRNA作为诊断性生物标记的敏感性和特异性。这些经过微阵列(生物芯片)分析获得的数据经过内部稳定对照miR-1238规范化。 

图4：示出在另一方面包含在本发明的特别优选的表达特征中的人类miRNA，参照本发明的远期应用鉴别肝细胞癌和健康个体、结直肠癌和肺癌。还显示与健康个体、结直肠癌和肺癌相比肝细胞癌患者中的miRNA的表达水平和准确性(即上调或下调)。在前五个miRNA的组合来作为诊断性生物标记鉴别肝细胞癌的准确性在85%-88% 

图5：示由五种不同的miRNA组成的四中组合的比较平台。由微阵列获得的数据变化与由实时定量PCR(quantitative RT-PCR)获得的数据之间数量上的相关性(R)为0.76。这些结果显示，由Agilent miRNA微阵列(Agilent miRNA microarray)获得的miRNA特征是高度可信的。 

发明详述

本发明基于如下出乎意料的发现，即肝细胞癌(HCC)能可靠地通过血浆中特定miRNA表达特征以高准确性和灵敏性来鉴定，其中所述表达特征如本文定义典型地包括被上调和下调的人类miRNA。更特别地，所述miRNA表达特征—通过分析血浆中整体miRNA表达模式和/或各个miRNA表达水平—使得能检测早期疾病状态下的HCC以及鉴别健康个体、结直肠癌和肺癌。 

以下例证的本发明可以合适地在不存在未在本文中具体揭示的任何一或多个元件、一或多种限制的条件下实施。 

本发明将根据特定的实施方案并参照附图加以描述，但是本发明不受其限制，仅受权利要求书限制。所描述的附图仅是示意性的，被认为是非限制性的。 

当术语“包含”被用于本发明说明书和权利要求书中时，其不排除其它元件或步骤。为本发明目的，术语“由…组成”被认为是术语“包含”的优选实施方案。如果在下文中组被限定为包含至少一定数目的实施方案，这也被理解为揭示了优选地仅由这些实施方案组成的组。 

当指代单数形式名词使用不定冠词或定冠词例如“一个”或“一种”，“所述”时，包括该名词的复数形式，除非特别指出。 

术语“大约”在本发明中是指本领域技术人员理解仍能保证目的特征的技术效果的准确性区间。该术语通常表示偏离指示值的±10%，优选±5%。 

另外，术语第一、第二、第三、(a)、(b)、(c)等在说明书和权利要求书中用于区分类似的元件，不是描述顺序或时间次序必须的。应理解如此应用的术语在合适情况下可互换，并且本发明描述的实施方案能以不同于本文所述或例证的其它顺序操作。 

术语的进一步定义在以下使用术语时给出。 

以下术语或定义仅为了理解本发明而提供。这些定义不应被认为具有小于本领域技术人员理解的范围。 

本发明的一个目的是提供用于诊断肝细胞癌、监测癌治疗、和/或治疗癌的新方法，其中通过测定血中的多种核酸分子，每种核酸分子均编码微RNA (miRNA)序列，其中所述多种核酸分子的一或多种在肝细胞癌的血浆中经分析与健康对照相比和/或与健康个体、结直肠癌和肺癌相比差异表达，其中所述一或多种差异表达的核酸分子一起代表核酸表达特征，该核酸表达特征指示肝细胞癌的存在，其中所述核酸表达特征包括肿瘤相关特征和血浆特异性特征。 

本文所用术语“癌症”(也称为“癌(carcinoma)”)通常指任何类型的恶性赘生物，即与未受影响的(健康)野生型对照细胞相比显示或具有发生癌特征倾向的靶细胞的任何形态学和/或生理学改变(基于遗传重编程(genetic re-programming))。这种改变的例子可涉及细胞大小和形状(变大或变小)、细胞增殖(细胞数增加)、细胞分化(生理学状态变化)、凋亡(程序性细胞死亡)或细胞存活。 

本文所用术语“肝细胞”涉及肝脏。因此，术语“肝细胞癌”是指在肝细胞的癌性生长。 

最常见类型的肝细胞癌是肝细胞癌(也称作肝癌，通常缩写为HCC)。本文所用术语“肝细胞癌”是指原发的肝脏恶性肿瘤。大多数HCC继发于病毒性肝炎感染(乙型肝炎或丙型肝炎)或者肝硬化(酒精中毒是导致肝硬化的最常见因素)。在肝炎不是地方病的国家中，大多数肝脏恶性癌症不是原发HCC，而是从机体其它部位例如结肠的癌症转移(传播)。HCC的治疗选择和预后依赖于许多因素，但是特别依赖于肿瘤大小和分期。肿瘤等级 (tumor grade)也是重要的。高等级(high-grade)肿瘤预后不佳，而低等级(low-grade)肿瘤也许可被忽视很多年。通常结果不佳是因为仅10%-20%的肝细胞癌通过手术可完全切除。如果癌症不能被完全切除，则该疾病通常在3-6个月内是致命的。 

肝细胞癌与任何其它癌症一样，当存在引起细胞高速复制和/或导致细胞避免凋亡的分子机制突变时而发生。特别地，乙型肝炎和/或丙型肝炎的慢性病毒感染通过重复导致机体自身免疫系统攻击肝细胞(其中一些被病毒感染，其它的仅是旁观者)而可助于肝细胞癌的发生。虽然这种损伤之后修复的恒定循环可导致修复期间的错误，随之导致癌发生，但是目前这种假说更适用于丙型肝炎。然而，在乙型肝炎中，病毒基因组整合进感染的细胞中是恶性肿瘤中最一致相关的因素。另外，重复大量饮酒可具有相似作用。 

因此，在本发明范围中，乙型肝炎和/或丙型肝炎感染或者肝硬化不仅被认为是肿瘤病因学的危险因素，而且还是肿瘤发展的早期/中间期(即“癌前状态”)，其与导致(通常为良性)非侵袭性赘生物的过度增殖性组织生长(随之可发展为恶性肿瘤如HCC)相关。 

这种恶性肿瘤侵袭其它组织并在时间足够时经常发生转移。恶性细胞通常特征在于进展性(progressive)和不受控制的生长。肉眼观察HCC看起来是结节性或侵润性肿瘤。结节型肿瘤可以是单发性(具有大团)或多发性(当发展为硬化并发症时)。肿瘤结节为圆形至椭圆形，边界清楚但无包膜。弥漫型边界不清，且侵润门静脉，很少侵润肝静脉。 

本发明中采用的哺乳动物目标血浆可以是人或非人类来源的。然而，本发明典型地用人类血浆进行。本文所用术语“一或多种血浆”应被理解为不仅包括个体血浆。本文所用术语“目标血浆”是指被至少认定是显示或具有发生肝细胞癌倾向的血浆，而术语“对照血浆”典型地是指不具有这种癌表型特征的(健康)型。但是在一些应用中，例如当比较显示不同癌或癌前状态的血浆时，具有不太严重的疾病特征的细胞典型地被认为是“对照血浆”。 

