检测细胞DACH1基因启动子区DNA甲基化状态的引物对及试剂盒

摘要

本发明提供用于检测细胞DACH1基因启动子区甲基化状态的引物对及试剂盒。本试剂盒首次选用细胞DACH1基因作为目标基因，该基因是本发明人通过MSP技术证明在胃癌、结直肠癌、肝癌和食管癌细胞中启动子区呈高甲基化状态的基因，具有首创性。利用本发明所述引物对及试剂盒检测胃癌、结直肠癌、肝癌及食管癌细胞的特异性好，在胃癌中为66％，结直肠癌50.4％，肝癌49％，食管癌70％；灵敏度高，达到0.5％，即1000个细胞中有5个癌细胞就能够被检测出。应用本发明试剂盒来检测细胞DACH1基因启动子区高甲基化状态可作为消化系统肿瘤诊断、疗效观察、预后判断、残留病灶检测等的有力手段，而且，操作简便、稳定性好，具有深远的临床意义和推广性。

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于检测细胞DACH1基因启动子区甲基化状态的引物对及试剂盒。 

背景技术

胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，发病率很高，由于胃癌的致死率较高，并且死亡率是可能收集到的最精确的统计数字，所以许多国家都采用死亡率来表示其发病率，在我国，胃癌死亡率占所有恶性肿瘤的23.02％，居各类癌症死亡的首位，在消化系统恶性肿瘤的死亡病例中，约有半数死于胃癌。大肠癌是中国常见的恶性肿瘤之一，近年来其发病率明显上升，由恶性肿瘤的第4位上升为第3位。其中以结肠癌增加为著，并且右侧结肠癌亦呈明显增长趋势。右侧结肠癌由于该部位解剖特点及肿瘤的生物学特性，确诊时患者病期多为晚期。原发性肝癌是指由肝细胞或胆管细胞发生的癌肿。临床上以肝细胞性肝癌(HCC)最多见，是我国常见的恶性肿瘤之一。死亡率在消化系统肿瘤中列第3位，仅次于胃癌和食管癌。食管癌是我国常见的恶性肿瘤之一，目前尚无特异性和敏感性均满足临床需求的肿瘤标志物应用于临床。当前，针对于上述消化系统恶性肿瘤的检测手段，尤其是早期诊断的检测方法仍然十分有限，是目前迫切需要解决的问题。现今用于诊断消化系统肿瘤的方法主要包括消化内镜，影像学检查，细胞学观测，生化与免疫学检查等。 

消化内镜检查：内镜检查是诊断胃癌，肠癌最直接、准确有效的诊断方法。自1826年食管镜，1968年直式胃镜出现之后，消化内镜不断改进发展，为胃肠道疾病的诊断提供了直观确切的证据，先后经历了纤维胃镜，电子内镜里程碑式的发展，现今利用胃镜，结肠镜，小肠镜，超声内镜等检查，不但可完成全消化道的检查，还可以进行ESD， EMR，ERCP等治疗，利用超声内镜，更可对肿瘤的侵润深度作出判断，活检病理和活体染色等方法可提高早癌的确诊率。 

影像学检查：影像学检查包括超声显像、放射性核素显像、计算机断层扫描(CT)与磁共振成像(MRI)等技术，为消化系统疾病的诊疗方面日益发挥作用。尤其是肝脏，胰腺，胆囊，脾脏这些器官，影像学检查往往提供最为直观的证据。B超检查对于原发性肝癌(HCC)这一局灶性病变具有很大的诊断价值。一般可列为首选，对HCC的确诊率达90％以上。高分辨实时超声可发现2cm以下的小肝癌，能检出HCC结节的形态、大小和部位，门脉主干或其分支内有无癌栓等。CT扫描与超声同为无创性检查方法，图像清晰、分辨率高，可显示器官全貌和邻近组织的侵犯情况。 

