基因重组人生长激素的制备方法

摘要

一种基因重组人生长激素的制备方法，包括步骤：基因的获得、载体pPIC9K与Ⅰ型人胶原蛋白以及人生长激素的连接、毕赤酵母电转化、多拷贝插入重组子的筛选、前导肽-人生长激素融合蛋白毕赤酵母发酵、基因重组人生长激素的纯化步骤。本发明以Ⅰ型胶原蛋白302～346基序作为前导肽引导人生长激素高表达，通过毕赤酵母高密度发酵及一系列纯化方法获得高纯度的人生长激素，为重组人生长激素临床应用的进一步扩展奠定了基础。本发明具有生产工艺简单、蛋白表达量高、纯度高的特点，可用于制备基因重组人生长激素。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基因重组人生长激素的制备方法。

背景技术

生长激素（human growth hormone，GH）是由脑垂体前叶特异性细胞分泌的一种单链、非糖基化蛋白激素，它是由191个氨基酸组成，分子量为22kDa，等电点为5.1，链内含有四个半胱氨酸，组成两对二硫键。生长激素是通过血液运输到靶组织，影响几乎所有的组织类型和细胞，甚至包括免疫组织、脑组织及造血系统。其主要作用是刺激骨、软骨细胞的生长和分化；调节蛋白质、糖及脂肪的代谢等，临床上主要用于治疗侏儒症，近年来研究发现生长激素还可治疗烧伤、创伤、骨折、骨质疏松等多种疾病。

在体内，生长激素调节肌肉、骨、软骨细胞的生长与分化等多种生理过程主要通过两种可能的机制发挥其功能，一是经胰岛素样生长因子等生长介质介导，生长激素刺激肝细胞释放胰岛素样生长因子，再经过胰岛素样生长因子作用于靶细胞促进细胞的增殖和生长；二是生长激素可以直接与靶细胞表面的生长激素受体结合，刺激靶细胞的生长。部分学者认为生长激素对脂肪组织的促成熟分化作用和对免疫系统、造血系统的促增殖发育作用主要是通过直接途径起作用。大量研究证实，生长激素缺乏是导致儿童生长障碍重要的因素之一。

最初获得的生长激素制剂主要是取自动物牛的垂体，但由于其种属特异性，治疗效果不佳，并且有发热、过敏等副作用，不久就停止使用。1958年，人们将从人尸体垂体中提取到的少量天然人生长激素，作为激素替代疗法用于治疗儿童侏儒症，其疗效显著，坚持数年治疗，可获得正常身高，但人的垂体仅0.5g，治疗一个病例需要约1000个垂体，药源稀缺，难以满足巨大患者群的需要。而化学合成的方法效率非常低，成本高，没有实用价值，因此采用基因工程方法大规模生产人生长激素是满足临床大量需求的重要手段。1985年，用大肠杆菌重组DNA技术合成的生长激素获准在临床使用，它是通过包涵体技术生产，含192个氨基酸，较之天然生长激素的氨基酸序列在N端多一个蛋氨酸（Met），故被称为蛋氨酸生长激素，其生物活性和天然产物相同。虽然临床使用表明Met-重组人生长激素治疗效果和人垂体分离的生长激素相似，但Met-重组人生长激素在治疗过程中容易诱导较大的免疫反应，即使是高纯度Met-重组人生长激素制剂，仍有50％～80％病人会产生抗体，因此，人们趋向于研究N-端不带Met的Met人生长激素。用大肠杆菌生产无Met的Met人生长激素有两种方法，一种是在胞内表达产生Met-人生长激素后，在加工、纯化过程中用酶法除去Met分子；另一种方法是用分泌型载体，把人生长激素成熟蛋白的编码序列直接转录入高表达高分泌启动子和信号序列后面，在分泌过程中切去信号肽，使表达的人生长激素累积在细胞周质中。90 年代，人们开始用哺乳类细胞合成重组人生长激素 (191肽)，该制剂的氨基酸序列与人天然生长激素完全一致，因为它是在哺乳细胞中合成，而非大肠杆菌，故无污染的危险，同时减少了抗原性。近年来，人们又不断尝试利用多种表达系统比如昆虫细胞、蚕、转基因小鼠、家兔、山羊、牛等表达人生长激素，但存在表达量不高，工艺复杂、发酵后处理繁琐、难以工业化生产等问题。毕赤酵母作为低等真核生物，具有高效分泌表达的特点，同时可以利用自身信号肽的切割的特点，获得无Met的人生长激素。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于克服上述基因重组人生长激素表达量较低的缺点，提供一种基因重组人生长激素表达量相对高、便于操作的基因重组人生长激素的制备方法。

