香精香料中四种禁用成分含量的测定方法

摘要

一种香精香料中四种禁用成分（马兜铃酸、水杨酸、正二氢愈创酸和邻氨基苯甲酸肉桂酯）含量的测定方法，包括样品溶液的制备，液相色谱分析及测定结果的计算等步骤。本发明的检测方法经优化之后具有检测时间短、操作简便、灵敏度高、回收率高及重复性好等优点，本发明方法的色谱条件使马兜铃酸、水杨酸、正二氢愈创酸和邻氨基苯甲酸肉桂酯色谱峰与杂质色谱峰分离较好，并且具有较好的相关性，检测限在0.04~0.34μg/g之间，平均回收率分别为94.01％、95.96％、86.48%和84.28％，样品测试结果的平均相对标准偏差分别为4.40%、2.39％、2.49%和3.35％。

说明书

 

技术领域

本发明属于香精香料的理化检验技术领域,具体涉及香精香料中四种禁用成分马兜铃酸、水杨酸、正二氢愈创酸和邻氨基苯甲酸肉桂酯含量的测定方法，

背景技术

马兜铃酸是碳环芳香族酸性化合物，基本骨架构成为蒽菲型结构，主要存在于马兜铃科植物中。早期发现该类物质具有抗肿瘤活性、抗感染及增强吞噬细胞活性等作用。随着研究的深入，马兜铃酸类物质已被证实具有肾毒、致癌和致基因突变作用。马兜铃酸与肾病讨论由来已久，1964年我国吴松寒首次报道了两例病人因服用大剂量木通（含马兜铃酸）导致急性肾功能衰竭，此后陆续有相关的报道，但未引起广泛关注。1993年，比利时学者Vanherweghem等首先发现2例女性服中草药减肥治疗后，出现慢性肾损害，病理组织学证实为快速进展的肾间质纤维化，经薄层色谱仪分析发现减肥胶囊中含马兜铃酸（aristolochic acid，AAs）。至1998年欧洲已有100余人因服该减肥药导致慢性肾损害，其中1/3已接受肾移植；1999年英国报道了两例因摄入木通而导致的晚期肾衰竭病例。由于有了这些病例，国内外才提出禁止马兜铃酸在药品和食品中使用的相关政策。从1999年7月29日，英国宣布禁止销售和使用含马兜铃酸的中药。2000年6月9日，美国药品与食品管理局(FDA)在至今未收到类似不利事件报告的情况下，命令停止进口、制造和销售已知含有和怀疑含有马兜铃酸的原料和成品，导致多达70余种中药被列入黑名单。2000年11月，世界卫生组织(World Health Organization，简称WHO)在其药物通讯中发出类似警告，西班牙、奥地利、埃及、马来西亚、菲律宾、日本等国纷纷效仿。2003年4月，我国国家食品药品监督管理局(State Food and Drug Administration，简写为SDA)取消了木通的药用标准。2004年8月又取消了广防己、青木香的药用标准，并对含马兜铃、寻骨风、天仙藤和朱砂莲的中药制剂严格按处方药管理。

水杨酸是一种植物激素，对植物生长发育过程及植物抗药性方面有调控作用，可以延缓多种果实成熟衰老进程。而且水杨酸具有一定的抑菌作用，在医药化工中用于消毒和治疗各种慢性皮肤病。另外，水杨酸还具有去角质、促进皮肤代谢的功效，在化妆品行业中也广泛使用。但是水杨酸在人体内会氧化为草酸，引起中毒，被列为食品禁用防腐剂。而且水杨酸对皮肤具有刺激性，严重可导致皮炎。对眼睛刺激性大，其半数致死量LD50（大鼠，口服）为891 mg/kg；LD50（肌肉，静脉注射）为500 mg/kg。美国食品药品管理局、美国皮肤病学会认为水杨酸的外用安全浓度是0.5-2.0 %。中国食品药品管理局也规定了护肤品中水杨酸的上限为2 %。

正二氢愈疮酸具有多种生物活性，包括抑制脂氧化酶、乳头状瘤病毒、单纯疱疹病毒、HIV及降血糖作用、人脑恶性胶质瘤的治疗作用。Larreatridentate Coville灌木的叶子、茎被制作成胶囊，发现早期被应用到膳食中。然而，在饮用了含有正二氢愈疮酸的茶叶或是食用了含有5–10%干重的正二氢愈疮酸胶囊后，出现了非感染性肝炎的病例，同时研究报告结论表明过量摄入正二氢愈疮酸会导致肾损伤。通过机理方面的研究表明，正二氢愈疮酸作为抗氧化剂, 其具有治疗优势。但是其他一些报告也显示出正二氢愈疮酸作为抗氧化剂具有潜在的毒性、致癌性和致突变性。在最近的一些研究发现：在低剂量的测试中，正二氢愈疮酸对DNA的合成有优先的抑制作用；在高剂量的测试中，对蛋白质的合成有明显的抑制作用。

