一种生防菌及其在防治棉花枯黄萎病中的应用

摘要

本发明公开了一种娄彻氏链霉菌（Streptomyces rochei）42561，2012年9月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.6556。通过管碟法、抑制菌丝生长速率法、抑制孢子萌发法、温室盆栽和田间试验综合测定了生防菌42561抑菌防病作用，试验结果表明，该菌株对棉花枯萎病和棉花黄萎病防效显著，可以作为有效的生物农药制剂，具有很好的应用开发前景。

说明书

技术领域

本发明涉及生物防治领域，具体涉及娄彻氏链霉菌（Streptomyces rochei）及其生防用途。

背景技术

棉花枯萎病和棉花黄萎病是危害棉花生产的最主要病害，近年来棉花枯萎病和棉花黄萎病在我国棉区发生日趋严重。然而，目前还没有防治棉花枯萎病和棉花黄萎病的有效药剂。从微生物资源中寻找生物农药是有效途径之一，放线菌所产生的农用抗生素是其中的最重要来源。井冈霉素、阿维菌素和秦岭霉素等生物农药的研制并推广充分证明了从放线菌的代谢产物中筛选经济高效农用抗生素的合理性和优越性。目前登记注册的防治棉花枯黄萎菌的生防菌还未见报道，但已有防治其他作物枯黄萎病的生防制剂商品。例如，1993年Harman等登记注册的商品名为F-stop的哈茨木霉，用于蔬菜镰刀根腐病的防治；德国的生防制剂PROPHYTA，为黄蓝状菌（Talaromyces flavus），主要用于蔬菜黄萎病的防治。

因此，通过从放线菌中筛选防治棉花枯萎病和棉花黄萎病的高效生防菌是本发明的目的。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种有效的生防菌，具体而言是娄彻氏链霉菌（Streptomyces rochei），2012年9月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.6556。

本发明提供的技术方案是：一种娄彻氏链霉菌（Streptomyces rochei），于2012年9月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏号为CGMCC No.6556，经检测存活。

本发明还提供所述的娄彻氏链霉菌作为生防菌的用途，特别是用于防治棉花枯萎病和棉花黄萎病。

本发明具有以下有益效果：结果表明娄彻氏链霉菌（生防菌42561）发酵液对棉花枯萎病菌（尖孢镰刀菌）和棉花黄萎病菌（大丽轮枝菌）抑菌圈直径分别为23.96mm和32.67mm，对其菌丝生长抑制率分别为89.41%和83.75%，孢子萌发抑制率分别为73.56%和68.75%；盆栽试验结果表明，生防菌42561发酵液对棉花枯萎病和棉花黄萎病均表现出很好的防治作用，防治效果分别为36.73%和44.82%；田间试验表明生防菌42561发酵液对棉花枯黄萎病的田间防治有一定的效果，在第三次施药后的第15 和30天，其防治效果分别达到33.06%和41.65%。因此，生防菌42561对棉花枯萎病和棉花黄萎病防效显著，可以作为有效的生物农药制剂，具有很好的应用开发前景。

附图说明

图1生防菌42561的分类学地位。

图2生防菌42561平板对峙法抑菌效果。其中，左：大丽轮枝菌为靶标菌；右：尖孢镰刀菌为靶标菌。A：42561；B：培养基块。

图3生防菌42561发酵液管碟法抑菌效果，左：大丽轮枝菌为靶标菌；右：尖孢镰刀菌为靶标菌。A：42561发酵液；B：液体培养基。

图4生防菌42561发酵液对大丽轮枝菌菌丝生长的抑制效果。A：生防菌42561发酵液处理组；B：液体培养基对照组。

图5生防菌42561发酵液对尖孢镰刀菌菌丝生长的抑制效果。A：生防菌42561发酵液处理组；B：液体培养基对照组。

图6 生防菌42561发酵液对2种植物病原真菌孢子萌发的抑制作用。A：大丽轮枝菌——42561发酵液处理组；B：大丽轮枝菌——液体培养基对照组）；C：尖孢镰刀菌——42561发酵液处理组；D：尖孢镰刀菌——液体培养基对照组。

