拮抗菌核病菌的固氮芽孢菌及其用途

摘要

本发明公开了拮抗菌核病菌的固氮芽孢菌及其用途。该固氮芽孢菌是芽孢杆菌(Bacillus sp.)GDSD212，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No.5035。本发明所提供的芽孢杆菌(Bacillus sp.)GDSD212 CGMCC No.5035具有较高的固氮活性，可以有效拮抗菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)，在固氮微生物菌剂和生物有机肥生产中具有广阔的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及拮抗菌核病菌的固氮芽孢菌及其应用。

背景技术

氮肥是农业生产中最重要的生产资料之一。生产化学氮肥消耗大量能源，占生产 总成本的70％～80％。近年来能源日趋紧张，我国化肥生产用煤价格飚升导致化学氮 肥价格上涨，农民难以承受，反响强烈。此外，化学氮肥在提高作物产量、保障我国粮 食安全方面发挥了巨大作用，但是不合理施氮已经形成了严重的面源污染，造成一系 列的严重危害，如太湖蓝藻事件令人触目惊心。城市地下水硝酸盐污染已经对饮用水 安全造成了威胁。

大气中含有78％的氮素，但其存在形式是分子态氮气，动植物不能直接利用，自 然界只有某些原核微生物具有直接利用大气中氮气的能力，将其还原成氨，这就是生 物固氮作用。选用高效固氮微生物菌种工厂化生产制成菌剂，或进一步与其它富含植 物营养的物料复合加工成生物制品，应用于农业生产，可以提供作物氮素营养，改善 作物根际生态环境，提高土壤生物肥力性状，这就是通常所说的固氮微生物菌剂或固 氮微生物肥料。生物氮肥具有多种优势：①生物氮肥由可再生的生化制剂和活体微生 物组成，可以再生，不存在资源枯竭问题，是可持续发展农资产品。②生物氮肥是环 境友好型肥料，其生产和使用过程均不产生三废等污染性物质，而且能改善土壤理化 性质，提高土壤肥力，是生态农业农资产品。③生物氮肥生产耗能少、成本低，其成 本仅为等效化学氮肥的20％～40％，可以为国家节省大量的煤炭和石油等能源战略物 资。④使用生物氮肥可以显著降低农业生产成本，提高农产品品质，提升土壤肥力， 使农民受益，促进社会和谐发展。

核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)的是作物菌核病的病原菌，形态特征表现为：子囊 盘小，呈小杯状，浅肉色至褐色，单个或几个从菌核上生出，直径0.5-1cm，柄褐色细 长，弯曲，长3-5cm，向下渐细，与菌核相连。菌丝体可以形成菌核，长柄的褐色子囊 盘产生在菌核上。菌核形状多样，长3-15μm。子囊圆柱形，120-140μm×11μm，孢子 通常8个，单行排列，椭圆形，8-14μm×4-8μm，侧丝细长，线形，无色，顶部较粗。该 菌是一种危害作物和蔬菜的世界性的重要的植物病原菌，广泛地侵染、危害十字花科、 豆科、茄科、芸香科等植物，如造成油菜、大豆、向日葵、黄瓜、辣椒等经济作物和 蔬菜菌核病。目前对菌核病的防治主要依靠化学农药，然而化学防治不仅成本高、污 染环境，而且防效也不理想，同时食品的安全性也受到严重影响。

菌种是微生物肥料生产应用的基础。目前，限制我国微生物肥料行业发展的瓶颈 就是高效菌种的选育问题。农业生产迫切需求固氮效能高、拮抗病原真菌、抗逆性强、 货架期长的微生物肥料生产用菌种。

发明内容

本发明的目的是提供一株可以在农作物根际进行高效固氮，并且拮抗核盘菌 (Sclerotinia sclerotiorum)的细菌。

本发明所提供的细菌是芽孢杆菌(Bacillus sp.)GDSD212，该菌株已于2011年7月 6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为： 北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.5035。

