白藜芦醇在制备用于预防和/或治疗系统性红斑狼疮的组合物中的用途

摘要

本发明涉及白藜芦醇在制备用于预防和/或治疗系统性红斑狼疮的组合物中的用途。本发明表明白藜芦醇在动物模型中对系统性红斑狼疮具有显著的预防和/或治疗作用，它可以减少红斑发生，减轻尿蛋白，减轻肾小球毛细血管襻细胞增生和炎性细胞浸润，减轻肾小球IgM、IgG沉积。

说明书

技术领域

本发明涉及自身免疫性疾病的领域，具体而言涉及预防和/或治疗哺乳动物系统性红斑狼疮的领域，更具体地本发明涉及白藜芦醇在制备用于预防和/或治疗哺乳动物系统性红斑狼疮的组合物中的用途。 

背景技术

系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）是一种累及全身多系统器官组织的自身免疫性疾病，血清中存在以抗核抗体、抗dsDNA抗体为代表的多种自身抗体，肾脏是最常受累的器官。 

SLE确切病因和发病机理尚不完全清楚，可能与遗传和环境因素有关（Tsokos GC，2011；Rahman A等人，2008；Sestak AL等人，2007）。目前认为： 

(1)SLE发病和CD4+T细胞异常活化刺激B细胞不断产生自身抗体有关。血循环中抗原抗体复合物或肾脏原位形成的抗原抗体复合物沉积激活补体，引起细胞浸润，凝血因子活化和炎症介质释放，引起自身免疫性复合物性肾炎（III型免疫反应）。致病性抗体如抗红细胞抗体、抗磷脂抗体、抗SSA抗体通过II型免疫反应引起组织损伤。 

(2)SLE的发病还与NK细胞和Treg细胞功能异常有关。 

(3)细胞因子如IL-10、IL-6、IFN、BLyS、TNF，炎症分子参与了SLE的发生发展。 

(4)此外与细胞凋亡异常等有关（Munoz LE等人，2008）。 

目前治疗SLE主要使用免疫抑制剂如糖皮质激素、环磷酰胺、硫唑嘌呤、环孢素、吗替考酚酯等；它们可以抑制免疫反应的一个或多个环节，如糖皮质激素能抑制巨噬细胞对抗原的吞噬和处理，抑制辅助性T细胞和B细胞，使抗体生成减少，抑制细胞因子如IL-2、IL-6、INF-γ和TNF-α等基因表达；环磷酰胺能抑制杀伤淋巴细胞尤其是B 细胞，抑制免疫反应。上述免疫抑制剂的应用使SLE患者的预后有了很大改观，但是它们对机体免疫反应的抑制缺乏选择性和特异性，对正常和异常免疫反应均有抑制作用，长期应用除各自的毒性外，还可降低机体抵抗力诱发感染，有些还可抑制骨髓造血功能，影响生殖系统功能，增加肿瘤发生率。近年来人们对生物制剂治疗SLE作了大量研究，抗CD20单抗已被用于治疗SLE，但其价格昂贵，其远期收益与风险仍难以评价。目前仍有相当部分SLE患者对目前药物疗效差，约5-20%患者最终进展为终末期肾功能衰竭。SLE的并发症和长期治疗引起的副作用是严重影响患者预后的重要因素。SLE患者肾功能不全、中枢神经狼疮、并发感染、心血管事件、早发性血管硬化成了目前棘手难题（Danila MI等人，2009）。SLE仍然严重危害着人类健康，因此开发对SLE预防更有效更安全的药物甚为重要。 

白藜芦醇（Resveratrol，Resv），化学名3,5,4-三羟基苯二烯（结构式如下式），于1940年首次从毛叶藜芦的根部提取。它广泛存在于植物和水果中，在红葡萄皮中尤其丰富。 

大量研究发现它是还具有抗氧化、抗炎和调节血脂的作用（Nakata R等人，2012）。例如，申请号为200610037290.2的中国专利申请公开了白藜芦醇在制备治疗帕金森病药物中的应用，白藜芦醇具有抑制脂质过氧化及自由基清除作用，使氧自由基产生和清除处于动态平衡中，从而延缓PD的病情进展。申请号为200810239145.1的中国专利申请公开了白藜芦醇和柚皮素抑制转化生长因子-B1水平升高，用于制备预防或治疗糖尿病肾病药物的应用。有研究表明，白藜芦醇可活化心血管系统内皮细胞一氧化氮合酶增加NO合成，表现松驰血管的作用。白藜芦醇对肺动脉高压具有抑制作用，其作用机理与NO有关。申请号为200610031480.3的中国专利申请公开了一种含有自藜芦醇和白藜芦醇苷的中药组合物，其对减轻和控制高脂血症及动脉硬化有很好的防治作用。 

