一种铱配合物及其制备方法和在二氧化硫检测中的应用

摘要

本发明公开了环金属化铱-偶氮配合物的制备以及其在检测二氧化硫方面的应用。本发明涉及的配合物能特异性与二氧化硫反应，产生荧光响应，并具有较强的细胞膜穿透性和较低的细胞毒性，能识别细胞内的二氧化硫，在实时、快速检测二氧化硫方面将具有极大的应用潜力。

说明书

技术领域

本发明涉及硫醇检测领域，具体涉及一种新的环金属化铱配合物的制备方法和应用。

背景技术

二氧化硫（SO₂）在大气中属于有毒气体，能形成酸雨，是一种全球性的常见而且严重的大气污染物。SO₂的污染状况以及毒性作用一直是全社会共同关注的问题。通过对SO₂接触现场工人的健康调查显示，SO₂暴露的主要毒害是对人和啮齿动物的呼吸道产生刺激作用和腐蚀作用，证明SO₂污染与一些呼吸系统疾病（例如气管炎、支气管炎、哮喘、肺气肿等）的发生相关。通过对SO₂的毒理实验，发现高浓度的SO₂吸入可以引起小鼠体内的DNA损伤，多种器官脂质过氧化损伤，蛋白质氧化损伤，酶活性降低等损害（Acta Physiol. Sin.(生理学报), 2011,63,593-600）。因此，对大气或其他环境中的SO₂污染物水平的监测，与人们的健康息息相关。

另外，近年来的研究发现，内源性SO₂与某些心血管疾病密切相关，在心血管系统中就存在SO₂生成系统，并且内源性SO₂的水平在心血管系统的生理，病理的调节方面发挥着重要关系。因此，人们推测内源性SO₂可能是继一氧化碳（CO），一氧化氮（NO）和硫化氢（H₂S）之后，又一种新型的气体信号分子。哺乳动物肝细胞内的含硫氨基酸（例如L-半胱氨酸）在酶的催化下可以转化为亚硫酸盐，H₂S也可以通过酶促反应或非酶促氧化作用形成亚硫酸盐。内源性SO₂在心血管系统的调节中发挥重要作用，它不仅具有舒张血管、抑制心脏功能、改善血管重构、抑制炎症反应、抗氧化以及调节脂质代谢等作用，而且对改善肺动脉高压、高血压和急性肺损伤等心肺血管疾病具有重要的病理生理学意义（Clin. Exp. Pharmacol. Physiol.,2010,37,745-752）。对内源性SO₂的检测，能有效对上述心血管疾病的诊断和预防提供指导和帮助。

目前，一些针对SO₂的气体传感器已经在设计开发当中，但是这些传感器的灵敏度都不高，而且只能对SO₂气体有传感作用，对溶液状态的SO₂则无法检测或检测灵敏度大大下降，无法直接应用于细胞内或组织内的分析。而一些仪器分析方法，比如高效液相色谱（HPLC），电化学分析等，尽管检测限低，但仍需借用昂贵的高分辨分析仪器，对样品的前期处理，实验参数优化等要求严格，分析时间较长，也无法直接应用于细胞内的SO₂检测。这些不足也直接限制了其应用。对SO₂的检测尤其是内源性SO₂的检测，目前仍未有能在大众推广的分析方法。在各种检测手段当中，分子探针技术的样品处理简便，操作简单，结果分析快速，抗干扰能力强，同时能获得很高的灵敏度，受到大家青睐。而且，荧光分子探针还能直接应用细胞内的实时分析，对内源性的分子检测也有高的灵敏度。应用荧光分子探针技术来检测SO₂，尤其对内源性SO₂水平的检测，将具有巨大的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于以下几项：提供一种铱-偶氮多吡啶配合物，以及其制备方法和应用。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

一种铱-偶氮多吡啶配合物，简称[Ir(ppy)₂azobpyIr(ppy)₂]²⁺，结构式如式Ⅰ所示：

                式I 

 简记为[Ir(ppy)₂azobpyIr(ppy)₂]²⁺

上述铱-偶氮配合物的制备方法，可由4,4’’-偶氮-2,2’-联吡啶配体和（2-苯基吡啶）铱二氯桥前体反应制得。步骤如下：将4,4’’-偶氮-2,2’-联吡啶配体和（2-苯基吡啶）铱二氯桥前体加入有机溶剂中加热搅拌，反应结束后旋干溶剂，纯化，得权利要求1所述铱-偶氮配合物。