解决上述技术问题采用的技术方案是：以Ⅰ型人胶原蛋白氨基酸302～346基序作为前导肽引导人生长激素表达的前导肽-人生长激素融合蛋白，Ⅰ型人胶原蛋白氨基酸302～346基序的氨基酸序列为：

1         GPRGLPGERG RPGAPGPAGA RGNDGATGAA GPPGPTGPAG PPGFP

前导肽-人生长激素融合蛋白的氨基酸序列为：

1        GPRGLPGERG RPGAPGPAGA RGNDGATGAA GPPGPTGPAG PPGFPEFKRE AFPTIPLSRL

61       FDNAMLRARR LYQLAYDTYQ EFEEAYILKE QKYSFLQNPQ TSLCFSESIP TPSNRVKTQQ

121      KSNLELLRIS LLLIQSWLEP VQLLRSVFAN SLVYGASDSN VYRHLKDLEE GIQTLMWRLE

181      DGSPRTGQIF NQSYSKFDTK SHNDDALLKN YGLLYCFRKD MDKVETFLRI VQCRSVEGSC

241      GF

前导肽-人生长激素融合蛋白的氮端为Ⅰ型人胶原蛋白302～346基序的45个氨基酸组成的前导肽，碳端为人生长激素的191个氨基酸，两段氨基酸序列之间添加pPIC9K载体自身α信号肽切割位点Lys-Arg-Glu-Ala、用于连接的谷氨酸和苯丙氨酸，分泌表达时切割获得基因重组人生长激素。基因重组人生长激素的氨基酸序列如下：

1         FPTIPLSRLF DNAMLRARRL YQLAYDTYQE FEEAYILKEQ KYSFLQNPQT SLCFSESIPT

61        PSNRVKTQQK SNLELLRISL LLIQSWLEPV QLLRSVFANS LVYGASDSNV YRHLKDLEEG

121       IQTLMWRLED GSPRTGQIFN QSYSKFDTKS HNDDALLKNY GLLYCFRKDM DKVETFLRIV

181       QCRSVEGSCG F

上述基因重组人生长激素的制备方法包括下述步骤：

1、基因的获得

从离体新生儿胎盘组织中提取总RNA，反转录获得cDNA，设计Ⅰ型人胶原蛋白302～346基序前导肽和人生长激素 PCR扩增引物，引入限制性酶切位点XhoⅠ、EcoRⅠ、NotⅠ、α信号肽切割位点AAACGAGAAGCT，Ⅰ型人胶原蛋白302～346基序前导肽和人生长激素的引物序列如下；

