一种养阴降糖片的制备方法及应用

摘要

本发明提供一种养阴降糖片的制备方法，由黄芪250g、党参110g、葛根145g、枸杞子110g、玄参145g、玉竹110g、地黄180g、知母110g、牡丹皮110g、川芎145g、虎杖180g、五味子70g作为原料药制成，采用超临界萃取和微波萃取制备而成，使得丹皮酚含量有很大提高，本发明还提供了养阴降糖片在制备抑制人早幼粒白血病细胞HL-60细胞增殖药物中的应用。

说明书

技术领域

本发明涉及中药制剂技术领域，具体涉及一种养阴降糖片的制备方法及应用。 

背景技术

养阴降糖片记载于卫生部标准WS3-B-0984-91，由黄芪250g、党参110g、葛根145g、枸杞子110g、玄参145g、玉竹110g、地黄180g、知母110g、牡丹皮110g、川芎145g、虎杖180g、五味子70g作为原料药制成，能养阴益气，清热活血。用于糖尿病。 

现有技术中，尚未有养阴降糖片在提取制备方面采用超临界和微波技术的报道，而采用打粉和水煎煮的方法，工艺粗糙、落后，杂质多，导致患者用量过大，不方便服用，严重影响了本品在临床上应用。 

发明内容

发明目的：为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种养阴降糖片的制备方法。 

本发明的另一个目的在于提供一种养阴降糖片在制备抑制人早幼粒白血病细胞HL-60细胞增殖药物中的应用。 

技术方案：本发明的目的是通过如下的方案实现的： 

一种养阴降糖片的制备方法，由黄芪250g、党参110g、葛根145g、枸杞子110g、玄参145g、玉竹110g、地黄180g、知母110g、牡丹皮110g、川芎145g、虎杖180g、五味子70g作为原料药制成，所述的方法由下列步骤组成：取川芎，加入到CO2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为4-6%，萃取压力15-30MPa，温度30-50℃，CO2流量1-3m1/g生药·min，萃取时间150-180min，得超临界萃取物，备用；取其余中药，粉碎，加入2L的70%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率400-600W，萃取2次，每次4-8分钟，合并萃取液，浓缩，加到D101大孔吸附树脂柱上，50%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得微波提取物，备用；将上述超临界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制颗粒，干燥，压片，制成1000片，每片重0.5g。 

上述一种养阴降糖片的制备方法，所述CO₂超临界萃取夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为5%。 

上述一种养阴降糖片的制备方法，所述微波萃取功率500W，每次萃取6分钟。 

上述一种养阴降糖片的制备方法，所述CO₂超临界萃取的萃取压力20MPa，温度40℃，CO₂流量2ml/g生药·min，萃取时间160min。 

上述养阴降糖片在制备抑制人早幼粒白血病细胞HL-60细胞增殖药物中的应用。 

现有技术中，养阴降糖片每片0.5g，每次8片，一日3次，采用本发明制备成的养阴降糖片每片0.5g，每次仅需4片，一日服用3次，在具有更多活性成分的条件下大大减少了服用量。此结论可以通过下述试验证明。 

试验一、不同方法制备的养阴降糖片中丹皮酚含量的比较 

1、仪器及试药本发明养阴降糖片：按实施例3方法制备，使用1665g原料药，经提取制成1000片，每片重0.5g。原养阴降糖片，按部颁标准方法制备，使用1665g原料药，经提取制成1000片，每片重0.5g。Agilent 1200高效液相色谱仪；METTLERAE240电子分析天平；丹皮酚对照品(中国药品生物制品检定所)。 

2、方法 

色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-水-磷酸（40：60：0.2）为流动相；检测波长为280nm。理论板数按丹皮酚峰计算，应不低于3000。 

对照品溶液的制备：精密称取在60℃减压干燥4小时的丹皮酚对照品适量，加甲醇制成每1ml含18μg的溶液，即得。 

供试品溶液的制备：取本发明养阴降糖片和原养阴降糖片，研细，混匀，取1g，精密称定，精密加入70%乙醇20ml，密塞，超声处理10分钟，离心，取上清液，即得。 

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。 

3、结果 

结果表明，本发明养阴降糖片中丹皮酚的含量为1.24mg/片；而原养阴降糖片中丹皮酚的含量为0.18mg/片，在服用量减少的情况下，丹皮酚含量有很大提高。 

上述研究表明，采用本发明制备的养阴降糖片，有效成分含量高于部颁标准法制备的养阴降糖片。 

具体实施方式

以下通过实施例形式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。 

实施例1 

取黄芪250g、党参110g、葛根145g、枸杞子110g、玄参145g、玉竹110g、地黄 180g、知母110g、牡丹皮110g、川芎145g、虎杖180g、五味子70g，将川芎，加入到CO2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为4%，萃取压力15MPa，温度30℃，CO2流量1m1/g生药·min，萃取时间150min，得超临界萃取物，备用；取其余中药，粉碎，加入2L的70%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率400W，萃取2次，每次4分钟，合并萃取液，浓缩，加到D101大孔吸附树脂柱上，50%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得微波提取物，备用；将上述超临界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制颗粒，干燥，压片，制成1000片，每片重0.5g。 