图7 生防菌42561发酵液对棉花枯萎病的盆栽试验结果。A：42561发酵液处理组；  B：多菌灵处理组  C：清水对照组。

图8生防菌42561发酵液对棉花黄萎病的盆栽试验结果。A：42561发酵液处理组；  B：多菌灵处理组  C：清水对照组。

图9田间防效试验棉花茎杆剖面图。A：发病田42561发酵液处理组；  B：发病田空白对照组；  C：发病田多菌灵处理组；  D：健康棉株。

具体实施方式

下面通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。

实施例一  生防菌的分离

采用新疆七角井盐湖（海拔1584.49m，北纬43.48°、东经91.48°）0～30cm的土壤样品，用含5%、10%、15%、20%和25%氯化钠的8种常规培养基（GW1培养基、GPY培养基、壳聚糖天冬酰胺培养基、甘油精氨酸培养基、甘油无机盐培养基，甘露醇无机盐培养基、ISP-4培养基和PY培养基），采用稀释平板法（称取1 g土壤样品放入9 mL的无菌水溶液中，充分振荡，做成10^-1悬浊液。吸取0.1 mL悬浊液，均匀涂布于预先配制好的分离培养基平板上，37℃倒置培养。培养皿采用保鲜膜封口，减少培养基水分散失，延长培养时间。），共分离出7个属共35株放线菌，多分布于链霉菌属和拟诺卡氏菌属，放线菌42561分离自含5%氯化钠的甘油精氨酸培养基，其培养基配方为：甘油5 g/L，精氨酸1 g/L，磷酸氢二钾1 g/L，硫酸镁0.5 g/L，碳酸钙0.5 g/L，氯化钠50 g/L,琼脂粉17 g/L，pH 7.5。通过平板对峙法初筛和管碟法复筛，最终分离和筛选出了抑菌效果最好的生防菌42561。

实施例二  生防菌的鉴定

为进一步确定生防菌42561的分类学地位，本发明采用传统分类方法和分子分类方法对该菌株进行了分类鉴定。

1 形态观察用培养基

无机盐淀粉琼脂（ISP-4）培养基：淀粉10.00 g 、(NH₄)₂SO₄ 4.00 g 、MgSO₄ 2.00 g 、K₂HPO₄ 2.00 g 、CaCO₃ 1.00 g、 Nacl 40.00 g、琼脂 18.00 g 、蒸馏水定溶至1000ml，pH 7.2-7.4，121℃高压湿热灭菌30min。

2 引物

采用放线菌通用引物由赛音生物技术（上海）有限公司合成。其序列分别为：27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTC-3’）和1492R（5’-CGGCTACCTTGTTACGACTT-3’）

3 试验方法

3.1 形态学观察

普通显微镜观察：采用插片法，37 ℃培养生防菌42561。用光学显微镜观察记录菌丝形态、气生菌丝和基内菌丝生长情况，菌丝体是否产生孢子丝及孢子丝的排列方式、形状；孢子形状和大小；孢子的有无、形状、大小及形成方式等。

3.2 生防菌42561的分子生物学鉴定

(A) 生防菌42561基因组DNA的提取

收集培养平板上的42561菌体放入1.5 mL的无菌离心管中，加入480μL的

1×TE缓冲液。加入20μL溶菌酶（50 mg/mL），放入37℃摇床中，200rpm振荡过夜。每管加入50 μL 20%的SDS，加入5μL 20 mg/mL的蛋白酶K，放入60℃摇床中，200 r/min振荡1 h。加入550μL的酚-氯仿-异戊醇（25：24：1），12000rpm离心10 min，取上清移入另一离心管中，反复抽提2-3次。取上清，加入等体积的无水乙醇，加入0.1倍体积的乙酸钠（3mol/L），放入4℃冰箱中沉淀DNA约0.5h。12000rpm离心10min，弃上清。用200μL的70%乙醇清洗离心产物2次，12000rpm离心5 min，弃上清，将乙醇挥发完全。用50μL无菌超纯水充分溶解底部的DNA，1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量，将提取的DNA放入-20℃冰箱中保存备用。

(B)生防菌42561 16S rDNA基因的扩增

用放线菌16S rDNA基因通用引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTC-3’）和1492R（5’-CGGCTACCTTGTTACGACTT-3’）扩增放线菌基因组DNA中的16S rDNA基因片段。

