一种长白山杜鹃花属植物菌根化苗的工厂化方法

摘要

本发明涉及一种植物繁殖领域，即一种长白山杜鹃花属植物菌根化苗的工厂化方法。其步骤如下：（1）取长白山杜鹃花属植物枝条处理后作为外植体备用。（2）茎段生根同时腋芽萌发生长的培养基：基本培养基中附加激动素KT(0.03～0.010mg·L-1)、吲哚丁酸IBA(0.10～0.45mg·L-1)、萘乙酸NAA(0.06～0.13mg·L-1)、赤霉素GA3(1.40～2.60mg·L-1)、琼脂粉7.8g·L-1、添加蔗糖10.0g·L-1，调节pH值至5.6；光照周期9h·d-1、光照强度1000lx和温度(23±2)℃条件下培养。（3）组培苗的菌根化。（4）组培苗的栽培，扩繁，实现杜鹃花菌根化苗的工厂化生产。对杜鹃花属植物进行菌根化处理，成活率高，实现快速繁殖，最终实现长白山9种杜鹃花菌根化苗的工厂化生产。

说明书

 

技术领域　

本发明涉及一种植物繁殖领域，即一种长白山杜鹃花属植物菌根化苗的工厂化方法。 

背景技术

在现有技术中，长白山杜鹃花属植物包括牛皮杜鹃(Rhododendron chrysanthum Pall.)、短果杜鹃(Rhododendron brachycarpum D. Don)、照白杜鹃(Rhododendron micranthum Turcz.)、小叶杜鹃(Rhododendron parvifolium Adams.)、大字杜鹃(Rhododendron schlippenbachii Maxim.)、兴安杜鹃(Rhododendron dauricum L.)、迎红杜鹃(Rhododendron mucronulatum Turcz.)、毛毡杜鹃(Rhododendron confertissimum Nakai)和苞叶杜鹃(Rhododendron redowskianum Maxim.)等共有9个种，均为吉林省重点保护植物，其中牛皮杜鹃和苞叶杜鹃为我国国家三级保护的珍贵稀有植物，短果杜鹃为长白山区珍贵稀有植物。其中，牛皮杜鹃、毛毡杜鹃、照白杜鹃和小叶杜鹃是常绿灌木，短果杜鹃为常绿小乔木，兴安杜鹃为半常绿灌木。牛皮杜鹃、苞叶杜鹃和毛毡杜鹃分布海拔达2500米高，属高山杜鹃。牛皮杜鹃、大字杜鹃、照白杜鹃、小叶杜鹃、迎红杜鹃和兴安杜鹃全株挥发油含量较高，为精油和药用植物。这9种杜鹃均可通过人工引种驯化为园林绿化植物，具有重要的社会、经济和生态价值。

以上9种杜鹃对水土保持和维持生态平衡起重要作用，是杜鹃花育种的种质资源。但其在我国分布甚狭，仅在长白山有较大种群分布，其它地区仅为零星分布，由于人们乱采乱挖，野生资源遭到极大威胁。这9种杜鹃花种子细小，萌发率低，萌发后形成的小苗成活率极低；扦插繁殖需要大量的野生杜鹃枝条，对野生资源破坏极大，且生根率和移栽成活率极低；而利用组织培养技术进行繁殖，具有年产试管苗量大，速度快等优点，但仍存在炼苗移栽成活率低、生长缓慢等问题，这就导致推广应用受到一定的限制。

经过大量实验研究发现，杜鹃花根系没有根毛，吸收水分、大量元素、微量元素和有机物质等营养成分能力比具有根毛的根系小得多。但自然条件下，杜鹃花细根都有杜鹃花类EM(Eriocdimyochrriaz，EM)内生菌根真菌的寄生，从而克服了杜鹃由于根系不发达而造成的对营养物质吸收困难。对杜鹃花属植物菌根化处理有利于提高成活率。

