一种作用革兰氏阳性菌的新抗生素及其制备方法和应用

摘要

本发明提供了一种作用革兰氏阳性菌的新抗生素，还提供了一种生产该新抗生素的生产菌株——壮观链霉菌（Streptomycesspectabilis）zgd-Q，于2012年9月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCCNo.M2012328。本发明特点是通过培养CCTCCNo.M2012328，再从其发酵液中分离、纯化提取物，得到分子式为C

说明书

(一)技术领域：本发明涉及一新菌株保藏号为CCTCC NO.M2012328的壮观链霉菌（Streptomyces spectabilis）zgd-Q，还涉及通过培养该新菌株得到一种作用革兰氏阳性菌的新的抗生素及其制备方法和其在作用革兰氏阳性菌方面的应用。 

(二)背景技术：壮观链霉菌（Streptomyces spectabilis）因产生非常壮观的红色而得名。在上世纪六十年代被发现产生一种广谱性氨基环醇类抗生素—大观霉素，大观霉素（Spectinomycin），又名壮观霉素，其对多数的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有活性，并对由这些细菌引起的感染效果较好。在临床上对肺炎杆菌、流感杆菌、支原体均有较好的抑制作用，特别是对淋球菌的效果较佳，因此作为特效药用于治疗由淋球菌引起的尿路感染、尿道炎、子宫颈炎、直肠炎等疾病。 

随着大量微生物次级代谢产物的分离,从自然界直接分离具有新结构、新活性化合物变得越来越困难,已知结构化合物分离的重复性很高。另一方面,病原微生物的耐药性日益严重,伴随着多药耐药性超级细菌不断出现,如何利用已有资源,定向创造新结构、新活性化合物以及提高微生物次级代谢产物的产量,成为当务之急。 

(三)发明内容：本发明的目的在于提供一种不同于己知抗生素结构的新的抗生素及其制备方法和其在作用革兰氏阳性菌的应用。 

本发明还提供一种该新的抗生素的生产菌株——壮观链霉菌（Streptomycesspectabilis）zgd-Q。 

本发明采用的一种壮观链霉菌（Streptomyces spectabilis）zgd-Q，己保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市珞珈山武汉大学菌种保存中心，430072，保藏日期2012年9月13日，保藏编号CCTCC NO:M 2012328。该菌种CCTCC NO:M2012328应用于生产作用革兰氏阳性菌的新的抗生素。 

本发明的主要技术方案为：通过培养壮观链霉菌（Streptomyces spectabilis）zgd-Q，CCTCC NO:M2012328，再从其发酵液中分离、纯化，得到作用革兰氏阳性菌的新的抗生素。 

本发明的新的抗生素是曲张链丝菌素的结构类似物，分子式为C₃₉H₄₉NO₁₄，分子量为755，[M+K]⁺为794，化学名为：17-羰基-19-甲氧基-曲张链丝菌素F，其结构 式为： 

本发明菌株CCTCC NO:M2012328，由如下方法获得： 

本发明的作用革兰氏阳性菌的新的抗生素的生产菌株CCTCC NO:M 2012328可以这样得到：出发菌株经过N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍（简称‘亚硝基胍’、NTG）、 ⁶⁰Coγ-射线诱变处理，将诱变处理后的孢子涂布于不同抗性药物的抗性平板或无药平板上，经过继代培养后获得不同药物的抗性突变菌株或不产生红色的色素突变株。不同突变菌株之间通过多轮的基因组改组育种，通过单菌落琼脂块抑菌圈法初筛、摇瓶发酵液生物效价测定法复筛高产抑菌物质的突变菌株。用于筛选的出发菌株为实验室筛选保藏的壮观链霉菌（Streptomyces spectabilis），用于筛选的抗性标记药物有链霉素（streptomycin）、氯霉素（chloramphenicol）、庆大霉素（gentamicin）、利福平（rifampicin）、夫西地酸（fusidic acid）、巴龙霉素（paromomycin）、新霉素（neomycin）和大观霉素（spectinomycin）等。用于筛选的指示菌为大肠杆菌(Escherichia coli)和藤黄八叠球菌(Micrococcus luteus)。 

