耐辐射异常球菌R1 HIN蛋白基因培育耐盐植物的应用

摘要

本发明发现耐辐射异球菌Deinococcus radiodurans R1中的HIN蛋白基因(DR1372)具有增强原核生物及植物的抗逆能力。本发明构建了包含上述基因的重组载体，把它们分别导入原核及真核宿主细胞。实验证明，HIN蛋白基因(DR1372)在原核宿主细胞和植物中表达后，均能增强其耐盐抗性。

说明书

技术领域

本发明涉及耐辐射异常球菌R1(Deinococcus radiodurans R1)HIN蛋白基因(DR1372，GeneID：1798946)的新功能，具体涉及该基因增强植物对盐胁迫抗性方面的应用。 

背景技术

盐碱、干旱和冻害是限制植物生长发育的重要逆境因子，在胁迫过程中植物体会诱导合成一系列的功能蛋白，以保护植物体细胞在胁迫条件下免受伤害(Shinozaki，2007)。大量研究表明，HIN蛋白在植物抵御高盐等非生物胁迫的过程中发挥着重要作用。D.radiodurans R1含有的HIN蛋白基因DR1372编码的蛋白属于LEA2家族成员，对胚乳发育和植物生长器官的渗透胁迫有保护作用(Campbell et al.，1997；Close et al.，1997；Brawley et al.，1998；Mtwisha et al.，1998)。 

但目前未见耐辐射异常球菌R1 HIN蛋白基因(DR1372，GeneID：1798946)在提高植物耐盐性方面的功能的研究报道。 

发明内容

本发明的目的是从D.radiodurans R1基因组中发现能够提高植物对盐抗性的基因。并将该基因转入植物，使转入该基因的植物获得耐盐的能力。 

本发明通过如下研究发现，Deinococcus radiodurans R1的HIN蛋白基因(DR1372)具有耐盐胁迫的功能，可用于培育耐盐性状的植物： 

1、获得含有D.radiodurans R1 HIN蛋白基因(DR1372)的重组工程菌株 

1)通过PCR从D.radiodurans R1(DSM 20539)菌株基因组扩增出D.radiodurans R1 HIN蛋白基因(DR1372)，基因序列号为：GeneID：1798946。其大小为495 bp，该基因编码164个氨基酸，将其克隆于载体pGEMT-easy上，构建了含有完整HIN蛋白基因的重组质粒pGEMT-hin； 

2)将HIN蛋白基因(DR1372)连接于pRADZ3穿梭质粒上，该质粒含有能在大肠杆菌和耐辐射异球菌中都起作用的groEL启动子，构建含有groEL启动子的完整HIN 蛋白基因(DR1372)重组质粒pRADZ3-hin G； 

3)将导入HIN蛋白基因(DR1372)的重组质粒pRADZ3-hin G转入受体大肠杆菌JM109中，获得重组菌株JM-hin(详见实施例1)； 

2、含有HIN蛋白基因工程菌株的耐盐实验 

实验证实，经4M NaCl盐溶液冲击后，含有D.radiodurans R1 HIN蛋白基因(DR1372)的JM-hin重组菌株生长状况良好，菌落数高于只含空质粒的JM-Z3菌株(见实施例2及图4)。该工程菌株具有耐受4M NaCl冲击的能力。 

此实验表明：D.radiodurans R1 HIN蛋白基因(DR1372)具有增强原核生物耐盐的能力。 

3、HIN蛋白基因(DR1372)在油菜中表达及转基因植株的耐盐性鉴定 

1)将D.radiodurans R1 HIN蛋白基因(DR1372)连接到植物表达载体pBI121中，构建具有HIN蛋白基因(DR1372)的重组质粒pBI121-hin； 