此外，近年来人们对白藜芦醇在免疫方面的作用诸如免疫细胞、 自身免疫病动物模型作用进行了研究。 

类风湿关节炎是以对称性多关节炎为主要临床表现为自身免疫性疾病。胶原诱导关节炎是目前用于研究RA的常用模型。白藜芦醇对胶原诱导DBA1鼠关节炎有预防和治疗作用，可降低小鼠关节炎的发生率，减轻关节软骨的破坏，抑制Th17和B细胞，降低血清抗胶原蛋白抗体IgG2α和IgG1水平，降低Il-17、INF-γ、TNF-α、IL-13、IL-5等细胞因子（Xuzhu G等人，2012）。 

多发性硬化是一种累及中枢神经系统的自身免疫性疾病，以脑白质内弥漫性髓鞘脱失和慢性炎性细胞浸润为主要病理特征。实验性自身免疫性脑脊髓炎是目前公认的研究多发性硬化的动物模型。在诱导小鼠产生EAE过程中给小鼠注射白藜芦醇可使小鼠病情减轻，其作用与IL-17+IL-10+T细胞和CD4(-)IFN-γ(+)细胞升高、巨噬细胞IL-6表达下调有关（Imler TJ Jr等人，2009）。 

溃疡性结肠炎是一种累及肠道的慢性非特特异性炎症性疾病。免疫功能紊乱和促炎/抗炎因子失衡是其重要的发病机制。白藜芦醇可使右旋葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠结肠炎病情减轻（Singh UP等人，2010）。 

此外动物实验证实白藜芦醇能够减轻由OVA诱发的支气管哮喘，它具有抑制Th2的作用（Lee M等人，2009）。在肝移植动物实验中给予白藜芦醇干预可延长移植肝生存时间，减轻排斥反应（Wu SL等人，2005）。 

尽管已经发现了白藜芦醇在上述疾病或症状中的应用，但是至今尚无有关白藜芦醇对预防和/或治疗SLE的研究。 

发明内容

根据本发明的第一方面，本发明提供了白藜芦醇在制备用于预防和/或治疗哺乳动物系统性红斑狼疮的组合物中的用途。 

在一些具体实施方式中，预防和/或治疗体现为避免和/或减少选自如下症状和/或指标中的一种或几种的发生和/或恶化：红斑、尿蛋白、肾小球免疫球蛋白沉积、肾脏病理、抗自身抗体。 

其中所述的肾小球免疫球蛋白沉积是指肾小球IgM沉积和/或肾小球IgG沉积。 

其中所述的肾脏病理选自：肾小球体积增大、肾脏系膜细胞增生、肾脏上皮细胞增生、肾脏内皮细胞增生、肾脏炎性细胞浸润、肾小管水肿样变性或肾小球毛细血管襻细胞增生中的一种或几种。 

其中所述的抗自身抗体选自：抗核抗体、抗双链DNA抗体、抗单链DNA抗体或抗nRNP/Sm抗体中的一种或几种。 

根据本发明的另一方面，所述的哺乳动物选自人类、小鼠、狗、兔、牛或猴；优选人类、猴或小鼠；最优选人类。 

根据本发明的另一方面，用于预防和/或治疗哺乳动物系统性红斑狼疮的组合物包含：预防和/或治疗有效量的白藜芦醇，和/或药学可接受的载体。 

如此处所用“预防和/或治疗有效量”是指针对给定的情况和施用方案提供预防和/或治疗作用的量。本领域技术人员应当理解，这是一种经计算，产生所需的预防和/或治疗作用的活性物质预先确定的量。针对本发明来说，“预防和/或治疗有效量”是指能够避免和/或减少选自如下症状和/或指标中的一种或几种的发生和/或恶化而预先确定的量：红斑、尿蛋白、肾小球免疫球蛋白沉积、肾脏病理、抗自身抗体。在用于制造用于本发明用途的组合物中，基于受试者特征（比如本领域熟知的年龄、性别、体重、并发症、病史、遗传因素、其它疾病等）通过普通医疗人员可以确定预防和/或治疗有效量。 