邻氨基苯甲酸肉桂酯具香脂膏香、水果香气，带棕褐色粉末。略带棕色粉状体。有似葡萄糖的果香和膏香。熔点大于60℃；d 1.18(15.5℃)；沸点332℃/10⁵。在60多年前此化合物已用于食品和日化用品的加香，此化合物已经被认证对公众健康无害的人造香味料。但是邻氨基苯甲酸肉桂酯可燃，燃烧可形成有毒的氮氧化合物。

关于马兜铃酸的检测，早期方法出现于1975年，Rao.K.V等人采用荧光分光光度计和气液色谱建立了马兜铃酸检测方法。1988年中华人民共和国药典中，测定马兜铃酸的方法为薄层色谱方法；1989年开始，多种针对不同来源样品的高效液相色谱（HPLC）测定马兜铃酸方法被建立；2002年，Kite, G.C.等人采用液相色谱二级质谱（LC-MS/MS）的方法建立了马兜铃酸检测方法，并采用该方法开展了定性和定量工作。此外，在早期测定马兜铃酸的方法还出现了分光光度法、极谱法，由于分光光度法和极谱法存在专属性较差、检测限较高等原因，目前这两种检测方法应用较少。

正二氢愈疮酸的主流分析方法包括高效液相色谱质谱检测器方法（HPLC-MS/MS）、高效液相色谱紫外检测器方法（HPLC-DAD）、微池毛细管电泳色谱安培检测器方法和高效液相色谱荧光检测器方法（HPLC-FLD）等，这些方法的共性即是用高效液相色谱或毛细管色谱进行分离，采用质谱、紫外或荧光检测器进行检测。

水杨酸的检测方法有五种类型，它们包括：液相色谱法、分光光度法、流动注射分析法、离子色谱法、化学发光法等。测定水杨酸的分析方法中较为经典的方法是上世纪七十年代AOAC根据水杨酸和铁离子（Fe³⁺）生成紫堇色的络合物，并采用分光光度法测定有色络合物的分析方法，该方法是适用于食品中水杨酸测定。美国药典32版（USP32）中，建立了水杨酸的液相色谱测定方法，该方法采用液相分离，紫外检测器采集270 nm紫外波长的方法检测了药品中的水杨酸。田兰等考察了不同pH值条件下流动相对峰分离度和峰形的影响，发现当pH值为3时，分离效果最好。李效宽等对多种流动相体系进行了比较，发现采用甲醇/0.02 mol/L磷酸二氢钾溶液(体积比，40:60)(磷酸调pH至3.0)为流动相时，分离效果最好。随着现代分析仪器技术的发展，出现了LC-MS测定水杨酸的分析方法。2005年Siska C等利用LC-MS对动物组织中的水杨酸和代谢物进行定量测定；Jiri G等用UPLC-MS/MS检测饮料中包括水杨酸在内的17种酚酸，分析时间在12 min以内，大大提高了分析效率和分析结果的准确性。同时，由于液质联用高灵敏度特点，因此液质联用方法也是目前测定水杨酸灵敏度较高的检测方法。

目前关于邻氨基苯甲酸肉桂酯的测定方法国内外研究极少。Demers等人曾用高效液相色谱荧光检测法测定了香水及花露水中的邻氨基苯甲酸肉桂酯，Sherma等做过类似的研究，二者的测定结果均较为理想；Keyhanfar等同样用高效液相色谱荧光检测法测定了小鼠体内的邻氨基苯甲酸肉桂酯及其代谢物，测定结果符合定量分析的要求。

目前，国内外公开文献暂无关于这四种禁用成分的同时检测方法。

发明内容

本发明的目的正是基于上述状况，通过长期的研究和探索，在方法对比、优化的基础上，提出了一种香精香料中四种禁用成分（马兜铃酸、水杨酸、正二氢愈创酸和邻氨基苯甲酸肉桂酯）含量的测定方法，用于检测香精香料中马兜铃酸、水杨酸、正二氢愈创酸和邻氨基苯甲酸肉桂酯的含量。本发明考察研究了香精香料中马兜铃酸、水杨酸、正二氢愈创酸和邻氨基苯甲酸肉桂酯的萃取条件，优化了色谱分离的条件，为简便、快速有效的测定香精香料中上述四种禁用成分残留的含量提供了技术支持。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种香精香料中四种禁用成分马兜铃酸、水杨酸、正二氢愈创酸和邻氨基苯甲酸肉桂酯含量的同时测定方法，包括以下步骤：