生化与免疫学检查：1)癌胚抗原(CEA)：首先从结肠癌提取物中发现，并存在于2～6个月龄的胚胎组织中。其后的研究发现CEA也存在于其他部位的上皮肿瘤中，是目前研究最为广泛的大肠癌肿瘤标志物。在早期大肠癌患者血中，CEA阳性率可达30～40％，在进展期大肠癌中可达90％左右。在50％早期胃癌和进展期胃癌中也可发现CEA明显增高。2)糖链抗原19-9(CA19-9)：CA19-9是1979年Koprowski等用人结肠癌细胞系SW1116免疫小鼠获得单克隆抗体，并用该抗体检测出相应的肿瘤抗原CA19-9，虽然其在大肠癌中的阳性率较CEA低，但其特异性相对较CEA高。胃腺癌常伴CA19-9升高，其阳性率约为45％，此外，胰腺癌患者血中CA19-9含量亦显著增高，阳性率甚至超过大肠癌，因此，CA19-9亦非理想的大肠癌标志物。3)CA72-4：CA72-4对胃癌的诊断价值较高其敏感性约为68％，特异性约为91％。4)AFP：在成人，如果血清中出现高浓度的AFP，强烈提示HCC或生殖腺胚胎肿瘤。此外，极少数胃、胰，胆管、结直肠癌AFP也可升高，但其绝对值不如HCC高。血清AFP是当前诊断HCC特异性、灵敏度最高的肿瘤标志物。除上述，尚有一些其他肿瘤标志物如γ-GT及其同工酶、CA125，CA242、CA50等等均对临床诊断有不小的价值。 

基因学诊断：目前认为致癌过程是多阶段的，包括多个连续的“独立”事件，是多个遗传物质，即基因累积性改变的结果，主要包括癌 基因的激活，如myc、ras、abl，抑癌基因的失活，典型的如APC、p53、Rb基因等。APC在结肠癌上皮增殖中起“看门”作用，故又称为“看门基因”。目前对于基因突变的检测包括免疫组织化学染色、聚合酶链反应(PCR)、变性梯度凝胶电泳法(DGGE)、限制性片段长度多态性分析(RFLP)以及寡核苷酸探针杂交法等。 

随着后基因组时代的到来，表观遗传学(Epigenetics)已成为生命学科的研究前沿。表观遗传学是针对遗传学而言的，是指研究DNA序列不发生改变的可遗传的基因表达变化的科学，它可以解释一些经典遗传学所不能解释的问题，例如：单卵双生的兄弟具有完全相同的基因型，并在同样的环境下成长，但仅其中一人患胃癌，而另外一人身体健康，因此表观遗传信息提供了何时、何地以何种方式去应用遗传信息的指令。在消化系统肿瘤领域中，表观遗传学研究主要集中DNA甲基化及组蛋白乙酰化上。DNA甲基化修饰是基因组表观遗传调控中主要的方式，人类肿瘤的发生、发展与DNA甲基化的异常有关，基因启动子区CpG岛高甲基化可导致抑癌基因表达沉默进而导致肿瘤发生。DNA甲基化是指在甲基化转移酶的作用下，以s-腺苷甲硫氨酸为甲基供体，将甲基转移到CG二核苷酸胞嘧啶的5号碳原子上，形成5甲基胞嘧啶。DNA甲基化异常是细胞癌变过程中早期、频发事件，因此特异基因的甲基化可作为癌症早期诊断的分子标志物、治疗靶点和判断预后手段。随着技术的进步，检测甲基化的手段也丰富起来，不仅可探测某段DNA序列的甲基化分布，而且还能大通量的了解整个基因组的甲基化程度。目前主要方法有两类：一是亚硫酸氢钠法(Sodium Bisulfite)，包括亚硫酸氢钠法依赖的基因测序法、亚硫酸氢钠联合限制性内切酶分析法(COBRA)、甲基化特异性PCR(Methylation Specific PCR，MSP)、甲基化敏感的单核苷酸扩增法(Ms-SNuE)等；另一类是甲基化敏感的限制性内切酶法，包括Southern法、甲基化敏感的限制性图谱(MSRF)、限制性标记基因组扫描技术(RLGS)、差异性甲基化杂交分析(DMH)、甲基化CpG岛扩增子分析(MCA)等。值得一提的是MS-PCR，自1996年Herman发明了此项技术后，大大简化了DNA甲基化的检测方法，使得表观遗传学研究更加迅速的向前发展，其突出的优点在于高特异性、高灵敏度、操作简便、费用及耗时均较 少、不受限制性内切酶的限制，目前MS-PCR已成为用以研究基因甲基化状态的应用最为广泛的方法，尤其对于大批的临床标本甲基化状态的研究更是首选方法。MS-PCR的基本原理是：DNA经过亚硫酸盐硫化修饰后，CpG岛上没有发生甲基化的CG二核苷酸中的胞嘧啶就转化为尿嘧啶，最后转化为胸腺嘧啶，而发生甲基化的胞嘧啶则保持不变，因此针对上述区别分别设计甲基化引物及非甲基化引物，分别进行PCR扩增，扩增产物进行凝胶电泳照相观察结果，得出是否为甲基化的结论。 