本文所用术语“血浆”是血液中的黄色液体组分，全血中的血细胞在其中可以正常悬浮。其体积约占全血体积的55%。血浆中大部分成分是水(体积占90%)，包含可溶性蛋白、葡萄糖、凝血因子、矿物质离子、激素和 二氧化碳(血浆是排泄物运输的主要介质)。血浆准备是通过将新鲜血液在离心机里离心，直到血细胞沉到管底。然后将血浆倾出。血浆的密度大概在1025kg/m³,or 1.025kg/L。近期的研究发现miRNA在血浆中是稳定的。术语“血浆样本”是指从个体或健康对照获取的待检的血浆。 

本文所用术语“患者”，是指至少应该被认为是患有肝细胞癌的人；本文所用术语“目标血浆”是指从患者获取的血浆；术语“健康个体”或“健康对照”特指不具有任一癌症表现的健康个体。并且这里“对照血浆”是指从这些健康个体获取的血浆。但是，在一些应用里，例如，当比较不同的癌症类型时，这些个人有其他的癌症类型，这些从这些个体中获取的血浆也被特指为“对照”。 

典型地，所用的目标血浆和对照血浆衍生自从待被诊断是否存在肝细胞癌或发生肝细胞癌倾向的对象中收集的生物学样品。另外，为了确证获得的数据，“比较样品”也可以从患有给定已知疾病状态的对象中收集。生物学样品可包括机体组织和液体，如组织、血清、血细胞、痰和尿。另外，如果需要，细胞可以从获得的机体组织和液体中纯化，然后用作生物学样品。根据本发明，本发明的核酸标记的表达水平在对象衍生的生物学样品中确定 

在本发明的体外方法中用于检测的样品通常应以临床可接受的方式收集，优选以保护核酸(特别是RNA)或蛋白质的方式收集。待分析的样品典型地是血液。另外，肝组织及其它类型样品也可以使用。样品特别在最初加工之后可以合并。但是也可以使用未合并的样品。 

本文所用术语“微RNA”(或“miRNA”)是其在本领域的普通含义(Bartel,D.P.(2004)Cell 23,281-292；He,L.and Hannon,G.J.(2004)Nat.Rev.Genet.5,522-531)。因此，“微RNA”是指衍生自基因组基因座的RNA分子，其从可以形成局部RNA前体miRNA结构的转录物加工而来。成熟miRNA通常长度为20、21、22、23、24或25个核苷酸，其它数目的核苷酸也可存在，例如18、19、26或27个核苷酸。 

miRNA编码序列具有与侧翼基因组序列配对的潜力，使成熟miRNA放置在非完全配对的RNA双链体之内(本文也称作茎-环或发夹结构或pre-miRNA)，所述双链体作为从更长的前体转录物进行miRNA加工的中间体。这一加工典型地通过分别称为Drosha和Dicer的两种特异的内切核 酸酶的连续作用而发生。Drosha从初级转录物(本文也称作“pri-miRNA”)产生典型地折叠成发夹或茎-环结构的miRNA 前体(本文也称作“pre-miRNA”)。从这个miRNA前体，通过Dicer切割miRNA双链体，其在发夹或茎-环结构的一条臂包含成熟miRNA，在另一条臂包含类似大小的节段(通常称为miRNA*)。miRNA然后被导向其靶mRNA以发挥其功能，而miRNA*被降解。另外，miRNA典型地衍生自与预测的蛋白质编码区不同的基因组节段。 

本文所用术语“miRNA前体”(或“前体miRNA”或“pre-miRNA”)是指从其加工成熟miRNA的miRNA初级转录物的部分。典型地，pre-miRNA折叠成稳定的发夹(即双链体)或茎-环结构。发夹结构典型地长度为50-80个核苷酸，优选60-70个核苷酸(计数miRNA残基，与miRNA配对的残基，及任何间插节段，但排除更远端的序列)。 

本文所用术语“编码微RNA序列的核酸分子”是指编码微RNA(miRNA)的任何核酸分子。因此，该术语不仅指成熟miRNA，也指相应的如上所述的前体miRNA及初级miRNA转录物。另外，本发明不限于RNA分子，也包括相应的编码微RNA的DNA分子，例如通过逆转录miRNA序列产生的DNA分子。编码本发明的微RNA序列的核酸分子典型地编码单个miRNA序列(即个体miRNA)。但是，也可能这种核酸分子编码两个或多个miRNA序列(即两个或多个miRNA)，例如一个转录单位包含在常用调节序列如启动子或转录终止子控制下的两个或多个miRNA序列。 

本文所用术语“编码微RNA序列的核酸分子”也被理解为包括“有义核酸分子”(即核酸序列(5′→3′)匹配或相应于所编码的miRNA (5′→3′)序列的分子)及“反义核酸分子”(即核酸序列互补于所编码的miRNA (5′→3′)序列或者换句话说匹配所编码的miRNA序列的反向互补序列(3′→5′)的分子)。本文所用术语“互补”是指“反义”核酸分子序列与相应的“有义”核酸分子序列(具有互补于反义序列的序列)形成碱基对、优选Watson-Crick碱基对的能力。 

在本发明范围内，两个核酸分子(即“有义”和“反义”分子)可以完全互补，即它们不含有任何碱基错配和/或额外的或缺失的核苷酸。或者，两个分子包含一或多个碱基错配或者在它们的核苷酸总数上不同(由于添加或缺失导致)。优选地，“互补”核酸分子包含与包含在相应的“有义”核 酸分子中的序列显示完全互补性的至少10个连续核苷酸。 

因此，包含在本发明的诊断试剂盒中的编码miRNA序列的多种核酸分子可包括一或多种“有义核酸分子”和/或一或多种“反义核酸分子”。有时，诊断试剂盒包括一或多种“有义核酸分子”(即miRNA序列本身)，所述分子被认为组成了差异表达的miRNA(即分子标记)的全体或至少亚集合，所述差异表达的miRNA是存在或发生特定病症倾向的指征，本文是肝细胞癌。另一方面，当诊断试剂盒包括一或多种“反义核酸分子”(即与miRNA序列互补的序列)时，所述分子可包含适合用于检测和/或定量给定样品中的一或多种特定(互补)miRNA序列的探针分子(用于进行杂交测定)和/或寡核苷酸引物(例如用于逆转录或PCR应用)。 

在本发明中定义的多种核酸分子可以包含至少2种、至少10种、至少50种、至少100种、至少200种、至少500种、至少1000种、至少10000种或至少100000种核酸分子，每种分子编码miRNA序列。 

本文所用术语“差异表达”是指特定miRNA在目标血浆中的表达水平相比于健康对照血浆是改变的，其可以是上调(即在目标血浆中miRNA浓度增加)或下调(即在目标血浆中miRNA浓度降低或消失)。换句话说，核酸分子在目标血浆中被激活至比在对照血浆中更高或更低的水平。 

本发明范围内，核酸分子被认为是差异表达的，如果该核酸分子在靶细胞和对照细胞中的相应表达水平典型地相差至少5%或至少10%，优选地至少20%或至少25%，最优选地至少30%或至少50%。因此，后者的值相应于给定核酸分子在靶细胞中的表达水平相比于野生型对照细胞分别上调至少1.3倍或至少1.5倍，或者反之在靶细胞中的表达水平下调至少0.7倍或至少0.5倍。 

