高效分泌表达芋螺毒素的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株

摘要

高效分泌表达芋螺毒素的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株，它涉及一种基因工程细胞株。解决现有转基因工程菌株芋螺毒素分泌表达量低，且需要在发酵上清液中加入β-巯基乙醇再透析过夜，导致成本高，生产周期长，风险增加，不适合工业化大规模生产的问题。将人工设计的CTx基因与真核表达质粒pcDNA3.1/V5-His-C重组构建的表达载体pcDNA3.1/V5-His-C-CTx与含有dhfr基因的质粒pDCH1P11共转染入CHO-dhfr

说明书

技术领域

本发明涉及一种基因工程细胞株。

背景技术

芋螺(Conus)多数生活在热带海洋的浅水区，种类繁多，目前发现的芋 螺有500多种，根据其不同种的外形、花纹及色泽等进行命名和分类。 捕食时，它们会向猎物投射接连毒腺管和毒囊的针状齿舌，并注射毒 液，猎物一旦被击中，就立刻麻痹，成为芋螺的食物，这种毒液的主 要成分便是芋螺毒素(conotoxin，CTx)。

芋螺毒素(conotoxin，CTx)是一类来源于芋螺毒液的活性多肽。芋螺 毒素通常是由10~46个氨基酸残基组成，分子量小，结构多样，富含半 胱氨酸，具有高度保守的二硫键骨架，主要作用于钠、钾、钙等多种 离子通道和神经递质受体，阻断或增强神经兴奋信号的传递，是迄今 发现分子量最小的一类多肽毒素。芋螺毒素具双重效应，一方面阻断 痛觉传递而具镇痛效应，另一方面抑制兴奋毒性(excitotxic）神经递 质释放，阻止神经元细胞病理性钙内流而有神经保护作用。因其直接 作用于钙通道，无需第二信使或G蛋白，故不成瘾，将成为慢性重症疼 痛如晚期恶性肿瘤和AIDS病，取代用阿片类成瘾的神经性疾病的新一 代药物。

芋螺毒素因生物活性强，作用靶点广且具有高度选择性，可直接作用 药物，又可以作为设计新药的先导化合物，具有重要的理论研究价值 和应用价值。但是从芋螺体内获得芋螺毒素的数量远远不能满足市场 的需要，因此利用生物转基因技术获得表达芋螺毒素的工程菌株成为 发展的的趋势。

但是目前所知的转基因工程菌株都存在芋螺毒素分泌表达量低的缺陷 ，而且有研究表明ω-芋螺毒素中只有天然二硫键的形成才能促使进一 步正确的折叠。因此，如何保证转基因后芋螺毒素的二级结构，保持 其生物活性，成为困扰芋螺毒素转基因设计的一大难题。现有的芋螺 毒素重组菌（或转基因菌株）都采用在发酵上清液中加入β-巯基乙醇 将二硫键打开，然后再透析过夜使其在空气中缓慢氧化，最终形成正 确的二硫键配对形式。但这种方式不适用于工业化大规模生产，且成 本高，生产周期长，也许存在一定的风险。

发明内容

本发明要解决现有转基因工程菌株芋螺毒素分泌表达量低，且需要在 发酵上清液中加入β-巯基乙醇再透析过夜，导致成本高，生产周期长 ，风险增加，不适合工业化大规模生产的问题，而提供的一株高效分 泌表达芋螺毒素的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株。

本发明高效分泌表达芋螺毒素的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株按以下 步骤制备：

一、设计芋螺毒素转基因序列，基因序列如SEQ ID NO：1所示； 

二、合成芋螺毒素转基因DNA片段，然后导入T载体中；

三、目的片段双酶切，用BamHI及EcoRⅠ双酶切消化T载体，反应体系 为

酶切反应条件为37℃放置10h，然后将酶切产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳 ，目的片段用DNA GEL EXTRACTION KIT纯化回收，得到插入片段C Tx；

四、质粒载体双酶切：用BamHI和EcoRⅠ双酶切消化质粒载体pcDNA3. 1/V5-His-C，反应体系为

酶切反应条件为37℃放置10h，然后将酶切产物用0.6%琼脂糖凝胶电泳 ，再用DNA GEL EXTRACTION KIT纯化回收，得到酶切后的载体pcD NA3.1/V5-His-C；

五、插入片段CTx与经过双酶切的载体pcDNA3.1/V5-His-C连接，连接 反应体系为

连接反应条件为16℃放置过夜，获得连接产物重组质粒pcDNA3.1/V5- His-C-CTx； 

六、重组质粒转染CHO：将构建好的重组质粒pcDNA3.1/V5-His-C-CTx 与质粒pDCH1P11混合，使用Lipofeetmine^TM 2000 Reagent共转染CH O-dhfr^-细胞，在24孔板中进行转染，细胞达到95%融合时，将培养基 更换为无抗生素、无血清的CHO-S-SFMⅡ，500μL/孔，转染6h后更换 含100mL/L FBS、不含HT和NAA的CHO-S-SFMⅡ，继续培养48h，用ELI SA试剂盒鉴定阳性转染的细胞按1:10传代，24h细胞贴壁后更换为不含 HT和NAA、含G418  0.75mg/L和FBS 100mL/L的选择性培养基，培养 14～16d后有阳性克隆形成，然后用定向消化的方法将阳性克隆转入2 4孔板，又传代至12孔板，经 ELISA试剂盒测定对阳性高表达的 细胞克隆进行扩大培养；