Ⅰ型人胶原蛋白302～346基序前导肽引物序列：

F: CGCTCGAGGGCCCCCGTGGCCTGC

R: CGGAATTCAGGGAAGCCAGGAGGACCAG

人生长激素引物序列：

F: GCGAATTCAAACGAGAAGCTTTCCCAACCATTCCCTTATC

R: TAGCGGCCGCCTAGAAGCCACAGCTGC

采用PCR方法扩增获得Ⅰ型人胶原蛋白302～346基序前导肽和人生长激素基因；Ⅰ型人胶原蛋白302～346基序前导肽的基因序列如下：

1        GGCCCCCGTG GCCTGCCTGG TGAGAGAGGT CGCCCTGGAG CCCCTGGCCC TGCTGGTGCT

61       CGTGGAAATG ATGGTGCTAC TGGTGCTGCC GGGCCCCCTG GTCCCACCGG CCCCGCTGGT

121      CCTCCTGGCT TCCCT

人生长激素基因序列如下：

1        TTCCCAACCA TTCCCTTATC CAGGCTTTTT GACAACGCTA TGCTCCGCGC CCGTCGCCTG

61       TACCAGCTGG CATATGACAC CTATCAGGAG TTTGAAGAAG CCTATATCCT GAAGGAGCAG

121      AAGTATTCAT TCCTGCAGAA CCCCCAGACC TCCCTCTGCT TCTCAGAGTC TATTCCAACA

181      CCTTCCAACA GGGTGAAAAC GCAGCAGAAA TCTAACCTAG AGCTGCTCCG CATCTCCCTG

241      CTGCTCATCC AGTCATGGCT GGAGCCCGTG CAGCTCCTCA GGAGCGTCTT CGCCAACAGC

301      CTGGTGTATG GCGCCTCGGA CAGCAACGTC TATCGCCACC TGAAGGACCT AGAGGAAGGC

361      ATCCAAACGC TGATGTGGAG GCTGGAAGAT GGCAGCCCCC GGACTGGGCA GATCTTCAAT

421      CAGTCCTACA GCAAGTTTGA CACAAAATCG CACAACGATG ACGCACTGCT CAAGAACTAC

481      GGGCTGCTCT ACTGCTTCAG GAAGGACATG GACAAGGTCG AGACATTCCT GCGCATCGTG

541      CAGTGCCGCT CTGTGGAGGG CAGCTGTGGC TTCTAG

2、载体pPIC9K与Ⅰ型人胶原蛋白以及人生长激素的连接

对载体pPIC9K、Ⅰ型人胶原蛋白进行XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切，回收酶切产物，用DNA连接酶连接，并转化大肠杆菌，提取质粒，命名为pPIC9K-Leader；对pPIC9K-Leader质粒与人生长激素分别进行EcoRⅠ及NotⅠ双酶切，回收酶切产物，用DNA连接酶连接，转化大肠杆菌，提取质粒，命名为pPIC9K-Leader-GH。

该重组DNA序列如下：

1        CTCGAGGGCC CCCGTGGCCT GCCTGGTGAG AGAGGTCGCCCTGGAGCCCC TGGCCCTGCT

61       GGTGCTCGTG GAAATGATGG TGCTACTGGT GCTGCCGGGC CCCCTGGTCC CACCGGCCCC

121      GCTGGTCCTC CTGGCTTCCC TGAATTCAAA CGAGAAGCTT TCCCAACCAT TCCCTTATCC

181      AGGCTTTTTG ACAACGCTAT GCTCCGCGCC CGTCGCCTGT ACCAGCTGGC ATATGACACC

241      TATCAGGAGT TTGAAGAAGC CTATATCCTG AAGGAGCAGA AGTATTCATT CCTGCAGAAC

301      CCCCAGACCT CCCTCTGCTT CTCAGAGTCT ATTCCAACAC CTTCCAACAG GGTGAAAACG

361      CAGCAGAAAT CTAACCTAGA GCTGCTCCGC ATCTCCCTGC TGCTCATCCA GTCATGGCTG

421      GAGCCCGTGC AGCTCCTCAG GAGCGTCTTC GCCAACAGCC TGGTGTATGG CGCCTCGGAC

481      AGCAACGTCT ATCGCCACCT GAAGGACCTA GAGGAAGGCA TCCAAACGCT GATGTGGAGG

541      CTGGAAGATG GCAGCCCCCG GACTGGGCAG ATCTTCAATC AGTCCTACAG CAAGTTTGAC

601      ACAAAATCGC ACAACGATGA CGCACTGCTC AAGAACTACG GGCTGCTCTA CTGCTTCAGG

661      AAGGACATGG ACAAGGTCGA GACATTCCTG CGCATCGTGC AGTGCCGCTC TGTGGAGGGC

721      AGCTGTGGCT TCTAGGCGGC CGC

3、毕赤酵母电转化

将10μg经SalⅠ内切酶线性化的pPIC9K-Leader-GH质粒，与80μL毕赤酵母GS115感受态细胞混匀，转至0.2cm冰预冷的电转化杯中，电击4～10毫秒，加入1mL冰预冷的1mol/L的山梨醇溶液将菌体混匀，涂布MD培养基平板，30 ℃倒置培养2～3天，在MD培养基平板上长出菌落。

4、多拷贝插入重组子的筛选

将MD培养基平板上长出的菌落用无菌牙签对应接种到G418浓度分别为0.5g/L、1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L的YPD平板上，30℃培养，筛选获得转化子。