本文所用术语“表达水平”是指特定的miRNA序列从其基因组基因座被转录的程度，即miRNA在一或多种被分析血浆中的浓度。 

如上所述，术语“对照血浆”典型地是指不具有HCC表型特征的(健康)血浆。但是，在一些应用中，例如当比较显示不同的癌或癌前状态的血浆时，具有较不严重疾病特征的血浆典型地被认为是“对照血浆”。 

表达水平的确定典型地遵循本领域熟知的已建立的标准程序(Sambrook,J.et al.(1989)Molecular Cloning:A Laborary Manual.2nd Ed.,Cold Spring Harbor Library Press,Cold Spring Harbor,NY；Ausubel,F.M.et al. (2001)Current Pro-cols in Molecular Biology.Wiley & Sons,Hoboken,NJ)。确定可以在RNA水平进行，例如使用miRNA特异性探针进行Northern印迹分析，或者在逆转录(及克隆)RNA群后例如通过定量PCR或实时PCR技术在DNA水平进行。本文所用术语“确定”包括分析编码上述微RNA序列的任何核酸分子。但是，由于pri-miRNA及re-mRNA半衰期短，典型地仅测量成熟miRNA的浓度。 

在具体的实施方案中，在给定样品的若干独立测量(例如两个、三个、五个或十个测量)和/或在一群目标血浆或对照血浆内的若干测量中获得的表达水平的标准值被用于分析。标准值可以用本领域已知的任何方法获得。例如，平均值±2SD(标准差)或平均值±3SD的范围可被用作标准值。 

所获得的疾病和对照血浆的表达水平之间的差异可以归一化至进一步的对照核酸例如管家基因的表达水平，管家基因的表达水平已知不根据细胞的疾病状态而不同。举例的管家基因包括β-肌动蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶和核糖体蛋白P1等。在优选的实施方案中，对照核酸是已知在样品中的不同非癌和癌(前)状态中稳定表达的另一种miRNA。 

但是，代替在任何实验中确定一或多种对照血浆的表达水平，也可以基于实验证据和/或现有技术数据定义针对特定疾病表型(即疾病状态)的一或多个截断值。在这种情况中，一或多种目标血浆的相应表达水平可以用用于归一化的稳定表达的对照miRNA确定。如果计算的“归一化”的表达水平高于相应定义的截断值，则这一发现是基因表达上调的指征。反之，如果计算的“归一化”的表达水平低于相应定义的截断值，则这一发现是基因表达下调的指征。 

在本发明中，术语“鉴定肝细胞癌和/或鉴别其他癌症类型”也包括预测和可能性分析(“诊断”意义上)。本文公开的组合物和方法意在临床应用，以决定治疗形式，包括治疗性干预，诊断标准如疾病阶段，和疾病监测和疾病监视。根据本发明，可提供用于检查对象状态的中间结果。这种中间结果可与额外信息组合以帮助医生、护士或其它从业人员诊断出该对象患有该疾病。或者，本发明可用于通过血样标本检测癌症倾向的改变，并提供有用信息给医生以进行诊断。另外，本发明还用于区别不同类型的肝细胞肿瘤及其他癌症类型包括结直肠癌和肺癌。 

在本发明中，所鉴定的一或多种差异表达的核酸分子一起代表一种核 酸表达特征，该核酸表达特征是在目标血浆中存在肝细胞癌的指征。本文所用术语“表达特征”是指一组核酸分子(例如miRNA)，其中各个核酸分子的表达水平在(癌性)目标血浆和(非癌性)对照血浆之间不同。本文中，核酸表达特征也指一组标记并代表最低数目的(不同)核酸分子，每种核酸分子编码能鉴定目标血浆的表型状态的miRNA序列。 

在第一方面，本发明涉及用于鉴别一或多种展现出肝细胞癌的目标血浆的血液中分子标记物的诊断试剂盒，所述试剂盒包含多种核酸分子，每种核酸分子编码微RNA序列，其中所述多种核酸分子的一或多种在目标血浆中和在一或多种对照血浆中差异表达，其中所述一或多种差异表达的核酸分子源于肿瘤相关或血浆特异性特征，其中所述一或多种差异表达的核酸分子一起代表核酸表达特征，所述核酸表达特征指示肝细胞癌的存在。 

本文限定的核酸表达特征可包括至少三十二种核酸分子，优选至少十二种核酸分子，特别优选至少六种核酸分子。 

在优选的实施方案中，所述核酸表达特征包括至少一种编码微RNA序列的核酸分子，其表达在一或多种目标血浆中与一或多种对照血浆相比被上调；以及包括至少一种编码微RNA序列的核酸分子，其表达与一或多种对照相比被下调 

本文的术语“血浆特异性”(plasma-specific)是指在肝癌患者和正常对照的血浆有差异性表达的特征，但在肝细胞癌组织细胞和非癌组织细胞之间没有发现显著的差异表达。 

典型地，包含在核酸表达特征中的核酸分子是人类序列(以后称为“has”(智人(Homo sapiens)))。 

在本发明的优选实施方案中，核酸表达特征包括编码肿瘤相关的hsa-miR-122(SEQ ID NO:1),hsa-miR-199b-3p (SEQ ID NO:2),hsa-miR-192(SEQ ID NO:3),hsa-miR-21(SEQ ID NO:4),hsa-miR-139-3p (SEQ ID NO:5),hsa-miR-10a (SEQ ID NO:6),hsa-miR-103(SEQ ID NO:7),hsa-miR-181d(SEQ ID NO:8),hsa-miR-125b-2*(SEQ ID NO:9),hsa-miR-125a-3p (SEQ ID NO:10)的任意一种或多种核酸分子的表达；编码血浆特异性的hsa-miR-34a(SEQ ID NO:11),hsa-miR-136(SEQ ID NO:12),hsa-miR-151-5p (SEQ ID NO:13),hsa-miR-193b*(SEQ ID NO:14),hsa-miR-124(SEQ ID NO:15),hsa-miR-936(SEQ ID NO:16),hsa-miR-198(SEQ ID NO:17),hsa-miR-149* (SEQ ID NO:18),hsa-miR-138(SEQ ID NO:19),hsa-miR-601(SEQ ID NO:20),hsa-miR-769-3p (SEQ ID NO:21),hsa-miR-513c (SEQ ID NO:22),hsa-miR-525-5p (SEQ ID NO:23),hsa-miR-654-5p (SEQ ID NO:24),hsa-miR-518c*(SEQ ID NO:25),hsa-miR-500(SEQ ID NO:26),hsa-miR-181c*(SEQ ID NO:27),hsa-miR-1226*(SEQ ID NO:28),hsa-miR-202(SEQ ID NO:29),hsa-miR-629*(SEQ ID NO:30)任意一种或多种核酸分子的表达；编码稳定内部稳定对照的hsa-miR-1238(SEQ ID NO:36)和hsa-miR-1228(SEQ ID NO:37)的核酸分子。 

上述miRNA的核酸序列列于表1。 

表1

本文公开的所有miRNA序列均已经保存在miRBase数据库中(http://microrna.sanger.ac.uk/；也参见Griffiths-Jones S.et al.(2008)Nucl.Acids Res.36,D154-D158)。 

