一类愈创木烷型倍半萜类辣椒素受体拮抗剂的镇痛用途

摘要

本发明涉及式(I)的辣椒素受体拮抗剂或其药学上可接受的盐。此类化合物可以激动辣椒素受体，有效地产生外周镇痛作用。

说明书

技术领域

本发明涉及一类愈创木烷型倍半萜类辣椒素受体拮抗剂的镇痛用途。 

背景技术

辣椒素(VR1)受体是一种由838个氨基酸组成的非选择性阳离子通道，共有6个锚蛋白重复序列(ARD)，第5“指环”为一孔道形成部位，N端、C端均位于细胞质内。VR1受体具有脂质结合部位和质子化、磷酸化位点，可被G蛋白耦联受体和酪氨酸激酶受体间接激活。是研究最为广泛、最受关注的非选择性阳离子通道受体之一。VR1广泛分布于哺乳动物的感觉神经纤维，尤其是无髓鞘的C类和部分少髓鞘的Aδ类纤维。所以，有以上神经纤维支配的组织几乎都有VR1分布。 

疼痛是一种复杂的生理心理活动，是临床上最常见的症状之一。疼痛感觉在生理状态下起保护作用，预警有伤害来临，提示肌体规避伤害；但在病理状态下，疼痛是多数疾病的主要症状之一，而慢性疼痛本身就是一种疾病。 

引起疼痛感觉的伤害性感受(nociception)首先是通过皮肤或内脏黏膜内的伤害性感受器(nociceptor)感知，以电信号的方式通过传递痛觉的传入神经纤维(主要是无髓鞘的C类纤维和部分少髓鞘Aδ类纤维)传递给初级感觉神经元(脊髓背根神经节和三叉神经节)，由此类神经元整合后进一步传递给脊髓的二级神经元，再沿脊髓逐步上传，最终进入大脑皮层(皮层感觉中枢)才形成有意识的痛觉。无论是位于皮肤内的伤害性感受器、以及传递伤害性感觉的传入神经纤维，还是向脊髓传递的输入性纤维都是由初级感觉神经元生成，所以初级感觉神经元在痛觉产生及传导过程中都起到了极为关键的作用。而在以上传递途径中都有VR1表达，VR1作为一类与痛觉传递有密切联系的膜上离子通道型受体，在介导炎性痛、内脏痛和癌痛甚至痛觉敏化等多种疼痛中起重要作用。 

目前研究认为VR1是感知疼痛的关键分子之一。大多数研究表明辣椒素受体拮抗剂无论是在临床前还是临床研究阶段都表现出显著的镇痛作用，VR1一直是被赋予了高期望值的、研发镇痛药的靶点之一。MK-2295(NGD-8243)和GRC6211分别是由美国Merck-Neurogen公司和印度Glenmark公司研发的用于治疗牙痛的小分子药物，已经进入III期临床试验研究阶段。由于是局部用药，对体温的影响较小，还是有很好的市场前景。AMG8562是由美国Amgen公司研发的第二代VR1小分子拮抗剂，研究报告称未发现对体温有影响，ABT-102临床前研究可显著抑制实验动物的炎性痛骨关节炎疼痛、手术后疼痛和骨癌疼痛，I期临床试验发现其安全性好。 

发明内容

为了开发辣椒素受体拮抗剂从而为疼痛的治疗寻找新的候选药物，本发明在采用辣椒素受体拮抗剂高通量筛选模型，通过功能性验证寻找先导化合物，发现了一类愈创木烷型倍半萜类辣椒素受体拮抗剂，为新型的镇痛药开发提供先导化合物。本发明可为此类临床外周伤害性疼痛治疗药物的开发提供先导化合物，为新型镇痛药物开发提供线索和实验依据。 

本发明的技术方案为：在中国仓鼠卵巢癌细胞(CHO)内稳定转染辣椒素受体，建立辣椒素受体拮抗剂靶向激动剂高通量筛选模型，初筛，复筛，构效关系分析，得到一类具有镇痛作用的候选药物。具体步骤如下： 

