C/Y/W135群脑膜炎球菌多糖精制工艺

摘要

本发明公开了一种C/Y/W135群脑膜炎球菌多糖精制工艺，包括溶解粗制的C、Y或W135群脑膜炎球菌多糖中的一种——将多糖置换到平衡缓冲液中——将收集的多糖溶液上阴离子交换柱——采用洗脱液从阴离子交换柱上洗脱吸附物质——按不同的洗脱峰分段收集206波长下的吸收峰——采用脱盐法去除小分子物质。本发明能将蛋白含量有效的控制，使多糖蛋白含量远远低于冷酚法，回收率可达到80%左右，适用于批次100克粗糖产量的规模生产。

说明书

技术领域

本发明涉及含有抗原的医药制品领域，特别是涉及C/Y/W135群脑膜炎 球菌多糖精制工艺。

背景技术

流行性脑脊髓膜炎（meningococcal meningitis）简称为流脑，是由 脑膜炎奈瑟菌引起的急性化脓性脑膜炎。其主要临床表现为突发高热 、剧烈头痛、频繁呕吐、皮肤黏膜瘀点、瘀斑及脑膜刺激征，严重者 可有败血症休克和脑实质损害，常可危及生命。部分病人暴发起病， 可迅速致死。A+C+Y+W135四价疫苗能对该病的预防起积极的作用。疫 苗接种后，可使机体产生体液免疫应答，用于预防A、C、Y、W135群脑 膜炎球菌引起的流行性脑脊髓膜炎。

细菌荚膜多糖是制备流脑疫苗的有效成分。A、C、Y、W135脑膜炎奈瑟 菌培养液，经提纯获取A、C、Y、W135群荚膜多糖抗原，纯化后加入乳 糖冻干，再经无菌、安全、毒力试验和分子量测定合格后，即成为合 格疫苗。

对于以荚膜多糖为抗原制备的疫苗，制备中要求将粗制多糖中的蛋白 尽可能完全去除。如发明专利ZL03131108.3（公告日2005.7.6）所述 ，现行脑膜炎球菌多糖精制工艺通常使用醋酸钠溶液溶解粗多糖，并 经预冷的苯酚抽提蛋白达到使其去除的目的，虽然多糖中的蛋白含量 去除指标满足2010版中国药典规定要求（＜10mg/g），但苯酚 的使用不但污染环境，其残留也影响制品质量，损害人体健康，还具 有潜在的致癌毒性。

申请中的发明专利201110245718.3（公开日2012.1.25）记载了不使用 苯酚精制A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖的工艺，但是该工艺目前仅 处于实验室阶段，技术参数无法在大规模生产中推广。

本发明C/Y/W135群脑膜炎球菌多糖精制工艺的原理在于，从细菌荚膜 多糖可以与阳离子表面活性剂CTAB结合形成沉淀的现象推断，荚膜多 糖带有负电荷，因此可与阴离子交换柱结合。填料筛选的结果证实， C/Y/W135群多糖能够非常牢靠地结合到阴离子填料上，很难洗脱，而 在阳离子交换填料上则全流穿。因而本发明在层析柱中添加表面活性 剂，使多糖流穿的同时蛋白吸附，达到多糖精制的目的。

本发明C/Y/W135群脑膜炎球菌多糖精制工艺相较于传统的冷酚法提取 ，其有益效果在于：

1.能将蛋白含量有效的控制，使多糖蛋白含量远远低于冷酚法；

2.能将多糖收率提高；

3.能降低内毒素含量。

而且，本发明C/Y/W135群脑膜炎球菌多糖精制工艺经试生产，证明回 收率可达到80%左右，适用于批次100克粗糖产量的规模生产。

发明内容

为克服现有技术采用冷酚提取粗制多糖中的蛋白，残留冷酚对人体造 成伤害，以及其他实验室方法无法量产的缺陷，本发明提供了一 种新型的层析技术，蛋白含量远远低于药典规定范围，残留毒性低于 冷酚法，并适于量产。