5、前导肽-人生长激素融合蛋白毕赤酵母发酵

将筛选到的基因工程菌接种于400ml BMGY培养基中，30 ℃振荡培养24小时，作为一级种子转接于装有4L FBS培养基的5L发酵罐中，温度设定为30 ℃，pH 值为5.0，培养16～20小时，作为二级种子转接入装有FBS培养基的150L大罐发酵，生长温度30℃，诱导温度29℃，pH值为4.5，溶氧控制在20%～30%，流加入质量浓度为75%的含12 mL/LPTM1 微量元素的甲醇水溶液，FBS培养基与质量浓度为75%的含12mL/L PTM1 微量元素的甲醇水溶液的体积比为1:0.25，诱导发酵36～42小时。在蛋白发酵分泌表达出胞外的过程中，细胞壁中所含有的蛋白酶切割α信号肽切割位点，切割出人生长激素。

6、基因重组人生长激素的纯化

发酵结束后，发酵液离心分离，取上清液，用分子截留量为60000D或80000D或100000D的中空纤维超滤系统进行超滤，收集滤过液，用分子量为6000D或10000D的卷式超滤膜超滤，收集浓缩液，得人生长激素粗蛋白浓缩液；用Sephacryl S100分子筛层析分离人生长激素粗蛋白浓缩液，然后用DEAE Sepharose FF阴离子交换层析，收集洗脱液，超滤脱盐浓缩，冷冻干燥，获得基因重组人生长激素, 基因重组人生长激素的氨基酸序列如下：

1         FPTIPLSRLF DNAMLRARRL YQLAYDTYQE FEEAYILKEQ KYSFLQNPQT SLCFSESIPT

61        PSNRVKTQQK SNLELLRISL LLIQSWLEPV QLLRSVFANS LVYGASDSNV YRHLKDLEEG

121       IQTLMWRLED GSPRTGQIFN QSYSKFDTKS HNDDALLKNY GLLYCFRKDM DKVETFLRIV

181       QCRSVEGSCG F

在本发明的重组人生长激素的纯化步骤6中，发酵结束后，发酵液离心分离，取上清液，用分子截留量为100000D的中空纤维超滤系统进行超滤，收集滤过液，用分子量为6000D的卷式超滤膜超滤，收集浓缩液，得人生长激素粗蛋白浓缩液；用Sephacryl S100分子筛层析分离人生长激素粗蛋白浓缩液，然后用DEAE Sepharose FF阴离子交换层析，收集洗脱液，超滤脱盐浓缩，冷冻干燥，获得基因重组人生长激素。

本发明以Ⅰ型胶原蛋白302～346基序作为前导肽引导人生长激素高表达，通过毕赤酵母高密度发酵及一系列纯化方法获得高纯度的人生长激素，为重组人生长激素临床应用的进一步扩展奠定了基础。

附图说明

图1是实施例1中表达载体pPIC9K-Leader-GH的质粒图谱。

图2是实施例1中前导肽与人生长激素基因的PCR产物电泳图。

图3是实施例1中人生长激素的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图。

图4是实施例1中人生长激素的Western Blot鉴定图

下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明不限于这些实施例。

实施例1

以Ⅰ型人胶原蛋白氨基酸302～346基序作为前导肽引导人生长激素表达的前导肽-人生长激素融合蛋白，Ⅰ型人胶原蛋白氨基酸302～346基序的氨基酸序列为：

1         GPRGLPGERG RPGAPGPAGA RGNDGATGAA GPPGPTGPAG PPGFP

前导肽-人生长激素融合蛋白的氨基酸序列为：

1        GPRGLPGERG RPGAPGPAGA RGNDGATGAA GPPGPTGPAG PPGFPEFKRE AFPTIPLSRL

61       FDNAMLRARR LYQLAYDTYQ EFEEAYILKE QKYSFLQNPQ TSLCFSESIP TPSNRVKTQQ

121      KSNLELLRIS LLLIQSWLEP VQLLRSVFAN SLVYGASDSN VYRHLKDLEE GIQTLMWRLE

181      DGSPRTGQIF NQSYSKFDTK SHNDDALLKN YGLLYCFRKD MDKVETFLRI VQCRSVEGSC

241      GF

前导肽-人生长激素融合蛋白的氮端为Ⅰ型人胶原蛋白302～346基序的45个氨基酸组成的前导肽，碳端为人生长激素的191个氨基酸，两段氨基酸序列之间添加pPIC9K载体自身α信号肽切割位点Lys-Arg-Glu-Ala、用于连接的谷氨酸和苯丙氨酸，分泌表达时切割获得基因重组人生长激素。基因重组人生长激素的氨基酸序列如下：

