一株具诱导大豆抗大豆胞囊线虫的简单芽孢杆菌及应用

摘要

本发明涉及一株处理大豆种子后具诱导大豆产生对大豆胞囊线虫抗性的简单芽孢杆菌(

说明书

技术领域

本发明属于微生物农药技术领域，具体涉及一种具诱导大豆抗大豆胞囊线虫的简单芽孢杆菌及应用。

背景技术

大豆胞囊线虫病（Soybean Cyst Nematode，简称SCN）是由大豆胞囊线虫(Heterodera glycines)侵染引起的，是危害世界大豆生产最严重的病害之一。该病害具有分布广、危害重、寄主范围宽、传播途径多、休眠体（胞囊）存活时间长等特点，是一种极难防治的土传病害。近年来随着我国大豆栽培面积的不断扩大，大豆胞囊线虫的分布也越来越广，主要发生在东北和黄淮海等共14个省市自治区，大豆受其为害后一般减产20%～30%，重者可达70%～80%，甚至颗粒无收。大豆胞囊线虫是土传的定居性内寄生线虫，侵染植株根系，成为目前世界各国大豆生产中的主要难题，化学防治使用的大多数杀线剂严重污染环境，破坏生态平衡。近20年来，随着可持续农业和有机农业的发展，人们已将防治线虫病害的工作重点转向了生物防治。

大豆胞囊线虫的生防因子有很多，包括真菌、细菌、病毒和原生动物等。利用植物根围促生菌(plant growth promoting rhizobacteria， PGPR) 防治大豆胞囊线虫病害已有研究，Becker等1988年报道了假单胞菌属(Pseudomonas)和芽孢杆菌属(Bacillus)对根结线虫病害有防治作用。Racke和Sikora 1992年报道了根际细菌Bacillus sp.和B.cereus对防治南方根结线虫(Meloidogyne incognita)、大豆胞囊线虫(Heterodera glycines)、玉米胞囊线虫(Heterodera zeae) 和燕麦胞囊线虫(Heterodera avenae)幼虫有效。芽孢杆菌属(Bacillus sp.)的细菌能够产生多种抗菌物质，包括脂肽类、肽类、磷脂类、类噬菌体颗粒和细菌素等，具有抗细菌、真菌、病毒和支原体的功能。而且，芽孢杆菌易于繁殖，适应环境能力强；绝大多数芽孢杆菌对人畜无毒，具有很强的环境适应性和环境友好性，因而在生物防治中起着重要的作用，具有很大的开发利用价值。相关研究表明简单芽孢杆菌有促生和生防作用，其对于大白菜软腐病的防治率高达到83%，同时增加大白菜产量50%，而简单芽孢杆菌对大豆胞囊线虫病的防治还尚未有报道。

针对生产上存在这一问题，通过系统筛选获得一株细菌，利用该菌或该菌的代谢产物处理大豆种子，可诱导大豆在种子萌发和生长期间产生对大豆胞囊线虫的抗性，从而解决了大豆胞囊线虫病的问题。

发明内容

本发明的目的是选择一株菌株对大豆种子处理后可以诱导苗期大豆对胞囊线虫产生明显的抗性，将菌株按常规液体发酵培养后，可以用该菌的代谢产物，开发出处理大豆种子的种子处理剂，经过处理的大豆种子可以诱导大豆产生对大豆胞囊线虫的抗性。

本发明筛选获得的一株细菌菌株是简单芽孢杆菌(Bacillus simplex）Sneb545，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：北京市朝阳区北辰西路1号 中国科学院微生物研究所；保藏日期：2012年10月11日；保藏登记入册的编号: CGMCC No.6650。简单芽孢杆菌(Bacillus simplex）Sneb545是从中国辽宁省沈阳市沈阳农业大学试验田中筛选出的一株对大豆具有强诱导活性的细菌菌株。

本发明通过研究发现，土壤细菌有很多株细菌都具有一定的诱导大豆抗胞囊线虫的能力，从这些细菌中筛选出一株性状相对较好的菌株——简单芽孢杆菌(Bacillus simplex）Sneb545进行了进一步的研究。

本发明还涉及用于诱导大豆产生抗胞囊线虫抗性的细菌代谢物，其是由本发明的细菌菌株简单芽孢杆菌(Bacillus simplex）Sneb545经过常规的液体发酵培养后获得。

本发明的细菌菌株简单芽孢杆菌(Bacillus simplex）Sneb545是通过培养皿培养后，再经扩大发酵培养来制备，其具体方法如下：

1. 培养皿培养

培养基配方为牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（NA）：牛肉浸膏3g，蛋白胨5g，蔗糖10g，琼脂17-20g，蒸馏水1000mL。