本发明提供了一种C/Y/W135群脑膜炎球菌多糖精制工艺，包括如下步 骤：

1.用溶解液分别溶解粗制的C、Y或W135群脑膜炎球菌多糖之一；

2.将多糖置换到平衡缓冲液中；

3.将收集的多糖溶液上阴离子交换柱，上样量为20~50mg/ml gel；

4.采用洗脱液从阴离子交换柱上洗脱吸附物质；

5.按不同的洗脱峰分段收集206波长下的吸收峰；

6.采用超滤膜超滤脱盐法去除小分子物质。

所述溶解液为10mM Tris-HCl,pH9.0；所述洗脱液为20mM Tris-HCl ,pH8.0，其中含1M NaCl.

优选地，所述阴离子交换柱包括Capto^TM adhere串联柱。其中，C群脑膜 炎球菌多糖精制工艺中，步骤3中的阴离子交换柱为DEAE-4FF与Capto ^TM adhere串联柱。选用DEAE-4FF与Capto^TM adhere串联柱能够更好的将多 糖与蛋白分离开来，由于蛋白在DEAE-4FF柱上吸附而多糖在DEAE-4FF 柱上流穿在Capto^TM adhere柱上吸附，从而将多糖与蛋白分离开来。

优选地，C群脑膜炎球菌多糖精制工艺中，平衡缓冲液为20mM Tris- HCl,pH8.0，含1%DOC（DOC，脱氧胆酸钠）。加入1%DOC是为了使C群脑 膜炎球菌多糖在层析柱中流穿，如果不加入DOC,蛋白和多糖的区分不 明显，不利于C群脑膜炎球菌多糖收集。

优选地，Y群或W135群脑膜炎球菌多糖精制工艺中，平衡缓冲液为20m M Tris-HCl,pH8.0。选用上述平衡缓冲液是因为它近似洗脱缓冲液（ 20mM Tris-HCl,pH8.0，其中含1M NaCl），更有利于多糖的洗脱

优选地，步骤6中采用脱盐柱或超滤脱盐法去除小分子物质。选用超滤 膜脱盐法易操作简便；选用脱盐柱可以实现联动操作。

本发明的有益效果是：无苯酚残留；能将蛋白含量有效的控制，使多 糖蛋白含量远远低于国家药典规定的范围；能提高多糖回收率；能降 低内毒素含量；适合于规模生产。

具体实施方式

下面对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征 能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为 清楚明确的界定。

采用层析法替代传统的苯酚抽提的方法从流脑粗糖中提纯流脑荚膜多 糖。根据现行的多糖生产工艺，细菌荚膜多糖可以与阳离子表面活性 剂CTAB结合形成沉淀推断多糖带有负电荷，从填料筛选的结果也证实 ，多糖能够结合到阴离子填料上，而在阳离子交换填料上全流穿。

实施例1 C群脑膜炎球菌多糖精制

原料采用粗制C群脑膜炎球菌多糖，溶解液为10mM Tris-HCl,pH9.0； 平衡缓冲液为20mM Tris-HCl,pH8.0，其中含1%DOC；洗脱液为20mM  Tris-HCl，其中含1M NaCl ,pH8.0。

1.用溶解液溶解粗制C群脑膜炎球菌多糖为5mg/ml；

2.采用SepHarose-G25(26/10 desalting)柱将溶解的多糖置换到平衡 缓冲液中，收集外水第一峰为多糖峰，终浓度约为2.5mg/ml；

3.将收集的多糖溶液上DEAE-4FF与Capto^TM adhere串联柱，上样量为20 ~50mg/ml gel；

4.采用线性洗脱方式从DEAE-4FF与Capto^TM adhere串联柱上洗脱吸附物 质，所用洗脱液为20mM Tris-HCl,pH8.0，其中含NaCl浓度从0 mol /l~1 mol/l的线性梯度变化；