1         FPTIPLSRLF DNAMLRARRL YQLAYDTYQE FEEAYILKEQ KYSFLQNPQT SLCFSESIPT

61        PSNRVKTQQK SNLELLRISL LLIQSWLEPV QLLRSVFANS LVYGASDSNV YRHLKDLEEG

121       IQTLMWRLED GSPRTGQIFN QSYSKFDTKS HNDDALLKNY GLLYCFRKDM DKVETFLRIV

181       QCRSVEGSCG F

上述基因重组人生长激素的制备方法包括下述步骤：

1、基因的获得

从离体新生儿胎盘组织中提取总RNA，采用GeneCopoeia First-Strand cDNA synthesis Kit试剂盒按说明书的使用方法进行反转录，获得cDNA，GeneCopoeia First-Strand cDNA synthesis Kit试剂盒由西安依科生物技术有限公司销售。根据Ⅰ型人胶原蛋白及人生长激素基因序列，设计Ⅰ型人胶原蛋白302～346基序前导肽及人生长激素基因PCR扩增引物，引入限制性酶切位点XhoⅠ、EcoRⅠ、NotⅠ、α信号肽切割位点AAACGAGAAGCT，Ⅰ型人胶原蛋白302～346基序前导肽及人生长激素基因引物序列如下：

Ⅰ型人胶原蛋白302～346基序前导肽(leader)引物序列：

F: CGCTCGAGGGCCCCCGTGGCCTGC

R: CGGAATTC AGGGAAGCCAGGAGGACCAG

人生长激素(GH)引物序列：

F: GCGAATTCAAACGAGAAGCTTTCCCAACCATTCCCTTATC

R: TAGCGGCCGCCTAGAAGCCACAGCTGC

采用PCR方法扩增获得Ⅰ型人胶原蛋白302～346基序前导肽和人生长激素基因，PCR扩增方法为：25μL反应体系中含有：13.3μL灭菌的二次蒸馏水、2.5μL 10×PCR buffer，3.5 μL 2 m mol/L dNTPMix，2.5μL MgCl₂，1μL 10 μmol/L Primer F，1μL 10μmol/L Primer R，0.2μL 0.5 U/μL Taq酶，1μL cDNA模板。反应条件为：95℃ 5分钟，94℃30 秒，54℃30 秒，72℃ 30秒，30个循环，72℃ 10分钟，4  10分钟，用PCR仪对Ⅰ型人胶原蛋白和人生长激素进行PCR扩增，PCR扩增结果见图2，由图2可见，Ⅰ型人胶原蛋白302～346基序前导肽PCR扩增产物在150bp处出现特异性条带，与Ⅰ型人胶原蛋白302～346基序前导肽设计的基因序列大小一致，人生长激素基因PCR扩增产物在570bp处出现特异性条带，与人生长激素基因设计的基因序列大小一致。