DACH1基因：最初在研究Ellipse(Elp)突变体果蝇眼睛的发育时，发现在这种突变体中，眼睛的起始发育细胞不能正常分化，基因学证据表明Elp等位基因是果蝇属EGFR同族体，随后，Graeme Mardon等人在Elp突变果蝇中鉴定出Ellipse突变的抑制基因，使得突变果蝇眼睛和腿能正常发育，因为该基因缺失的果蝇为短腿表型，因此将其命名为dachshund(DACH)(Mardon，G.，N.M.Solomon，and G.M.Rubin，dachshund encodes a nuclear protein required for normal eye and leg development in Drosophila.Development，1994.120(12)：p.3473-86.)。DACH1基因位于人13号染色体长臂二区二带，即13q22，外显子数：12。下面简述DACH1基因的结构与功能： 

DAC基因在多细胞动物的发育过程中起着至关重要的作用，调控着眼睛、腿和性腺的发育。在眼睛的发育调节中，dac基因是视网膜决定基因网络(RDGN)的重要成员，保证正常的眼睛发育起始(Chen，R.，et al.，Dachshund and eyes absent proteins form a complex and function synergistically to induce ectopic eye development in Drosophila.Cell，1997.91(7)：p.893-903)。研究发现，从果蝇、鼠到人，DAC基因在结构上存在两个高度保守结构域，功能上也高度一致(Hammond，K.L.，et al.，Mammalian and Drosophila dachshund genes are related to the Ski proto-oncogene and are expressed in eye and limb.Mechanisms of development，1998.74(1-2)：p.121-31.)，DAC基因家族主要包括DACH1、DACH2，DACH1主要与眼睛、腿、性腺等的发育有关，DACH1突变鼠胚胎出生后伴有多器官损伤，很快夭折(Backman，M.，et al.，Targeted disruption of mouse Dach1 results in postnatal lethality.Developmental dynamics：an official publication of the American  Association of Anatomists，2003.226(1)：p.139-44.；Davis，R.J.，et al.，Dach1 mutant mice bear no gross abnormalities in eye，limb，and brain development and exhibit postnatal lethality.Molecular and cellular biology，2001.21(5)：p.1484-90.)。比较之下，DACH2的功能似乎不及DACH1那么重要，DACH2突变的小鼠并未表现出明显的发育异常(Davis，R.J.，et al.，Characterization of mouse Dach2，a homologue of Drosophila dachshund.Mechanisms of development，2001.102(1-2)：p.169-79.)。 

