一种三聚氰胺衍生物及三聚氰胺单克隆抗体的制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种三聚氰胺衍（Melamine）生物及三聚氰胺单克隆抗体的制备方法和应用，所述三聚氰胺衍生物的制备方法包括以下步骤：a）将三聚氰胺溶解于预热至预定温度的二甲基酰胺中，加入戊二酸酐反应第一预定时间；b）将反应后溶液冷却后加入乙醚，产生沉淀；c）过滤所述沉淀，并将过滤后固体进行重结晶，得到三聚氰胺衍生物。根据本发明实施例的三聚氰胺衍生物，相对于三聚氰胺多出了一个臂状结构，通过该臂状结构可以与载体蛋白相连接，连接所得抗原免疫原性好，特异性强，可刺激动物产生特异性的抗体，并且效价高，解决了很难单独用三聚氰胺化合物制备出有效抗体的问题。

说明书

技术领域

本发明涉及化学合成技术领域，更具体地，本发明涉及一种三聚氰胺衍生物及三聚氰 胺单克隆抗体的制备方法和应用。

背景技术

三聚氰胺化合物因分子小，结构简单，直接偶联载体蛋白后，不能充分的暴露出小分 子的空间结构，不利于淋巴细胞识别该小分子化合物，所以用未经改造的三聚氰胺分子直 接偶联载体蛋白的这种抗原制备的抗体效价低，特异性差，无法满足检测试剂盒的研发的 需求。

发明内容

本发明旨在至少解决上述技术问题之一。

为此，本发明的一个目的在于提出一种与载体蛋白连接后抗体效价高、特异性强的三 聚氰胺衍生物。

根据本发明实施例的三聚氰胺衍生物具有如下分子结构式：

根据本发明实施例的三聚氰胺衍生物，相对于三聚氰胺多出了一个臂状结构，通过该 臂状结构可以与载体蛋白相连接，连接所得抗原免疫原性好，特异性强，可刺激动物产生 特异性的抗体，并且效价高，解决了很难单独用三聚氰胺化合物制备出有效抗体的问题。

本发明还提出了三聚氰胺衍生物的制备方法，其具体可以包括以下步骤：

a）将三聚氰胺（1.26g，10mmol）溶解于预热至40℃～50℃的二甲基酰胺（DMF 40mL） 中，加入戊二酸酐（1.14g，10mmol）反应2h；

b）将反应后溶液冷却后加入乙醚10mL，产生白色沉淀；

c）过滤所述沉淀，并将过滤后固体进行重结晶，可得到1.8g三聚氰胺衍生物。

该方法操作简单易行，制备成本低，并且制备所得三聚氰胺衍生物用途广泛，适合推 广使用。

本发明的另一个目的在于提出一种三聚氰胺衍生物在制备三聚氰胺单克隆抗体中的应 用。

基于所述三聚氰胺衍生物相对于三聚氰胺多出了一个臂状结构，通过该臂状结构可以 与载体蛋白相连接，连接所得抗原免疫原性好，特异性强，因此，可将所述三聚氰胺用于 制备三聚氰胺单克隆抗体。

本发明还提供了三聚氰胺单克隆抗体的制备方法，其具体操作步骤可以包括：

A）将三聚氰胺衍生物与血蓝蛋白（KLH）通过偶联剂偶联，得到完全抗原；

B）将三聚氰胺衍生物与牛血清白蛋白（BSA）通过偶联剂偶联，得到三聚氰胺-蛋白偶 联物（三聚氰胺-BSA）；

C）将所述完全抗原与弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂乳化后免疫试验动物，并在第四 次免疫后的第十天取静脉血测定抗体效价；