25μL的PCR反应体系为：ddH₂O  20.4μL，10×Buffer（缓冲液含Mg²⁺）2.5μL，dNTPs 0.5μL，引物27F（10μmol/L）0.5μL，引物1492R（10μmol/L）0.5μL，Taq DNA聚合酶0.1μL，模板DNA 0.5μL。

PCR反应条件为：预变性94℃ 4 min；变性94℃ 1min，退火56℃ 1 min，延伸72℃ 2 min，30次循环；总延伸72℃8min。反应完成后用1%琼脂糖凝胶电泳检测。符合条件的PCR产物进行序列测定。

(C) 测序结果的比对分析

测序结果用 DNAMAN5.2软件拼接，序列通过BLAST与GenBank数据库中的已有效发表的菌株序列进行比对，下载相似度较高的已有效发表菌株的16S rDNA基因序列，用MEGA 4.1软件对序列进建系统发育树的行构，确定放线菌的分类学地位。

4 试验结果

4.1生防菌42561的形态学观察结果

生防菌42561在ISP-4培养基上生长良好，菌落圆形扁平，表面干燥，菌落边缘整齐，气生菌丝丰富，孢子堆灰色，基内菌丝灰褐色，无可溶性色素产生。

生防菌42561革兰氏染色为阳性，最适生长温度37℃，最适生长pH为7.2，最适NaCl(W/V)为4%，在ISP-4培养基上37℃插片培养7d，通过光学显微镜观察发现：生防菌42561的基内菌丝分枝多、无横隔；气生菌丝丰富，气生菌丝体形成长短不一的孢子链，孢子成串生长，孢子丝较直。根据生防菌42561菌落、菌体形态和生理特征测定，确定生防菌42561属于链霉菌属( Streptomyces )。

4.2 生防菌42561的分子生物学鉴定结果

4.2.1生防菌42561的 16S rDNA 序列测定结果

测序结果用 DNAMAN5.2软件拼接，确定该片段由1348个碱基组成，得到生防菌42561的16S rDNA 序列如SEQ ID NO.1所示。

4.2.2 同源进化树构建

通过BLAST比对，在GenBank数据库中下载与待测放线菌16S rDNA基因序列相似度较近的序列，用MEGA5.1软件对放线菌16S rDNA基因序列进行多重序列比对，构建系统发育树。生防菌42561进化树见图1，生防菌42561与娄彻氏链霉菌( Streptomyces rochei ) 的16S rDNA 基因序列( 相似性大于99.9%) 聚在同一个系统进化分支上,  故将该生防菌鉴定为娄彻氏链霉菌( Streptomyces rochei )42561 。

实施例三生防菌42561抑菌活性

1 供试病原菌

棉花黄萎病原菌：大丽轮枝菌（Verticillium dahliae），棉花枯萎病原菌：尖孢镰刀菌棉花专化型（Fusarium oxysporum sp. vasinfectum）由新疆生产建设兵团塔里木盆地生物资源保护利用重点实验室提供。

2 供试植物和药剂

供试植物：棉花（新陆中36）

处理药剂：生防菌42561发酵液

对照药剂：多菌灵可湿性粉剂（山东东信生物农药有限公司）

3 培养基

马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：取200g去皮马铃薯，切成小块后沸水煮 30min，四层纱布过滤，滤液加葡萄糖20g，琼脂18g，蒸馏水定容至1000mL，pH自然。锥形瓶分装后，121℃高压湿热灭菌 30min。

活化培养基：无机盐淀粉琼脂（ISP-4）培养基：淀粉10.00 g 、(NH₄)₂SO₄ 4.00 g 、MgSO₄ 2.00 g 、K₂HPO₄ 2.00 g 、CaCO₃ 1.00 g、 Nacl 40.00 g、琼脂 18.00 g 、蒸馏水定溶至1000ml，pH 7.2-7.4，121℃高压湿热灭菌30min。

种子培养基：无机盐淀粉琼脂（ISP-4）培养基

发酵培养基：玉米粉15g、蛋白胨5g 、葡萄糖5g 、CaCO₃ 1g 、NaCl 40g、自来水定溶至1000 ml， pH 7.2-7.4，121℃高压湿热灭菌30min。

