鉴定小菜蛾钠离子通道基因突变的方法及专用引物

摘要

本发明公开了一种鉴定小菜蛾钠离子通道基因突变的方法及专用引物。本发明提供的引物组合物由引物组合物甲和引物组合物乙组成；引物组合物甲由序列1、序列2、序列3、序列4和序列5所示的单链DNA分子组成；引物组合物乙由序列6、序列7、序列8、序列9和序列10所示的单链DNA分子组成。本发明提供的特异引物组合物能够有效鉴定出小菜蛾kdr相关para型钠离子通道基因突变（T929I突变和L1014F突变），对于监测小菜蛾田间种群对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗性基因频率和对拟除虫菊酯类杀虫剂抗药性发生发展动态，及时调整小菜蛾防治策略，指导合理用药、延缓抗性发展具有重要意义。

说明书

技术领域

本发明涉及鉴定小菜蛾(Plutella xylostella)钠离子通道基因突变的方法及专 用引物，具体涉及鉴定小菜蛾kdr相关para型钠离子通道基因的L1014F突变和T929I 突变的方法及其专用引物，本发明提供的方法和专用引物可用于监测小菜蛾对拟除虫 菊酯类药剂的抗性。

背景技术

拟除虫菊酯（pyrethroids）是继有机氯、有机磷和氨基甲酸酯之后的具有生物 活性强、环境相容性高的一类杀虫剂，由于其具有击倒快、毒力强、杀虫谱广、毒性 低和残留少等优点，在农业害虫、林业害虫和卫生害虫的防治上都有广泛使用。随着 菊酯类药剂在全世界范围内的连续、大量和广泛使用，许多防治对象都由于巨大的选 择压力而对其产生了严重抗性。

Kdr（knockdown resistance）最早在家蝇中发现。1951，Busvine观察到家蝇成 虫对DDT和拟除虫菊酯类杀虫剂的快速麻痹和毒杀作用表现出抗性，其后，Milani 对其进行了遗传学分析，认为控制此抗性的基因位于家蝇第III染色体上，为隐性的 击倒抗性基因（kdr基因），并把此抗性称为“击倒抗性”。1978，Sawicki等又发现 对溴氰菊酯产生500多倍抗性的家蝇品系具有超击倒抗性基因（super-kdr基因）。

钠离子通道属电压门控通道，主要调控细胞膜钠离子的瞬时通透性，参与形成细 胞膜动作电位的上升相，在神经兴奋性信号传导中具有重要作用，是拟除虫菊酯和许 多神经毒性药物作用的分子靶标。

自1996年发现家蝇“击倒抗性”与para型钠通道基因（Vsscl)的突变有关后， 至今已在其他13种昆虫的para直向同源钠通道基因序列中发现了20个抗性相关 的点突变。Super-kdr基因中的突变位点在家蝇中为M918T/L1014F，在小菜蛾中为 T929I/L1014F，在人头虱中为T929I/L932F。

中国占有巨大的菊酯类药剂市场份额，是菊酯类药剂的主要应用地之一，而菊酯 类药剂又广泛用于小菜蛾的防治，所以监测小菜蛾对该类药剂的抗性情况对于指导合 理用药、延缓抗性发展具有重要意义，特别是在分子水平上对我国田间小菜蛾菊酯类 药剂抗性频率进行检测，可为实际应用提供更可靠的依据。由于等位特异PCR分子技 术（PASA）快速有效、能处理大批样本、还能区分出SS、RR及杂合子RS，因此被应 用到昆虫抗药性位点突变检测上。