本发明的另一个目的是提供一种菌剂，该菌剂的活性成分为所述的芽孢杆菌 (Bacillus sp.)GDSD212 CGMCC No.5035。

该菌剂除包含作为活性成分的芽孢杆菌(Bacillus sp.)GDSD212 CGMCC No.5035 外，还可包括辅料，如草炭、动物的粪便、各类作物的秸秆、松壳、稻草、花生皮等。

该菌剂可用于抑制病原真菌、防治植物真菌病害、固氮、产生固氮酶等。

所述芽孢杆菌(Bacillus sp.)GDSD212 CGMCC No.5035在制备下述1)-4)中任 一菌剂中的应用也属于本发明的保护范围：

1)用于抑制病原真菌的菌剂；

2)用于防治植物真菌病害的菌剂；

3)用于固氮的菌剂；

4)产生固氮酶的菌剂。

所述病原真菌为通过土壤、施入土壤中的肥料、和/或种子传播的真菌，具体可为 引起菌核病的真菌；所述植物真菌病害可为菌核病。

所述引起菌核病的真菌可为核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)。

所述的芽孢杆菌(Bacillus sp.)GDSD212 CGMCC No.5035或以芽孢杆菌(Bacillus  sp.)GDSD212 CGMCC No.5035为活性成分的菌剂在生产固氮酶中的应用以及在制备 生物有机肥中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明的再一个目的是提供一种含有芽孢杆菌(Bacillus sp.)GDSD212 CGMCC No.5035或以芽孢杆菌(Bacillus sp.)GDSD212 CGMCC No.5035为活性成分的菌剂的 生物有机肥。

本发明的又一目的是提供一种培养芽孢杆菌(Bacillus sp.)GDSD212 CGMCC No. 5035的方法，包括将芽孢杆菌(Bacillus sp.)GDSD212 CGMCC No.5035在用于培养芽 孢杆菌的培养基中培养的步骤。

本发明的又一目的是提供一种制备所述菌剂的方法，该方法包括如下步骤：将所 述的芽孢杆菌(Bacillus sp.)GDSD212 CGMCC No.5035作为活性成分，得到所述菌剂。

实验证明，本发明是从土壤样品中经过层层筛选，最终筛选出了芽孢杆菌(Bacillus  sp.)GDSD212 CGMCC No.5035，该菌株具有很高的固氮酶活性，能够拮抗作物菌核 病病原菌核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)，竞争适应能力强，接种效果好，在固氮微生 物菌剂和生物有机肥生产中具有广阔的应用前景。

保藏说明

菌种名称：芽孢杆菌

拉丁名：(Bacillus sp.)

菌株编号：GDSD212

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2011年7月6日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.5035

附图说明

图1为芽孢杆菌(Bacillus sp.)GDSD212 CGMCC No.5035的固氮酶活性。

图2为芽孢杆菌(Bacillus sp.)GDSD212 CGMCC No.5035拮抗菌核病菌 (Sclerotinia sclerotiorum)。左侧菌落为病原真菌核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)，右侧 菌落为芽孢杆菌(Bacillus sp.)GDSD212 CGMCC No.5035。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

固氮菌富集培养液ACCC55成份：蔗糖10g、K₂HPO₄·3H₂O 0.5g、NaCl 0.2g、CaCO₃1g、MgSO₄·7H₂O 0.2g、蒸馏水1000ml、pH 7.0～7.2。

改良固氮培养基成份：蔗糖10g、K₂HPO₄·3H₂O 0.5g、NaCl 0.2g、CaCO₃ 1g、 MgSO₄·7H₂O 0.2g、酵母膏0.5g、蒸馏水1000ml、琼脂1.5％～2.0％，pH7.0～7.2。

无氮培养基：蔗糖10g，NaCl 0.12g，K₂HPO₄·3H₂O 0.5g，CaCO₃ 1g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，蒸馏水1000mL，pH7.2。