4 实验方法

4.1菌株发酵培养

将生防菌42561接于活化培养基上，于37℃恒温培养7d，按一定的接种量，接入装有100mL种子培养基的250mL三角瓶中，37℃、180rmp条件下，摇瓶培养4d，再按照6%的接种量接种于装有80mL发酵培养基的250 mL三角瓶中，37℃、180rmp条件下，摇瓶培养4 d。

4.2 发酵液预处理

    将发酵液以8000rmp的速度离心10min去除发酵液中的菌丝体等固体，取上清液作为盆栽和大田试验的处理药剂；微孔滤膜（0.45μm）过滤除去上清液中悬浮的细小杂质后作为管碟法、抑制菌丝生长法和抑制孢子萌发法的处理药剂。

4.3 抑菌活性测定方法

(1) 离体活性测定

离体活性测定采用平板对峙法、管碟法、抑制菌丝生长速率法、抑制孢子萌发法进行，具体方法如下：

(A) 平板对峙法：先将生防菌42561和供试病原菌分别进行平板活化，分别用灼烧灭菌后的接种针刮取已培养5天的真菌菌丝到相应的装有5mL无菌水的小瓶中，制成10⁶～10⁷个孢子/mL的真菌菌悬液，吸取60μL的菌悬液到 PDA 平板上，用已灭菌的涂布棒将菌悬液涂布均匀后，在超净工作台上稍微吹干，制成真菌指示平板。用无菌打孔器从已培养5天的放线菌平板上打下菌饼(Φ=7mm)放到已制备好的靶标菌平板上，以ISP-4培养基块作对照，然后置于28℃恒温培养箱中培养4～5d后，利用十字交叉法测量抑菌圈直径（抑菌圈直径=抑菌圈直径测量值-7mm），每处理重复 3次。

(B)管碟法：

将培养好的病原真菌孢子用无菌水从培养平板上洗脱，制成10⁶～10⁷个孢子/mL的孢子悬浮液，吸取60μL的孢子悬浮液到PDA平板上，用已灭菌的涂布棒将菌悬液涂布均匀，在超净工作台上稍微吹干。在带菌平板上等距离放置牛津杯，每个牛津杯中加入200μL发酵产物，以发酵培养基为对照，28℃培养4～5d，十字交叉法测量抑菌圈直径，每处理重复 3次。

(C)抑制菌丝生长速率法：

将预处理后的发酵液与融化后冷却至45℃左右的PDA培养基以1:9的比例混匀后倒入无菌培养皿内，制成平板，再将病原菌菌饼(Φ=7mm)置于平板中央，重复3次，于28℃恒温培养。待对照皿中病原真菌的菌丝即将铺满全皿时，用十字交叉法测量供试真菌菌落生长直径，按以下公式计算菌丝生长抑制率：

(D) 抑制孢子萌发法：

采用凹玻片法测定菌株发酵产物对供试植物病原真菌孢子萌发的抑制作用。将培养好的病原真菌孢子用无菌水从培养平板上洗脱，用多层纱布过滤以除去菌丝，制成孢子悬浮液。孢子浓度以在10×10低倍镜下，每个视野有20～30个孢子为宜。将发酵液与孢子悬浮液以1:1的比例混合，取一滴滴加在凹玻片上，每处理3次重复。在25℃下保湿培养，当对照组的萌发率达到90％后，检查处理的孢子萌发率,每处理各重复随机观察3个以上视野，调查孢子的总数不少于200个，孢子芽管长度大于孢子的短半径视为萌发。根据下列公计算孢子萌发抑制率。

(2) 温室盆栽活性测定

棉花枯黄萎病的防治试验：采用灌根法进行，盆栽棉花，棉花出苗后每盆留苗3棵，待棉花长出3～4片真叶时开始接种病原菌。接种时，每盆灌入浓度为1×10⁷个孢子/mL的悬浮液30mL。25℃，相对湿度90%以上条件下培养。待病情稳定后，将发酵液每盆用30mL对已发病的棉苗进行灌根处理。以多菌灵10mg﹒mL^-1(每盆30mL)作为对照药剂，以施用清水作空白对照，每处理10盆，实验重复3次。每隔7d给药一次，共给药3次，在最后一次给药后的第15d和30d分别调查棉苗生长和发病情况。按以下标准计算病情指数和防治效果。