DACH1基因是视网膜决定基因网络(RDGN)成员之一，编码一种保守的核蛋白，DAC基因在基因组中约占20kb，含有12个外显子，编码出的蛋白包括1081个氨基酸残基，含有两个高度保守的结构域，DachBox-N和DachBox-C，在人类，DachBox-N与SKI/SNO蛋白氨基酸序列高度一致，所以又称为DACH SKI/SNO(DS)domain。DACH1通过该结构域与HDAC3、SIX6、NCoR结合发挥作用(Kim，S.S.，et al.，Structure of the retinal determination protein Dachshund reveals a DNA binding motif.Structure，2002.10(6)：p.787-95.)。 

除与发育相关外，目前，DACH1基因与肿瘤之间关系的研究是学术界关注的热点。研究资料表明，DACH1不仅与肿瘤的发生机制，而且与肿瘤的预后相关。目前研究发信在乳腺癌、前列腺癌、子宫内膜癌等中均有DACH1的表达异常。在乳腺癌中，DACH1明显低表达，并且与CyclinD1成负相关，分析2200名患者的DACH1表达和预后关系，发现DACH1低表达患者预后较差，DACH1低表达患者较正常表达患者至少提前3年死亡(Wu，K.et al.(2006)DACH1 is a cell fate determination factor thatinhibitscyclin D1 and breast tumor growth.Mol.Cell.Biol.26，7116-7129)。DACH1可以抑制C-jun诱导的DNA合成和细胞增殖(Wu，K.，et al.，Cell fate determination factor DACH1 inhibits c-Jun-induced contact-independent growth.Molecular biology of the cell，2007.18(3)：p.755-67.)。研究表明DACH1可以通过抑制TGF-β信号通路抑制肿瘤的发生发展(Wu，K.，et al.，DACH1 inhibits transforming growth factor-beta signaling through binding Smad4.The Journal of biological chemistry，2003.278(51)：p.51673-84.)。 

本发明首次通过MSP的方法在消化系统肿瘤中成功验证了细胞DACH1启动子区的高甲基化。因此推断该基因的启动子区高甲基化状 态可能是一个新的消化系统肿瘤分子标记物，细胞DACH1基因可能是一个新的消化系统肿瘤相关抑癌候选基因。以此为坚实的理论依据，本发明人应用MSP的方法对大量临床消化系统肿瘤(胃癌、结直肠癌、肝癌、食管癌)及正常胃、结直肠、肝、食管标本进行检测，以明确其细胞DACH1基因启动子区甲基化状态。 

发明内容

本发明的目的是提供一种检测细胞DACH1基因启动子区甲基化状态的引物对，即用于检测细胞DACH1基因启动子区甲基化状态和非甲基化状态的一对特异性引物对，其包括甲基化引物和非甲基化引物，同时，本发明还提供一种含有上述甲基化引物或非甲基化引物的试剂盒。 

本发明提供一种用于检测细胞DACH1基因启动子区甲基化状态的引物对，包括甲基化引物和非甲基化引物，其中，所述甲基化引物的上游引物核苷酸序列为：5′-GGAAAAAATTATTAGTTTTCGCGGAC-3′，下游引物核苷酸序列为：5′-AAACCGAAAACACAAAAATAACGATCG-3’；所述非甲基化引物的上游引物核苷酸序列为：5′-TTTGGAAAAAATTATTAGTTTTTGTGGAT-3′，下游引物核苷酸序列为：5′-AAAAAACCAAAAACACAAAAATAACAATCA-3′。 