并且，根据本领域的公知技术，普通技术人员可以从一种物种的预防和/或治疗有效量推知另一物种的预防和/或治疗有效量。例如，可采用下列方法进行人类与不同种类动物之间药物剂量的换算：已知A种动物每kg体重用药量，欲估算B种动物每kg体重用药剂量时，可查表1（表1所列值，各家报道略有出入），找出折算系数（W），再按下式计算： 

B种动物的剂量（mg/kg）=W×A种动物的剂量（mg/kg） 

表1.动物与人体的每公斤体重剂量折算系数表 

在人类应用中，白藜芦醇可以单独施用，但通常白藜芦醇与根据预期的施用途径和标准的药物操作所选择的合适的药学可接受的载体混合施用。 

因此，在一些具体实施方式中，组合物包含白藜芦醇和药学可接受的载体，其中药学可接受的载体选自：稀释剂、缓冲液、赋形剂、防腐剂、抑菌剂、抗氧化剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、稳定剂、矫味剂中的一种或几种。 

在本说明书中，“药学可接受的载体”指进入组合物中的化合物，不会引起次级反应，并且例如促进白藜芦醇的给药、延长其在生物体中的存在时间和/或有效性、增强其在溶液中的溶解性或改善其贮存。这样的载体是本领域技术人已熟知的，并且可由本领域技术人员根据所选活性化合物的性质和给药途经进行适应性调整。 

在一些具体实施方式中，组合物由白藜芦醇和生理盐水组成。在一些具体实施方式中，组合物由白藜芦醇和无菌水组成。在一些具体实施方式中，白藜芦醇也可以先用适量乙醇先溶解，再用水稀释便于灌服。当用于小鼠腹腔注射时，白藜芦醇可以用适量二甲基亚砜稀释后腹腔注射。根据需要，可以对白藜芦醇组合物进行除菌，可以采用本领域公知的不影响有效成分活性的除菌方法，如过滤除菌、高温灭菌、辐射等。 

在一些具体实施方式中，组合物通过选自如下的施用方式向受试者施用：静脉内、皮下、皮内、肌肉内、腹腔内或口服；优选静脉内或口服；最优选通过口服向受试者施用。 

已有报道，成功制备了水溶性白藜芦醇纳米制剂，通过纳米给药体系，解决了白藜芦醇难溶于水的问题。载药量可以高达10%（w/w），溶解于水中可形成透明清亮状的纳米乳液，乳滴粒径小于50nm，能显著提高白藜芦醇的生物利用度。再比如，姚倩等采用氯化钠沉淀法制备白藜芦醇壳聚糖纳米粒（姚倩等，2006）。 

在一些具体实施方式中，组合物按照选自如下的施用频率向受试者施用：每日三次、每日两次、每日一次、隔日一次、每周一次、每周两次、两周一次、每月一次；优选每日三次、每日两次、每日一次、隔日一次；最优选每日一次。 

在一些具体实施方式中，组合物可出现在单剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿和小瓶，并且可存储在只需在使用前即刻添加无菌液体载体（例如注射用水）的冷冻-干燥（冻干）情况中。 