圆褐固氮菌(Azotobacter chroococcum)ACCC11103(参见“孙建光等.高效固氮 芽孢杆菌筛选及其生物学特性.中国农业科学，2009，42(6)：2043-2051”)。

菌核病菌-核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)(中国农业微生物菌种保藏管理中心， ACCC30046)。

实施例1、固氮菌GDSD212的分离与鉴定

一、固氮菌GDSD212的富集与分离

取10g土样(中国黑龙江省氮素营养相对贫瘠的农田土壤)放入90ml无菌水中摇 床振荡20min制成混浊液，吸取5ml放入30ml固氮菌富集培养液ACCC55中，100rpm， 28℃进行摇床振荡培养，72h后换新鲜培养液继续培养。重复培养3次后进行固氮芽孢 菌分离。吸取1ml上述固氮菌富集培养物放到9ml无菌水中制成10^-1稀释度，继续稀释 制成10^-2、10^-3、10^-4、10^-5稀释度的菌悬液，在100℃沸水中加热10min，冷却后每个 稀释度取0.1ml涂布在固氮菌分离培养基平板上，29℃静置培养。2～3d待菌落形成后， 在改良的ACCC55固氮菌培养基平板上，用平板划线法进行菌种纯化。将分离并纯化 所得的其中一个菌株命名为固氮菌GDSD212。

二、固氮菌GDSD212的鉴定

从以下几个方面鉴定步骤一分离并纯化得到的固氮菌GDSD212：

1、形态学鉴定

将处于对数生长期，且菌落大小稳定，上述步骤一分离并纯化得到的固氮菌 GDSD212进行单菌落状态描述，主要包括菌落的大小、颜色、透明度、湿润度、菌落 表面状态(是否平坦、突起、褶皱、凹陷等)、菌落边缘状态(是否整齐、不规则、放 射状等)。

对于处于对数生长期的所述固氮菌GDSD212，经涂片染色后采用光学显微镜观察 菌体的形态。

结果表明，上述步骤一分离并纯化得到的固氮菌GDSD212菌落圆形凸起，浅乳 白色，有光泽，表面光滑湿润，边缘整齐；菌体杆状，0.5×2.0～3.0μm，有芽孢。

2、生理生化特征分析

参考《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册.北京： 科学出版社，2011.)和《微生物学实验》(沈萍，范秀容，李广武.微生物学实验(第三 版).北京：高等教育出版社，1999.)测定上述固氮菌GDSD212的生理生化特征。

所述固氮菌GDSD212的生理生化特征测定结果如表1所示：

表1 固氮菌GDSD212的生理生化特征

注：“+”表示阳性，“-”表示阴性。

3、16s rDNA序列同源性分析

常规方法培养上述步骤一分离纯化得到的固氮菌GDSD212，提取菌株的总DNA 作为基因扩增模板，以细菌16s rDNA通用引物，27f： 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492r：5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′ 进行PCR反应。反应体系采用上海生物工程有限公司PCR扩增试剂盒。反应程序为： 95℃变性30s、55℃退火1min、72℃延伸2min，共30个循环。DNA测序由北京三博远 志生物技术公司完成，序列拼接及相似性分析使用DNAStar软件完成，序列比对通过 美国国家生物技术信息中心NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)在线完成。

固氮芽孢菌GDSD212菌株16s rDNA的序列详见序列表中序列1。

4、生长特性分析

进行了菌株最适温度和最适pH生长实验。采用无氮培养基分别在4℃、28℃、37 ℃、60℃培养、观察、记录菌株的温度适应性，每个处理3次重复。调整酸度分别为 pH3、pH4、pH5、pH6、pH7、pH8、pH9、pH10、pH11，每个处理3次重复，培养、 观察、记录菌株生长的最适pH。