本发明还提供一种用于检测消化系统肿瘤细胞的试剂盒，其中，该试剂盒含有上述甲基化引物或非甲基化引物，所述消化系统肿瘤包括胃癌、结直肠癌、肝癌、食管癌。 

本发明具有如下优点：利用本发明所述引物对及试剂盒检测胃、食管、结直肠粘膜细胞或肝的活检组织细胞，在肿瘤细胞中DACH1基因启动子区呈高甲基化状态，甲基化率在胃癌、结直肠癌、肝癌及食管癌中分别约为66％、50.4％、49％、70％，而在正常胃、结直肠、肝、食管组织细胞中，DACH1基因启动子区呈非甲基化状态，表明该基因启动子区的甲基化状态对于消化系统肿瘤细胞具有特异性；同时应用本发明所述引物对及试剂盒可使检测消化系统肿瘤细胞的灵敏度达到0.5％，即1000个细胞中有5个癌细胞就能够被检测出，这说明 DACH1基因启动子区甲基化状态可作为消化系统肿瘤中新的分子标志。本试剂盒首次选用细胞DACH1基因作为目标基因，具有首创性。因此，应用本发明引物及试剂盒来检测细胞DACH1基因启动子区高甲基化状态可作为消化系统肿瘤如胃癌、结直肠癌、肝癌和食管癌的诊断、疗效观察、预后判断等的有力手段，而且，操作简便、稳定性好，具有深远的临床意义和推广性。 

附图说明

图1以硫化修饰后的人外周血淋巴细胞DNA(非甲基化对照)，硫化修饰后的结肠癌细胞系HCT116细胞DNA(甲基化对照)和去离子水(阴性系统对照)建立对照体系。分别用甲基化引物及非甲基化引物对胃癌、结直肠癌、肝癌、食管癌组织标本进行MSP检测，同时检测正常结肠、胃、肝和食管细胞DNA。扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果(分别扩增，混合点样)如图所示。 

图2将结肠癌细胞系HCT116的DNA(DACH1基因启动子区100％甲基化)与正常结肠组织细胞的DNA(DACH1基因启动子区100％非甲基化)按比例混合，进行硫化修饰，此后用甲基化引物进行扩增，扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果(分别扩增，混合点样)如图所示。 

具体实施方式

经过反复的试验与推敲，本发明人选出一对特异性很好的甲基化引物对及非甲基化引物对，应用敏感度较高的琼脂糖凝胶电泳技术作为结果的检出手段，得出可靠的实验结果，实验结果表明：DACH1基因启动子区的高甲基化状态在人类消化系统肿瘤中具有较高的特异性。利用所述引物对及试剂盒检测细胞DACH1基因甲基化状态的灵敏度高，解决了上述现有技术中其他方法的检出率低、结果难以分析、仅能显示大体的基因学异常等一系列技术问题，因此，本发明所述的引物及试剂盒可用于消化系统肿瘤的早期诊断、疗效判定等。 

本发明提供的用于检测细胞DACH1基因启动子区甲基化状态的引物对，包括甲基化引物和非甲基化引物，其中，所述甲基化引物的上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.1所述，即： 5′-GGAAAAAATTATTAGTTTTCGCGGAC-3′，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.2所述，即：5′-AAACCGAAAACACAAAAATAACGATCG-3′；所述非甲基化引物的上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.3所述，即：5′-TTTGGAAAAAATTATTAGTTTTTGTGGAT-3′，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.4所述，即：5′-AAAAAACCAAAAACACAAAAATAACAATCA-3′。 

利用上述甲基化引物，以硫化修饰后的DNA为模板进行MSP扩增，如果DACH1基因启动子区存在甲基化，则会得到124bp大小的片段；如果DACH1基因未发生甲基化，则不产生扩增产物。基于此，本申请将该引物称为甲基化引物。所述甲基化引物，其上游引物的Tm69.7，GC含量48.1％，下游引物的Tm 70.2，GC含量33.3％。 

利用该非甲基化引物，以硫化修饰后的DNA为模板进行MSP扩增，如果DACH1基因未发生甲基化，则会得到130bp大小的片段。基于此，本申请将该引物称为非甲基化引物。所述非甲基化引物，其上游引物的Tm 66.7，GC含量20.7％，下游引物的Tm67.2，GC含量20％。 