2.       液体发酵培养

其中液体发酵培养基配方为：以重量百分比计，酵母浸膏0.1%-0.2%、蛋白胨0.5%-0.6%、牛肉浸膏0.3%-0.4%、蔗糖1%-2%，余下为蒸馏水，pH为6.8-7.0。

将菌种接种到250mL三角瓶（每瓶装100mL）液体培养基中，25℃～28℃下，摇床转速以150r· min^-1～180r·min^-1、发酵2-3d，优选3d。

液体发酵的菌种可以通过大型发酵罐进行规模生产，其产品为发酵液或发酵液的制成品。

本发明还涉及一种大豆种子处理剂，其包含有效量的本发明所述的简单芽孢杆菌(Bacillus simplex）Sneb545本身或其代谢物作为有效活性成分。

本发明的简单芽孢杆菌(Bacillus simplex）Sneb545或其代谢物具有对大豆的诱导活性，可用于大豆的种子处理，处理后的大豆对大豆胞囊线虫的胞囊形成具有很好的抑制作用，解决了大豆胞囊线虫病的难题。

具体实施方式：

为了更详细地进一步阐明而不是为了限制本发明，给出了下列实施例。

实施例1：简单芽孢杆菌(Bacillus simplex）Sneb545的培养

首先对简单芽孢杆菌(Bacillus simplex）Sneb545菌株进行发酵培养，然后对发酵培养后的代谢产物进行大豆诱导活性试验，确定其对大豆的诱导作用。

     将简单芽孢杆菌(Bacillus simplex）Sneb545的菌体接种到培养基上，培养基配方为牛肉膏蛋白胨培养基，即成分：牛肉浸膏3g，蛋白胨5g，蔗糖10g，琼脂17-20g，加蒸馏水至1000mL，25℃培养2d。

再将菌种接种到250mL三角瓶（每瓶装100mL）液体培养基中，培养基配方为：以重量百分比计，酵母浸膏0.1%-0.2%、蛋白胨0.5%-0.6%、牛肉浸膏0.3%-0.4%、蔗糖1%-2%，余下为蒸馏水，pH为6.8-7.0，发酵温度为25-28℃，摇床转速150r·min^-1～180r·min^-1、发酵时间2-3d。形成的发酵液或发酵液的制成品可以直接或间接处理大豆种子。被处理的大豆种子可以减轻由于大豆胞囊线虫病害所造成的危害。

实施例2：简单芽孢杆菌(Bacillus simplex）Sneb545的发酵

    基本同实施例1，不同之处是将液体培养的菌种接种到1000L的发酵罐进行发酵，在25℃下培养，pH为7.0，发酵3d。

实施例3：简单芽孢杆菌(Bacillus simplex）Sneb545诱导大豆系统抗性的验证

  利用裂根试验设计（split-root system）探讨了菌株Sneb545对大豆胞囊线虫的诱导系统抗性。裂根试验中的挑战根系和应答根系彼此在空间上完全隔离，应答根系中的Sneb545发酵液与大豆胞囊线虫没有直接接触，菌株对线虫的控制作用完全依赖于其对植株的诱导抗性。该测定方法可靠，已被广泛应用于生防微生物对土传病害的系统诱导抗性研究。

1. 制备试验用制剂

按前述液体发酵培养方法制备简单芽孢杆菌菌株Sneb545的发酵液，待备用。

2. 制备试验用线虫

大豆胞囊线虫(Heterodera glycines)：大豆胞囊线虫3号生理小种取自沈阳农业大学北方线虫研究所试验基地。采用改良淘洗-过筛法从采取的土样中分离胞囊，在体视镜下挑取新鲜、饱满、成熟、均一的胞囊。胞囊先用0.5%次氯酸钠溶液消毒3min，再用无菌水冲洗5次，放在含有少量无菌水的培养皿里，25 ℃恒温箱中培养，浅盘孵化15天后得到2龄幼虫，将2龄幼虫悬浮液调节到200头/ml。

3.制备试验用种子

辽豆15：由辽宁省农业科学院提供。

4.种子处理方法

将大豆种子先用5%次氯酸钠溶液表面消毒5min，再用无菌水冲洗5次。

5.试验方法

采用温室盆栽处理，取无大豆胞囊线虫的土和沙，在干热灭菌锅中165℃，2h灭菌，然后以V(土)：V（沙）为2：1的比例混匀装入16×16cm塑料钵中。每钵中播种3粒辽豆15种子，待豆苗长至两片子叶时，每钵留1株。将豆苗取出并洗净，根系分为均等的两部分。取3个同样大小的塑料钵，成“品”字形放置，底部的塑料钵分别放于2个16cm直径的盘托中。在顶部的塑料钵底部开2条1cm×2cm，幼苗置于顶部的塑料钵中，使分开的根系分别通过2个裂缝到达下部的两个塑料钵的土壤中，在底部两个塑料钵中生长的根系分别为挑战根系和应答根系，3个钵中装入土壤基质固定植株。系统置于温室（25℃、14h光照），在挑战根系的塑料钵中2cm表土以下接种Sneb545发酵液10ml，接种Sneb545发酵液1周后接种10ml J2悬浮液到应答根系。以无菌水为对照，共2个处理，3次重复。35d后调查应答根系钵中的土中的胞囊量和根内的大豆胞囊线虫总数。