发明内容

本发明的目的是针对上述不足而提供一种对杜鹃花属植物菌根化处理，实现菌根化苗的快速繁殖，成活率高的长白山杜鹃花属植物菌根化苗的工厂化方法。

本发明的技术解决方案是：一种长白山杜鹃花属植物菌根化苗的工厂化方法，其特征在于步骤如下：

（1）取长白山杜鹃花属植物枝条，水培促其侧芽萌发生长，将鲜嫩的侧芽剪下处理，切割成1叶1段作为外植体备用。

（2）培养基（茎段生根同时腋芽萌发生长培养基）：87 mg·L^-1(NH₄)₂SO₄，375 mg·L^-1NH₄NO₃，180 mg·L^-1KNO₃，320 mg·L^-1CaCl₂·2H₂O，245 mg·L^-1MgSO₄·7H₂O，436 mg·L^-1KH₂PO₄；18.4 mg·L^-1FeSO₄·7H₂O，24.9 mg·L^-1Na₂·EDTA·2H₂O；12.4 mg·L^-1MnSO₄·4H₂O，7.2 mg·L^-1ZnSO₄·7H₂O，5.7 mg·L^-1H₃BO₃，0.32 mg·L^-1KI，0.05 mg·L^-1Na₂MO₄·2H₂O；培养基中附加激动素KT(0.03～0.010 mg·L^-1)、吲哚丁酸IBA(0.10～0.45 mg·L^-1)、萘乙酸NAA(0.06～0.13 mg·L^-1)、赤霉素GA₃(1.40～2.60 mg·L^-1)、琼脂粉7.8 g·L^-1、添加蔗糖10.0 g·L^-1，调节pH值至5.6；光照周期9 h·d^-1、光照强度1000 lx和温度(23±2) ℃条件下培养。

（3）试管苗的菌根化：将试管苗从培养瓶中取出，用清水洗净根部琼脂，再放入菌液中浸泡18～24 h；所述菌液组分与配置为：1000 mL培养基的成分及含量为：KH₂PO₄380 mg，MgSO₄·7H₂O149 mg，维生素C26 mg，泛酸钙67 mg，烟酸1.4 mg，蛋白胨3.0 g，葡萄糖16.5 g；将含有六个菌种接入液体基本培养基的三角锥形瓶中进行混合培养，得到液体菌种母液；再将液体菌种母液500 mL，红糖500 g溶解后，加水至50 L发酵7～10 d后即成菌液；六种主要杜鹃花类菌根真菌是从长白山9种野生杜鹃花科植物根部分离纯化获得，分别为Phialocephala fortinii，Pezizilla ericace，Oidiodendron maius，Meliniomyces variabilis，Cryptosporiopsis ercae，Acaulospora lacunosa。

（4）菌根化苗的栽培：把步骤（3）菌根化后的试管苗栽植到已用菌液灌透的基质中，基质为腐殖土、腐熟松针和蛭石，比例为3:2:1，覆盖透光性好的塑料薄膜保温保湿，开始温度控制在(25±2) ℃，15 d后温度控制在(20±2) ℃，保持相对湿度在70%～75%之间，10 h·d^-1的自然光照；扩繁，实现杜鹃花菌根化苗的工厂化生产。

所述的杜鹃花属植物为牛皮杜鹃，茎段生根同时腋芽萌发生长的培养基为：培养基＋KT(0.13～0.14 mg·L^-1)＋IBA(0.05～0.08 mg·L^-1)＋GA₃(2.70～2.90 mg·L^-1)。

所述的杜鹃花属植物为短果杜鹃，茎段生根同时腋芽萌发生长的培养基是：培养基＋KT(0.09～0.12 mg·L^-1)＋IBA(0.03～0.07 mg·L^-1)＋GA₃(2.80～3.00 mg·L^-1)。

所述的杜鹃花属植物为照白杜鹃，茎段生根同时腋芽萌发生长的培养基是：培养基＋IAA(0.20～0.25 mg·L^-1)＋NAA(0.02～0.05 mg·L^-1)＋GA₃(2.30～2.60 mg·L^-1)。

所述的杜鹃花属植物为小叶杜鹃，茎段生根同时腋芽萌发生长的培养基是：培养基＋KT(0.08～0.12 mg·L^-1)＋IBA(0.15～0.20 mg·L^-1)＋GA₃(2.00～2.30 mg·L^-1)