2、载体pPIC9K与Ⅰ型人胶原蛋白以及人生长激素的连接

（1）载体pPIC9K和Ⅰ型人胶原蛋白的双酶切

对载体pPIC9K、Ⅰ型人胶原蛋白进行XhoⅠ和EcoRⅠ进行双酶切，pPIC9K载体购于美国Invitrogen公司。双酶切体系如下：

上述试剂加好后，混匀，37℃水浴消化2小时，用DNA纯化试剂盒，按产品说明书，从质量浓度为1.5%琼脂糖凝胶上回收特异性条带。

（2）载体pPIC9K与Ⅰ型人胶原蛋白前导肽的连接

用T4 DNA连接酶对上述双酶切回收产物pPIC9K与leader进行连接，反应体系如下：

上述连接体系充分混匀后，于16℃连接12小时。

（3）载体pPIC9K与Ⅰ型人胶原蛋白前导肽连接产物的转化

取冷冻的DH5α感受态细胞一管100μL，放于冰上解冻，加入上述连接产物，手指轻弹使其混合，在冰中放置30 分钟，42℃水浴热激90秒，将管转移到冰浴中，使细胞冷却2～3分钟，加入800μL无抗生素的LB液体培养基，混匀，37℃温育50分钟，吸取100～200μL，涂于含浓度为50μg/mL卡那霉素的固体LB 平板上，将固体LB平板倒置于37℃培养箱中，培养12～18 小时，挑选单菌落接种于含浓度为50μg/mL卡那霉素的液体LB培养基中，摇床37℃过夜培养，用质粒提取试剂盒按操作说明提取质粒，质粒命名为pPIC9K-leader。

（4）pPIC9K-leader和人生长激素双酶切

对上述提取的pPIC9K-leader质粒和人生长激素PCR产物用EcoRⅠ和NotⅠ进行双酶切。双酶切体系如下：

上述试剂加好后，混匀，37℃水浴消化2小时，用DNA纯化试剂盒，按产品说明书从质量浓度为1.5%琼脂糖凝胶上回收特异性条带。

（5） pPIC9K-leader与人生长激素的连接

用T4 DNA连接酶对上述的pPIC9K-leader与人生长激素的双酶切产物进行连接，反应体系如下：

连接体系充分混匀后，于16℃连接12小时。

（6） pPIC9K-leader与人生长激素连接产物的转化

按载体pPIC9K与Ⅰ型人胶原蛋白前导肽连接产物的转化（3）方法进行转化，提取质粒命名为pPIC9K-leader-GH。

构建的前导肽-人生长激素融合蛋白表达载体的质粒图谱见图1，该重组DNA序列如下：

1        CTCGAGGGCC CCCGTGGCCT GCCTGGTGAG AGAGGTCGCCCTGGAGCCCC TGGCCCTGCT

61       GGTGCTCGTG GAAATGATGG TGCTACTGGT GCTGCCGGGC CCCCTGGTCC CACCGGCCCC

121      GCTGGTCCTC CTGGCTTCCC TGAATTCAAA CGAGAAGCTT TCCCAACCAT TCCCTTATCC

181      AGGCTTTTTG ACAACGCTAT GCTCCGCGCC CGTCGCCTGT ACCAGCTGGC ATATGACACC

241      TATCAGGAGT TTGAAGAAGC CTATATCCTG AAGGAGCAGA AGTATTCATT CCTGCAGAAC

301      CCCCAGACCT CCCTCTGCTT CTCAGAGTCT ATTCCAACAC CTTCCAACAG GGTGAAAACG

361      CAGCAGAAAT CTAACCTAGA GCTGCTCCGC ATCTCCCTGC TGCTCATCCA GTCATGGCTG

421      GAGCCCGTGC AGCTCCTCAG GAGCGTCTTC GCCAACAGCC TGGTGTATGG CGCCTCGGAC

481      AGCAACGTCT ATCGCCACCT GAAGGACCTA GAGGAAGGCA TCCAAACGCT GATGTGGAGG

541      CTGGAAGATG GCAGCCCCCG GACTGGGCAG ATCTTCAATC AGTCCTACAG CAAGTTTGAC

601      ACAAAATCGC ACAACGATGA CGCACTGCTC AAGAACTACG GGCTGCTCTA CTGCTTCAGG

661      AAGGACATGG ACAAGGTCGA GACATTCCTG CGCATCGTGC AGTGCCGCTC TGTGGAGGGC

721      AGCTGTGGCT TCTAGGCGGC CGC

3、毕赤酵母电转化

对pPIC9K-leader-GH质粒进行SalⅠ线性化，反应体系如下：

上述试剂加好后，混匀，37℃水浴反应5小时，终止反应前先取出5μL 以质量百分浓度为1.0%琼脂糖凝胶电泳检测是否酶切完全，用DNA纯化试剂盒对线性化质粒进行回收。

取10μg上述SalⅠ内切酶线性化的pPIC9K-leader-GH质粒，与80μL毕赤酵母GS115感受态细胞混匀，转至0.2cm冰预冷的电转化杯中，电压1.5kV；电容25μF；电阻200Ω；电击4～10毫秒，加入1mL冰预冷的1mol/L的山梨醇溶液将菌体混匀，涂布MD培养基平板，30 ℃倒置培养2～3天，在MD培养基平板上长出菌落。GS115购自西安依科生物技术有限公司。