附图说明

本发明的示例性实施方式在如下非-限制性实施例中进行描述，参考如下附图： 

图1：BALB/c鼠的外观变化。A：Pristane诱导组的小鼠出现红斑；B：对照组小鼠未出现红斑。箭头指示红斑位置。 

图2：白藜芦醇A组、白藜芦醇B组和对照组小鼠的体重变化。其中，●对照组；■白藜芦醇A组；▲白藜芦醇B组。 

图3：白藜芦醇A组、白藜芦醇B组和对照组ANA的OD值变化。其中，●对照组；■白藜芦醇A组；▲白藜芦醇B组。 

图4：白藜芦醇A组、白藜芦醇B组和对照组的抗ds-DNA抗体OD值变化。其中，白色框为对照组；灰色框为白藜芦醇A组；黑色框为白藜芦醇B组。 

图5：白藜芦醇A组、白藜芦醇B组和对照组的抗nRNP/Sm抗体OD值变化。其中，白色框为对照组；灰色框为白藜芦醇A组；黑色框为白藜芦醇B组。 

图6：肾组织HE染色（放大倍数×200）。A：对照组；B：白藜芦醇A组；C：白藜芦醇B组。 

图7：肾组织HE染色（放大倍数×400）。A：对照组；B：白藜芦醇A组；C：白藜芦醇B组。 

图8：肾小球直接免疫荧光照片，经羊多克隆抗小鼠IgG-H&L（FITC）染色。A：对照组；B：白藜芦醇A组；C：白藜芦醇B组。 

图9：肾小球直接免疫荧光照片，经羊多克隆抗小鼠IgM-mu（FITC）染色。A：对照组；B：白藜芦醇A组；C：白藜芦醇B组。 

图10：白藜芦醇A组、白藜芦醇B组和对照组的血清IFN-α的OD值比较。 

具体实施方式

实施例 

实验材料 

以下提供了本发明实施方式中所使用的具体材料及其来源。但是，应当理解的是，这些仅仅是示例性的，并不意图限制本发明，与如下动物、试剂和仪器的类型、型号、品质、性质或功能相同或相似的材料均可以用于实施本发明。 

1.实验动物及饲养 

BALB/c鼠，SPF级，雌性，9-10周龄，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。实验经北京协和医院实验动物伦理委员会通过。小鼠饲养于SPF级动物房，清洁饮水，自由取食。环境采用十二小时明暗循环。苦味酸标记编号。 

2.实验试剂 

白藜芦醇                      美国Sigma公司 

Pristane                      美国Sigma公司 

生理盐水                      自制 

抗核抗体检测试剂盒            欧蒙股份有限公司 

抗nRNP/Sm抗体IgG检测试剂盒    欧蒙股份有限公司 

抗双链DNA抗体IgG检测试剂盒    欧蒙股份有限公司 

抗单链DNA抗体IgM检测试剂盒    欧蒙股份有限公司 

小鼠IFN-α检测试剂盒          eBioscience公司 

羊多克隆抗小鼠IgM-mu chain(HRP)    Abcam 

羊多克隆抗小鼠IgG-Fc(HRP)          Abcam 

羊多克隆抗小鼠IgM-mu chain(FITC)   Abcam 

羊多克隆抗小鼠IgG-H&L(FITC)        Abcam 

目测尿蛋白试纸                花都高尔宝生物有限公司 

3.仪器 

Model 550酶标仪               美国Bio-rad 

Eurostar Ⅱ荧光显微镜        欧蒙股份有限公司 

CH-2型显微镜                 日本OLYMPUS公司 

冰冻切片机                   Thermo shandon limited 

实施例1：Pristane诱导性狼疮小鼠模型的建立 

诱导性狼疮小鼠模型是指应用诱导剂使小鼠出现类似人类SLE病变表现的动物模型。1995年Satoh M等发现给非自发性免疫鼠BALB/c ByJ鼠腹腔注射0.5ml Pristane（2,6,10,14-四甲基十五烷）可成功诱导小鼠出现类似于人类狼疮病变。文献报道该狼疮模型包括免疫复合物型肾炎、关节炎、血管炎、血清中出现ANA、抗dsDNA抗体、抗ss-DNA抗体、抗nRNP/Sm抗体等多种自身抗体。目前该方法已成为诱导狼疮小鼠模型最常用方法（Satoh M等人，1994）。 

1.实验分组和SLE模型诱导 

BALB/c鼠20只，SPF级，雌性，9-10周龄。随机分为： 

(1)诱导组:10只，实验第1天全部均一次性腹腔注射Pristane0.5ml。 

(2)正常对照组：10只，实验第1天全部均一次性腹腔注射生理盐水0.5ml。 

观察期为7个月。两组小鼠均于实验开始及每月检查尿蛋白。两组均于实验开始及第1、3、5、7月眶缘采0.2-0.3ml，分离血清，检查抗核抗体、抗双链DNA抗体、抗nRNP/Sm抗体、抗ssDNA抗体。观察期结束后断颈脱臼法处死小鼠，分离肾脏作病理检查。病理检查包括石蜡切片HE染色，肾脏冰冻切片免疫荧光法观测免疫球蛋白沉积。 