D）将试验动物的脾细胞与骨髓瘤细胞融合,分离筛选单克隆抗体细胞株；

E）将筛选的稳定的阳性克隆株扩大培养，接种试验动物，制备单克隆抗体腹水；

F）将所述抗体腹水分离上清，用Protein A亲和层析柱分离纯化，得到三聚氰胺单克 隆抗体。

根据上述方法制备所得的完全抗原可以用于动物的免疫，得到的三聚氰胺-BSA可以用 于检测抗体。

在本发明的实施例中，关于测定抗体效价的方法，没有特殊限制，例如可以采用竞争 ELISA方法，其具体操作可以为：

以三聚氰胺-BSA包被酶联板，用1%BSA封闭，洗涤酶联板，将小鼠血清稀释成不同的 比例，与酶联板上的抗原反应，免疫前小鼠血清做阴性对照，洗涤酶联板，再与辣根过氧 化物酶标记的二抗反应，洗涤酶联板，过氧化氢作为底物，TMB(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺) 显色，2N H₂SO₄作为终止液，于450nm测定OD值。其中，洗涤酶联板所用洗涤液为0.01M PBS, 含体积百分百为0.05%的吐温-20，pH值为7.4。

本发明的再一个目的在于提出一种三聚氰胺衍生物在制备用于检测三聚氰胺的试剂盒 中的应用。通过该试剂盒的应用，可以检测分析动物尿液、血液、肌肉、肝脏、牛奶及饲 料等样本中的环丙沙星的残留量，还可用于癌症、心血管病、糖尿病或其他某些疾病患者 的诊断和预后,具有准确、特异、灵敏、稳定、方便等优点。

本发明还提供了一种检测人血管内皮细胞生长因子(VEGF)的酶联检测试剂盒，试剂盒 盒体内包括:从昆虫细胞表达纯化的VEGF受体包被的酶联反应板、辣根过氧化物酶(HRP) 标记的抗体加保护剂配置的酶结合物、作为阳性对照的VEGF蛋白的冻干粉、作为阴性对照 蛋白冻干粉、样品稀释液、PBST浓缩漂洗液、3,3’,5,5’-四甲基联苯胺配置的显色底物、 作为终止液的2N H₂SO₄、封板胶纸。该试剂盒可用于癌症、心血管病、糖尿病或其他某些 疾病患者的诊断和预后,具有准确、特异、灵敏、稳定、方便等优点。同时,本发明还提供 了运用昆虫细胞高效表达外源蛋白的方法。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明 显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和 容易理解，其中：

图1是根据本发明一个实施例中标准品的OD450平均值的标准曲线图。

具体实施方式

以下通过具体实施例来进一步描述本发明，下列实施例用于说明目的，而非用于限制 本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，可按照常见的分子克隆手册所 述的条件进行操作。下列实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂 商店购买所得。

实施例1三聚氰胺衍生物的制备

一、试验材料

三聚氰胺、DMF、戊二酸酐、乙醚均为自常规生化试剂商店购买所得。

二、试验步骤

a）将三聚氰胺（1.26g，10mmol）溶解于预热至40℃～50℃的DMF（40mL）中，加入 戊二酸酐（1.14g，10mmol）反应2h；

b）将反应后溶液冷却后加入乙醚10mL，产生白色沉淀；

c）过滤所述沉淀，并将过滤后固体进行重结晶，可得到1.8g三聚氰胺衍生物。

实施例2三聚氰胺单克隆抗体的制备

一、试验材料

三聚氰胺衍生物（由实施例1制备所得）；

KLH、BSA、碳二亚胺、弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂、过氧化氢、TMB、H₂SO₄为自常 规生化试剂商店购买所得；

洗涤液为0.01M PBS,含体积百分百为0.05%的吐温-20，pH值为7.4，可自行调配所得。

二、试验动物

Balb/c小鼠（中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供）

三、试验步骤

A）将三聚氰胺衍生物与KLH通过碳二亚胺偶联，得到完全抗原；

B）将三聚氰胺衍生物与BSA通过碳二亚胺偶联，得到三聚氰胺-蛋白偶联物（三聚氰 胺-BSA），检测用抗原；

C）将所述完全抗原与弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂乳化后免疫Ba l b/c小鼠，并在 第四次免疫后的第十天取静脉血测定抗体效价；