发明内容

本发明的目的是提供一种鉴定小菜蛾钠离子通道基因突变的方法及专用引物。

本发明提供了一种引物组合物（引物组合物丙），由引物组合物甲和引物组合物乙 组成；所述引物组合物甲由序列表的序列1所示的单链DNA分子、序列表的序列2所 示的单链DNA分子、序列表的序列3所示的单链DNA分子、序列表的序列4所示的单 链DNA分子和序列表的序列5所示的单链DNA分子组成；所述引物组合物乙由序列表 的序列6所示的单链DNA分子、序列表的序列7所示的单链DNA分子、序列表的序列 8所示的单链DNA分子、序列表的序列9所示的单链DNA分子和序列表的序列10所示 的单链DNA分子组成。

所述引物组合物丙可用于如下（a）和（b）：（a）鉴定小菜蛾对于钠离子通道基因 自5’末端第12992位核苷酸为CC基因型、TT基因型还是CT基因型；（b）鉴定小菜 蛾对于钠离子通道基因自5’末端第14197位核苷酸为CC基因型、TT基因型还是CT 基因型。

所述引物组合物丙可用于制备试剂盒；所述试剂盒的用途为如下（a）和（b）： （a）鉴定小菜蛾对于钠离子通道基因自5’末端第12992位核苷酸为CC基因型、TT 基因型还是CT基因型；（b）鉴定小菜蛾对于钠离子通道基因自5’末端第14197位核 苷酸为CC基因型、TT基因型还是CT基因型。

本发明还保护引物组合物甲，由序列表的序列1所示的单链DNA分子、序列表的 序列2所示的单链DNA分子、序列表的序列3所示的单链DNA分子、序列表的序列4 所示的单链DNA分子和序列表的序列5所示的单链DNA分子组成。

所述引物组合物甲可用于鉴定小菜蛾对于钠离子通道基因自5’末端第12992位 核苷酸为CC基因型、TT基因型还是CT基因型。

本发明还保护一种鉴定小菜蛾对于钠离子通道基因自5’末端第12992位核苷酸 为CC基因型、TT基因型还是CT基因型的方法（方法甲），包括如下步骤：以待测小 菜蛾的基因组DNA为模板，用序列表的序列1所示的单链DNA分子、序列表的序列2 所示的单链DNA分子和序列表的序列5所示的单链DNA分子进行第一组荧光定量PCR， 用序列表的序列3所示的单链DNA分子、序列表的序列4所示的单链DNA分子和序列 表的序列5所示的单链DNA分子进行第二组荧光定量PCR，如果第一组荧光定量PCR 的溶解曲线在75-80℃之间具有1个峰且第二组荧光定量PCR的溶解曲线在75-80℃之 间不具有峰待测小菜蛾为CC基因型，如果第二组荧光定量PCR的溶解曲线在75-80℃ 之间具有1个峰且第一组荧光定量PCR的溶解曲线在75-80℃之间不具有峰待测小菜 蛾为TT基因型，如果第一组荧光定量PCR的溶解曲线在75-80℃之间具有1个峰且第 二组荧光定量PCR的溶解曲线在75-80℃之间具有1个峰待测小菜蛾为CT基因型。

本发明还保护引物组合物乙，由序列表的序列6所示的单链DNA分子、序列表的 序列7所示的单链DNA分子、序列表的序列8所示的单链DNA分子、序列表的序列9 所示的单链DNA分子和序列表的序列10所示的单链DNA分子组成。