5.按不同的洗脱峰分段收集206波长下的吸收峰；

6.采用脱盐柱或超滤脱盐法去除小分子物质。

此处缓冲液中加入1%DOC目的是为了使C群脑膜炎球菌多糖在层析柱中 流穿，如果不加入DOC,蛋白和多糖的区分不明显，不利于C群脑膜炎球 菌多糖收集。

实施例2 C群脑膜炎球菌多糖精制

如实施例1所述方法，区别在于，前述步骤2改为：使用100KD超滤膜， 在超滤器上将溶解的多糖置换到平衡缓冲液中，终浓度约为2.5mg/ml 。相较于实施例1，此法同样可以达到将多糖置换到平衡缓 冲液的作用，同时可省略一步收集洗脱峰的操作，因此更适用于工业 化生产。

实施例3  Y群脑膜炎球菌多糖精制

原料采用粗制Y群脑膜炎球菌多糖。溶解液为10mM Tris-HCl, pH9. 0；平衡缓冲液为10mM Tris-HCl,pH8.0；洗脱液为20mM Tris-HCl,  1 mol/lNaCl ，pH8.0。

1.用溶解液溶解粗制Y群脑膜炎球菌多糖为5mg/ml；

2.采用SepHarose-G25 (26/10desalting)柱将多糖置换到平衡缓冲液 中，收集外水第一峰为多糖峰，终浓度为2.5mg/ml；

3.将收集的多糖溶液上Capto^TM adhere阴离子交换柱，上样量为20~5 0mg/ml gel；

4.采用梯度洗脱和线性洗脱配合的方式将多糖洗脱，具体地，以35%  B洗脱液梯度洗脱 2个柱体积，再以35%-100% B洗脱液线性洗脱5个 柱体积。B洗脱液为20mM Tris-HCl, 1 mol/lNaCl ，pH8.0；（3 5%B或35%-100%B中%表示盐浓度的变化

5.收集206波长下的吸收峰；

6.采用脱盐柱或超滤脱盐法去除小分子物质。

或者，步骤2替换为：使用100KD超滤膜，在超滤器上将溶解的多糖置 换到平衡缓冲液中，终浓度约为2.5mg/ml。对于实际生产中超滤置换 缓冲液比脱盐柱使用更方便简洁。

实施例4  W135群脑膜炎球菌多糖精制

如实施例3所述方法，区别在于，前述粗制Y群脑膜炎球菌多糖替换为 粗制W135群脑膜炎球菌多糖。

实施例5  A群脑膜炎球菌多糖精制

如实施例3所述方法，区别在于，前述粗制Y群脑膜炎球菌多糖替换为 粗制A群脑膜炎球菌多糖。

实施例6 纯度检定

对杂蛋白含量比较高的同一批次C群粗制多糖，按实施例1所述方法精 制C群多糖，通过生化检测我们可以得出以下数据，见表1。由表中数 据可知，在使用DEAE-4FF和Capto^TM adhere串联层析法去除蛋白时， 不仅使蛋白含量远远低于国家规定要求，而且将核酸残留也一并去除 干净，内毒素也比在冷酚法所检测到的内毒素还要低一倍。

表1.C群粗制多糖冷酚法与层析法生化检测结果对比

同时此检测结果也适用于根据实施例3方法所精制的Y群、实施例4方法 所精制的W135群或实施例5方法所精制的A群脑膜炎 球菌多糖，结果见表2-表4。

表2.A群粗制多糖冷酚法与层析法生化检测结果对比

其中，A群粗制多糖层析法从实施例5获得

表3.Y群粗制多糖冷酚法与层析法生化检测结果对比

其中，Y群粗制多糖层析法从实施例3获得

表4.W135群粗制多糖冷酚法与层析法生化检测结果对比

其中，W135群粗制多糖层析法从实施4获得

经测算回收率，上样量16g多糖，得到12.8g多糖，回收率在80%左右， 远远大于苯酚法50%的多糖回收率，更能满足大规模生产的要求。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡 是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或 间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范 围内。