本发明提供的用于检测消化系统肿瘤细胞的试剂盒含有上述甲基化引物或非甲基化引物，所述消化系统肿瘤包括胃癌、结直肠癌、肝癌、食管癌。 

进一步地，本发明的试剂盒还含有甲基化对照MSP模板，该模板为硫化修饰后的细胞DACH1基因启动子区为100％甲基化的肿瘤细胞DNA。在此，对该肿瘤细胞没有特别的限制，只要满足“硫化修饰后的细胞DACH1基因启动子区100％甲基化”即可，例如可以为消化系统肿瘤细胞等，所述消化系统肿瘤包括胃癌、结直肠癌、肝癌、食管癌。 

进一步地，本发明的试剂盒还含有非甲基化对照MSP模板，该模板为硫化修饰后的细胞DACH1基因启动子区为100％非甲基化的正常细胞DNA。在此，对该正常细胞没有特别的限制，只要满足“硫化修饰后的细胞DACH1基因启动子区100％非甲基化”即可，例如可以为正常外周血淋巴细胞、正常消化系统组织细胞等，所述正常消化系统组织包括正常胃、结直肠、肝、食管组织。 

进一步地，本发明的试剂盒还含有作为阴性系统对照的去离子水。 

进一步，本发明的试剂盒还含有MSP反应所需的下列成分：50mM MgCl₂，10×MSP buffer，10mMdNTPmixture，Hot start Taq酶。 

为更详细地了解本发明，以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。 

实施例一 

1、模板的制备(基因组DNA的提取及硫化修饰过程) 

DNA的制备：获取胃癌、结直肠癌、肝癌、食管癌标本及正常上述组织标本。在本实施例中结直肠癌8例(CRC1-CRC8)、胃癌8例(GC1-GC8)、肝癌5例(HCC1-HCC5)、食管癌5例、正常结直肠(NC1-NC3)、正常胃(NG1-NG2)、一例正常肝(NH)和一例正常食管，应用酚-氯仿抽提的方法分别提取基因组DNA，紫外分光光度仪测定吸光度(A)值确定其含量及纯度。 

亚硫酸盐修饰：参考herman(J.G.Herman，J.R.Graff，S.Myohanen，B.D.NelkinandS.B.Baylin，Methylation-specific PCR：a novel PCR assay formethylation status of CpG islands，Proc.Natl.Acad.Sci.USA93(1996)，9821-9826.)等报道的方法加以改进。取上述制备的基因组DNA，经稀释后，在液氮中反复冻融2次，再用26G注射器抽吸40次，应用紫外分光光度计测定DNA浓度，并精确取2ugDNA，加去离子水至终体积50ul，加入新鲜配制的2M的NaOH 5.5ul，37℃孵育15min。之后加入新鲜配制的10mM的氢醌30ul及3M亚硫酸氢钠520ul混合均匀(其内已加入新鲜配制的2M的NaOH，计算方法：10ml 3M亚硫酸氢钠中加入2M的NaOH 740ul)，50℃孵育16h，此后应用DNA纯化试剂盒(promega公司产品)纯化并回收DNA，应用50ul去离子水洗脱DNA，向其内加入5.5ul 3M的NaOH以终止硫化修饰，加入1ul糖原和17ul 7.5M乙酸铵，用3倍体积的无水乙醇沉淀DNA，最终硫化修饰后的DNA重新溶解在20ul去离子水中，得到DNA模板，立即使用或-20℃保存。 

2、MSP扩增 

以甲基化引物进行扩增的MSP反应体系，以总体积25ul计，包括： 

模板(硫化修饰后的DNA)：2ul； 

甲基化引物(50pmol/ul)： 

上游引物(5′-GGAAAAAATTATTAGTTTTCGCGGAC-3′)：0.5ul， 

下游引物(5′-AAACCGAAAACACAAAAATAACGATCG-3′)：0.5ul； 

50mM MgCl₂(Invitrogen公司)：0.75ul； 

10×MSP buffer(缓冲液，Invitrogen公司)2.5ul； 

10mMdNTP mixture(Invitrogen公司)：1.25ul； 

Hot start Taq酶(Invitrogen公司，浓度为5U/μL)：0.1ul； 

去离子水：17.4ul 

以非甲基化引物进行扩增的MSP反应体系与以甲基化引物进行扩增的MSP反应体系的不同之处仅在于：引物不同。具体地，以非甲基化引物进行扩增的MSP反应体系，以总体积25ul计，包括： 