所述的有机溶剂为甲醇、氯仿混合溶剂；具体来说，可为体积比为1:1~1:5的甲醇、氯仿混合溶剂。

所述的反应条件为回流反应时间为4~8小时；纯化方法为硅胶柱层析纯化。

可优选以下方法进行合成：先制备[Ir(ppy)₂Cl]₂和azobpy，然后以摩尔比为1:1将上述两种物质混合加到1:1的甲醇/氯仿混合溶剂中，加热回流6h后直接蒸发干溶剂，所得固体用硅胶柱层析分离，用体积比为1:3的丙酮/氯仿混合液洗脱，真空干燥即得所要的配合物固体。其中ppy为2-苯基吡啶，[Ir(pq)₂Cl]₂的合成办法参照文献（Inorg. Chem. 2003,42,6886-6897）方法；azobpy为4,4’’-偶氮-2,2’-联吡啶，合成办法参照文献（Inorg. Chem. 2003,42,3057-3066）方法。

经研究表明，本发明的上述铱-偶氮配合物[Ir(ppy)₂azobpyIr(ppy)₂]²⁺，在水溶液条件下的荧光强度比较弱，但与溶液型SO₂（亚硫酸盐，亚硫酸氢盐）反应后，其荧光强度均大大增强。以铱配合物作为生色基团，以偶氮配体作为SO₂识别基团，此配合物对SO₂具有快速，灵敏的响应，能对外源性SO₂水平进行荧光检测。而且，此配合物能穿透细胞，对细胞内源性的SO₂进行检测。MTT结果表明配合物的细胞毒性很低，对细胞损伤小。因而，本发明铱-偶氮配合物在荧光检测二氧化硫方面（可用于体外检测或细胞内检测）具有良好的应用前景。

 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明的铱-偶氮配合物作为第一例对荧光识别溶液型SO₂分子探针，其分子结构小，结果简单稳定，合成方法简单，背景荧光强度弱，但与SO₂反应之后，其荧光增强15倍之多，而且对SO₂的最低检出限在10^-7 mol/L级别，灵敏度比较高。由于铱-偶氮配合物的脂溶性非常好，在无需细胞预处理（如电穿孔或溶剂固定等）的条件下，该配合物在短时间孵育的情况下可以成功进入活细胞中并在活细胞内对SO₂产生荧光响应，具有培育时间短、染色灵敏度高、细胞渗透能力强、大的stoke位移、低细胞毒性和耐光漂白的特点，在对SO₂的检测方面将具有极大的应用潜力。

附图说明

图1 铱-偶氮配合物分子结构式。

图2 铱-偶氮配合物的合成途径。

图3 铱-偶氮配合物对Na₂SO₃的紫外响应光谱，[Ir] = 10 mM。

图4 铱-偶氮配合物对Na₂SO₃的荧光响应光谱，[Ir] = 10 mM。

图5 HeLa细胞与不同浓度亚硫酸钠溶液孵育1h后，再与5 μM的配合物培育30 min的细胞成像结果；(a), [SO₂] = 0 μM; (b), [SO₂] = 10 μM; (c), [SO₂] = 50 μM; (d), [SO₂] = 250 μM。标尺为50微米。

具体实施方式

实施例1 

(1)   2,2’-联吡啶-N-氧化物

可以参照文献（Chem. Comm. 2011,47,11011-11013）方法制备。7.8 g 2,2’-联吡啶溶解在40 mL三氟乙酸中，加入8.5 mL 30%双氧水，室温搅拌4 h，用6N的氢氧化钠溶液中和，然后用4 ′ 50 cm³氯仿萃取，有机相合并后用饱和氯化钠溶液洗涤，再用无水硫酸钠干燥，过滤后蒸去氯仿，得无色油状物，真空干燥过夜后得白色针状固体。

(2)   4-硝基-2,2’-联吡啶-N-氧化物

在冰浴搅拌情况下将3 g 2,2’-联吡啶-N-氧物溶解在19mL浓硫酸中，然后逐滴滴加发烟硝酸/浓硫酸（30mL/14mL）混酸中，15 min滴完，然后升温至100摄氏度，回流5 h。冷却至室温，将反应液导入150 g冰水中，用38%的氢氧化钠溶液调pH至8，析出淡黄色固体，抽滤，用水洗，固体用二氯甲烷溶解后，再用无水硫酸钠干燥，过滤后除去二氯甲烷，真空干燥得淡黄色固体。

(3)   4-硝基-2,2’-联吡啶

可以参照文献（J. Org. Chem. 1983,48,283-289）方法制备。将1 g 4-硝基-2,2’-联吡啶-N-氧化物溶解在15 mL氯仿中，冰浴条件下加入1 mL PCl3, 回流1 h后倒入冰水中，溶液用氢氧化钠碱化，过滤，滤液用氯仿萃取，  再用无水硫酸钠干燥，过滤后除去二氯甲烷，真空干燥得淡黄色固体。