2.检验方法 

2.1尿蛋白检测方法： 

按产品操作指导将尿液滴到试纸上湿透，在30-60秒内观察试纸颜色变化并与标准色板对照，测得结果，结果记录为“–”、“±”、“＋”、“＋2”、“＋3”、“＋4”。 

2.2抗核抗体IgG检测（ELISA）： 

采血于普通EP管中，室温下待血液自然凝固后分离血清，将血清1：100稀释。按供应商提供的使用方法对血样进行检测。 

2.3抗双链DNA抗体IgG检测（ELISA）： 

采血于普通EP管中，室温下待血液自然凝固后分离血清，将血清1：100稀释。按供应商提供的使用方法对血样进行检测。 

2.4抗nRNP/Sm抗体IgG检测（ELISA）： 

采血于普通EP管中，室温下待血液自然凝固后分离血清，将血清1：100稀释。按供应商提供的使用方法对血样进行检测。 

2.5抗ssDNA抗体IgM检测（ELISA）： 

采血于普通EP管中，室温下待血液自然凝固后分离血清，将血清1：100稀释。按供应商提供的使用方法对血样进行检测。 

2.6肾脏病理： 

分离小鼠肾脏，按照本领域中组织固定、脱水、石蜡包埋和切片的常规操作，制备组织切片。对组织切片进行HE染色，并镜检。 

2.7肾小球免疫球蛋白沉积检查（直接免疫荧光法）： 

分离小鼠肾脏，常规冰冻切片，厚度5-7μm，丙酮固定。于标本上滴加羊多克隆抗小鼠IgG-H&L(FITC)荧光抗体50μl或羊多克隆抗小鼠IgM-mu chain(FITC)荧光抗体50μl。置湿盒内37℃作用30分钟。用PBS吐温缓冲液流水冲洗，继以将其浸入装有PBS吐温缓冲液的3个洗杯中浸洗，在每个杯中浸洗至少3分钟。最后取出自然干燥。封片，荧光显微镜观察荧光强度类型并拍照。标本只加缓冲甘油封片作为标本自发荧光对照。抑制试验：标本先加未标记的特异性抗体，水洗后再加标记荧光抗体，荧光显微镜观察有无荧光。 

3.统计方法 

计量资料以均值±标准差表示，比较采用t检验。计数资料以百分率(P)表示，比较采用χ2检验。等级资料采用非参数检验。P＜0.05为差异有统计学意义。采用SPSS17.0软件处理。 

4.结果 

BALB/c鼠外观变化：诱导组和对照组观察期间小鼠均无死亡。诱导组有5只鼠出现红斑，分布在额部，病变部位大小不等，局部毛发脱落（见图1）。对照组未出现红斑。 

尿蛋白变化：两组小鼠实验起始尿蛋白为“-”或“±”。诱导组小鼠在注射pristane后第2月出现尿蛋白，多为“±”或“＋”。随着时间推移诱 导组小鼠出现蛋白尿者及尿蛋白量越来越明显。对照组尿蛋白为≤＋，不随时间加重。经非参数检验，两组尿蛋白有明显差异（数据未显示）。 

腹腔脏器变化：至观察期结束诱导组2只小鼠出现腹水。全部小鼠脏器根部或肠系膜可见米粒大小乳白色小结，经病理证实为反应性增生，在注射的pristane周围有脂肪组织和炎性细胞浸润。部分小鼠脾脏、肾脏体积增大。对照组小鼠无上述变化。 

血清抗体变化：自身抗体是狼疮出现的重要标志。我们检查抗核抗体（IgG/M）、抗ds-DNA抗体（IgG）、抗nRNP/Sm（IgG）、抗ss-DNA抗体（IgM）。1）实验起始时诱导组抗核抗体（ANA）光密度（OD）为0.225±0.056，对照组抗核抗体OD为0.235±0.118，两组无明显差异。诱导组小鼠ANA于第三个月出现，随着时间推移，诱导组抗核抗体OD渐升高，而对照组变化不大。至实验观察结束时诱导组抗核抗体OD检查结果为0.632±0.341，而对照组抗核抗体OD检查结果为0.347±0.075，经统计学检验，诱导组小鼠OD显著高于对照组小鼠OD。2）实验起始时诱导组小鼠抗ds-DNA抗体OD为0.101±0.020，对照组抗ds-DNA抗体OD为0.112±0.036，两组无明显差异。于实验观察结束时组诱导组小鼠抗ds-DNA抗体OD为0.269±0.098，而对照组抗ds-DNA抗体OD为0.145±0.029。经统计学检验，诱导组小鼠OD显著高于对照组小鼠OD。3）实验起始时诱导组小鼠抗nRNP/Sm抗体OD为0.201±0.096，对照组抗nRNP/Sm抗体OD为0.226±0.071，两组无明显差异。于实验观察结束时组诱导组小鼠抗nRNP/Sm抗体OD为0.759±0.375，而对照组抗nRNP/Sm抗体OD检查结果为0.349±0.068，经统计学检验，诱导组小鼠OD显著高于对照组小鼠OD。4）诱导组小鼠实验起始时检测抗ss-DNA抗体OD为0.111±0.013，对照组抗ss-DNA抗体OD为0.119±0.012，两组无明显差异。实验观察结束时诱导组小鼠抗ss-DNA抗体OD检查结果为0.112±0.013，而对照组抗ss-DNA抗体OD检查结果为0.109±0.008，经统计学检验，两组OD无明显差异。 