4、多拷贝插入重组子的筛选

将MD培养基平板上长出的菌落用无菌牙签对应接种到G418浓度分别为0.5g/L、1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L的YPD平板上，30℃培养，筛选获得转化子。G418购自西安依科生物技术有限公司。

5、前导肽-人生长激素融合蛋白的发酵

将筛选到的转化子接种于400ml BMGY培养基中，30 ℃振荡培养24小时，作为一级种子转接于装有4L FBS培养基（1 L FBS培养基中含甘油 40g、K₂SO₄ 18.2g 、H₃PO₄ 26.7ml、CaSO₄.2H₂O 0.93g、MgSO₄ 14.9g、KOH 4.13g，混合配制成）的5L发酵罐中，温度设定为30 ℃，pH 值为5.0，培养16～20小时，作为二级种子转接入装有80L FBS培养基的150L大罐。发酵过程中，生长温度30℃，诱导温度29℃，pH 值为4.5，溶氧控制在20%～30%，当溶氧陡然上升时，预示基础盐培养基中的甘油已耗尽，开始流加18.15mL/h/L质量百分浓度为50 %的甘油，在质量百分浓度为50 %甘油中含12 mL/L微量元素PTM1（1L微量元素PTM1中含CuSO₄.5H₂O 6g、NaI 0.08g、MnSO₄.H₂O3g、Na₂MoO₄.H₂O 0.2g、H₃BO₃ 0.02g、H₂SO₄ 5ml、CoCl₂.6H₂O0.5g、ZnCl₂ 20g、FeSO₄.7H₂O 75g、生物素 0.2g，混合配制成），维持溶氧在20%～30%。发酵液的湿菌重达到300mg/mL时，停止补料，饥饿1小时，甘油耗尽，流加20L质量百分浓度为75 %甲醇诱导发酵，在质量百分浓度为75 %甲醇中含12 mL/L PTM1 微量元素，以速率为7.5ml/L/h流加2～3 小时，然后提高速率至10.9ml/L/h流加进行发酵。通过调节转速、罐压和通气量使溶氧大于20%，诱导发酵36～42小时。在蛋白发酵分泌表达出胞外的过程中，细胞壁中所含有的蛋白酶切割α信号肽切割位点，切割出完整的人生长激素。

6、重组人生长激素的纯化

（1）发酵液的固液分离及脱色

发酵结束后，发酵液离心分离，取上清液80L，用分子截留量为100000D的中空纤维超滤系统进行超滤，收集滤过液，用分子量为6000D的卷式超滤膜超滤，收集浓缩液，通过上述两步超滤法即可去除前导肽及毕赤酵母发酵产生的大量黄绿色物质，获得人生长激素粗蛋白浓缩液。

（2)分子筛层析

用Sephacryl S100分子筛，购于美国GE公司，层析分离人生长激素浓缩液。Sephacryl S100凝胶装于规格为80cm×12cm的纯化柱中，用去离子水平衡2～3个柱体积，上800mL浓缩样品，流速为40mL/min，去离子水洗脱，用核酸蛋白仪检测，收集人生长激素蛋白峰，获得人生长激素粗蛋白液。

（3）重组人生长激素的离子交换层析

将人生长激素粗蛋白液进行阴离子交换层析，填料选用DEAE Sepharose FF，DEAE Sepharose FF购于美国GE公司，用3倍柱体积的pH为7.5的10mmol/L 磷酸盐缓冲液平衡，上样，用10倍柱体积的含1.0mol/L NaCl的pH值为7.5的10mmol/L磷酸盐缓冲液洗脱，收集基因重组人生长激素蛋白液，用分子量为1000D的卷式超滤膜超滤，脱盐，收集浓缩液，冷冻干燥机冻干，得基因重组人生长激素，发酵上清液表达量达890mg/L。基因重组人生长激素的氨基酸序列如前所述。

7、重组人生长激素的检测及鉴定

（1）重组人生长激素的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测

将发酵液上清、纯化后的重组人生长激素使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测方法进行检测，检测方法如下：