D）将Balb/c小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合,分离筛选单克隆抗体细胞株；

E）将筛选的稳定的阳性克隆株扩大培养，接种Balb/c小鼠，制备单克隆抗体腹水；

F）将所述抗体腹水分离上清，用Protein A亲和层析柱分离纯化，得到三聚氰胺单克 隆抗体。

其中，关于测定抗体效价的方法，没有特殊限制，例如可以采用竞争ELISA方法，其 测定原理为：

根据抗原抗体的特异性结合反应，采用竞争ELISA方法，在酶标板微孔条上包被抗三 聚氰胺小鼠单克隆抗体IgG，加入三聚氰胺的标准品或样本抽提物和三聚氰胺-HRP交联物。 游离的三聚氰胺分子和HRP交联的三聚氰胺分子竞争结合三聚氰胺特异抗体的结合位点。 没有被结合的三聚氰胺分子和HRP-三聚氰胺被洗涤除去，用TMB底物显色，在辣根过氧化 物酶作用下变为蓝色，加入终止液后颜色由蓝色变为黄色，在450nm处测定吸光值，样本 吸光值与其所含残留三聚氰胺分子的含量成负相关，与标准曲线比较再乘以其对应的稀释 因子，即可得出样品中三聚氰胺的残留含量。

实施例3用于检测三聚氰胺的试剂盒的检测试验

一、试验材料

1、96孔微孔板（包被三聚氰胺单克隆抗体）1板（12条×8孔）

2、三聚氰胺标准品液：6管（0.5ml/管），分别标记为标准品1-6。样品应在阴凉处存 放，或放在4℃冰箱中贮存。

标准品1：1管（三聚氰胺含量为0ng/ml）；

标准品2：1管（三聚氰胺含量为0.1ng/ml）；

标准品3：1管（三聚氰胺含量为0.5ng/ml）；

标准品4：1管（三聚氰胺含量为1ng/ml）；

标准品5：1管（三聚氰胺含量为5ng/ml）；

标准品6：1管（三聚氰胺含量为10ng/ml）。

3、酶联物（HRP-Melamine浓缩液）：1管（50ul）。使用时1：1000倍稀释，现配现用。

4、显色剂A（白色）：1瓶（8ml）。

5、显色剂B（黑色）：1瓶（8ml）。

6、反应终止液（棕色）：1瓶（15ml）。

7、样品稀释/洗板浓缩液：1瓶（40ml），使用时用蒸馏水1：25稀释。

8、新鲜猪肉、猪肝脏、猪肾脏、鸡蛋、牛奶、奶粉。

二、试验设备

微孔板酶标检测仪；

低温离心机；

微量移液器：0.5-10μl，20－200μl和200－1000μl；

吸头：0.5-10μl，20－200μl和200－1000μl。

三、试验步骤

1、试剂配制

将样品稀释/洗板浓缩液用双蒸水1：25倍稀释，得到稀释工作液；

使用稀释工作液，将酶联物以1：1000稀释，得到酶联物工作液。

2、样本处理

1）将新鲜猪肉、猪肝脏、猪肾脏剪碎匀浆，鸡蛋、牛奶、奶粉（可加水）等液态奶制 品不必要匀浆；

2）1g匀浆好的样品或1ml液态奶制品中加入4ml 70%甲醇剧烈混匀10min（上下震摇 或涡旋混均）；

3）4℃下，3000rpm离心10min，取上清；

4）利用稀释工作液1：2稀释上清；

5）以50ul/孔，加入微孔板中用于检测。

3、检测步骤

1）实验前将所有试剂盒组件在室温中平衡30分钟；

2）配制稀释/洗板工作液（见表1）；

表1稀释/洗板工作液配制排列表

3）配制三聚氰胺-HRP交联物工作液；

4）拆开板子，在微孔板支架中插入足够数量的用于标准品和样品检测试验的微孔板条， 记录标准品和样品的位置；

5）加入50μl／孔的标准品液或者准备好的待检测样品并同时设置重复孔。添加每一 种新的标准品或样品时应使用新枪头；

6）在每一孔中加入50μl稀释好的酶-Melamine交联物工作液，见表2；

表2各孔加入量表

  标准品 样本抽提液 内部质控液 酶-CIP工作液 标准品孔 50ul / / 50ul 样品孔 / 50ul / 50ul 内部质控孔 / / 50ul 50ul