所述引物组合物乙可用于鉴定小菜蛾对于钠离子通道基因自5’末端第14197位 核苷酸为CC基因型、TT基因型还是CT基因型。

本发明还保护一种鉴定小菜蛾对于钠离子通道基因自5’末端第14197位核苷酸 为CC基因型、TT基因型还是CT基因型的方法（方法乙），包括如下步骤：以待测小 菜蛾的基因组DNA为模板，用序列表的序列6所示的单链DNA分子、序列表的序列7 所示的单链DNA分子和序列表的序列10所示的单链DNA分子进行第一组荧光定量PCR， 用序列表的序列8所示的单链DNA分子、序列表的序列9所示的单链DNA分子和序列 表的序列10所示的单链DNA分子进行第二组荧光定量PCR，如果第一组荧光定量PCR 的溶解曲线在70-80℃之间具有1个峰且第二组荧光定量PCR的溶解曲线在70-80℃之 间不具有峰待测小菜蛾为CC基因型，如果第二组荧光定量PCR的溶解曲线在70-80℃ 之间具有1个峰且第一组荧光定量PCR的溶解曲线在70-80℃之间不具有峰待测小菜 蛾为TT基因型，如果第一组荧光定量PCR的溶解曲线在70-80℃之间具有1个峰且第 二组荧光定量PCR的溶解曲线在70-80℃之间具有1个峰待测小菜蛾为CT基因型。

所述引物组合物甲可用于鉴定小菜蛾对拟除虫菊酯杀虫剂（拟除虫菊酯类杀虫剂） 的抗性。

所述方法甲可用于鉴定小菜蛾对拟除虫菊酯杀虫剂（拟除虫菊酯类杀虫剂）的抗 性。TT基因型的小菜蛾对拟除虫菊酯杀虫剂（拟除虫菊酯类杀虫剂）的抗性高于CC 基因型的小菜蛾和CT基因型的小菜蛾。

所述引物组合物乙可用于鉴定小菜蛾对拟除虫菊酯杀虫剂（拟除虫菊酯类杀虫剂） 的抗性。

所述方法乙可用于鉴定小菜蛾对拟除虫菊酯杀虫剂（拟除虫菊酯类杀虫剂）的抗 性。TT基因型的小菜蛾对拟除虫菊酯杀虫剂（拟除虫菊酯类杀虫剂）的抗性高于CC 基因型的小菜蛾和CT基因型的小菜蛾。

所述引物组合物丙可用于鉴定小菜蛾对拟除虫菊酯杀虫剂（拟除虫菊酯类杀虫剂） 的抗性。对于钠离子通道基因自5’末端第12992位核苷酸，TT基因型的小菜蛾对拟 除虫菊酯杀虫剂（拟除虫菊酯类杀虫剂）的抗性高于CC基因型的小菜蛾和CT基因型 的小菜蛾。对于钠离子通道基因自5’末端第14197位核苷酸TT基因型的小菜蛾对拟 除虫菊酯杀虫剂（拟除虫菊酯类杀虫剂）的抗性高于CC基因型的小菜蛾和CT基因型 的小菜蛾。

以上任一所述钠离子通道基因具体可为如下1）或2）或3）的DNA分子：

1）序列表中序列14所示的DNA分子；

2）在严格条件下与1）限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能的蛋白的DNA分 子；

3）与1）或2）限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码具有相同功能的蛋白 的DNA分子。

上述严格条件可为在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65°C下杂交，然后用2×SSC、 0.1%SDS和1×SSC、0.1%SDS各洗膜一次。

本发明提供的特异引物组合物能够有效鉴定出小菜蛾kdr相关para型钠离子通道 基因突变（T929I突变和L1014F突变），从而判断小菜蛾对于拟除虫菊酯类杀虫剂的 抗性或敏感性，具有快速有效、灵敏度高、能处理大批样本的优点，对于监测小菜蛾 田间种群对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗性基因频率和对拟除虫菊酯类杀虫剂抗药性发生 发展动态，及时调整小菜蛾防治策略，指导合理用药、延缓抗性发展具有重要意义。

附图说明

图1为荧光定量PCR的溶解曲线。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明， 均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实 验，结果取平均值。

载体PUC57：生工生物工程(上海)股份有限公司产品，目录号：SD0171。

实施例1、模板的制备

与对拟除虫菊酯类药剂敏感的小菜蛾相比，对拟除虫菊酯类药剂具有抗性的小菜 蛾的kdr相关para型钠离子通道基因（该基因的基因组DNA如序列表的序列14所示， 编码序列表的序列13所示的蛋白质）中发生了两个核苷酸突变，即该基因自5’末端 第12992位核苷酸由C突变为T（导致相应蛋白质自N末端第877位氨基酸残基由苏 氨酸突变为异亮氨酸；T929I突变），第14197位核苷酸由C突变为T（导致相应蛋白 质自N末端第962位氨基酸残基由亮氨酸突变为苯丙氨酸；L1014F突变）。