“核糖体工程”是研究核糖体结构上的突变对微生物次级代谢调控作用的影响，是一种微生物推理育种的新方法。作用核糖体的抗生素包括链霉素（streptomycin，Str）、红霉素（erythromycin，Ery）、庆大霉素（gentamicin，Gen）、利福平（rifampicin，Rif）、大观霉素（spectinomycin，Spe）、巴龙霉素（paromomycin，Par）、新霉素（neomycin，Neo）和林肯霉素（lincomycin，Lin）等。如果微生物对这些抗生素产生抗性，即表明该微生物的核糖体结构可能已发生改变，其蛋白质合成能力和次级代谢产物合成的调控也会受到影响，进而可筛选获得微生物代谢产物合成能力有所提高或合成新活性物质的菌株。 

1.本发明菌株CCTCC NO:M2012328的培育方法： 

（1）出发菌株：壮观链霉菌（Streptomyces spectabilis）（菌落红色、中间皱褶隆 起，大观霉素抗性为1500U/L）。 

（2）⁶⁰Coγ-射线诱变：壮观链霉菌原始菌株经自然分离的平板用1kGy⁶⁰Coγ射线，垂直距离1m照射1h。取诱变后平板一小块菌体置于含无菌生理盐水和玻璃珠的50mL三角瓶中，打散成单细胞悬浮液后稀释成10^-1、10^-2、10^-3三个浓度，各取0.2mL涂布于链霉素（streptomycin）、氯霉素（chloramphenicol）、庆大霉素（gentamicin）、利福平（rifampicin）、夫西地酸（fusidic acid）、巴龙霉素（paromomycin）、新霉素（neomycin）和大观霉素（spectinomycin）平板上，倒置平板于28℃培养3d，挑单菌落在同等条件下进行继代培养5代后进行复筛抗性稳定的菌株。得到抗性菌落、无色菌落、中间凸起无皱褶等Ws系列突变菌株。 

（3）亚硝基胍诱变：壮观链霉菌原始菌株斜面培养6d，生理盐水5mL洗涤培养斜面，制成浓度为10⁸的孢子悬液。孢子悬液在生理盐水中培养3～5h后涂平板，培养基配方为：牛肉膏0.1%，可溶性淀粉2.0%，K₂HPO₄0.05%，MgSO₄0.05%，NaCl 0.05%，FeSO₄.7H₂O 0.001%，胰蛋白胨0.2%，pH 7.2（上述百分比浓度为质量体积百分比，下同。某组分浓度1%表示100mL培养基中含有1g该物质）。平板置于安全柜中，待培养基表面干燥后进行亚硝基胍诱变。具体操作方法可参考（沈萍，陈向东，微生物学实验，高等教育出版社）。诱变后处理的菌株分别涂布于链霉素（streptomycin）、氯霉素（chloramphenicol）、庆大霉素（gentamicin）、利福平（rifampicin）、夫西地酸（fusidic acid）、巴龙霉素（paromomycin）、新霉素（neomycin）和林肯霉素（lincomycin）大观霉素（spectinomycin）平板上。抗性菌株在抗性平板上经过连续的5代继代培养，获得抗性菌株和菌落形态突变株（即黄色有皱褶的突变菌株和菌落粉色有皱褶的突变菌株两种突变株）。 

（4）基因组重排：分别培养上述各突变菌株于S培养基（配方为：酵母膏0.4%，葡萄糖1.0%，蛋白胨0.4%，MgSO₄·7H₂O 0.05%，KH₂PO₄0.2%，K₂HPO₄0.4%，pH7.0），培养温度为30℃、180rpm、黑暗培养20～36h，离心收集菌丝体，用1.5mg/L的溶菌酶高渗缓冲液35℃下处理20min，用高渗P溶液洗涤原生质体3次，再等量混合上述各突变株的原生质体（每种突变菌株的原生质数量为10⁸）于35%分子量4000的PEG中促融合。上述获得的融合子分别涂布于链霉素（streptomycin）、氯霉素（chloramphenicol）、庆大霉素（gentamicin）、利福平（rifampicin）、夫西地酸（fusidicacid）、巴龙霉素（paromomycin）、新霉素（neomycin）和大观霉素（spectinomycin）平板上，30℃、培养7天后挑选抗性菌株。在抗性平板上继代3代后，抑菌圈法初步评价抗性菌株的抑菌能力，筛选5株抑菌能力最强的菌株制备抗性菌株的原生质体， 进行新的一轮菌株间的基因组重排（原生质体制备和融合方法与前面相同）。如此进行连续的4轮基因组重排，获得稳定的抗性菌株，经过初筛、摇瓶发酵复筛获得高产抗生素菌株zgd-Q。 