步骤一：建立及培养稳定转染辣椒素受体的CHO细胞株。 

步骤二：激动剂模型建立及阳性药验证，确定激动剂的EC₈₀。 

步骤三：拮抗剂模型建立及阳性性药验证。 

步骤四：采用稳转细胞株和实验确定的最佳检测条件对化合物进行辣椒素受体拮抗剂的高通量筛选，得到有明显量效关系的化合物。 

附图说明：

图1：激动剂对照量效关系 

图2：拮抗剂对照量效曲线 

图3：先导化合物1量效曲线 

图4：先导化合物2量效曲线 

具体实施方式

以下结合附图说明本发明的具体实施方式： 

1.建立及培养稳定转染辣椒素受体的CHO VR1细胞株。 

2.激动剂模型建立及阳性药验证，确定激动剂的EC₈₀：将细胞于无抗生素的培养基中培养18h后用PBS+0.5mM EDTA将细胞消化下来，离心机离心后，将3x10⁵cells/mL细胞于分析缓冲液中重悬。在无菌条件下，向以上的细胞悬液中加入腔肠素，使之终浓度达到5μM，混合均匀。在室温下避光孵育4小时，并不断搅动。将上述细胞悬液中加入5倍细胞悬液的缓冲液中稀释，并在以上条件下培养1小时，并不断搅动。在稀释缓冲液中准备各种梯度配体激动剂稀释液。 

3.在384孔板中每孔加入20μl的激动剂稀释液。将地高辛，ATP，缓冲液加入空白对照孔中作为本实验的内参照，使地高辛的终浓度达到100μM，ATP的终浓度为50uM。 

4.利用Envision检测仪的加样装备，在每孔中加入20μl的细胞悬液，即时检测20s，15s，10s，5s，3s内钙离子变化情况，仪器得出的最终结果表示为该检测时间内引起钙离子变化峰的峰面积。对实验数据作图，可得出最佳检测时间为20s及激动剂的EC₅₀和EC₈₀。 

5.拮抗剂模型建立及阳性药验证，确定拮抗剂的IC₅₀：细胞处理同上所述，在384孔板中每孔加入10μl的细胞液以及10μl拮抗剂稀释液，室温孵育1小时。配制激动剂最大效应浓度(激动剂的EC₈₀)，利用Envision将激动剂泵入反应完全的384孔板中，每孔20ul，即时检测20s内钙离子变化情况，仪器得出的最终结果表示为20s内引起钙离子变化峰的峰面积。对实验数据作图，可得出拮抗剂的IC₅₀。辣椒素受体模型建立后，使用激动剂阳性药进行检测的质控曲线见图1，使用拮抗剂进行检测的质控曲线见图2.

6.采用摸索的最佳检测条件在稳转细胞中对辣椒素受体拮抗剂进行初筛与复筛。用Janus全自动加样工作站将化合物从96孔化合物母液板转移至96孔化合物子板第一排并对化合物逐级稀释，并吸取10μl稀释好的化合物转移至384孔板中；Multidrop自动加样仪将处理好的细胞液10μl加入384孔板中，孵育1小时；利用Envision将激动剂泵入反应完全的384孔板中，每孔20ul，即时检测20s内钙离子变化情况。处理数据，计算所筛选化合物IC₅₀。对筛选出的有效的化合物进行构效关系分析，先导化合物的活性曲线见图3、图4。 

辣椒素受体活性筛选实验结果 

筛选得到的辣椒素受体拮抗剂为愈创木烷型倍半萜类化合物，其结构通式与IC₅₀如下： 

其中 

R₁为OH或O-β-D-Glc； 

R₂为OH或H； 

R₃为α-H，β-CH₃或＝CH₂。 

优选的结构式： 

先导化合物1(AF-7)：R₁＝O-β-D-Glc，R₂＝OH；R₃＝α-H，β-CH₃； 

化学名：8α-羟基-11αH-11，13-二氢-中美菊素C-3-O-β-D-葡萄糖苷 

(8α-hydroxy-11αH-11，13-dihydro-zaluzanin C-3-O-β-D-glucopyranoside)。 

先导化合物2(AF-4)：R₁＝O-β-D-Glc，R₂＝H，R₃＝CH₂； 

化学名：中美菊素C-3-O-β-D-葡萄糖苷 

(Zaluzanin C-3-O-β-D-glucopyranoside)。 

先导化合物对辣椒素受体拮抗活性：