将40μL蛋白质样品与10μL 5×上样缓冲液混合，加入水浴锅，100℃加热 5分钟，玻璃板和样品梳用洗涤剂洗净，用二次蒸馏水冲洗3～5次，用乙醇擦拭，晾干，将两块洗净的玻璃板夹好放入制胶模具中，按如下体积配制质量浓度为12％的分离胶10.0 ml，混匀；

二次蒸馏水3.3 mL

1.5 mol/L盐酸缓冲溶液（pH=8.8））2.5mL

质量浓度为30%的丙烯酰胺4.0 mL

质量浓度为10%的十二烷基硫酸钠0.1 mL

质量浓度为10%的过硫酸铵0.1 mL

N,N,N',N'-四甲基乙二胺(TEMED)0.004mL

向玻璃板间灌制5.5mL分离胶，覆一层二次蒸馏水，聚合30 分钟。

按如下体积配制质量浓度为5％浓缩胶3.0 mL，混匀；

二次蒸馏水2.1mL

1.0 mol/L盐酸缓冲溶液（pH=8.8）0.38mL

质量浓度为30%的丙烯酰胺0.5mL

质量浓度为10%的十二烷基硫酸钠0.03 mL

质量浓度为10%的过硫酸铵0.03 mL

N,N,N',N'-四甲基乙二胺(TEMED)0.003mL

将分离胶上层重蒸水倾去，滤纸吸干，灌制浓缩胶，插入样品梳，聚合30分钟。装好电泳系统，加入电极缓冲液，上样50μL/每孔；稳压80V，待溴酚蓝进入浓缩胶，提高电压至120V，待溴酚蓝接近分离胶底部时，停止电泳。卸下胶板，剥离胶片，胶片放入染色液中，室温染色2小时，弃去染色液，加入脱色液，置于80rpm脱色摇床上,每20分钟更换一次脱色液，至蛋白条带清晰可见。用凝胶成像仪进行图像捕捉和分析，电泳结果见图3，由图3可见，在22KD处出现特异性条带，与人生长激素的分子量一致，纯化后的电泳条带经灰度值扫描分析，纯度达90%。

（2）基因重组人生长激素的Western Blot蛋白免疫印迹鉴定

制备SDS-聚丙烯酰胺凝胶凝胶电泳，电泳结束后，取出凝胶，放入电转移缓冲液中浸泡20分钟，同时浸泡6张滤纸，聚偏氟乙烯（PVDF）膜，从负极到正极：三层滤纸-凝胶-聚偏氟乙烯（PVDF）膜-三层滤纸，恒流 300mA，电转移1小时，将PVDF膜用去离子水漂洗干净，将聚偏氟乙烯（PVDF）膜浸泡于含质量浓度为5%牛血清白蛋白的TBS(1.21g三羟甲基氨基甲烷，8.8g氯化钠，加800ml水溶解后用盐酸调pH至7.5，再加水定容至1L)缓冲液中，室温封闭l小时，加入来源于鼠的单克隆抗体(一抗，l:500)，4℃过夜，以TBST（1L TBS中加入0.5ml吐温20）洗膜4次(10分钟/次)，加入辣根过氧化物酶标记兔抗鼠(二抗，l:500)，37℃孵育l小时，以TBST洗膜4次，用底物二氨基联苯胺（DAB）显色，Western Blot鉴定结果见图4，由图4可见，在22KD处有显色，与人生长激素的分子量一致，由此表明，通过上述的制备方法所制备的基因重组人生长激素，能与人生长激素抗体产生免疫反应性，说明获得的是正确人生长激素。

实施例2

在实施例1的基因重组人生长激素的纯化步骤6中，所用的分子截留量为100000D的中空纤维超滤系统用分子截留量为80000D的中空纤维超滤系统替换，所用的分子量为10000D的卷式超滤膜用分子量为6000D的卷式超滤膜替换，该步骤中的其他步骤与实施1相同。其他步骤与相应的实施相同，制备成基因重组人生长激素。

实施例3

在实施例1的基因重组人生长激素的纯化步骤6中，所用的分子截留量为100000D的中空纤维超滤系统用分子截留量为60000D的中空纤维超滤系统替换，该步骤中的其他步骤与实施1相同。其他步骤与相应的实施相同，制备成基因重组人生长激素。