7）震荡板子，使其混合均匀，并将其置于37℃恒温箱孵育30min；

8）将孔中的液体倒出并在吸水纸上拍干，用稀释/洗板工作液洗板，每孔加入 200-250μl，洗涤拍干，重复3-5次；

9）在每孔中加入100μl的底物／显色剂（A：B=1：1）轻微震荡混匀，于37°Ｃ恒温箱 避光孵育5分钟；

10）在每孔中加入100μl终止液，轻微震荡混匀并在450nm处测吸光值，在加入终止 液后30min以内检测。

四、试验结果

在检测样本的同时，应该使用标准品做平行实验。以log（100×标准品浓度）为纵坐 标，OD₄₅₀值为横坐标绘制线性标准曲线。根据样本测定的OD₄₅₀值和稀释因子，计算样本三 聚氰胺的测定含量ng/ml（即ppb,以1ml液体为1g计算）。

根据下列公式计算样本中的三聚氰胺的含量：

三聚氰胺的含量=分析浓度×稀释因子ppb

各种样本的稀释因子见表3。

表3各样本的稀释因子

样本 稀释因子 猪肉 20 肝 20 肾 20 蛋 20 牛奶 20

1.1标准品测定的平均值

三聚氰胺标准品液标准品1-6测定的平均值如表4所示。

表4标准品1-6的平均值

标准品 标准品终浓度 OD450平均值（n=10） 标准品6 10ppb 0.099 标准品5 5ppb 0.157 标准品4 1ppb 0.427

标准品3 0.5ppb 0.583 标准品2 0.1ppb 0.837 标准品1 0ppb 1.219

1.2根据标准品测定的平均值，绘制标准曲线并做线性回归，所述标准曲线如图1所 示。

1.3根据回归公式计算三聚氰胺的分析浓度。

三聚氰胺的分析浓度（ng/ml）=1/100×10^（-2.572×测定OD值+3.17）

不同抑制率下对应的三聚氰胺的分析浓度见表5。

表5不同抑制率下对应的三聚氰胺分析浓度表

竞争抑制率（%） OD₄₅₀分析浓度ng/ml 10 1.097 0.02 20 0.975 0.05 30 0.853 0.09 40 0.731 0.19 50 0.610 0.40 60 0.488 0.82 70 0.366 1.70 80 0.244 3.49 90 0.122 7.19

根据表5可知：IC 50为0.4ng/ml。

按照抑制率在20%以上抑制为确定抑制区间计算，测定下限为0.05ng/ml,线性范围 0.05～10ng/ml。

1.4样本中三聚氰胺的浓度

样本中三聚氰胺的浓度见表6。

表6样本中三聚氰胺的浓度

样本 浓度ppb 猪肉 分析浓度×20 肝 分析浓度×20 肾 分析浓度×20 蛋 分析浓度×20 牛奶 分析浓度×20

根据上述实施例可以看出，根据本发明实施例的三聚氰胺衍生物制备方法简单，根据 所述三聚氰胺衍生物制备所得三聚氰胺单克隆抗体可识别三聚氰胺分子，特异性强，灵敏 度高，稳定性好；同时还可应用于制备检测三聚氰胺的试剂盒，检测方法简单可行，并且 检测效果好，为开发其它小分子化合物检测试剂盒开辟了一条新思路。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离 本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发 明的范围由权利要求及其等同物限定。