2)将pBI121-hin重组质粒转化油菜中，获得了能够耐受盐胁迫的转基因油菜植株； 

此实验表明：D.radiodurans R1 HIN蛋白基因(DR1372)具有培育耐盐植物的用途(见实施例3)。 

附图说明：

图1是含有D.radiodurans R1 HIN蛋白基因(DR1372)序列的PCR产物验证电泳图谱； 

图2是含有D.radiodurans R1 HIN蛋白基因(DR1372)及groEL启动子构建原核表达载体的验证电泳图谱； 

图3是在盐冲击试验前的含有空载体和含有D.radiodurans R1 HIN蛋白基因(DR1372)序列的原核表达载体的大肠杆菌的生长情况的菌落照片，其中： 

a是含有空表达载体的大肠杆菌JM 109菌株； 

b是含有D.radiodurans R1 HIN蛋白基因(DR1372)表达载体的大肠杆菌重组菌株； 

图4是含有D.radiodurans R1 HIN蛋白基因(DR1372)的原核表达载体及空载体的大肠杆菌(E.coli)在含4M NaCl培养基中的生长情况的菌落照片，图中的菌株如下： 

a是含有空表达载体的大肠杆菌JM109菌株； 

b是含有D.radiodurans R1 HIN蛋白基因(DR1372)表达载体的大肠杆菌重组菌株； 

图5是在350mmol.L^-1的NaCl培养基上转D.radiodurans R1 HIN蛋白基因(DR1372)油菜与非转基因油菜的耐盐试验结果比较。 

图中顺序从左至右，左起第1盆是非转基因油菜，第2～5盆是转入D.radiodurans R1HIN蛋白基因(DR1372)的油菜。 

具体实施方案

以下实施例中所举的质粒、菌株只是用于对本发明作进一步详细说明，并不对本发明的实质内容加以限制。凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。 

实施例中所举的质粒、菌株来源如下： 

克隆载体pGEMT-easy：为Promrga公司市售产品； 

穿梭质粒pRADZ3：为本实验室保存； 

植物表达载体pBI121：为Clontech公司市售产品； 

大肠杆菌JM 109：为北京全式金公司市售产品。农杆菌EHA 105由本实验室保存 

实施例1 D.radiodurans R1 HIN蛋白基因(DR1372)序列在大肠杆菌中的表达 

根据已公布的D.radiodurans R1基因组中的HIN蛋白基因(DR1372)序列设计1对PCR特异性引物，从D.radiodurans R1基因组DNA中扩增完整的核苷酸序列： 

Up 5′ATTA GAGCTATGAAGAAGATGGCTTTTG3′； 

Down 5′ACGC TCCTCAAAACACCGATAAAG3′。 

上述黑斜体部分是酶切位点。 

通过PCR方法从D.radiodurans R1的基因组中扩增出目的基因序列，反应条件：94℃10min，[94℃60sec，55℃30sec，72℃60sec]30个循环，72℃10min，PCR产物经胶回收后，克隆于载体pGEMT-easy上，命名为pGEMT-hin，并测序验证；然后通过SpeI/NdeI双酶切获得含有粘性末端的及含有启动子groEL的pRADZ3载体，将HIN蛋白基因(DR1372)连接于pRADZ3载体上，构建大肠杆菌表达载体pRADZ3-hinG，将该表达载 体转化大肠杆菌JM109，经PCR、酶切，测序验证插入序列正确(见图1，2)，将该重组菌株命名为JM-hin。 

将含有pRADZ3空质粒的E.coli JM109命名为JM-Z3。 

实施例2 含D.radiodurans R1 HIN蛋白基因(DR1372)重组菌株的耐盐实验 

一、实验方法 

1、将实施例1中获得的2个重组大肠杆菌分别接种于20mL LB液体培养基(含Amp抗生素)中，摇瓶过夜(37℃)培养后，再分别转接于100mL的LB液体培养基中，尽量保持接种量的一致，培养至OD₆₀₀≈0.5即可。 

2、取10mL的菌液离心后，在等体积的4M NaCl盐溶液里冲击2h，每个样品立即用无菌去离子水倍比稀释至10^-4，取10μL点在LB固体培养基表面，经37℃培养16h，观察菌落形成情况并照相。 