枯萎病分级方法：

0级:健株；

1级:病株叶片有10%以下表现典型症状；

3级:病株叶片有11%-25%表现典型症状；

5级:病株叶片有26%-50%显病状，株型矮化；

7级:病株叶片有51%-90%显病状，株型明显矮化；

9级：病株叶片几乎全部显病状，甚至枯焦脱落，枝茎枯死，有时整株出现急性凋萎死亡。

黄萎病分级方法：

     0级:健株；

     1级:病株叶片有10%以下显病状，叶片表现淡黄色不规则病斑；

     3级:病株叶片有11%25%显病状，叶片主脉间产生淡黄色不规则病斑；

     5级:病株叶片有26%-50%显病状，病斑的颜色大部分变成黄色和黄褐色，叶片边缘有卷枯；

     7级:病株叶片有51%以上显病状，病斑大多数显黄褐色，叶片边缘卷枯，有少数叶片凋落；

     9级:病株叶片脱落成光杆及植株死亡，有时出现急性萎蔫死亡症状。

药效计算方法

（3）田间药效试验

田间药效试验是在新疆生产建设兵团农一师12团28连进行, 选择常年发生黄萎病和枯萎病较重的地块。试验分3个处理, 具体处理为：(1) 生防菌42561发酵液组,(2) 多菌灵组, (3)清水对照组。重复3次, 小区面积为30m², 随机区组排列， 调查时间为蕾铃期和吐絮期。播种时间为2012年4月28日, 棉花品种为新陆中36, 土壤为沙壤土, 肥力中等, 灌溉条件较好。当棉花长至5～6片真叶时，分别对棉苗进行病原真菌灌根处理一次。待病情开始显现时每隔7d施药一次，共施药三次，最后一次施药后的第15d和30d分别调查棉株生长和发病情况。施药方法和调查与计算方法同温室盆栽试验。

5 结果与分析

5.1 生防菌42561的室内离体抑菌活性测定结果

5.1.1 生防菌42561的拮抗活性测定结果

采用平板对峙法，检测生防菌42561的对大丽轮枝菌和尖孢镰刀菌拮抗活性，如图2所示，其中生防菌42561对大丽轮枝菌和尖孢镰刀菌的抑菌圈直径分别达到34.75和24.20mm。

5.1.2 生防菌42561发酵液拮抗活性测定结果

管碟法测定生防菌42561发酵液对大丽轮枝菌和尖孢镰刀菌的抑制作用，如图3所示。发酵液对大丽轮枝菌和尖孢镰刀菌有强烈的抑制作用，抑菌圈直径分别为32.67和23. 96mm。

5.1.3 生防菌42561发酵液对供试病原真菌菌丝生长的抑制作用

由图4、图5可知，42561菌株发酵液对大丽轮枝菌和尖孢镰刀菌菌丝生长均有较好的抑制作用，其抑制率均大于80%。其中对大丽轮枝菌和尖孢镰刀菌的抑制率分别为83. 41%和89.75%。

5.1.4 生防菌42561发酵液对2种植物病原真菌孢子萌发的抑制作用

由图6可见，生防菌42561发酵液对供试植物病原真菌孢子萌发均有较好的抑制作用，对大丽轮枝菌和尖孢镰刀菌孢子萌发抑制率分别为68.75%和73. 56%。

5.2.2 盆栽法测定生防菌42561发酵液抑菌活性的结果

5.2.2.1 生防菌42561发酵液对棉花枯黄萎病的防治效果

由图7、图8和表1可以看出：生防菌42561发酵液对棉花枯萎病和棉花黄萎病有一定的防治效果。防治效果分别为36.73%和44.82%，远高于对照药剂多菌灵的10.00%和9.51%。

 

表1生防菌42561发酵液对棉花枯黄萎病的盆栽防治效果

 5.2.2.3田间药效试验结果

在室内离体和盆栽基础上, 将生防菌42561进行田间防治棉花枯黄萎病的试验。从表1可以看出，一方面生防菌42561发酵液对棉花枯黄萎病的田间防治有一定的效果，在第三次施药后的第15和30d，其防治效果分别达到33.06%和41.65% ；另一个方面是作用缓慢，虽然42561发酵液不能从根本上阻断病原真菌的传播，但是它有效的延缓了病情的进一步恶化。

表2生防菌42561发酵液对棉花枯黄萎病的田间防治效果