所述的杜鹃花属植物为大字杜鹃，茎段生根同时腋芽萌发生长的培养基是：培养基＋KT(0.07～0.10 mg·L^-1)＋NAA(0.01～0.03 mg·L^-1)＋GA₃(2.20～2.50 mg·L^-1)。

所述的杜鹃花属植物为兴安杜鹃，茎段生根同时腋芽萌发生长的培养基是：培养基＋NAA(0.02～0.04 mg·L^-1)＋GA₃(1.00～1.50 mg·L^-1)。

所述的杜鹃花属植物为迎红杜鹃，茎段生根同时腋芽萌发生长的培养基是：培养基＋KT(0.03～0.06 mg·L^-1)＋NAA(0.03～0.07 mg·L^-1)＋GA₃(0.09～1.30 mg·L^-1)。

所述的杜鹃花属植物为毛毡杜鹃，茎段生根同时腋芽萌发生长的培养基是：培养基＋KT(0.08～0.12 mg·L^-1)＋NAA(0.05～0.07 mg·L^-1)＋GA₃(1.80～2.00 mg·L^-1)。

所述的杜鹃花属植物为苞叶杜鹃，茎段生根同时腋芽萌发生长的培养基是：培养基＋IAA(0.14～0.18 mg·L^-1)＋GA₃(1.30～1.80 mg·L^-1)。

本发明将杜鹃花的组培快繁技术和组培苗菌根化技术相结合，开展杜鹃花菌根化苗的快速繁殖。即利用1种培养基在试管内同时完成杜鹃花嫩茎段生根和腋芽萌发生长后，待杜鹃花试管苗扩繁到需要数量且苗高长到一定高度时，将试管苗从培养瓶中取出，放入自制的菌液中浸泡后栽植到草炭土、腐烂松针和河砂的混合基质中，在自然光照下，保湿保温即可完成杜鹃花菌根化苗的快速繁殖，并提高成活率。

本发明的优点是：内生菌根真菌的寄生改善了植株营养状况，调节代谢活性，提高肥料利用率，增强植株抗逆性，可加促进杜鹃花的生长发育，提高移栽苗成活率，节约生产成本，增加经济效益，实现长白山9种杜鹃花菌根化苗的工厂化生产。 

下面将结合实施例对本发明的实施方式作进一步详细描述。 

具体实施方式

一种长白山杜鹃花属植物菌根化苗的工厂化方法，步骤如下：

1 材料与处理

于长白山区采集牛皮杜鹃(Rhododendron chrysanthum Pall.)、短果杜鹃(Rhododendron brachycarpum D. Don)、照白杜鹃(Rhododendron micranthum Turcz.)、小叶杜鹃(Rhododendron parvifolium Adams.)、大字杜鹃(Rhododendron schlippenbachii Maxim.)、兴安杜鹃(Rhododendron dauricum L.)、迎红杜鹃(Rhododendron mucronulatum Turcz.)、毛毡杜鹃(Rhododendron confertissimum Nakai)和苞叶杜鹃(Rhododendron redowskianum Maxim.)等9个种的杜鹃花枝条，并将枝条顶芽去除，在500倍液的赤霉素溶液中水培促其侧芽萌发生长。待侧芽萌发长至2.50～3.00 cm时，将鲜嫩的侧芽剪下，去除嫩叶及叶柄，用70%乙醇（体积分数）涮洗30 s，移至饱和次氯酸钠溶液中浸泡10 min，无菌水冲洗8次，无菌滤纸吸干表面水分，去除被乙醇和次氯酸钠毒伤的组织后切割成1叶1段作为外植体备用。