二、实验结果 

图3显示，4M NaCl盐溶液冲击前含有D.radiodurans R1 HIN蛋白基因(DR1372)的JM-hin菌株与含空质粒的JM-Z3菌株生长状态基本一致；4M NaCl盐溶液冲击后，含有D.radiodurans R1 HIN蛋白基因(DR1372)的JM-hin重组菌株生长状况良好，菌落数明显高于只含空质粒的JM-Z3菌株(见图4)。 

三、实验结论 

D.radiodurans R1 HIN蛋白基因(DR1372)增强了原核生物耐盐的能力。 

实施例3 HIN蛋白基因(DR1372)在油菜中表达及转基因植株的耐盐性实验 

(一)农杆菌介导转化油菜实验 

1.根癌农杆菌EHA105感受态的制备 

1)挑取单菌落，接种于5mL YEB液体培养基(含利福平Rif 50mg/L)，28℃，250rpm振荡培养过夜； 

2)取2mL菌液，加入50mL YEB液体培养基(含Rif 50mg/L)中，28℃，250rpm振荡培养至OD₆₀₀≈0.6； 

3)将菌液转至50mL无菌离心管中，冰浴30min，5000×g离心5min； 

4)弃上清，沉淀用2mL 20mM CaCl₂重浮，每份100μL分装到1.5mL离心管中，液氮中保存备用。 

2.重组质粒DNA转入农杆菌 

1)将约1μg的pBI 121-hin质粒DNA分别加入到100μL EHA105感受态细胞中，混匀，冰浴5min； 

2)将离心管置液氮中冷冻8min，迅速转至37℃水浴中温浴5min； 

3)加入1mL YEB液体培养基，在28℃摇床上250rpm复苏4～5h； 

4)取适量菌液涂布到含利福平(Rif)50mg/L和卡那霉素(Kan)100mg/L的YEB固体培养基上，置28℃培养24～48h。 

3.农杆菌的质粒的提取 

1)挑取菌落于含利福平(Rif)50mg/L和卡那霉素(Kan)100mg/L的YEB液体培养基中(YEB：胰蛋白胨5g/L，酵母提取物1g/L，蔗糖5g/L，硫酸镁0.5g/L)，28℃，250rpm振荡培养20h； 

2)取1.5mL菌液离心后，弃上清，用STE溶液(Tris-HCI 10mM pH 8.0，NaCl 10mM，EDTA 10mM pH 8.0)洗涤2次，弃上清，加入预冷的溶液I(50mM葡萄糖，25mM Tris-HClpH8.0，10mM EDTA pH 8.0，RNase A 100μg/mL)300μL，用移液器反复抽吸混匀，室温静置10min； 

3)加入新鲜配置的溶液II(0.2M NaOH，1％SDS)600μL，上下颠倒几次混匀； 

4)加入预冷的溶液III(5M乙酸钾pH 5.2，冰醋酸11.5mL，加水至100mL)450μL，充分混匀，冰浴5min，4℃12000×g离心5min，取上清用0.6倍体积的异丙醇沉淀； 

5)沉淀加入50μL TE(Tris-HCl 10mmol/L，1mmol/LEDTA，pH 8.0)溶解后，经PCR、Bam HI、Sac I双酶切验证。 

4.油菜无菌苗的准备及农杆菌介导的HIN蛋白基因(DR1372)遗传转化 

1)油菜无菌苗的培养 

甘蓝型油菜(Brassica napus L.)(84100-18)种子在超净工作台上用灭菌水浸泡10min，10％的NaClO灭菌12min，再用0.1％的升汞溶液消毒7-8min，用灭菌水洗3-5遍，并把灭菌的油菜种子均匀地摆放在无激素的预培养基上(7.5％琼脂)。光照培养，4-5 d龄油菜幼苗最适于遗传转化。 

2)预培养 

用75％的酒精和高温消毒灭菌的剪刀剪掉子叶和生长点，剪取油菜无菌苗紧邻生长点下约0.5cm长的下胚轴，置于预培养基(MS+6-BA 2mg/L+2，4-D 1mg/L+AgNO₃ 2.5 mg/L+AS 19.62mg/L)上，光照预培养2d。 