特别优选地，与在一或多种对照血浆中相比，在所述一或多种目标血浆中编码hsa-miR-122、hsa-miR-199b-3p、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-10a、hsa-miR-103、hsa-miR-34a、hsa-miR-136、hsa-miR-151-5p的任意一种或多种核酸分子的表达被上调，而编码hsa-miR-139-3p、hsa-miR-193b*、hsa-miR-124、hsa-miR-181d、hsa-miR-125b-2*、hsa-miR-125a-3p、hsa-miR-936、hsa-miR-198、hsa-miR-149*、hsa-miR-138、hsa-miR-601、hsa-miR-769-3p、hsa-miR-513c、hsa-miR-525-5p、hsa-miR-654-5p、hsa-miR-518c*、hsa-miR-500、hsa-miR-181c*、hsa-miR-1226*、hsa-miR-202、hsa-miR-629*的任意一种或多种核酸分子的表达被下调；hsa-miR-1238和hsa-miR-1228无变化。 

如本文所用，术语“所述多种核酸分子的一或多种”及“任意一种或多种人靶细胞衍生的核酸分子”可涉及所述多种核酸分子的任何亚群，例如任一种、任两种、任三种、任四种、任五种、任六种、任七种、任八种、任九种、任十种等核酸分子，每种核酸分子均编码包含于所述核酸表达特征内的微RNA序列。 

在特别优选的实施方案中，核算表达特征包括编码hsa-miR-34a/hsa-miR-193b*、hsa-miR-21/hsa-miR-936、hsa-miR-192/hsa-miR-124、hsa-miR-122/hsa-miR-193b*、hsa-miR-34a/hsa-miR-138、hsa-miR-34a/hsa-miR-198、hsa-miR-122/hsa-miR-124、hsa-miR-103/hsa-miR-139-3p、hsa-miR-192/hsa-miR-193b*、hsa-miR-122/hsa-miR-138、hsa-miR-34a/hsa-miR-139-3p、hsa-miR-122/hsa-miR-198、hsa-miR-122/hsa-miR-769-3p、hsa-miR-103/hsa-miR-193b*、 hsa-miR-34a/hsa-miR-124、hsa-miR-192/hsa-miR-139-3p、hsa-miR-34a/hsa-miR-769-3p、hsa-miR-192/hsa-miR-936、hsa-miR-10a/hsa-miR-193b*、hsa-miR-122/hsa-miR-601、hsa-miR-21/hsa-miR-769-3p、hsa-miR-199b-3p/hsa-miR-193b*、hsa-miR-103/hsa-miR-138、hsa-miR-103/hsa-miR-198、hsa-miR-199b-3p/hsa-miR-139-3p、hsa-miR-21/hsa-miR-139-3p和hsa-miR-21/hsa-miR-193b*的任意一种或多种核酸分子表达的组合。 

本文中使用的术语“核酸组合”是指把两种以上核酸表达水平作为一个整体使用。特别是使用相关性变化或用同一个整体模式计算结果。 

在第二方面，本发明涉及用于将肝细胞癌与健康个体、结直肠癌和肺癌的区别开的诊断试剂盒。所述试剂盒包含多种核酸分子，每种核酸分子编码微RNA序列，其中所述多种核酸分子的一或多种在目标血浆中和在一或多种健康个体、结直肠癌和肺癌中差异表达，而其中所述一或多种差异表达的核酸分子一起代表核酸表达特征，所述核酸表达特征指示肝细胞癌的存在。 

本文限定的核酸表达特征可包括至少十六种核酸分子，优选至少六种核酸分子。 

在优选的实施方案中，所述核酸表达特征包括至少一种编码微RNA序列的核酸分子，其表达在一或多种目标血浆中与一或多种健康个体、结直肠癌和肺癌相比被上调；以及包括至少一种编码微RNA序列的核酸分子，其表达在一或多种目标血浆中与一或多种健康个体、结直肠癌和肺癌相比被下调。 

在优选实施方案中，核酸表达特征包括编码：肿瘤相关特征hsa-miR-122(SEQ ID NO:1)、hsa-miR-192(SEQ ID NO:4)、hsa-miR-215(SEQ ID NO:31)、hsa-let-7c(SEQ ID NO:32)、hsa-miR-103(SEQ ID NO:5)、hsa-miR-139-3p (SEQ IDNO:7)、hsa-miR-26b (SEQ ID NO:33);血浆特异性特征hsa-miR-936(SEQID NO:16)、hsa-miR-193b*(SEQ ID NO:14)、hsa-miR-124(SEQ ID NO:15)、hsa-miR-34a (SEQ ID NO:11)、hsa-miR-198(SEQ ID NO:18)、hsa-let-7g (SEQ ID NO:34),hsa-30miR-363(SEQ ID NO:35)和内部稳定对照has-miR-1228(SEQ ID NO:36)和hsa-miR-1238(SEQ ID NO:37)的任意一种或多种核酸分子。 

上述miRNA的核酸序列列于表2。 

表2

本文公开的所有miRNA序列均已经保存在miRBase数据库中(http://microrna.sanger.ac.uk/；也参见Griffiths-Jones S.et al.(2008)Nucl.Acids Res.36,D154-D158)。 

特别优选地，与在一或多种健康个体、结直肠癌和肺癌相比，在所述一或多种目标血浆中编码hsa-miR-122、hsa-miR-192、hsa-miR-215、hsa-let-7c、hsa-miR-103、hsa-miR-26b、hsa-miR-34a、hsa-let-7g、hsa-miR-363的任意一种或多种核酸分子表达被上调；而编码hsa-miR-936、hsa-miR-193b*、hsa-miR-124、hsa-miR-139-3p和hsa-miR-198的任意一种或多种核酸分子表达被下调；hsa-miR-1238和hsa-miR-1228没有改变。 

在特别优选的实施方案中，核酸表达特征包括编码hsa-miR-122/hsa-miR-936,hsa-miR-34a/hsa-miR-193b*,hsa-miR-34a/hsa-miR-198,hsa-miR-192/hsa-miR-936,hsa-miR-122/hsa-miR-193b*,hsa-miR-122/hsa-miR-198,hsa-miR-192/hsa-miR-124,hsa-miR-192/hsa-miR-193b*,hsa-miR-122/hsa-miR-124,hsa-miR-192/hsa-miR-198,hsa-miR-363/hsa-miR-936,hsa-miR-215/hsa-miR-193b*,hsa-miR-103/hsa-miR-936,hsa-miR-122/hsa-miR-139-3p,hsa- let-7c/hsa-miR-936,hsa-miR-215/hsa-miR-198,hsa-miR-192/hsa-miR-139-3p,hsa-miR-27b/hsa-miR-198,hsa-miR-26b/hsa-miR-936,hsa-let-7g/hsa-miR-936,hsa-miR-103/hsa-miR-198,hsa-let-7c/hsa-miR-193b*,hsa-miR-103/hsa-miR-193b*,hsa-miR-26b/hsa-miR-139-3p,hsa-let-7c/hsa-miR-198,hsa-miR-27b/hsa-miR-193b*,hsa-let-7g/hsa-miR-193b*,hsa-miR-363/hsa-miR-139-3p,hsa-let-7g/hsa-miR-198,hsa-miR-363/hsa-miR-198,hsa-miR-26b/hsa-miR-198,hsa-miR-103/hsa-miR-139-3p,hsa-miR-301a/hsa-miR-198,hsa-miR-26b/hsa-miR-193b*,hsa-let-7g/hsa-miR-139-3p,hsa-miR-363/hsa-miR-124,hsa-let-7c/hsa-miR-139-3p,hsa-miR-301a/hsa-miR-193b*,hsa-miR-301a/hsa-miR-139-3p,hsa-miR-26b/hsa-miR-124,hsa-let-7d/hsa-miR-198,hsa-let-7d/hsa-miR-139-3,hsa-miR-103/hsa-miR-124,hsa-miR-363/hsa-miR-193b*和hsa-let-7d/hsa-miR-193b*的任意一种或多种核酸组合。 