5.1土壤中胞囊的分离与计数：每个土样称取200cc(即用1000mL烧杯盛水800mL，加土至1000mL)，采用淘洗—过筛—贝曼漏斗法收集胞囊，在体视解剖镜下记录胞囊的数量。

5.2 根内线虫的染色与计数：将根系用流水清洗干净，称根鲜重，然后用次氯酸钠—酸性品红染色法进行根内线虫的染色，在体视显微镜下观察记录根内线虫数量，并折成每克根鲜重线虫的数量。

5.3 防治效果计算

胞囊抑制率（％）＝                                                

线虫减少率（％）＝

6 试验结果

测定显示，Sneb545能够诱导大豆产生对大豆胞囊线虫很强的抗性。菌株Sneb545在挑战根系中接种后，应答根系中大豆胞囊线虫的入侵显著降低，应答根系土中胞囊数量显著减少。应答根系大豆胞囊线虫入侵降低51.27%，土中胞囊减少65.82%（表1）。

表1 Sneb545接种挑战根系后应答根系中入侵线虫和土中胞囊总数

处理土中胞囊数量根内大豆胞囊线虫数量Sneb5459.0000±2.6458bB32.0000±4.3589bBCK26.3333±2.6034aA65.6667±5.6075aA

注：35 d后的调查结果，数字后字母为Duncan’s新复极差测验结果，不同大小写英文

字母分别表示差异极显著( P < 0. 01)和差异显著( P < 0. 05) 。

实施例4：简单芽孢杆菌(Bacillus simplex）Sneb545的田间防治大豆胞囊线虫病效果试验

使用发酵液原液，按1：100的比例处理包衣大豆种子，晾干后，将处理过的大豆种子正常播种在大豆胞囊线虫病块地，经过Sneb545代谢物处理大豆种子后可以诱导苗期大豆对胞囊线虫产生明显的抗性，对大豆胞囊线虫胞囊的形成有明显的抑制作用，是很有潜力的生防菌，为防治大豆胞囊线虫病开辟了新思路。

1. 制备试验用制剂

按前述液体发酵培养方法制备简单芽孢杆菌菌株Sneb545的发酵液，待备用。

2.制备试验用种子

辽豆15：由辽宁省农业科学院提供。

合丰50：由黑龙江省农业科学院大庆分院提供。

3.种子处理方法

将大豆种子先用5%次氯酸钠溶液表面消毒5min，再用无菌水冲洗5次。将制备好的发酵液采用1%的种子量进行种子包衣处理，待晾干后备用。

4.试验方法

采用田间自然发病土壤接种大豆。分别在辽宁省康平县和黑龙江省大庆市两地进行5次重复试验。大豆田均为重茬大豆田，康平试验基地重茬3年，田间胞囊量为40个胞囊/100ml土壤，大庆试验基地重茬6年以上，田间胞囊量为55个胞囊/100ml土壤。田间小区设计为3个处理，5次重复，共15个小区，随机区组排列，每小区5垄，垄长5米，过道1米，每垄播种100粒，小区边缘设保护行。以未经过包衣的大豆种子和NA液体培养液包衣的大豆种子为对照，在大豆播种后35d，待大豆胞囊线虫生长发育突破大豆根表后，每个小区随机取20株苗，去掉表土（0-5cm）后将植株连根挖出，保持根系的完整，调查单株大豆根系胞囊着生量，计算胞囊抑制率。

5.试验结果

对Sneb545菌株处理的大豆，在大豆胞囊线虫显囊期调查根系胞囊着生情况， Sneb545细菌菌株包衣处理后的大豆苗对大豆胞囊线虫的胞囊形成了明显的抑制作用，由表2可知，Sneb545在大庆和康平的抑制率分别达到了57.67%、47.92%，包衣处理后的大豆在康平和大庆两地处理的结果有一定差异，这可能与不同地区大豆胞囊线虫生理小种的差别有关。

表2 Sneb545菌株包衣处理大豆种子对大豆根系胞囊形成的影响

处理黑龙江大庆辽宁康平Sneb54539.2±3.6387bBC45.35±4.7315bcdBNA93.2±5.0735aA84.34±5.8726aACK92.6±3.7762aA87.08±8.1215aA

注：35 d后的调查结果，数字后字母为Duncan’s新复极差测验结果，不同大小写英文

字母分别表示差异极显著( P < 0. 01)和差异显著( P < 0. 05) 。