七、MTX的加压培养：以MTX加压筛选，浓度依次为2×10^-8 mmol/L、1× 10^-7 mmol/L和5×10^-7 mmol/L，最终得到能够在5×10^-7 mmol/L的MTX中 正常生长的CHO细胞株，即为高效分泌表达芋螺毒素的中国仓鼠卵巢基 因工程细胞株。

本发明中芋螺毒素多肽（CTx）由25个氨基酸组成（SEQ ID NO：2） ，在编码芋螺毒素多肽的序列5’端加上Kozak序列和信号肽，然后在 序列两端分别加上限制性内切酶BamHI和EcoRⅠ的位点；并根据表达系 统选择CHO-dhft^-偏爱密码子设计出本发明芋螺毒素转基因序列。

本实施方式中芋螺毒素转基因DNA片段的合成由生物工程公司合成，T 载体由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

本发明高效分泌表达芋螺毒素的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株所分泌 的芋螺毒素保持了原有的天然二硫键和二级结构，具有生物活性，因 此可采用3步层析的方法直接分离获得芋螺毒素(conotoxin，CTx)，而 不必向上清液中加入β-巯基乙醇再透析过夜。所以本发明高效分泌表 达芋螺毒素的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株适用于工业化大规模生产 ，可满足市场对CTx的需求，具有生产成本低、生产周期短等优点。

芋螺毒素除有止痛效果外，也可用于治疗焦虑症、帕金森氏病、肌肉 紧张和高血压等病症。

本发明高效分泌表达芋螺毒素的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株在初始 细胞浓度为5×10^-7 mmol/L、产业化细胞培养液（DMEM/F12(1:1)+14mm ol/L柠檬酸铁+0.8mg/L硫酸锌+0.3g/L酵母水解物）中培养72h可得到 芋螺毒素12mg/L。本发明基因工程细胞株具有高效分泌表达芋螺毒素 的优点。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实 施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式高效分泌表达芋螺毒素的中国仓鼠卵巢 基因工程细胞株按以下步骤制备：

一、设计芋螺毒素转基因序列，基因序列如SEQ ID NO：1所示； 

二、合成芋螺毒素转基因DNA片段，然后导入T载体中；

三、目的片段双酶切，用BamHI及EcoRⅠ双酶切消化T载体，反应体系 为

酶切反应条件为37℃放置10h，然后将酶切产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳 ，目的片段用DNA GEL EXTRACTION KIT纯化回收，得到插入片段C Tx；

四、质粒载体双酶切：用BamHI和EcoRⅠ双酶切消化质粒载体pcDNA3. 1/V5-His-C，反应体系为

酶切反应条件为37℃放置10h，然后将酶切产物用0.6%琼脂糖凝胶电泳 ，再用DNA GEL EXTRACTION KIT纯化回收，得到酶切后的载体pcD NA3.1/V5-His-C；

五、插入片段CTx与经过双酶切的载体pcDNA3.1/V5-His-C连接，连接 反应体系为

连接反应条件为16℃放置过夜，获得连接产物重组质粒pcDNA3.1/V5- His-C-CTx； 

六、重组质粒转染CHO：将构建好的重组质粒pcDNA3.1/V5-His-C-CTx 与质粒pDCH1P11混合，使用Lipofeetmine^TM 2000 Reagent共转染CH O-dhfr^-细胞，在24孔板中进行转染，细胞达到95%融合时，将培养基 更换为无抗生素、无血清的CHO-S-SFMⅡ，500μL/孔，转染6h后更换 含100mL/L FBS、不含HT和NAA的CHO-S-SFMⅡ，继续培养48h，用ELI SA试剂盒鉴定阳性转染的细胞按1:10传代，24h细胞贴壁后更换为不含 HT和NAA、含G418  0.75mg/L和FBS 100mL/L的选择性培养基，培养 14～16d后有阳性克隆形成，然后用定向消化的方法将阳性克隆转入2 4孔板，又传代至12孔板，经 ELISA试剂盒测定对阳性高表达的细胞 克隆进行扩大培养；

七、MTX的加压培养：以MTX加压筛选，浓度依次为2×10^-8 mmol/L、1× 10^-7 mmol/L和5×10^-7mmol/L，最终得到能够在5×10^-7 mmol/L的MTX中 正常生长的CHO细胞株，即为高效分泌表达芋螺毒素的中国仓鼠卵巢基 因工程细胞株。