第三方面，本发明涉及用于鉴别一或多种展现出肝细胞癌的血浆的方法，所述方法包括：(a)在所述一或多种目标血浆中确定多种核酸分子的表达水平，每种核酸分子编码微RNA序列；(b)在一或多种健康对照血浆中确定所述多种核酸分子的表达水平；(c)通过对比在步骤(a)和(b)中获得的各自的表达水平，从所述多种核酸分子中鉴别出在所述目标血浆和对照血浆中差异表达的一或多种核酸分子，其中所述差异表达的一或多种核酸分子一起代表本文所定义的特征(signature)，其指示肝细胞癌的存在。 

在本发明的优选实施方案中，所述方法包括(a)在一或多种目标血浆中确定核酸分子组合的表达水平，每种核酸分子均编码微RNA序列，并用特定的公式计算；(b)在一或多种健康对照血浆中确定所述核酸分子组合的表达水平，并用特定的公式计算；以及(c)通过比较在(a)和(b)步骤中所获得的各自的表达水平来鉴别所述组合在所述一或多种目标血浆中的差异,其中一或多种差异表达的组合一切代表特征，其指示肝细胞癌的存在。 

在更优选的实施方案中，本方法进一步用于将肝细胞癌与健康个体、结直肠癌和肺癌区别开。 

第四方面，本发明涉及用于监测肝细胞癌治疗的方法，所述方法包括：(a)通过使用本文所定义的方法在一或多种目标血浆中鉴别核酸表达特征；和(b)在血液中监测所述核酸表达特征所包含的编码微RNA序列的一或多种核酸分子的表达，所述监测以如下的方式进行，即其血浆中的表达在治 疗前被上调的核酸分子的表达在治疗后被下调，而其血浆中的表达在治疗前被下调的核酸分子的表达在治疗后被上调。 

如本文所用，术语“改变编码miRNA序列的核酸分子的表达”是指对特定核酸分子的任何操纵以导致所述分子的表达水平改变，即与“野生型”(即未改变的对照)的表达相比产生不同量的相应miRNA。如本文所用，术语“不同量”既包括与未改变的对照相比较高的量，也包括较低的量。换句话说，如本文所定义的操纵可以是上调(即激活)或下调(即抑制)核酸分子的表达(即特别是转录)。 

第五方面，本发明涉及用于预防或治疗肝细胞癌的方法，所述方法包括：(a)用本文限定的方法在血浆中鉴别核酸表达特征；和(b)在血液中改变所述核酸表达特征所包含的编码微RNA序列的一或多种核酸分子的表达，所述改变以如下的方式进行，即其表达在血液中被上调的核酸分子的表达被下调，而其表达在血液中被下调的核酸分子的表达被上调。 

在本发明中，核酸表达特征中所包含的编码微RNA序列的一或多种核酸分子的表达以这样的方式被修饰，由此其表达在所述一或多种目标血浆中被上调的核酸分子的表达被下调且其表达在所述一或多种目标血浆中被下调的核酸分子的表达被上调。换句话说，编码miRNA序列的特定核酸分子的表达的修饰以与所述分子在所述一或多种癌目标血浆中的调节作用的反方式(anti-cyclical)的发生，以在所述一或多种目标血浆中干扰被上调的分子的“过度活性”和/或恢复被下调的分子的“缺陷活性”。 

在本发明方法的一个优选实施方案中，下调核酸分子的表达包括将编码与被下调的核酸分子编码的微RNA序列互补的序列的核酸分子导入病人体内。 

如本文所用术语“导入血液中”是指使得一或多种核酸分子转移进入血液中的任何操纵。这种技术的例子包括本领域熟知的注射、消化和其他技术。 

如本文所用术语“互补序列”是指导入一或多种细胞中的“互补”核酸分子(本文也称作“反义核酸分子”)能与上调的内源“有义”核酸分子形成碱基对，优选Watson-Crick碱基对。 

两种核酸分子(即“有义”和“反义”分子)可以是完全互补的，即其不含有任何碱基错配和/或添加或缺失核苷酸。在其它实施方案中，这两种分 子包含一或多个碱基错配或者其核苷酸总数不同(由于添加或缺失所致)。在另外的实施方案中，“互补”核酸分子包含一段与上调的“有义”核酸分子中包含的序列完全互补的至少十个连续核苷酸。 

“互补”核酸分子(即编码与下调的核酸分子编码的微RNA序列互补的核酸序列的核酸分子)可以是天然发生的DNA-或RNA分子或者在其序列中包含一或多个相同类型或一或多种不同类型的修饰核苷酸的合成的核酸分子。 

例如，可能这种核酸分子包含至少一个核糖核苷酸主链单位及至少一个脱氧核糖核苷酸主链单位。此外，所述核酸分子可含有一或多个RNA主链修饰为2′-O-甲基基团或者2′-O-甲氧基基团(也称作2′-O-甲基化)，其防止在培养基中核酸酶降解，并且重要地是也防止RNA诱导性沉默复合物核酸酶的内核分离，导致miRNA的不可逆抑制。另一可能的修饰(其功能等价于2′-O-甲基化)包含锁定核酸(LNA)，代表含有一或多个LNA核苷酸单体的核酸类似物，所述单体在RNA模拟糖构象中具有锁定双环呋喃糖单位(Orom,U.A.et al.(2006)Gene 372,137-141)。 

最近开发了另一类的miRNA表达沉默基因。这些称作“antagomirs”的化学工程化寡核苷酸是与胆固醇缀合的单链23个核苷酸的RNA分子(Krutzfeldt,J.et al.(2005)Nature 438,685–689)。作为这种化学修饰寡核苷酸的另一选择，产生了作为RNA从转基因中产生的可以在细胞中表达的微RNA抑制剂。称作“微RNA海绵(microRNA sponges)”的这些竞争性抑制剂是从强启动子表达的转录物，含有感兴趣的微RNA的多个串联结合位点(Ebert,M.S.et al.(2007)Nat.Methods 4,721-726)。 