（1）萃取溶液的配制：称取1g的抗坏血酸（此成分的作用是抗氧化剂，使目标化合物稳定）加入到1L的容量瓶中，用含0.1%甲酸的甲醇-水的混合溶液定容，甲醇与水的体积比为9:1；

（2）标准溶液的配制：用萃取溶液分别配制具有浓度梯度的马兜铃酸、水杨酸、正二氢愈创酸和邻氨基苯甲酸肉桂酯的标准工作溶液；所述标准溶液的配制方法如下：称取马兜铃酸，正二氢愈创酸，水杨酸，邻氨基苯甲酸肉桂酯各50mg(精确至0.1mg)，用萃取溶液溶解转移至50mL容量瓶中，定容至刻度并摇匀，定为第1级标准溶液。取第1级标准溶液5mL至50mL容量瓶中，用萃取溶液定容至刻度，定为第2级标准溶液。分别准确移取100μL，300μL, 500μL, 1000μL, 2000μL, 4000μL的第2级标准溶液至50mL容量瓶中，用萃取溶液定容至刻度，得到系列标准工作溶液。

（3）样品溶液的制备：使用萃取溶液振荡萃取样品，然后离心过滤制备样品溶液；具体方法是：称取2g试样于100mL具塞锥形瓶中，准确加入50mL萃取溶液，用150r/min振荡萃取10min，取8mL萃取溶液于10mL具塞离心试管中，在10000r/min转速条件下离心5min,取1mL上清液过有机相滤膜，滤液用高效液相色谱分析仪分析。

（4）液相色谱分析：利用液相色谱仪分别对标准溶液和样品溶液进行检测分析；所述的色谱分析条件为色谱柱采用Eclipse DB-C18液相色谱柱，色谱柱温度为30℃，进样量为10 μL，流速为1.0 mL/min；二级管阵列检测波长：λ= 393 nm；荧光检测器波长：开始时激发波长λ_ex为290nm, 发射波长λ_em为400nm，13min时为λ_ex=280nm，λ_em=306nm，19min时为λ_ex =342nm，λ_em =413nm；流动相：A为0.1%的甲酸乙腈溶液，B为0.1%的甲酸水溶液，采用梯度洗脱程序，即初始A是30％，B为70％，15min时A是50％，B是50％，25min时A是90％，B是10％，28min时A是50％，B是50％，30min时A是30％，B是70％，32min时A是30％，B是70％，总洗脱时间为32min。

（5）香精香料中马兜铃酸、水杨酸、正二氢愈创酸和邻氨基苯甲酸肉桂酯含量的计算，各成分含量的计算方法如下：首先以标准溶液所检测出的目标物的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准曲线；然后将样品溶液检出的目标物的色谱峰面积，代入标准曲线，即得到样品中马兜铃酸、水杨酸、正二氢愈创酸和邻氨基苯甲酸肉桂酯质量，由此即可计算出香精香料中马兜铃酸、水杨酸、正二氢愈创酸和邻氨基苯甲酸肉桂酯的含量。

本发明通过实验考查了方法的重复性、再现性和普适性等，制订了香精香料中马兜铃酸、水杨酸、正二氢愈创酸和邻氨基苯甲酸肉桂酯的高效液相色谱检测方法，达到了以下效果：

1、检测时间短：采用本发明测定香精香料中马兜铃酸、水杨酸、正二氢愈创酸和邻氨基苯甲酸肉桂酯含量周期仅需要27分钟；

2、本发明具有操作简便、灵敏度高、回收率高及重复性好的优点：本发明方法的色谱条件使香精香料中马兜铃酸、水杨酸、正二氢愈创酸和邻氨基苯甲酸肉桂酯色谱峰与杂质色谱峰分离较好，并且具有较好的相关性，检测限在0.04－0.34μg/g之间，平均回收率分别为94.01％、95.96％、86.48%和84.28％，样品测试结果的平均相对标准偏差分别为4.40%、2.39％、2.49%和3.35％。

该方法的建立对于监督香精香料的品质、保护消费者的健康有着非常重要的意义。

附图说明

图1为本发明的测定方法的流程图；

图2为马兜铃酸的标准曲线线性方程及线性回归系数坐标图；

图3为水杨酸的标准曲线线性方程及线性回归系数坐标图；

图4为正二氢愈创酸的标准曲线线性方程及线性回归系数坐标图；

图5为肉桂酯的标准曲线线性方程及线性回归系数坐标图；

图6为标准溶液马兜铃酸DAD信号色谱图；

图7为标准溶液水杨酸、正二氢愈创酸和肉桂酯FLD信号色谱图；

图8为样品溶液马兜铃酸DAD信号色谱图；

图9为样品溶液水杨酸、正二氢愈创酸和肉桂酯FLD信号色谱图。

 