2 方法

2.1  9种杜鹃花的快速繁殖

培养基成分和含量：87 mg·L^-1(NH₄)₂SO₄，375 mg·L^-1NH₄NO₃，180 mg·L^-1KNO₃，320 mg·L^-1CaCl₂·2H₂O，245 mg·L^-1MgSO₄·7H₂O，436 mg·L^-1KH₂PO₄；18.4 mg·L^-1FeSO₄·7H₂O，24.9 mg·L^-1Na₂·EDTA·2H₂O；12.4 mg·L^-1MnSO₄·4H₂O，7.2 mg·L^-1ZnSO₄·7H₂O，5.7 mg·L^-1H₃BO₃，0.32 mg·L^-1KI，0.05 mg·L^-1Na₂MO₄·2H₂O。培养基中附加激动素KT(0.03～0.010 mg·L^-1)、吲哚丁酸IBA(0.10～0.45 mg·L^-1)、萘乙酸NAA(0.06～0.13 mg·L^-1)和赤霉素GA₃(1.40～2.60 mg·L^-1)，琼脂粉7.8 g·L^-1，添加蔗糖10.0 g·L^-1，调节pH值至5.6，9种杜鹃花嫩茎段在光照周期9 h·d^-1、光照强度1000 lx和温度(23±2) ℃条件下培养。进而筛选并确定9种杜鹃花茎段生根和腋芽萌发生长的激动素、吲哚丁酸、萘乙酸和赤霉素最佳浓度配比。

待9种杜鹃花茎段生根和腋芽萌发生长至2.00～3.50 cm时，腋芽发出5～7个叶时，将腋芽留1叶剪下苗干，再将苗干切割成1叶1段后，再次将小茎段转接到相应的茎段生根和腋芽萌发生长培养基中进行组培苗的快繁，以获得大量的杜鹃花小植株。

2.2  菌液组分与配置

基本培养基成分及含量(1000 mL培养基的含量)为：KH₂PO₄380 mg，MgSO₄·7H₂O149 mg，维生素C26 mg，泛酸钙67 mg，烟酸1.4 mg，蛋白胨3.0 g，葡萄糖16.5 g。

从长白山9种野生杜鹃花科植物根部分离纯化获得6种主要杜鹃花类菌根真菌的优势种，分别为Phialocephala fortinii，Pezizilla ericace，Oidiodendron maius，Meliniomyces variabilis，Cryptosporiopsis ercae，Acaulospora lacunosa。

将含有6个菌种到液体基本培养基的三角锥形瓶中进行混合培养，得到液体菌种母液，再将液体菌种母液500 mL，红糖500 g溶解后，加水至50 L发酵7～10 d后即成菌液。

2.3  9种杜鹃花的组培苗的菌根化和栽培

即利用9种杜鹃花嫩茎段在试管内同时完成茎段生根和腋芽萌发生长后，待杜鹃花试管苗扩繁到需要数量且苗高长到2.50 cm以上时，将试管苗从培养瓶中取出，用清水洗净根部琼脂，再放入菌液中浸泡（菌液含有Phialocephala fortinii，Pezizilla ericace，Oidiodendron maius，Meliniomyces variabilis，Cryptosporiopsis ercae，Acaulospora lacunose 6种杜鹃花类菌根真菌，均等比例。其它成份1000mL中含有KH₂PO₄380 mg，MgSO₄·7H₂O149 mg，维生素C26 mg，泛酸钙67 mg，烟酸1.4 mg，蛋白胨3.0 g，葡萄糖16.5 g，琼脂粉8.5 g，1.5%脱氧胆酸钠溶液4 mL和0.05 mg吲哚乙酸），取出栽植到已用菌液灌透的基质（基质为腐殖土、腐熟松针和蛭石）中，覆盖透光性好的塑料薄膜保温保湿，置于自然光照条件下，湿度过高或中午温度升高时，将薄膜打开小口进行换气通风，湿度降低时，可在早上喷洒适量清水。

3  结果

3.1  长白山9种杜鹃茎段生根同时腋芽萌发生长的培养基

牛皮杜鹃茎段生根同时腋芽萌发生长的培养基为：培养基＋KT(0.13～0.14 mg·L^-1)＋IBA(0.05～0.08 mg·L^-1)＋GA₃(2.70～2.90 mg·L^-1)。嫩茎段平均生根率99.9%，腋芽萌发后的平均生长长度为3.06 cm。