所述高渗P溶液配方：蔗糖103g，K₂SO₄0.25g，MgCl₂.6H₂O 2.02g，微量元素溶液2mL[1L微量元素溶液中含有ZnCl₂40mg,FeCl₃.6H₂O 200mg，CuCl₂.2H₂O10mg，MnCl₂.4H₂O 10mg，Na₂B₄O₇.10H₂O 10mg，（NH₄）₆Mo₇O₂₄.4H₂O 10mg]，用蒸馏水定容至800mL，然后分装成80mL/瓶于121℃灭菌20min。使用前每瓶加入灭好菌的KH₂PO₄（0.5%）1mL，CaCl₂·2H₂O（3.68%）10mL，TES缓冲液（2%Ttris，调节pH7.2）10mL。 

关于菌株选育方法，现有技术中，仅有采用物理化学诱变后筛选大观霉素高产突变株，标记比较单一，如： 

（1）刘伟，大观霉素优良菌株的培养，赤峰学院学报，2005，21（5）：87~88； 

（2）于广成，王建华，邵淑田，壮观霉素自身耐药高产菌株的选育，中国医药工业杂志，1994，25（2）：58~61； 

（3）韩香玲，曲音波，孙树申，张焕青，大观霉素高产菌株的选育，华中农业大学学报，2005，24（5）：474~476； 

（4）王宏斌，邵素兰，原生质体－再生技术在大观霉素菌种选育中的应用，中国抗生素杂志，2003，28（11）：696－697 

本发明菌株选育方法具有以下优点： 

（1）本发明采用多种药物的多重抗性为目标，筛选出的突变菌株稳定性好，在大观霉素生产中不易产生回复突变而造成抗生素产量下降；（2）本发明采用物理化学等传统诱变与先进的基因组重排技术改造壮观链霉菌；（3）本发明第一次采用核糖体工程技术用于改造壮观链霉菌获得新菌种产生新抗生素。 

2.本发明菌株CCTCC NO:M2012328应用于生产不同于己知抗生素结构的新的抗生素的方法： 

（1）抗生素生物发酵种子培养：将壮观链霉菌（Streptomyces spectabilis）zgd-Q（CCTCC NO:M2012328）接至种子培养基中培养，种子培养时培养基装液量为30mL~50mL/250mL的三角瓶，培养温度为28~30℃，摇瓶转速为180rpm~220rpm，培养时间36-48h，获得种子培养液； 

种子培养基：葡萄糖（或糊精、玉米浆、可溶性淀粉）1.0%，鱼粉（或棉子粉、花生粉、豆饼粉）0.5%，酵母粉1.0%，蛋白胨0.2%，用NaOH调节pH至7.2-8.0， 115℃灭菌30min，备用； 

上述百分比浓度为质量体积百分比，即某组分浓度1%表示100mL培养基中含有1g该物质，下同。 

（2）抗生素生物发酵液体深层发酵培养：将种子培养液接至液体发酵培养基中培养，发酵培养基装液量为30mL~50mL/250mL的三角瓶，接种量体积比，V/V，10%～15%，培养温度为28~30℃，摇瓶转速为180rpm~220rpm，培养时间为96~110h，获得含抗生素的发酵液； 

发酵培养基：可溶性淀粉4.0～8.0%，糊精（或葡萄糖）1.5～5.0%，豆饼粉（或黄豆粉）1.0～5.0%，玉米浆0.5～3.0%，酵母粉2.0～5.0%，CaCl₂0.0～2.0%，KH₂PO₄0.0～0.7%，KCl 0.0～0.5%，CaCO₃0.2～1.0%，pH为7.2～7.8，灭菌，备用。 

