一种荧光假单胞菌及其在促进中国枫香生长中的应用

摘要

本发明公开了一种荧光假单胞菌FXW-HS7A，其分类命名为荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens），已保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC M 2012260。本发明还公开了上述荧光假单胞菌在中国枫香促生长中的应用。本发明菌株在液体摇瓶培养的情况下，对难溶性磷酸盐磷酸三钙、磷酸铁、磷酸铝和羟基磷灰石具有较强溶解效果；该菌株制成菌剂接种于中国枫香实生苗，结果表明，该菌剂能明显促进中国枫香的生长发育。因此，本发明能为将来开发中国枫香专用微生物肥料提供优良的菌株资源。

说明书

技术领域

本发明属于生物肥料领域中的微生物肥料技术领域，具体涉及一种中国枫香根际高效解磷荧光假单胞菌及其应用。 

背景技术

中国枫香(Liquidambar formosana)为金缕梅科枫香亚科枫香属的高大落叶乔木,别名为枫木、黑饭木、香枫等。是我国重要的乡土树种，也是亚热带地区优良速生落叶阔叶树种,其适应性广、生长迅速,为典型的荒山先锋树种。维护地力效果明显，生态效益好，是人工林树种结构调整的首选树种之一，也是很有潜力的造林绿化树种。在观赏、药用、用材等方面都具有重要作用。近年来，枫香在生产、科研上备受重视。 

中国枫香生长快，耗水耗费量大，种植枫香的林地往往容易导致土壤养分缺乏。就影响枫香生长的养分因素来看，土壤中有效磷含量高低是制约枫香生长的重要因素之一。随着对木材需求量的巨增，森林资源的逐步匮乏，速生枫香的种植量明显上升。最初仅作为观赏树种和科研林木，后来逐渐被引种为绿化树种，现在作为缓解木材和林产品需求紧张的主要树种，枫香被广泛种植。枫香具有重要的经济和生态价值。 

磷是植物生长所需的重要营养物质，植物能够直接吸收的磷很少，故磷常常成为植物营养的限制因素。溶磷微生物广泛分布于土壤，是一类能够减少磷肥固定、提高磷肥利用率和溶解土壤难溶磷的微生物群，在转化土壤难溶磷，保持土壤磷平衡，提高磷肥利用率，促进作物生长等方面发挥着重要的作用，已经被世界公认为廉价高效环保型的土壤磷活化的生物措施(毕江涛,2009)。 

磷的释放主要与土壤pH值、土壤氧化还原反应、微生物分泌物以及有机物质的分解等因素有关，是多种因子综合作用的结果（杜振宇,2010；杨苞梅,2010）。解磷细菌作为土壤磷循环中一类重要的微生物，能够改善中国枫香的磷素供应，加快中国枫香的生长。 

目前，有关中国枫香根际高效解磷细菌菌株的筛选及应用研究未见报道。因此提高土壤有效磷含量就有十分重大的意义，并成为众多学者热点关注的核心问题。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种中国枫香根际高效解磷荧光假单胞菌。 

本发明还要解决的一个技术问题是提供上述中国枫香根际高效解磷荧光假单胞菌的应用。 

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下： 

2011年4月23日，从安徽省黄山市稽灵山公园中国枫香根际土壤中，筛选获得了一株高效解磷荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens FXW-HS7A。保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，邮编430072，菌种保藏号：CCTCC M 2012260，保藏日为2012年7月1日。 

CCTCC M 2012260菌株的主要生物学特征：在牛肉膏蛋白胨培养基平板上，菌落较小，浅黄，圆形；菌体直杆状，革兰氏染色阴性，大小约0.43×0.64μm~1.89×2.00μm，无芽孢，有鞭毛；好氧，氧化酶反应阳性，接触酶试验阳性，淀粉水解阴性，M.R.和吲哚试验阴性，V.P.试验阳性；明胶液化阳性，硝酸还原试验阴性，产氨和硫化氢试验阴性，柠檬酸盐生长试验阳性。 

CCTCC M 2012260菌株16SrDNA基因序列，见SEQ ID No.1所示。将所测16SrDNA序列与GenBank数据库中的序列进行BLAST比对，结果表明：菌株CCTCC M2012260与假单胞菌属（Pseudomonas）同源性都很高，与P.fluorescens的相似度为99%。结合形态、生理生化特征及16SrDNA序列分析，鉴定为荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）。 