(4)   4,4’’-偶氮-2,2’-联吡啶

可以参照文献（Inorg. Chem. 2003,42,3057-3066）方法制备。将0.323 g 4-硝基-2,2’-联吡啶溶解在40 mL异丙醇中，回流待溶液变澄清后加入1.1 g/2 mL的氢氧化钠溶液，然后5 min内分批加入2.7 g 还原锌粉，继续回流3 h。将反应物用冰浴冷却，然后过滤，滤渣先用热水，热乙醇冲洗，再用氯仿萃取，收集萃取液，除去氯仿，真空干燥得橙黄色固体。

(5)   [Ir(ppy)₂Cl]₂

可以参照文献（Inorg. Chem. 2003,42,6886-6897）方法制备。将0.30 g三氯化铱和0.31 g的2-苯基吡啶加入到30 mL/10 mL的乙二醇一乙醚/水的混合溶剂中，升温至110摄氏度回流24h, 冷却至室温，收集黄色固体，水洗，真空干燥。

(6)   [Ir(ppy)₂azobpy Ir(ppy)₂] Cl ₂

将0.108 g [Ir(ppy)₂Cl]₂溶于10mL/10mL的氯仿/甲醇混合溶剂中，加入0.034 g azo, 65摄氏度回流6 h，加入0.2 g六氟磷酸铵的饱和甲醇溶液，继续搅拌30 min，减压蒸馏出去溶剂，所得固体用硅胶进行柱层析分离，用体积比为1:3的丙酮/氯仿混合液洗脱，真空干燥即得所要的配合物固体。Anal. Calcd. for C₈₀H₅₄Cl₂N₁₀Ir₂ (%):C, 47.17; H, 2.85; N, 8.60. Found (%): C, 47.39; H, 2.80; N, 8.70. ES-MS (CH₃OH) m/z: 670 [M-2PF₆]²⁺, 1483 [M-PF₆]⁺。

实施例2 [Ir(ppy)₂azobpy Ir(ppy)₂]²⁺对SO₂的体外响应实验

以下采用的配合物为实施例1所制备获得的化合物。

用体积比为1:1的乙腈/HEPES（10 mM，pH 7.5）的缓冲液配制10 mM的配合物溶液，滴加不同浓度的亚硫酸钠溶液，充分搅拌后室温静置5 min，然后分别测量其紫外吸收光谱和荧光强度。配合物激发波长、最大发射波长分别为400, 560 nm。实验结果分别为图3、图4。由图3可见，在加入少量亚硫酸钠溶液后，配合物的紫外吸收光谱发生比较明显的变化，在280 nm附近的吸收增强，在400 nm附近的吸收减弱，表明配合物能与溶液型的SO₂（亚硫酸钠）发生反应。由图4可见，本来荧光很弱的配合物，在加入少量亚硫酸钠溶液后，荧光强度大大增强，增强约15倍，表明配合物能对溶液型的SO₂表现出很灵敏的荧光响应，能用作SO₂的荧光探针。

实施例3 [Ir(ppy)₂azobpy Ir(ppy)₂]²⁺对SO₂的细胞内响应实验

以下采用的配合物为实施例1所制备获得的化合物。

细胞培养：Hela细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养，细胞(5 ′ l0⁸/L) 接种在共聚焦显微镜专用玻底培养皿中，培养皿直径35 mm，其中盖玻片厚度0.085~0.13 mm，皿中心微孔直径10 mm，5% CO₂和95%空气条件下，37℃培养，贴壁生长24小时后，换取无血清的培养基继续孵育4小时。

共聚焦显微镜-细胞成像： Hela细胞先与不同浓度的亚硫酸钠溶液孵育1h，然后吸出培养基，换上PBS，加入配合物（5 μM）继续培育30min，再吸出PBS，然后用PBS缓冲液洗涤3~4次，在Leica TCS SP5 激光扫描共聚焦显微镜上成像，使用63′/1.4油镜，用405 nm光作为激发光源，收集520~610nm范围内的荧光。实验结果见图5。由图可见，单加配合物不加亚硫酸钠溶液的Hela细胞内的荧光比较弱，加入亚硫酸钠溶液后，荧光增强，而且随着亚硫酸钠溶液的浓度不断增大，Hela细胞内的荧光强度也越来越强，表现出浓度依赖现象。结果表明配合物不仅能在体外与溶液型的SO₂（亚硫酸钠）反应产生荧光响应，在细胞内也能对溶液型SO₂反应并产生荧光响应，可以作为一种荧光探针应用于细胞内的SO₂浓度水平的检测。