肾脏病理变化：诱导组小鼠肾脏病理石蜡切片经HE染色光镜下显示部分肾小球体积增大，系膜细胞增生，上皮和内皮细胞增生。可见轻、中度炎性细胞浸润。部分球囊毛细血管襻间隙缩小，甚至消失。 肾小管可见水肿样变性。对照组肾小球、肾小管无上述变化。 

肾小球免疫球蛋白沉积：本实验采用羊多克隆抗小鼠IgG-H&L（FITC）检查IgG在肾小球沉积情况。诱导组部分小鼠（7/10）肾小球系膜毛细血管襻可见明显荧光，荧光呈连续性或颗粒分布，显示IgG在肾小球沉积。对照组小鼠肾小球系膜毛细血管襻荧光微弱。本实验还采用羊多克隆抗小鼠IgM-mu chain（FITC）检查IgM在肾小球沉积情况。诱导组部分小鼠（5/10）肾小球系膜毛细血管襻可见明显荧光，荧光呈连续性或颗粒分布，提示IgM在肾小球沉积。对照组小鼠肾小球系膜毛细血管襻荧光微弱。

5.结论 

人类SLE临床表现多样，目前普遍采用美国风湿病学会1997年推荐的SLE分类标准诊断。该分类标准中，符合4项或4项以上者，在除外感染、肿瘤和其它结缔组织病后，可诊断为SLE（Tsokos GC等人，2011）。本实施例中BALB/c鼠经腹腔注射Pristane后可诱导出现蛋白尿、免疫复合物性肾小球肾炎、皮肤红斑、自身抗体（包括ANA、抗nRNP/Sm抗体、抗dsDNA抗体），符合上述SLE诊断标准。 

实施例2：白藜芦醇组合物的制备 

使用具有足够精确度的电子天平称量白藜芦醇，溶于生理盐水中配制成所需浓度。除了生理盐水也可以是使用实验室级用水、或者去离子水、中国药典中的注射用水等。 

由于白藜芦醇在水中溶解度有限，且小鼠的胃容量有限，可以适当浓缩白藜芦醇的浓度，以便于小鼠灌胃。因此白藜芦醇可以先用适量乙醇溶解，再用水稀释便于灌服。除了乙醇外，也可以使用其它适当的药学可接受的载体进行溶解。 

根据需要，可以使用0.22微米滤器对白藜芦醇溶液进行过滤除菌。 

实施例3：白藜芦醇预防和/或治疗Pristane诱导狼疮鼠的作用研究 

1.实验分组和SLE模型诱导 

BALB/c鼠30只，雌性，9-10周龄，SPF级，随机分为3组： 

(1)白藜芦醇A组：10只，均一次性腹腔注射Pristane 0.5ml。次日起灌服实施例2中制备的白藜芦醇组合物，剂量为50mg白藜芦醇/kg/d，每日一次直至第七个月。 

(2)白藜芦醇B组：10只，均一次性腹腔注射Pristane 0.5ml。次日起灌服实施例2中制备的白藜芦醇组合物，剂量为75mg白藜芦醇/kg/d，每日一次直至第七个月。 

(3)对照组：10只，均一次性腹腔注射Pristane 0.5ml，次日起灌服生理盐水，体积同A和B组的给药体积，每日一次直至第七个月。 

观察期为7个月。各组均于实验开始日及每月检查尿蛋白，于实验开始日及第1、3、5、7月眶缘采血0.2-0.3ml，分离血清检查抗核抗体、抗双链DNA抗体、抗RNP/Sm抗体和IFN-α。观察期结束采取断颈脱臼法处死小鼠，分离肾脏作病理检查包括常规石蜡切片HE染色，新鲜肾组织做冰冻切片采用免疫荧光法了解免疫球蛋白IgG和IgM在肾脏沉积情况。 