非甲基化引物(10pmol/ul)： 

上游引物(5′-TTTGGAAAAAATTATTAGTTTTTGTGGAT-3′)：0.5ul， 

下游引物(5′-AAAAAACCAAAAACACAAAAATAACAATCA-3′)：0.5ul； 

其余组分及其用量均与以甲基化引物进行扩增的MSP反应体系中的相同。 

以上仅分别列举了以甲基化引物和非甲基化引物进行扩增的MSP反应体系中各组分的用量的一个例子，使用不同公司生产的MgCl₂、MSP buffer缓冲液、dNTP mixture、Hot start Taq酶时，反应体系中各组分的用量会有所不同，可以根据实际需要进行调整。本发明对MSP反应体系中各组分的用量没有特别的限制，使用常规的用量即可。 

利用上面建立的MSP反应体系对制备的33个硫化DNA模板——结直肠癌8例(CRC1-CRC8)、胃癌8例(GC1-GC8)、肝癌(HCC1-HCC5)5例、食管癌(EC1-EC5)5例，正常结直肠(NC1-NC3)3例、正常胃(NG1-NG2)2例、正常肝(NH)1例和正常食管(NE)1例分别进行扩增，并以与上述组织同时硫化修饰后的结肠癌细胞系HCT116细胞DNA为甲基化对照(IVD)，以硫化修饰后的人外周血淋巴细胞 DNA为非甲基化对照(NL)，以去离子水作为阴性系统对照(H₂O)，扩增程序为：95℃下预变性5min，接着进入循环，在95℃下变性30s，在60℃下退火30s，在72℃下延伸40s，共35个循环，之后，继续在72℃下延伸7min。 

3.MSP反应产物的检测 

MSP产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，紫外透射分析仪检测并照相。 

4.结果 

图1以硫化修饰后的人外周血淋巴细胞DNA(非甲基化对照)，硫化修饰后的结肠癌细胞系HCT116细胞DNA(甲基化对照)，去离子水(阴性系统对照)建立对照体系，分别用甲基化引物及非甲基化引物对胃癌、结直肠癌、肝癌、食管癌组织标本进行MSP检测，同时检测正常结肠、胃、肝和食管细胞DNA。扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果(分别扩增，混合点样)如图所示。 

Marker为DL2000marker(分子量标准) 

M标记的2、4、6、8、10、12、14、16泳道为甲基化引物扩增的产物； 

U标记的3、5、7、9、11、13、15、17泳道为非甲基化引物扩增的产物； 

NC1、NC2、NC3为正常结直肠，NG1、NG2为正常胃；CRC1～CRC8为结直肠癌；GC1～GC8为胃癌；HCC1～HCC5为肝癌；NH为正常肝；EC1～EC5为食管癌；NE为正常食管。另有IVD标记的为甲基化对照，NL标记的非甲基化对照，H₂O阴性系统对照(去离子水)。 

结果判读方法如下： 

用甲基化引物(图中以M表示)进行扩增，有扩增产物，而用非甲基化引物(图中以U表示)进行扩增，无扩增产物的标本，判读为完全甲基化； 

用甲基化引物及非甲基化引物进行扩增，均有扩增产物的标本，判读为部分甲基化； 

用非甲基化引物进行扩增，有扩增产物，用甲基化引物进行扩增，无扩增产物的标本，判读为非甲基化。 

部分甲基化及完全甲基化的标本均判读为甲基化。 

如图1所示，结直肠癌CRC2、CRC4、CRC6、CRC7，胃癌GC1、GC3、GC4、GC5、GC6、GC7，肝癌HCC1、HCC2、HCC5，食管癌EC1、EC3、EC4为部分甲基化(其中，EC4接近完全甲基化)；结直肠癌CRC1、CRC3、CRC5、CRC8，胃癌GC2、GC8、肝癌HCC3、HCC4和食管癌EC2、EC5为非甲基化。正常结直肠(NC1-NC3)、胃(NG1-NG2)、肝(NH)、食管(NE)均为非甲基化。对照体系反应正常，结果可信。 