1、合成序列表的序列11所示的双链DNA分子，并将其插入载体PUC57的StuI 和SmaI酶切位点之间，得到敏感质粒。

2、合成序列表的序列12所示的双链DNA分子，并将其插入载体PUC57的StuI 和SmaI酶切位点之间，得到抗性质粒。

实施例2、引物的设计

根据突变体小菜蛾kdr相关para型钠离子通道基因的序列设计allele specific-PCR引物。

引物SF929和引物R929的靶序列中包括T929I突变，引物SF929的3’端第一个 核苷酸（见下划线标注）与突变前的核苷酸一致，引物CSF929为引物SF929的反向互 补序列。引物RF929和引物R929的靶序列中包括T929I突变，引物RF929的3’端第 一个核苷酸（见下划线标注）与突变后的核苷酸一致，引物CRF929为引物RF929的反 向互补序列。

引物SF1014和引物R1014的靶序列中包括L1014F突变，引物SF1014的3’端第 一个核苷酸（见下划线标注）与突变前的核苷酸一致，引物CSF1014为引物SF1014 的反向互补序列。引物RF1014和引物R1014的靶序列中包括L1014F突变，引物RF1014 的3’端第一个核苷酸（见下划线标注）与突变后的核苷酸一致，引物CRF1014为引 物RF1014的反向互补序列。

各个引物的核苷酸序列见表1。

表1各个引物的核苷酸序列

引物 序列(5'-3') SF929 GCCTTGGGCAACCTGAC（序列1） CSF929 GTCAGGTTGCCCAAGGC（序列2） RF929 GCCTTGGGCAACCTGAT（序列3） CRF929 ATCAGGTTGCCCAAGGC（序列4） R929 CACTCCCACCAATTTCACTTAC（序列5） SF1014 CGTCGTCATTGGCAACC（序列6） CSF1014 GGTTGCCAATGACGACG（序列7） RF1014 CCGTCGTCATTGGCAACT（序列8） CRF1014 AGTTGCCAATGACGACGG（序列9） R1014 CTCAAACCAGGGCAAACAC（序列10）

实施例3、引物的应用

分别以实施例1制备的敏感质粒或抗性质粒为模板，采用引物SF929、引物CSF929 和引物R929组成的引物组合物（T929I突变敏感引物组合物），在ABI 7500荧光定量 PCR仪中进行PCR扩增。PCR扩增体系见表2。

表2PCR扩增体系（20μl）

分别以实施例1制备的敏感质粒或抗性质粒为模板，采用引物RF929、引物CRF929 和引物R929组成的引物组合物（T929I突变抗性引物组合物），在ABI 7500荧光定量 PCR仪中进行PCR扩增。PCR扩增体系见表3。

表3PCR扩增体系（20μl）

分别以实施例1制备的敏感质粒或抗性质粒为模板，采用引物SF1014、引物 CSF1014和引物R1014组成的引物组合物（L1014F突变敏感引物组合物），在ABI 7500 荧光定量PCR仪中进行PCR扩增。PCR扩增体系见表4。

表4PCR扩增体系（20μl）

分别以实施例1制备的敏感质粒或抗性质粒为模板，采用引物RF1014、引物 CRF1014和引物R1014组成的引物组合物（L1014F突变抗性引物组合物），在ABI 7500 荧光定量PCR仪中进行PCR扩增。PCR扩增体系见表5。