具体实施方式

本发明以下结合实施例（附图）做进一步描述：

实施例1

本实施例对香精香料中马兜铃酸、水杨酸、正二氢愈创酸和邻氨基苯甲酸肉桂酯含量的检测方法如下（所述检测方法的流程图如图1所示）

（1）标准溶液的配制：称取马兜铃酸，正二氢愈创酸，水杨酸，邻氨基苯甲酸肉桂酯各50mg(精确至0.1mg)，用萃取溶液溶解转移至50mL容量瓶中，定容至刻度并摇匀，定为第1级标准溶液。取第1级标准溶液5mL至50mL容量瓶中，用萃取溶液定容至刻度，定为第2级标准溶液。分别准确移取100μL, 300μL, 500μL, 1000μL, 2000μL, 4000μL的第2级标准溶液至50mL容量瓶中，用萃取溶液定容至刻度，得到系列标准工作溶液。在2℃-8℃下保存，有效期1个月。

（2）样品溶液的制备：称取2g（精确至0.1 mg）试样于100mL具塞锥形瓶中，准确加入50mL萃取溶液，用150r/min振荡萃取10min，取8mL萃取溶液于10mL具塞离心试管中，在10000r/min转速条件下离心5min,取1mL上清液过有机相滤膜，滤液用高效液相色谱分析仪分析。

（3）色谱分析：所述的色谱分析条件为色谱柱采用Eclipse XDB-C18液相色谱柱，色谱柱温度为30℃，进样量为10 μL，流速为1.0 mL/min；二极管阵列检测波长：λ= 393 nm；荧光检测器波长：开始时λ_ex(激发波长)为290nm,λ_em(发射波长)为400nm，13min时为λ_ex =280nm，λ_em  =306nm，19min时为λ_ex =342nm，λ_em =413nm；流动相：A为0.1%的甲酸乙腈溶液，B为0.1%的甲酸水溶液，采用梯度洗脱程序，即初始A是30％，B为70％，15min时A是50％，B是50％，25min时A是90％，B是10％，28min时A是50％，B是50％，30min时A是30％，B是70％，32min时A是30％，B是70％，总洗脱时间为32min。

标准溶液的色谱分析结果如图6、7所示；样品溶液的色谱分析结果如图8、9所示；

（4）香精香料中马兜铃酸、水杨酸、正二氢愈创酸和邻氨基苯甲酸肉桂酯含量的计算

首先以标准溶液所检测出的目标物的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准曲线（如图2-5所示）；与标准曲线相对应的回归方程、相关系数等数据如表1所示。

然后将样品测得的检出目标物的色谱峰面积，代入标准曲线，即得到样品中的马兜铃酸、水杨酸、正二氢愈创酸和邻氨基苯甲酸肉桂酯质量，由此计算香精香料中马兜铃酸、水杨酸、正二氢愈创酸和邻氨基苯甲酸肉桂酯的含量，

计算公式如下:

式中：

m—每克添加剂中马兜铃酸、水杨酸、正二氢愈创酸和邻氨基苯甲酸肉桂酯的含量，单位为微克每克（μg/g）；

A—样品中马兜铃酸、水杨酸、正二氢愈创酸和邻氨基苯甲酸肉桂酯的浓度（μg/mL）；

S－溶液体积；

n—称取样品的质量（g）。

由表1和附图8、9可知，所采用的色谱条件使马兜铃酸、水杨酸、正二氢愈创酸和邻氨基苯甲酸肉桂酯色谱峰与杂质色谱峰分离较好，并且具有较好的相关性，检测限在0.04－0.34μg/g之间。

实施例2

本实施例对本发明方法的重复性和加标回收率的检测方法如下

采用样品加标回收率试验，分别在样品中加入低中高三个不同浓度的标准溶液进行加标回收率试验，每个样品分别测定6次，色谱分析的条件同实施例1，根据分析结果计算本方法香精香料中马兜铃酸、水杨酸、正二氢愈创酸和邻氨基苯甲酸肉桂酯的加标回收率及加标后测定值的相对标准偏差，结果如表2所示；

由表2可以看出，在3个加标水平上，利用此方法检测香精香料中马兜铃酸、水杨酸、正二氢愈创酸和邻氨基苯甲酸肉桂酯的平均回收率分别为94.01％、95.96％、86.48%和84.28％，样品测试结果的平均相对标准偏差分别为4.40%、2.39％、2.49%和3.35％，说明本法的回收率较高，重复性较好。