（3）本发明的抗生素的分离、纯化 

上述含抗生素的发酵液离心去除发酵液中固形物，将上清液pH调至2.0~3.5，过滤去除发酵液中的金属离子、蛋白质等杂质。滤液用阳离子交换树脂（001X4凝胶型强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂，或001X7强酸性苯乙烯系离子交换树脂，或D001大孔强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂等）去除大观霉素后采用常规的乙酸乙酯萃取的方法提取发酵液中的抑菌组分，乙酸乙酯萃取粗提物，用甲醇溶解，MCI柱色谱分离获得4个部分，常规的管碟法（指示菌为Sarcina lutea）跟踪抑菌组分，其中C组分抑菌活性较强。采用硅胶柱色谱分离C组分，获得C1、C2、C3和C4四个有抑菌活性的组分，其中C2组分抑菌活性较强，C2利用硅胶柱、凝胶HW-40C柱层析进一步纯化，采用生物自显影方法跟踪C2中的抑菌组分，最后获得样品yxl-1。 

本发明采用管碟法检测抗生素的生物活性，以土霉素测定菌Sarcina lutea（藤黄八叠球菌）中科院微生物菌种库编号11433为检测菌，检测培养基LB。 

3.本发明的新的抗生素的结构鉴定 

仪器：岛津UV-2450PC紫外分光光度计，安捷伦1100series高效液相色谱仪，BrukerAVANCE III 500MHz型超导核磁共振谱仪（δ/ppm，TMS内标），安捷伦6210型飞行时间质谱仪。 

试剂：用于色谱分析的溶剂均为色谱级试剂，未进行处理 

用于核磁共振分析的溶剂为氘代甲醇（含TMS内标） 

C₃₉H₄₉NO₁₄：桔黄色固体；UV MeOH max:241nm；ESI-MS：m/z 754[M+H]⁺，794[M+K]⁺；¹H-NMR和¹³C-NMR(MeOH,500MHz)见表1； 

表117-羰基-19-甲氧基-曲张链丝菌素F的NMR数据（500MHz,MeOH） 

本发明所述曲张链丝菌素的结构类似物的17-羰基-19-甲氧基-曲张链丝菌素F，结构式如下： 

本发明抗生素可用于杀灭革兰氏阳性菌。通过抑菌圈试验测定本发明抗生素的石炭酸系数，结果本发明抗生素的石炭酸系数为2.0-12.8，表明17-羰基-19-甲氧基-曲张链丝菌素F具有较强的杀菌强度。 

(四)具体实施方式：

下面结合具体实施例对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。本发明的保护范围中的任何选取值均可实现本发明，下面实施例中的数值为任意选取。 

实施例1： 

菌株：壮观链霉菌zgd-Q的获得； 

（1）壮观链霉菌原始菌株用1kGy⁶⁰Coγ射线处理，垂直距离1m照射1h。取诱变后平板一小块菌体置于含无菌生理盐水和玻璃珠的50mL三角瓶中，打散成单细胞悬浮液后稀释成10^-1、10^-2、10^-3三个浓度，各取0.2mL涂布于链霉素、氯霉素、庆大霉素、利福平、新霉素和大观霉素平板上，28℃培养3d，挑单菌落在同等条件下进行继代培养5代后进行复筛抗性稳定的菌株，获得无色、抗性菌落Ws突变菌株。 

（2）壮观链霉菌原始菌株斜面培养6d，生理盐水5mL洗涤培养斜面，制成浓度为10⁸的孢子悬液。孢子悬液在生理盐水中培养3～5h后涂平板，培养基配方为：牛肉膏0.1%，可溶性淀粉2.0%，K₂HPO₄0.05%，MgSO₄0.05%，NaCl 0.05%，FeSO₄.7H₂O 0.001%，胰蛋白胨0.2%，pH 7.2。平板置于安全柜中，待培养基表面干燥后进行常规的亚硝基胍诱变。具体操作方法可参考（沈萍，陈向东，微生物学实验，高等教育出版社）。诱变后处理的突变菌株分别涂布于链霉素、氯霉素、庆大霉素、利福平、新霉素和大观霉素平板上。抗性菌株在抗性平板上经过连续的5代继代培养，获得两种突变株，分别是黄色有皱褶的Hz突变菌株和菌落粉色有皱褶的FS突变菌株。 