CCTCC M 2012260菌株可将土壤中难溶性无机磷转变为有效态磷供中国枫香吸收，促进中国枫香生长。 

有益效果：本发明的中国枫香根际高效解磷荧光假单胞菌在液体摇培的情况下，对难溶性磷酸盐磷酸三钙（Ca₃(PO₄)₂）、磷酸铁（FePO₄·4H₂O）、磷酸铝（AlPO₄）和羟基磷灰石（Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂）具有较强的溶解效果，与对照（CK）相比，差异极显著；本发明的中国枫香根际高效解磷荧光假单胞菌制成菌剂接种中国枫香实生苗。结果表明，该菌剂能明显促进中国枫香的生长发育，因此，本发明为将来开发中国枫香专用微生物肥料提供了优良的菌株资源。 

附图说明

荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens FXW-HS7A，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，邮编430072，菌种保藏号：CCTCC M 2012260，保藏日为2012年7月1日。 

图1为FXW-HS7A菌株对难溶性磷酸盐磷酸三钙、磷酸铁、磷酸铝和羟基磷灰石的溶解能力。 

图2为FXW-HS7A对枫香的促生效果。 

具体实施方式

根据下述实施例，可以使本领域的技术人员更好地理解本发明。实施例所描述的仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。 

实施例1：FXW-HS7A菌株实验室解磷试验。 

解磷培养基A：葡萄糖10g，Ca₃(PO₄)₂5g，MgCl₂5g，KCl 0.2g，MgSO₄·7H₂O 0.25g，(NH₄)₂SO₄0.1g，蒸馏水1000mL，pH 7.0。 

解磷培养基B：用羟基磷灰石（Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂）代替解磷培养基A中的Ca₃(PO₄)₂，其它成分和含量相同。 

解磷培养基C：用磷酸铁（FePO₄·4H₂O）代替解磷培养基A中的Ca₃(PO₄)₂，其它成分和含量相同。 

解磷培养基D：用磷酸铝（AlPO₄）代替解磷培养基A中的Ca₃(PO₄)₂，其它成分和含量相同。 

将活化的FXW-HS7A菌株接种NA培养基（牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL，pH 7.2~7.4）中，28℃振荡培养18~24h作为种子液，将种子液按1%（v/v）接种量分别接种到装有50mL解磷培养基A、B、C、D的100mL三角瓶中，以接相同体积空白种子液的解磷培养基为对照（CK），每个处理三个重复，28℃，180r/min培养3d后，发酵液4℃，10000r/min离心10min，钼锑抗比色法测定发酵液中可溶性磷含量，结果见图1。 

从图1中可以得出，分别以难溶性磷酸盐磷酸三钙（Ca₃(PO₄)₂）、磷酸铁（FePO₄·4H₂O）、磷酸铝（AlPO₄）和羟基磷灰石（Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂）为唯一磷源，培养3d后，FXW-HS7A发酵液中可溶性磷含量均高于对照。以上表明，菌株JW-JS1对四种难溶性磷源均具有较强的溶解能力。 

实施例2：FXW-HS7A温室盆栽试验。 

将菌株FXW-HS7A活化后，用接种环挑取少量菌体接种于装有50mLNA培养基（牛 肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL，pH 7.2~7.4）的100mL三角瓶中，29℃，200r/min振荡培养48h。发酵液（4℃，6000r/min）离心5min，无菌生理盐水润洗菌体3次后，无菌生理盐水调节菌悬液（10⁸cfu/ml）制成接种剂。接种中国枫香（苗龄1年），以等量无菌生理盐水为对照，接种量为实生苗5mL/株。每处理10个重复，置于温室统一管理，光照为12h/天，适时浇水。 

中国枫香接种后150天生长情况见表1，可以看出，接种FXW-HS7A能够显著促进中国枫香实生苗的生长。与对照（CK）相比，接种FXW-HS7A的处理在苗高和茎粗上的增长率分别达到了15.09％和8.97％，促生效果显著。图2为中国枫香接种FXW-HS7A后150天时的照片，可以看出接种后的中国枫香明显高于对照。 

表1 FXW-HS7A对中国枫香实生苗生长的影响 

注：P<0.05，同列不同行小写字母不相同代表差异显著。