2.检验方法 

2.1尿蛋白检测、抗核抗体IgG检测、抗双链DNA抗体IgG检测、抗nRNP/Sm抗体IgG检测、肾脏病理和肾小球免疫球蛋白沉积检查同实施例1中2.1至2.7所述的方法。 

2.2IFN-α检测（ELISA）：采血于普通EP管中，室温下待血液自然凝固后分离血清，将血清1：100稀释。按供应商提供的使用方法对血样进行检测。 

3.统计方法 

同实施例1中3所述的方法。 

4.结果 

小鼠外观变化：白藜芦醇A、白藜芦醇B组和对照组各鼠毛发均光泽，精神活动良好。实验初期白藜芦醇A组、白藜芦醇B组和对照组体重分别为20.51±0.61g、20.35±0.83g、20.98±0.55g，至实验观察期结束时白藜芦醇A组、白藜芦醇B组和对照组体重分别为24.26±1.12g、21.02±2.53g、26.41±0.72g。各组体重变化如图2。B组体重增加值明显低于A组和对照组，有统计学意义（t=2.517，P＜0.05）。 

红斑比较：对照组50%的鼠额部出现红斑。白藜芦醇A组和白藜芦醇B组各鼠均未出现红斑。与对照组比较，白藜芦醇A组红斑发生率明显低于对照组，经非参数检验，有明显差异（Z=2.517，P＜0.05）。白藜芦醇B组结果类似（数据未显示）。 

尿蛋白比较：对照组部分小鼠在注射pristane后第2月开始出现尿蛋白，多为“±”或“＋”。随着时间推移对照组小鼠出现蛋白尿者及尿蛋白量越来越明显。白藜芦醇A组和白藜芦醇B组尿蛋白为≤＋。至实验观察期结束时各组小鼠尿蛋白检查结果如表2。经非参数检验，白藜芦醇A组和白藜芦醇B组与对照组比较尿蛋白明显减轻，有统计学意义。 

表2.白藜芦醇A组、白藜芦醇B组和对照组的尿蛋白比较 

血清自身抗体比较：实验起始对照组小鼠ANA的OD值为0.225±0.056，白藜芦醇A组和白藜芦醇B组抗核抗体OD值分别为0.216±0.048、0.223±0.066。注射pristane后，各组ANA于第三个月出现，后渐升高。至观察期结束时对照组小鼠ANA OD值为0.632±0.341，白藜芦醇A组和白藜芦醇B组抗核抗体OD值分别为0.570±0.093、0.561±0.233，均低于对照组，经检验差异均无统计学意义（白藜芦醇A组vs对照组t=0.548，P＞0.05；白藜芦醇B组vs对照组t=0.524，P＞0.05）（图3）。观察期结束时，对照组抗ds-DNA抗体OD值为0.188±0.114，白藜芦醇A组和白藜芦醇B组抗ds-DNA抗体OD分别为0.175±0.094、0.156±0.110，低于对照组，但经检验差异无统计学意义（白藜芦醇A组vs对照组t=0.275，P＞0.05；白藜芦醇B组vs对照组t=0.619，P＞0.05）（图4）。观察期结束时对照组抗nRNP/Sm抗体OD值为0.839±0.996，白藜芦醇A组和白藜芦醇B组抗nRNP/Sm抗体OD分别为0.605±0.189、0.455±0.375，低于对照组，但经检验差异无统计学意义（白藜芦醇A组vs对照组t=0.729，P＞0.05；白藜芦醇B组vs对照组t=1.087，P＞0.05）（图5）。 

肾脏病理变化比较：对照组小鼠肾脏病理切片HE染色示部分肾小球体积增大，系膜细胞增生，上皮和内皮细胞增生；可见炎性细胞浸润；部分球囊毛细血管襻间隙缩小，甚至消失；肾小管可见水肿样变性（图6，A；图7，A）。而白藜芦醇A组（图6，B；图7，B）和 白藜芦醇B组（图6，C；图7，C）上述变化较轻。 

平均肾小球细胞数被用来衡量比较SLE患者肾小球毛细血管襻细胞增生情况。本实施例类似地比较各组小鼠平均肾小球细胞数以了解各组小鼠肾小球毛细血管襻细胞增生情况。计算平均肾小球细胞数方法是每张小鼠石蜡切片计数至少10个肾小球的细胞数，然后计算其平均肾小球细胞数。结果发现对照组肾小球平均细胞数为52.5±14.6，白藜芦醇A组为44.1±11.4，对照组平均肾小球细胞数明显大于白藜芦醇A组平均肾小球细胞数，经统计学检验有显著性差异（t=2.282，P＜0.05）。白藜芦醇B组平均肾小球细胞数为42.8±9.9，对照组平均肾小球细胞数大于白藜芦醇B组平均肾小球细胞数，经统计学检验有显著性差异（t=2.510，P＜0.05）。但白藜芦醇A组和白藜芦醇B组平均肾小球细胞数经统计学检验无显著性差异（t=0.441，P＞0.05）。 