在本发明方法的特别优选的实施方案中，其表达相对于表达特征而被下调的一或多种核酸分子编码选自如下一组的微RNA序列：hsa-miR-139-3p、hsa-miR-181d,hsa-miR-125b-2*、hsa-miR-125a-3p、hsa-miR-193b*、hsa-miR-124、hsa-miR-936、hsa-miR-138,hsa-miR-198、hsa-miR-769-3p、hsa-miR-149*、hsa-miR-654-5p、hsa-miR-525-5p、hsa-miR-629*、hsa-miR-181c*、hsa-miR-202、hsa-miR-513c、hsa-miR-500、hsa-miR-518c*、hsa-miR-601和hsa-miR-1226*，如上所述可能是肝细胞癌的指征。 

在本发明方法的另一优选的实施方案中，上调核酸分子表达包括将编 码被上调的核酸分子编码的微RNA序列的核酸分子导入血液中。换句话说，编码miRNA序列的核酸分子的表达的上调通过将所述miRNA序列的另一拷贝(即另外的“有义”核酸分子)导入所述一或多种细胞中而实现。导入一或多种靶细胞中的所述“有义”核酸分子可包含与上述“反义”核酸分子相同的修饰。 

在本发明方法的特别优选的实施方案中，其表达相对于表达特征而被上调的一或多种核酸分子编码选自如下一组的微RNA序列：hsa-miR-122、hsa-miR-199b-3p、hsa-miR-192、hsa-miR-21、hsa-miR-10a、hsa-miR-103、hsa-miR-34a、hsa-miR-136、hsa-miR-151-5p、hsa-miR-215、hsa-let-7c、hsa-miR-26b、hsa-let-7g和hsa-miR-363如上所述可能是肝细胞癌的指征。 

导入一或多种靶细胞中以修饰一或多种编码核酸表达特征中所包含的微RNA序列的核酸分子的表达的“有义”和/或“反义”核酸分子可以与调节序列可操纵地连接以使得所述核苷酸序列表达。 

为了阐明癌性或癌前样品中鉴别的miRNA的任何潜在关联，可以进行关于所述miRNA可以结合的mRNA靶序列的鉴别的预备功能分析。基于发现miRNA既可以参与肿瘤阻抑也可以参与肿瘤发生(Esquela-Kerscher,A.and Slack,F.J (2006)如前文;Calin,G.A.and Croce,C.M.(2007)如前文;Blenkiron,C.and Miska,E.A.(2007)如前文)，可以推测这种miRNA的mRNA靶位点包括肿瘤阻抑基因以及癌基因。 

如果核酸分子包含含有关于转录和/或翻译调节信息的序列元件，且这种序列“可操纵地连接”于编码多肽的核苷酸序列，则称该核酸分子为“能表达核酸分子”或者能“使得核苷酸序列表达”。可操纵地连接是其中所述调节序列元件与被表达的序列(和/或互相表达的序列)以能使得基因表达的方式进行连接的连接。 

为基因表达必需的调节区的确切性质在不同物种中可以不同，但是通常这些区域均包含启动子，在原核生物中其含有两个启动子，即指导转录起始的DNA元件以及当转录为RNA时发出翻译起始信号的DNA元件。这种启动子区域通常包括参与转录和翻译起始的5′非编码区，如在原核生物中的-35/-10盒和Shine-Dalgarno元件或者在真核细胞中的TATA盒、CAAT序列和5′-加帽元件。这些区域也可以包括增强子或阻抑子元件以及翻译信号和前导序列以将天然多肽靶向于宿主细胞的特定区室。另外，3′ 非编码序列可含有参与转录终止、聚腺苷酸化等的调节元件。然而，如果这些终止序列在特定的宿主细胞中的功能不令人满意，则可以用在该细胞中发挥功能的信号取代。 

此外，如本文定义的核酸分子的表达也可以通过例如存在修饰的核苷酸而影响(如上所述)。例如，锁定核酸(LNA)单体被认为通过增强对降解的抗性及通过稳定对于沉默活性关键的miRNA-靶双链体结构而增加体内miRNA的功能性半衰期(见例如Naguibneva,I.et al.(2006)Biomed.Pharmacother.60,633–638)。 

因此，被导入提供血液中的本发明的核酸分子可包括调节序列，优选启动子序列，任选还包括转录终止序列。所述启动子可以允许组成型或者可诱导的基因表达。合适启动子包括大肠杆菌(E.coli)lacUV5和tet (四环素应答)启动子、T7启动子以及SV40启动子或者CMV启动子。 

本发明的核酸分子也可以包含在载体或者其它克隆载体如质粒、噬菌粒、噬菌体、粘粒或人工染色体中。在优选的实施方案中，所述核酸分子包含在载体中，特别是包含在表达载体中。这种表达载体除了上述调节序列及编码如本发明定义的遗传构建体的核酸序列以外可包括衍生自与用于表达的宿主相容的物种的复制和控制序列以及赋予转染的细胞可选择表型的选择标记。本领域已知且可商购许多合适的载体如pSUPER和pSUPERIOR。 

第六方面，本发明涉及用于预防和/或治疗血液中的肝细胞癌的药物组合物，所述组合物包含一或多种核酸分子，每种核酸分子均编码序列，所述序列与如本文所定义的在来自肝细胞癌患者的血浆中其表达被上调的核酸分子所编码的微RNA序列至少部分互补，和/或所述序列对应于如本文所定义的在来自结直肠癌患者的血浆中其表达被下调的核酸分子所编码的微RNA序列。 

最后，第七方面，本发明涉及所述药物组合物在制备用于预防和/或治疗肝细胞癌的药物中的用途。 

在本发明范围内，合适的药物组合物包括适于口服、直肠、鼻、局部(包括经含服和舌下)、腹膜和胃肠外(包括肌内、皮下或静脉内)给予的那些组合物，或者通过吸入或吹入给予的那些组合物。可以局部或全身性给予。优选通过口服或静脉内途径给予。所述制剂可以包装为独立剂量单位。 

本发明的药物组合物包括本领域确定的任何药物剂量形式，例如胶囊、微囊、扁囊剂、丸剂、片剂、粉末、小丸剂(pellet)、多颗粒制剂(例如珠、颗粒或晶体)、气雾剂、喷雾剂、泡沫、溶液、分散剂、酊剂、糖浆、酏剂、悬浮液、油包水乳状液如软膏，及水包油乳状液如乳剂、洗剂和香脂。 

使用药理学可接受的成分以及已建立的制备方法可以将上述(“有义”和“反义”)核酸分子配制为药物组合物(Gennaro,A.L.and Gennaro,A.R.(2000)Reming-n:The Science and Practice of Pharmacy,20th Ed.,Lippincott Williams & Wilkins,Philadelphia,PA;Crowder,T.M.et al.(2003)A Guide -Pharmaceutical Particulate Science.Interpharm/CRC,Boca Ra-n,FL;Niazi,S.K.(2004)Handbook of Pharmaceutical Manufacturing Formulations,CRC Press,Boca Ra-n,FL)。 

为了制备药物组合物，可以使用药学惰性的无机或有机赋形剂(即载体)。为了制备例如丸剂、片剂、胶囊或颗粒，可以使用例如乳糖、滑石、硬脂酸及其盐、脂肪、蜡、固体或液体多元醇、天然油或硬化油。用于生产溶液、悬浮液、乳状液、气雾剂混合物或在使用之前重配为溶液或气雾剂混合物的粉末的合适赋形剂包括水、醇、甘油、多元醇及其合适的混合物以及植物油。 