实施例二：临床标本检测 

取胃癌临床标本65例，结直肠癌标本100例，肝癌标本55例和食管癌60例。进行MSP扩增，模板制备、PCR扩增体系及条件、扩增产物的检测均与实施例一中的相同，检测结果请见下表1： 

表1 

实施例三：敏感度实验 

将结直肠癌细胞系HCT116的DNA(DACH1基因启动子区100％甲基化)与正常细胞的DNA(DACH1基因启动子区100％非甲基化)按比例混合，进行硫化修饰(方法同实施例一)，再用甲基化引物进行MSP。MSP产物进行8％琼脂糖电泳，紫外透射分析仪测定并照相。 

分组： 

第1组：100％结直肠癌HCT116细胞DNA+0％正常结直肠癌细胞DNA 

第2组：50％结直肠癌HCT116细胞DNA+50％正常结直肠癌细胞DNA 

第3组：5％结直肠癌HCT116细胞DNA+95％正常结直肠癌细胞DNA 

第4组：1％结直肠癌HCT116细胞DNA+99％正常结直肠癌细胞DNA 

第5组：0.5％结直肠癌HCT116细胞DNA+99.5％正常结直肠癌细胞DNA 

第6组：0％结直肠癌HCT116细胞DNA+100％正常结直肠癌细胞DNA 

结果如图2所示：在1000个正常细胞中有5个结直肠癌细胞就可以被检测出，即用本发明的引物对及试剂盒检测结直肠癌细胞DACH1基因启动子区的甲基化状态，其灵敏度可达到0.5％，灵敏度较高，可用来监测早期结直肠癌癌变。 

同理，用本发明的引物对及试剂盒检测胃癌、肝癌及食管癌细胞DACH1基因启动子区的甲基化状态，其灵敏度也可达到0.5％，灵敏度较高，可用来监测早期胃癌、肝癌及食管癌癌变。 

实施例四：检测消化系统肿瘤细胞的试剂盒组成 

检测消化系统肿瘤细胞的试剂盒包括以下成分，其中，进行1次MS-PCR的用量为： 

1、甲基化引物：上游引物核苷酸序列为SEQ ID No.1，下游引物核苷酸序列为SEQ ID No.2，各为0.5ul。 

2、非甲基化引物：上游引物核苷酸序列为SEQ ID No.3，下游引物核苷酸序列为SEQ ID No.4，各为0.5ul。 

3、反应液2份，每份反应液包括： 

(1)50mM MgCl₂：0.75ul； 

(2)10×MSP buffer：2.5ul； 

(3)10mMdNTP mixture：1.25ul； 

(4)Hot start Taq酶：0.1ul； 

(5)去离子水：17.4ul。 

一个试剂盒可以包括上述各成分进行多次MSP的用量，如25次、50次、100次等，各成分的具体量视情况需要而定。 

为防止出现MSP扩增产物的假阳性，试剂盒还可包括以下几项组成： 

a、甲基化对照MSP模板：硫化修饰后的DACH1基因启动子区为100％甲基化的肿瘤细胞(如消化系统肿瘤细胞等)DNA，进行1次MSP的用量为：2ul。 

b、非甲基化对照MSP模板：硫化修饰后的DACH1基因启动子区为100％非甲基化的正常细胞(如正常外周血淋巴细胞、正常消化系统组织细胞等)DNA，进行1次MSP的用量为：2ul。 

c、阴性系统对照：去离子水，用以评估体系是否存在PCR产物的污染，如去离子水检测的结果为阴性(M和U均为阴性)，则体系结果可信，进行1次MSP的用量为：2ul。