肾小球免疫球蛋白沉积比较：为了了解免疫球蛋白在肾小球沉积情况，采用免疫荧光法检查各组小鼠肾小球免疫球蛋白IgG和IgM沉积。 

冰冻切片经羊多克隆抗小鼠IgG-H&L（FITC）染色，对照组小鼠肾小球荧光强度为-～+2，大部分（7/10）小鼠肾小球荧光强度阳性，提示出现IgG沉积；白藜芦醇A和B组小鼠肾小球荧光强度为-～+，小部分（2/10）小鼠肾小球荧光强度阳性（IgG沉积），经非参数检验，两组免疫球蛋白IgG沉积差异有统计学意义（P＜0.05）（表3）。 

肾小球直接免疫荧光检法查，经羊多克隆抗小鼠IgG-H&L（FITC）染色。对照组荧光强（图8，A）；白藜芦醇A组（图8，B）和白藜芦醇B组（图8，C）肾小球荧光微弱。 

表3.白藜芦醇A组、白藜芦醇B组和对照组的肾小球IgG荧光强度比较 

冰冻切片经抗小鼠IgM-mu chain（FITC）染色，对照组小鼠肾小球荧光强度为-～+2，有部分（5/10）小鼠荧光强度阳性；白藜芦醇A 和B组小鼠肾小球荧光强度为-～+，只有1只（1/10）小鼠荧光强度阳性。经非参数检验，两组小鼠肾小球荧光强度差异有统计学意义（P＜0.05），提示两组小鼠肾小球IgM沉积有显著差异（表4）。 

肾小球直接免疫荧光法检查，经羊多克隆抗小鼠IgM-mu chain（FITC）染色。对照组荧光强（图9，A）；白藜芦醇A组（图9，B）和白藜芦醇B组（图9，C）肾小球荧光微弱。 

表4.白藜芦醇A组、白藜芦醇B组和对照组的肾小球IgM荧光强度比较 

血清IFN-α比较：文献报道IFN-α在SLE发病中起重要作用。Pristane诱导狼疮鼠IFN-α升高。为了了解白藜芦醇是否会影响IFN-α水平，我们检测了各组IFN-α水平。结果发现至观察期结束时，对照组血清IFN-αOD为0.115±0.001，白藜芦醇A组和白藜芦醇B组血清IFN-αOD分别为0.110±0.001，0.111±0.001，对照组与白藜芦醇A组和白藜芦醇B组比较，血清IFN-α差异经统计学检验无显著性（白藜芦醇A组vs对照组：t=1.001，P＞0.05；白藜芦醇B组vs对照组：t=1.089，P＞0.05）（图10）。 

5.结论 

本发明首次证实BALB/c小鼠在注射Pristane后灌服白藜芦醇7个月后与对照组比较可以减少红斑发生，减轻尿蛋白，减轻肾小球毛细血管襻细胞增生和炎性细胞浸润，减轻肾小球IgM、IgG沉积，这显示白藜芦醇对Pristane诱导狼疮鼠有预防和/或治疗作用。 

6.讨论 

目前对SLE的治疗主要是抑制免疫反应，抑制淋巴细胞活化和增殖，抑制自身抗体产生，药物包括糖皮质激素、环磷酰胺、硫唑嘌呤、环孢素、吗替麦考酚酯、FK506、雷公藤总苷等，它们对免疫反应的抑制缺乏选择性和特异性，长期应用存在较多毒副作用。生物制剂价格昂贵，远期疗效和副作用还难以评价。仍有部分患者对治疗效果差， 因此有必要开发更有效更安全的治疗药物。本申请提供了一种白藜芦醇在制备用于预防和/或治疗系统性红斑狼疮的组合物中的用途。在本申请的研究过程中，白藜芦醇不仅显著减轻、改善了系统性红斑狼疮的典型症状和/或指标，也没有观察到明显的毒副作用。因此，白藜芦醇有可能代表着治疗SLE的新方法。 

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