所述药物组合物也可以含有添加剂，如充填剂、结合剂、增湿剂、助流剂、稳定剂、防腐剂、乳化剂，及另外的溶剂或者增溶剂或者实现储存效应的物质。后者可理解为可以将核酸分子掺入缓释或持续释放或靶向输送系统中如脂质体、纳米颗粒和微囊中。 

为了靶向体内的大多数组织，需要临床可行的无创策略以将如本文定义的这种药物组合物定向于细胞。在过去，一些方法通过将合理剂量的siRNA经静脉内注射入小鼠和灵长类动物体内已经获得重大的治疗益处，而无明显的限制毒性。 

一种方法包括将miRNA的过客链(miRNA*链)与胆固醇或其衍生物/缀合物共价偶联以促进通过遍在表达的细胞表面LDL受体的吸收(Soutschek,J.et al.(2004)Nature 432,173-178)。或者，未缀合的PBS-配制的锁定核酸修饰的寡核苷酸(LNA-antimiR)可以用于全身性输送(Elmen,J.et al.(2008)Nature 452,896-899)。另一种输送miRNA的方法包括使用聚乙二醇使miRNA包囊化成为特定的脂质体以降低清除细胞的吸收并增强循环时间。 这些特定的核酸颗粒(稳定的核酸-脂质颗粒或者SNALP)有效地将miRNA输送至肝脏(且不到达其它器官(如Zimmermann,T.S.et al.(2006)Nature 441,111-114所述))。近年来，描述了一类称作lipidoids的新型脂质样输送分子(基于烷基丙烯酸酯或者烷基-丙烯酰胺与伯胺或仲胺的缀合加成而合成)作为RNAi治疗剂的输送剂(Akinc,A.et al.(2008)Nat.Biotechnol.26,561-569)。 

进一步的细胞特异性靶向策略包括将miRNA与一种融合蛋白混合，该融合蛋白由与鱼精蛋白连接的靶向抗体片段组成，所述鱼精蛋白是使精子中的DNA成核并通过电荷结合miRNA的碱性蛋白(Song,E.et al.(2005)Nat.Biotechnol.23,709-717)。近来已经开发了对上述基本输送方法进行的多种修改和改变。这些技术为本领域所已知，并综述在例如de Fougerolles,A.et al.(2007)Nat.Rev.Drug Discov.6,443-453;Kim,D.H.and Rossi,J.J.(2007)Nat.Genet.8,173-184)中。 

本发明通过附图和如下实施例进一步描述，所述附图和实施例只是为了例证本发明的特异的实施方案的目的，不应理解为以任何方式限制本发明范围之意。 

实施例

实施例1：样品收集与制备

63例肝组织手术切除样本。外科手术样本液氮中收集速冻或收集后立即速冻在液氮中。样本储藏在-80℃。所选肿瘤样本的基本特征如表3中所示。 

表3肝组织标本的基本特征

组织标本 数目 正常肝组织 31 HCC组织 32 总数 63

患者资料(年龄、性别、影像资料、治疗及其他医学情况、家族史诸如此类的)从医院的资料库里获取来匹配所收集的不同样品。病理学追踪研究(例如通过苏木精和伊红(H&E)染色进行的组织学分析)用于明确确定给定样品的疾病状态(即对照、癌前期(例如肝硬化)、原发恶性肿瘤(例如肝细胞癌)或继发/转移恶性肿瘤(例如癌栓))以及保证样本 的一致分级。 

对每个癌样品任选进行激光捕获显微切割以特异性分离肿瘤细胞群(大约200000个细胞)。简而言之，将透明的转移膜应用于组织切片或样本的表面。在显微镜下，观察置于载玻片上的薄组织切片，并鉴别细胞群以进行分离。当选择的细胞位于观察视野的中心时，激活近红外激光二极管集成显微镜光学器件(near IR laser diode integral with the microscope optics)。脉冲激光束激活转移膜上的斑点(spot)，使该膜与下面的选择的细胞融合。然后将具有结合的细胞的转移膜从所述薄组织切片中剥离(Emmert-Buck,M.R.et al.(1996).Science 274,998-1001;Espina,V.et al.(2007)Expert Rev.Mol.Diagn.7,647-657)。基本如厂商指导制备冷冻切片并使用激光捕获显微镜(Arcturus Veritas^TM Laser Capture Microdissection Instrument(Molecular Devices,Inc.,Sunnyvale,CA,USA)进行捕获步骤。 

使用生产商(Ambion,Austin,TX).的mirVana miRNA抽提试剂盒(mirVana miRNA isolation kit)来获取总RNA。用NanoDrop 1000分光光度计(NanoDrop Technologies,Waltham,MA)测定总RNAA浓度。对RNA的质量监测则通过2100 Bioanalyzer使用RNA 6000 Pico LabChip试剂盒(Agilent Technologies,Santa Clara,CA)来实现。 

实施例2;组织样本中miRNA表达的分析

使用Agilent miRNA微阵列平台(Agilent Technologies,Santa Clara,CA,USA)根据厂商指导任选对特定样品中(差异)表达的miRNA进行定性分析。通过应用Quantile方法及使用本领域已知的R软件将针对单色(CY3)杂交获得的原始数据归一化。 

数据分析方面，通过单色(CY3)获得的原始数据应用这一领域知名的Quantile方法和GeneSpring GX10软件(Agilent Technologies,Santa Clara,CA,USA)归一化。Fisher检验(F-test)之后的非配对t-检验(p <0.01)，用来确定正常肝组织和HCC组织之间miRNA的差异性表达。 

63例组织样本都是独立的实验来检测，并且miRNA的表达水平决定于各自获得数据的平均值。 

实施例3：血浆样本的收集与制备

图1示在患者血液中确定有肝细胞癌的指征的关键步骤。 

我们在上海中山医院和华山医院收集2008-2009年癌症和健康个体的血样154例。本发明所用的血样的基本特征如图4所示。所有的患者的血样都是在手术前获取的。病人资料(年龄、性别、影像资料、治疗及其他医学情况、家族史诸如此类的)从医院的资料库里获取来。肿瘤的组织病理学分类参照世界卫生组织(WHO)肿瘤分类系统由三名病理医师分别独立完成。 

表4血液标本的基本特征

 基因组范围的miRNA分析 数目   对照    健康个体 23   结直肠癌 31   肺癌 36   肝细胞癌 24     定量RT-PCR 分析    健康个体 16   肝细胞癌 24   总数 154

采取外周血液(2ml)至含有EDTA含有的管子中，两小时内要离心820转，10分钟。然后将约1ml的血浆转移至1.5ml的离心管离心16000转10分钟以沉淀任何残存的细胞碎片。然后将上清液移至新的管子中-80℃保存。 

使用mirVana PARIS miRNA抽提试剂盒(mirVana PARIS miRNA isolation kit)参照生产厂家(Ambion,Austin,TX)的使用说明来获取总RNA。用NanoDrop 1000分光光度计(NanoDrop Technologies,Waltham,MA)测定总RNA浓度。对RNA的质量监测则通过2100 Bioanalyzer使用RNA 6000 Pico LabChip试剂盒(Agilent Technologies,Santa Clara,CA)来实现。 