结果表明，所述固氮菌GDSD212的最适生长温度为28℃，最适生长pH为pH7～ 8。

鉴于上述形态、生理生化特征分析和16s rDNA序列同源性分析结果，将步骤一 分离并纯化得到的固氮菌GDSD212鉴定为变型细菌α亚群芽孢杆菌科芽孢杆菌属 (Bacillus sp.)。该固氮菌GDSD212已于2011年7月6日保藏于中国微生物菌种保藏管 理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3 号)，保藏编号为CGMCC No.5035。

实施例2、芽孢杆菌(Bacillus sp.)GDSD212 CGMCC No.5035固氮酶活性测定

对实施例1所得的芽孢杆菌(Bacillus sp.)GDSD212 CGMCC No.5035进行固氮酶 活性测定，具体操作如下所述：在15×150mm螺口玻璃管中加入5ml改良固氮培养基 制成斜面，接种芽孢杆菌(Bacillus sp.)GDSD212 CGMCC No.5035，28℃培养。以微 生物肥料常用生产菌种圆褐固氮菌(Azotobacter chroococcum)ACCC11103为阳性对 照，不接种空白斜面为阴性对照，设3个重复。培养72h后，换橡胶塞，注入乙炔气 体使终浓度为10％，用医用胶布密封，继续培养72h，取100μl反应气体，用气相色谱 仪测定乙烯生成量，根据以下公式计算菌株的固氮酶活性。固氮酶活性(nmol/mg·h) ＝C₂H₄nmol/[菌体蛋白量(mg)×反应时间(h)]，其中C₂H₄nmol＝1000×C₂H₄体积(μl) ×273×P/[22.4×(273+t)×760]，其中P为气压(mm汞柱)，t为反应温度(℃)。

其中，菌体蛋白含量测定方法如下所述：用5ml生理盐水将试管斜面上的菌苔洗 入离心管中，收集菌体，向沉淀中加入3ml 0.5M的NaOH沸水煮沸5min，加入3ml 0.5M 的HCl混合，离心后取上清1.0ml，加入5ml考马斯亮蓝溶液，在漩涡混合器上混合， 显色3min，测定595nm处的吸光值A₅₉₅，根据牛血清白蛋白标准曲线计算菌体蛋白含 量。

结果显示，筛选到的芽孢杆菌(Bacillus sp.)GDSD212 CGMCC No.5035的固氮酶 活性为68.403nmol C₂H₄/h·mg蛋白，统计分析显著高于微生物肥料常用生产菌种圆 褐固氮菌ACCC11103的固氮酶活性25.100nmol C₂H₄/h·mg蛋白，如图1所示。这一 结果表明，本发明的芽孢杆菌(Bacillus sp.)GDSD212 CGMCC No.5035能高效固氮。

实施例3、芽孢杆菌(Bacillus sp.)GDSD212 CGMCC No.5035拮抗病原真菌抑菌 率测定

采用两点对峙法对实施例1所得到的芽孢杆菌(Bacillus sp.)GDSD212 CGMCC No. 5035进行拮抗病原真菌抑菌率测定，具体操作如下所述：在PDA平板上距离中心2cm 的两点上分别接种作物病原真菌核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)和芽孢杆菌(Bacillus  sp.)GDSD212 CGMCC No.5035，每个筛选处理3个重复，以只接病原真菌不接固氮 菌的平板为对照。28℃恒温培养，15d后用毫米刻度尺测量对峙平板上病原真菌沿被测 芽孢杆菌(Bacillus sp.)GDSD212 CGMCC No.5035方向的菌落半径r₁、及对照平板上 病原真菌的菌落半径r₀。病原真菌生长抑制率(％)＝(对照半径r₀-对峙培养病原真菌菌 落半径r₁)/对照半径r₀×100％。

结果显示，菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)的r₀是63.0±2.Imm，r₁是14.67± 1.13mm。将平均值代人上述公式计算得：所述芽孢杆菌(Bacillus sp.)GDSD212 CGMCC No.5035对菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)的抑菌率为76.71％，如图2所示。