本实施方式步骤五挑取阳性菌落测序，阳性菌落包含SEQ ID NO：1 所示序列，证明本实施方式设计的芋螺毒素转基因DNA片段连接到载体 上。

本实施方式步骤六中二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞CHO-dh fr^-用含100mL/L胎牛血清、NAA、1×HT的DMEM培养基培养。

本实施方式步骤六中的选择性培养基为不含HT和NAA、含G418  0.7 5mg/L和FBS 100mL/L的无血清的CHO-S-SFMⅡ培养基。

本实施方式将人工设计的CTx基因与真核表达质粒pcDNA3.1/V5-His-C 重组构建的表达载体pcDNA3.1/V5-His-C-CTx与含有dhfr基因的质粒p DCH1P11共转染入CHO-dhfr^-，ELISA 检测到培养上清中重组蛋白的表 达，对阳性表达的细胞进行G418筛选，对阳性克隆进行氨甲喋呤（MT X）加压扩增，获得高效分泌表达芋螺毒素的中国仓鼠卵巢基因工程细 胞株。

本实施方式基因工程细胞株CTx蛋白表达水平的ELISA检测：

将本实施方式高效分泌表达芋螺毒素的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株 在初始细胞浓度为5×10^-7 mmol/L、产业化细胞培养液（DMEM/F12(1:1 )+14mmol/L柠檬酸铁+0.8mg/L硫酸锌+0.3g/L酵母水解物）中培养72  h的上清液用ELISA法测定蛋白含量，按说明书进行操作。本实施方式 基因工程细胞株CTx表达量为12mg/L。

本实施方式基因工程细胞株RT-PCR鉴定：

收集本实施方式高效分泌表达芋螺毒素的中国仓鼠卵巢基因工程细胞 株细胞，以Trizol进行总RNA提取，逆转后以引物P1和引物P2为引物进 行PCR扩增。PCR反应条件为：95℃预变性5 min；94℃ 30 s，52℃  30 s，72℃ 30 s，共30个循环；再72℃最终延伸5min。

引物P1 序列如SEQ ID NO：3所示，引物P2序列如SEQ ID NO：4 所示.

未转染pcDNA3.1/V5-His-C-CTx的CHO细胞进行扩增后无条带。由于CH O细胞自身并无芋螺毒素mRNA形式存在，所以未转染细胞无相应片段被 扩增。而本实施方式基因工程细胞株稳定的扩增出138bp的设计DNA片 段，表明目的片段已完整的整合到CHO细胞中，有目的基因的转录。

利用本实施方式基因工程细胞株纯化分离芋螺毒素的方法：

将产业化细胞培养液（DMEM/F12(1:1)+14mmol/L柠檬酸铁+0.8mg/L硫 酸锌+0.3g/L酵母水解物）中培养的高效分泌表达芋螺毒素的中国仓鼠 卵巢基因工程细胞株的培养液经离心超滤后上柱Sepharose F.F[18m mol/L,pH7.0 PBS],0.15mol/L NaCI洗脱，收集峰值，用18mmol/L、 pH7.2的Tris-Cl缓冲液透析过夜，上柱Q Sepharose F.F[18mmol/L ,pH7.2的Tris-Cl]，0.15mol/L  NaCI洗脱，收集峰值产物上柱Superdex75[pH7.2的Tris-Cl，100mmol /L NaCI]，收集峰值产物即得到芋螺毒素。

芋螺毒素纯度达99.7%以上。

本实施方式基因工程细胞株培养基上清液中分离得到的芋螺毒素的镇 痛实验：

挑取大小相近的雌性SD大鼠60只，任意分为6组，每组10只。调节热板 温度为55±0.5℃，置大鼠于热板上，测定各大鼠的正常痛反应。以大 鼠舔后足或抬后足并回头为标准，痛阙时间为5~30s为正常，60s为最 大值。

空白对照组给予等量生理盐水，阳性对照组1给予低剂量的吗啡(25μ g/kg)，阳性对照组2给予高剂量的吗啡(125μg/kg)，实验低剂量组给 予CTx(0.25μg/kg)、实验中剂量组给予CTx(0.75μg/kg)、实验高剂 量组给予CTx(1.5μg/kg)。药后0.5h、lh、2h、3h重复上述测定，记 录痛觉反应时间。记录给药后不同时间的痛阙，求出各组平均值，实 验结果如表1所示。

表1

实验低剂量组的CTx(0.25μg/kg)与阳性对照组1的吗啡(25μg/kg)镇 痛效果相似，由于CTx分子量约是吗啡的8倍，故可以得知表达的重组 CTx的镇痛效应大约是吗啡的800倍。芋螺毒素实验组与生理盐水空白 对照组相比均有显著差异(P<0.01)。

pcDNA3.1D/V5-His-C表达载体购自Invitrogen；ELISA检测试剂盒购自 R&D公司。本实施方式中使用的药品、试剂、酶、感受态细胞和质粒等 均购买获得，若无特殊要求则浓度为产品标注浓度。