表5PCR扩增体系（20μl）

以上各个体系进行荧光定量PCR的反应条件均见表6。

表6各个体系进行荧光定量PCR的反应条件

退火温度为65℃时的结果见图1。图1A为以敏感质粒或抗性质粒为模板，采用 T929I突变敏感引物组合物进行荧光定量扩增的溶解曲线图。图1B为以敏感质粒或抗 性质粒为模板，采用T929I突变抗性引物组合物进行荧光定量扩增的溶解曲线图。图 1C为以敏感质粒或抗性质粒为模板，采用L1014F突变敏感引物组合物进行荧光定量 扩增的溶解曲线图。图1D为以敏感质粒或抗性质粒为模板，采用L1014F突变抗性引 物组合物进行荧光定量扩增的溶解曲线图。

以敏感质粒为模板，用T929I突变敏感引物组合物进行荧光定量PCR，融解曲线 在大约77℃有个典型的尖峰。以抗性质粒为模板，用T929I突变敏感引物组合物进行 荧光定量PCR，融解曲线呈本底水平，在77℃未见到明显的峰。因此所述T929I突变 敏感引物组合物适用未发生T929I突变的检测。

以抗性质粒为模板，用T929I突变抗性引物组合物进行荧光定量PCR，融解曲线 在大约77℃有个典型的尖峰。以敏感质粒为模板，用T929I突变抗性引物组合物进行 荧光定量PCR，融解曲线呈本底水平，在77℃未见到明显的峰。因此所述T929I突变 抗性引物组合物适用发生T929I突变的检测。

以敏感质粒为模板，用L1014F突变敏感引物组合物进行荧光定量PCR，融解曲线 在大约75℃有个典型的尖峰。以抗性质粒为模板，用L1014F突变敏感引物组合物进 行荧光定量PCR，融解曲线呈本底水平，在75℃未见到明显的峰。因此所述L1014F 突变敏感引物组合物适用未发生L1014F突变的检测。

以抗性质粒为模板，用L1014F突变抗性引物组合物进行荧光定量PCR，融解曲线 在大约75℃有个典型的尖峰。以敏感质粒为模板，用L1014F突变抗性引物组合物进 行荧光定量PCR，融解曲线呈本底水平，在75℃未见到明显的峰。因此所述L1014F 突变抗性引物组合物适用发生L1014F突变的检测。

结果表明：T929I突变敏感引物组合物对只对敏感质粒进行扩增，其融解曲线大 约在77℃有个典型的尖峰；L1014F突变敏感引物组合物只对敏感模板进行扩增，其融 解曲线大约在75℃有个典型的尖峰；T929I突变抗性引物组合物只对抗性模板进行扩 增，其融解曲线大约在77℃有个典型的尖峰；L1014F突变抗性引物组合物只能对抗性 模板进行扩增，其融解曲线大约在75℃有个典型的尖峰。上述敏感引物组合物和抗性 引物组合物能很好地区分等位基因，选用相应专用引物组合物用于T929I和L1014F 等位基因突变的检测，即可以特异性地检测小菜蛾是否对拟除虫菊酯类药剂产生了抗 药性。

将已经过拟除虫菊酯类药剂鉴定（对拟除虫菊酯类药剂敏感）和测序鉴定（对于 钠离子通道基因自5’末端第12992位核苷酸为CC基因型且对于钠离子通道基因自5’ 末端第14197位核苷酸为CC基因型）的小菜蛾提取基因组DNA，将基因组DNA作为模 板，并按照上述方法进行荧光定量PCR，各个结果与敏感质粒的结果一致。

将已经过拟除虫菊酯类药剂鉴定（对拟除虫菊酯类药剂具有抗性）和测序鉴定（对 于钠离子通道基因自5’末端第12992位核苷酸为TT基因型且对于钠离子通道基因自 5’末端第14197位核苷酸为TT基因型）的小菜蛾提取基因组DNA，将基因组DNA作 为模板，并按照上述方法进行荧光定量PCR，各个结果与抗性质粒的结果一致。