短果杜鹃茎段生根同时腋芽萌发生长的培养基是：培养基＋KT(0.09～0.12 mg·L^-1)＋IBA(0.03～0.07 mg·L^-1)＋GA₃(2.80～3.00 mg·L^-1)。嫩茎段平均生根率99.7%，腋芽萌发后的平均生长长度为3.17 cm。

照白杜鹃茎段生根同时腋芽萌发生长的培养基是：培养基＋IAA(0.20～0.25 mg·L^-1)＋NAA(0.02～0.05 mg·L^-1)＋GA₃(2.30～2.60 mg·L^-1)。嫩茎段平均生根率99.4%，腋芽萌发后的平均生长长度为3.22 cm。

小叶杜鹃茎段生根同时腋芽萌发生长的培养基是：培养基＋KT(0.08～0.12 mg·L^-1)＋IBA(0.15～0.20 mg·L^-1)＋GA₃(2.00～2.30 mg·L^-1)。嫩茎段平均生根率99.5%，腋芽萌发后的平均生长长度为2.96 cm。

大字杜鹃茎段生根同时腋芽萌发生长的培养基是：培养基＋KT(0.07～0.10 mg·L^-1)＋NAA(0.01～0.03 mg·L^-1)＋GA₃(2.20～2.50 mg·L^-1)。嫩茎段平均生根率99.9%，腋芽萌发后的平均生长长度为2.87 cm。

兴安杜鹃茎段生根同时腋芽萌发生长的培养基是：培养基＋NAA(0.02～0.04 mg·L^-1)＋GA₃(1.00～1.50 mg·L^-1)。嫩茎段平均生根率99.5%，腋芽萌发后的平均生长长度为3.30 cm。

迎红杜鹃茎段生根同时腋芽萌发生长的培养基是：培养基＋KT(0.03～0.06 mg·L^-1)＋NAA(0.03～0.07 mg·L^-1)＋GA₃(0.09～1.30 mg·L^-1)。嫩茎段平均生根率99.0%，腋芽萌发后的平均生长长度为3.37 cm。

毛毡杜鹃茎段生根同时腋芽萌发生长的培养基是：培养基＋KT(0.08～0.12 mg·L^-1)＋NAA(0.05～0.07 mg·L^-1)＋GA₃(1.80～2.00 mg·L^-1)。嫩茎段平均生根率99.6%，腋芽萌发后的平均生长长度为2.80 cm。

苞叶杜鹃茎段生根同时腋芽萌发生长的培养基是：培养基＋IAA(0.14～0.18 mg·L^-1)＋GA₃(1.30～1.80 mg·L^-1)。嫩茎段平均生根率99.8%，腋芽萌发后的平均生长长度为2.77 cm。

3.2  9种杜鹃花菌根化苗的快速繁殖、炼苗和移栽

按2.1、2.2和2.3中的方法，当9种杜鹃花种苗扩繁到需要数量后，均选取2.50～3.00 cm以上的健壮小植株洗净根部琼脂后，将小植株放入菌液中浸泡18～24 h，取出栽植到已用菌液灌透的基质（基质为腐殖土、腐熟松针和蛭石，比例为3:2:1）中，覆盖透光性好的塑料薄膜保温保湿，开始温度控制在(25±2) ℃，以利于均与真菌的生长和杜鹃花根的共建，15 d后温度控制在(20±2) ℃，保持相对湿度在70%～75%之间，10 h·d^-1的自然光照，湿度过高或中午温度升高时，将薄膜打开小口进行换气通风，湿度降低时，可在早上喷洒适量清水，成活率均达97.8%以上，并且长势极强。

平均按每瓶接种12个茎段，平均28天为1个周期，每个茎段在1个培养周期内平均可平均切割成7段计算，每年有n个周期（9种杜鹃每年均为12个周期）进行扩繁，年生产杜鹃菌根花苗数为：∑年产菌根苗=12×7ⁿ×97.8%株，可见本发明可以满足长白山9种杜鹃花菌根化苗的工厂化生产。