经检测，成品中丹皮酚的含量为1.29mg/片。 

实施例2 

取黄芪250g、党参110g、葛根145g、枸杞子110g、玄参145g、玉竹110g、地黄180g、知母110g、牡丹皮110g、川芎145g、虎杖180g、五味子70g，将川芎，加入到CO₂超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为6%，萃取压力30MPa，温度50℃，CO₂流量3m1/g生药·min，萃取时间180min，得超临界萃取物，备用；取其余中药，粉碎，加入2L的70%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率600W，萃取2次，每次8分钟，合并萃取液，浓缩，加到D101大孔吸附树脂柱上，50%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得微波提取物，备用；将上述超临界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制颗粒，干燥，压片，制成1000片，每片重0.5g。 

经检测，成品中丹皮酚的含量为1.37mg/片。 

实施例3 

取黄芪250g、党参110g、葛根145g、枸杞子110g、玄参145g、玉竹110g、地黄180g、知母110g、牡丹皮110g、川芎145g、虎杖180g、五味子70g，将川芎，加入到CO₂超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为5%，萃取压力20MPa，温度40℃，CO₂流量2m1/g生药·min，萃取时间160min，得超临界萃取物，备用；取其余中药，粉碎，加入2L的70%乙醇，投入微波萃取装置中进行微波萃取，萃取功率500W，萃取2次，每次6分钟，合并萃取液，浓缩，加到D101大孔吸附树脂柱上，50%乙醇洗脱，收集5倍量柱体积洗脱液，减压回收乙醇，浓缩并干燥，得微波提取物，备用；将上述超临界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制颗粒，干燥，压片，制成1000片，每片重0.5g。 

经检测，成品中丹皮酚的含量为1.24mg/片。 

实施例4：养阴降糖片抑制HL-60细胞增殖的实验研究资料 

1实验材料 

1.1实验用细胞株 

人早幼粒白血病细胞HL-60细胞，南京正宽医药科技有限公司实验室细胞库，DMEM+10%FBS常规培养。 

1.2实验药物 

研究药物：本发明养阴降糖片：按实施例3方法制备。 

药液储液：称取100mg养阴降糖片，溶于5ml无水乙醇中，0.2μm滤器过滤，500μldoff管分装，-20℃存储，同时0.2μm滤器过滤无水乙醇以备对照组之用。 

1.3实验试剂 

DMEM（GIBCO公司Cat.No.12100-061Lot.No.758137）；胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司Lot.No.100419）；NaHCO3（上海久亿化学试剂有限公司Cat.No.11810-033Lot.No.1088387）；Trypsin（AMRESCO公司批号：2010/04）；EDTA（AMRESCO公司批号：2009/10）；Penicillin G Sodium Salt（AMRESCO公司批号：2010242）；Streptomycin Sulfate（AMRESCO公司批号：2010382）；无水乙醇（南京化学试剂有限公司批号：080310182）；MTT(Biosharp批号：0793);PBS（实验室自配）； 

1.4实验器材 

莱卡倒置显微镜（德国Leica型号：DM1L）；可见-紫外光微孔板检测仪（美国MD公司型号：SPECTRAMAX 190）；CO2培养箱（FORMA型号：3111）；超净台（苏净集团安泰公司制造型号：SW-CJ-ZFD）；纯水仪（美国Spring公司型号：S/N 020579）；精密移液器（法国吉尔森公司型号：P2）；电子天平（德国赛多利斯有限公司型号：BT323S）；全自动高压灭菌锅（日本SANYO公司型号：MLS-3020）；台式电热鼓风干燥箱（上海精密实验设备公司型号：DHG9123A）；冰箱（西门子公司型号：KG18V21TI）；液氮罐（CBS型号：2001）；低速离心机（上海安亭科学仪器厂型号：KA-1000）；0.2μm滤器（MILLIPORE型号：SLGP033RB）；10cm培养皿(NEST公司)、96孔培养板（NEST公司）；细胞计数板；离心管、移液管、Tips若干。 

2实验方法 

1）HL-60细胞用DMEM+10%FBS于37℃、5%CO2进行常规培养（10cm培养皿），当细胞生长至对数期时，收集细胞，弃去培养液，PBS轻洗3遍，加入3ml 0.25%胰蛋白酶-0.04%EDTA，37℃消化2min后，向其中加入5ml完全培养基中和反应，吹打细胞后将其转入离心管中，1000rpm离心5min，调整细胞悬液浓度3×104个/ml。 

2）将细胞种入96孔培养板中，每孔加入细胞悬液180μl，培养板放入细胞培养箱中 （37℃，5%CO2）常规培养。 

3）根据细胞生长情况，一般长至50%-70%，加入养阴降糖片溶液，继续培养24h。 

4）24h后加入20μl MTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。 

5）4h后扣板法倒去上清，用吸水纸轻轻拍干，每孔加入200μl二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光值。 

6）同时设置本底（不加细胞，只加培养液），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定6个复孔。 

7）结果以药物对细胞的抑制率表示： 

细胞增值抑制率（%）=（对照孔OD值-给药孔OD值）/对照孔OD值×100%。实验重复3次。 

3 统计处理 

采用Microsoft Excel 2003软件中的相关分析和Student t检验，数据以mean±S.D.表示。 

4 实验结果 

MTT法实验后统计结果显示，与对照组比较，当剂量达到5mg/ml时，对HL-60细胞增殖抑制有差异（P<0.05），剂量在10mg/ml时该差异具有显著性（P<0.01），当剂量达到15-20mg/ml时有极显著性差异（P<0.001）。 

表1养阴降糖片对HL-60细胞增殖抑制影响研 

注：与对照组比较，*P<0.01；**P<0.001 

5 实验结论 

养阴降糖片可以抑制HL-60细胞增殖，减少HL-60细胞的细胞生长数目，该作用呈剂量依赖性。