（3）上述突变菌株Ws、Hz、FS分别培养于S培养基（配方为：酵母膏0.4%，葡萄糖1.0%，蛋白胨0.4%，MgSO₄·7H₂O 0.05%，KH₂PO₄0.2%，K₂HPO₄0.4%，pH7.0），培养温度为30℃、180rpm、黑暗培养20～36h，离心收集菌丝体，用1.5mg/L的溶菌酶高渗缓冲液35℃下处理20min，用高渗P溶液洗涤原生质体，等量混合各突变株的原生质体（各种原生质数量为10⁸），于35%分子量4000的PEG中促融。获得的融合子分别涂布于链霉素、氯霉素、庆大霉素、利福平、新霉素和大观霉素平板上，30℃、培养7天后挑选抗性菌株。在抗性平板上继代3代后，抑菌圈法初步评价抗性菌株的抑菌能力，筛选5株抑菌能力最强的菌株制备抗性菌株的原生质体，进行新的一轮菌株间的基因组重排（原生质体制备和融合方法与前面相同）。如此进行连续的4轮基因组重排，获得稳定的链霉素、新霉素双抗性菌株，经过初筛、摇瓶发酵复筛获得高产抗生素菌株zgd-Q。 

实施例2： 

菌株zgd-Q高产新抗生素； 

种子培养基：葡萄糖1.0%，鱼粉0.5%，酵母粉1.0%，蛋白胨0.2%，用NaOH 调pH至7.2，115℃灭菌30min； 

发酵培养基：可溶性淀粉5.0%，葡萄糖3.0%，黄豆粉1.5%，玉米浆1.3%，酵母粉2.0%，CaCl₂0.5%，KH₂PO₄0.3%，KCl 0.2%，CaCO₃0.4%，pH为7.2； 

将壮观链霉菌（Streptomyces spectabilis）zgd-Q（CCTCC NO:M 2012328）接至种子培养基中培养，种子培养时培养基装液量为30mL~50mL/250mL的三角瓶，培养温度为28~30℃，摇瓶转速为180rpm~220rpm，培养时间36-48h，获得种子培养液；取发酵培养基500mL，将种子培养液接至液体发酵培养基中，接种量同单位体积比，V/V，10%～15%，分装20个250mL的三角瓶中，30℃，180rpm，黑暗培养105h，获得含抗生素的发酵培养液；将该发酵培养液以10000r/min离心10min除去菌丝体，发酵液进行检测，以大观霉素标样为对照，测定发酵液中新抗生素的生物学效价为200~8000u/L。 

实施实例3： 

新抗生素的分离纯化 

发酵液10000r/min离心10min，去除发酵液中固形物，用HCl、草酸或醋酸将上清液pH调至2.0~3.5，过滤去除发酵液中的金属离子、蛋白质等杂质。滤液用732强酸性阳离子交换树脂去除大观霉素后，采用乙酸乙酯萃取的方法提取发酵液中的抑菌组分，乙酸乙酯萃取粗提物，用甲醇溶解，采用MCI柱、硅胶柱、凝胶HW-40C柱层析进一步纯化，采用管碟法跟踪抑菌组分，选择抑菌活性最强组分即得新抗生素。 

实施例4： 

新抗生素的应用：以土霉素测定菌—藤黄八叠球菌（Sarcina lutea，11433）、大观霉素检定菌—克雷白肺炎杆菌（Klebosiella pneumoniae，46117）、大肠杆菌、枯草杆菌、假单胞菌、酿酒酵母为检测菌，通过抑菌圈试验测定本发明抗生素的抗菌作用及抗菌强度，结果17-羰基-19-甲氧基-曲张链丝菌素F对酵母菌和革兰氏阴性菌（克雷白肺炎杆菌、大肠杆菌、假单胞菌）无抑菌作用，对革兰氏阳性菌（藤黄八叠球菌、枯草杆菌）具强烈的抑菌作用，石炭酸系数为12.8，表明17-羰基-19-甲氧基-曲张链丝菌素F对革兰氏阳性菌具有强的杀菌强度。