实施例4：血浆中miRNA表达谱分析

使用Agilent miRNA微阵列平台(Agilent Technologies,Santa Clara,CA,USA)根据厂商指导任选对特定血液品中(差异)表达的miRNA进行定性分 析。该微阵列取自Sanger v.10.1数据库，包含723个人类miRNA探针。114个血液中每个样本抽提的总RNA(100ng)用Cy3标记后上样。并将过XDRScan (PMT100,PMT5)扫描得到信号。标记和杂交的方法均参照Agilent miRNA微阵列说明书。 

数据分析方面，通过单色(CY3)获得的原始数据应用稳定内对照(hsa-miR-1238)归一化。Fisher检验(F-test)之后的非配对t-检验(p<0.01)，用来确定正常肝组织和HCC组织之间和或HCC相对于健康个体、结直肠癌和肺癌miRNA的差异性表达。 

使用MedCalc软件对HCC相对与健康对照和或HCC相对于健康个体、结直肠癌和肺癌中单个miRNA进行接受者操作特性((ROC)曲线分析来分析单个作为诊断生物标记的miRNA的敏感性和特异性分析。限定有意义的可信区间为95%。 

下列所述标准来评定是否某一个miRNA在HCC相对与健康对照和或HCC相对于健康个体、结直肠癌和肺癌中有差异性表达。 

(i)差异表达≥2倍改变的p值(概率值)≤0.05；及 

(ii)AUC(作为诊断性生物标记的准确性)>0.700 

如果至少这些标准满足，则认为所述miRNA在HCC相对与健康对照和或HCC相对于健康个体、结直肠癌和肺癌中有差异性表达。 

114例血液都是独立的实验来检测，并且miRNA的表达水平决定于各自获得数据的平均值。 

下面表5-7所示HCC相对于健康对照miRNA差异性表达分析数据。表5列出在HCC与健康对照中组织和血浆中miRNA差异性表达分析。表6总结了HCC与健康对照中血浆中miRNA差异性表达分析。表7列出了HCC患者血浆中最好的特征性miRNA组合。前五个由六个不同的miRNA组成的组合诊断性生物标记来鉴别肝细胞癌和健康着的准确性在87%-94%。在表栏中，“t”代表HCC组织，“n”代表正常肝组织，而“p”代表HCC患者，“h”代表健康对照。特别优选的miRNA (表5中的SEQ ID NO:1-7和表6中的SEQ ID NO:11-17)也被用黑体字标出。 

表5肝细胞癌的血浆中的肿瘤相关miRNA特征

表6肝细胞癌的血浆特异性miRNA特征

表7肝细胞癌的血浆中的组合的miRNA特征

第二方面如下表8-10中示鉴别肝细胞癌与健康个体、结直肠癌和肺癌 所优选的特异性表达数据。表8列出肝细胞癌的肿瘤相关miRNA表达特征；表9示血浆特异性miRNA表达特征；而表10列出了HCC患者血浆中最好的特征性miRNA组合。前五个由六个不同的miRNA组成的组合诊断性生物标记来鉴别肝细胞癌和健康个体、结直肠癌和肺癌的准确性在85%-88%。在表栏中，"t”代表HCC组织，"n”代表正常肝组织，而“HCC”代表从HCC患者获得的血浆，“对照”代表从健康个体获取的血浆。特别优选的miRNA(表8中的SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:31;表9中的SEQ ID NO:14-SEQ ID NO:16)也被用黑体字标出。 

表8用于将肝细胞癌与健康个体、结直肠癌和肺癌区别的肿瘤相关miRNA表达特征

表9用于将肝细胞癌与健康个体、结直肠癌和肺癌区别的血浆特异性miRNA表达特征

表10用于将肝细胞癌与健康个体、结直肠癌和肺癌区别的组合miRNA表达特征

实施例5：微阵列数据的验证

为了验证(和或定量)微阵列获取的miRNA表达的数据，采用TaqMan MicroRNA分析(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)实时定量RT-PCR技术参照其说明书(操作)。简单地说，选用Applied Biosystem的Taqman microRNA RT Kits参照其说明数进行逆转录(RT)。15ul RT体系中包括，总RNA 10ng，1X 逆转录缓冲液,1X RT引物,1nM dNTP,4U RNA 酶抑制剂和50U MultiScribe 逆转录酶。然后将RT体系溶液在PCR仪(Thermal cycler alpha engine,Bio-rad)上执行如下程序：16°C，30min；42°C，30min；85°C，5min。定量PCR则选用TaqMan Universal PCR Master Mix试剂盒和Taqman microRNA测定试剂盒等试剂盒并参考其说明使用。定量PCR体系包括2ul的RTT产物、1X TaqMan Universal PCR Master Mix(No AmpErase)UNG、1X TaqMan MicroRNA Assay mix。每个反应重复三次。实时PCR在Roch Light Cycling 480上实行并执行如下程序：先96°C，5min；然后45或50个循环，95°C，15s；60°C，60s。Cp 值用二次导数(2nd derivative)的方法在LC480软件上完成。每个miRNA 的Cp值都用稳定内参hsa-miR-1228归一化。 

如图4示为来源于16个健康对照和HCC患者的血浆中的5个不同的miRNA组成的4个miRNA组合的对比平台的实验数据。通过微阵列和通 过实时PCR获取的数据倍数变化数量的相关性是0.76。说明Agilent miRNA微阵列获取的miRNA的表达特征是高度可信的。 

这些结果表明miRNA肝癌患者的表达水平在全球有高度的特异性。因次本文中的各个特异性miRNA代表着唯一的miRNA表达特征，诊断肝细胞癌，不仅可以诊断肝癌倾向的状态而且可以鉴别其与结直肠癌和肺癌。 

本发明中所鉴定的miRNA特征性表达为用血液检查来筛选、发现和诊断肝细胞癌提供了特有的分子标记。而且这些特征性表达还被用来监测肝癌患者治疗反应和指导治疗方案。另外，这些特征性表达还可以被用来开发抗肝癌药物。 

在此举例描述的的本发明可以适当地在不存在本文特别揭示的任何元件、限制的条件下进行。因此，例如术语“包含”、“包括”“含有”等应具有广泛含义且无限制。另外，本文应用的术语和表达用于描述本发明而无限制之意，且没有使用这些术语和表达排除任何其所示特征和描述或其一部分的等价物之意，但是应意识到在请求保护的本发明范围内可以进行各种修改。因此，应理解尽管通过实施方案和任选的特征对本发明进行的特别揭示，但是本领域技术人员可以对本发明进行修改和改变，这种修改和改变认为在本发明的范围内。 

本文广泛及上位地描述了本发明。落入上位描述范围内的每个较窄的下位概念和亚上位集合也组成了本发明的一部分。这包括用条件或从上位中除去任何主题的否定限制对本发明的上位描述，而无论所除去的主题是否在本文中特别引述。 

其它实施方案在如下权利要求范围内。另外，当本发明的特征或各个方面用马库什组方式描述时，本领域技术人员能意识到本发明也以马库什组的任何各个成员或成员亚组方式被描述。