3)农杆菌的培养 

在50mL LB液体培养基(含卡那霉素100mg/L、利福平50mg/L)中加入0.1mLhin-EHA 105菌液，28℃下220rpm振荡培养16h左右，室温下4000×g离心10min，弃上清液，菌体用灭菌的MS液体培养基(含AS 100μmol/L)悬浮，稀释到原体积的5-20倍，在28℃下220rpm振荡培养1h，使菌液的OD₆₀₀≈0.5。 

4)共培养 

把预培养2d的下胚轴放入菌液中浸染1min，用药勺捞出下胚轴，放在灭菌的吸水纸上，吸干下胚轴上的多余菌液，再放到覆盖有灭菌滤纸的预培养基上，用封口膜封好培养皿，25℃左右，于暗处共培养约2d(暗培养)。 

5)诱导培养 

把共培养2d的下胚轴放到诱导培养基(MS+6-BA 2mg/L+AgNO₃ 2.5mg/L)上，用封口膜封好培养皿，25℃左右光照培养，每2周继代1次，直至长出膨大的愈伤组织。 

6)选择培养 

把膨大的愈伤组织转移到筛选培养基(MS+6-BA 2mg/L+AgNO₃ 2.5mg/L+Kan 100mg/L)上，用封口膜封好培养皿，25℃左右光照培养，每2周继代1次，直至长出苗。 

7)生根培养 

当幼芽长到1-2cm高时，把它们从愈伤组织上分离，转移到生根培养基上(1/2MS+NAA 0.5mg/L+Kan 25mg/L)进行生根培养。在抗生素筛选条件下，约87％的芽在2周后形成根。 

8)炼苗和移栽 

生根后的幼苗长到5-6cm高时，半敞开培养瓶盖子，进行炼苗；待幼苗适应外界环境以后，转移到室内灭菌的蛭石中栽种培养，并用1/2MS培养液浇灌。当幼苗生长至7-9cm时，将幼苗移植到泥土中生长，然后再进行下一步实验。 

(二)含HIN蛋白基因(DR1372)序列转基因油菜的耐盐性鉴定实验 

1、实验目的 

鉴于该核苷酸序列已被证明在大肠杆菌中对盐胁迫具有抗性，进一步对转基因植株进行耐盐性鉴定。 

2、实验方法 

采用不同的NaCl浓度(0、50、100、150、250和350mmol.L^-1NaCl)分别对转基因油菜植株和非转基因油菜植株进行生长情况的观察。 

3、实验结果 

在没有NaCl处理的情况下，转基因油菜和非转基因油菜的生长状况没有明显的差异； 

在添加50mmol.L^-1NaCl的情况下，非转基因油菜仍然能保持生长，但生长的速率比转基因油菜要缓慢一些，表明低盐条件下，野生型植株生长已明显受到抑制； 

当NaCl的浓度增加到100和150mmol.L^-1时，非转基因的油菜叶片最初变黄、接着叶片逐渐萎蔫，20d后全部死亡； 

当NaCl浓度为250mmol.L^-1时，非转基因的油菜叶片迅速发黄、叶片萎焉，幼叶几乎停止生长，并向叶背面翻卷，大约在10d后死亡； 

当NaCl浓度增加到350mmol.L^-1，非转基因油菜苗均在1-2d内开始发黄，4-5d后几乎全部死亡，而转基因油菜均能够存活4周以上。从图5可知转基因油菜可在350mmol.L^-1浓度的NaCl培养基上正常生长，非转基因油菜在350mmol.L^-1浓度的NaCl培养基上干枯死亡。结果证明，该基因对盐的胁迫确有抗性。 

而在上述各种NaCl浓度下，转入HIN蛋白基因(DR1372)的油菜均能正常生长。 

上述实验结果见表1： 

表1 转基因油菜和非转基因油菜对盐胁迫的比较 

4、实验结论 

上述结果表明，所克隆的HIN蛋白基因(DR1372)的功能与植物对盐的耐受性有关，植株能最大耐受350mmol.L^-1浓度的NaCl。