一种抗炭疽PA抗原的单克隆抗体及其应用

摘要

本发明公开了一种具有人源化、嵌合和鼠源化形式的抗炭疽PA抗原的单克隆抗体，以及所述抗体在制备炭疽治疗药物中的应用。本发明公开的抗体具有特异的抗原结合性、优异的毒素中和活性以及良好的动物保护功能。

说明书

技术领域

本发明涉及抗炭疽单抗的基因和基因编码的多肽，以及所述基因和 多肽在制备炭疽治疗药物中的应用。

背景技术

炭疽是由炭疽芽胞杆菌(Bacillus Anthrax)引起的人畜共患重大烈性 传染病。在世界范围内具有广泛的分布。根据感染途径不同，人类炭疽 分为皮肤炭疽、胃肠炭疽和吸入性炭疽三种原发类型。在我国，肺炭疽 因为病死率高而作为I类传染病进行管理。炭疽芽孢杆菌包含两个主要的 毒力因子：以γ键相联结的聚-D-谷氨酰荚膜(PGA)和由三种蛋白组分 构成的炭疽毒素。其中荚膜能阻止细菌被宿主免疫细胞吞噬，而毒素是 造成宿主损伤和死亡的主要原因。炭疽毒素由细菌质粒POX1编码，包 括三种蛋白质成分：保护性抗原(Protective antigen，PA)、致死因子(Lethal  factor，LF)和水肿因子(Edema factor，EF)。其中PA能诱导机体的保护 性免疫，是目前唯一获美国食品药品监督管理局批准的人用炭疽吸附疫 苗(anthrax vaccine absorbed，AVA)的主要免疫活性成分。LF具有金属 依赖的蛋白酶活性，能够分解MAPKK(mitogen-activated protein kinase  kinase，有丝分裂原激活蛋白激酶激酶)并使巨噬细胞溶解；EF具有钙 调蛋白依赖的腺苷酸环化酶活性，可使靶细胞内环磷酸腺苷浓度升。致 宿主细胞内信号通路损伤，防御能力下降，打破体液平衡导致水肿。实 验证实，炭疽毒素是一种AB(active-binding)的模式。PA是复合物中的 “B”，与细胞膜上的炭疽毒素受体(anthrax toxin receptor，ATR)——肿瘤 肉皮细胞标志8(TEM8)或2型毛细血管形成蛋白(CMG2)结合，由 位于细胞膜上的Furin蛋白酶切除其氨基端20kD片段PA20，余下的63kD 片段(PA63)发生寡聚化，在膜上形成七聚体((PA63)₇)。LF和EF是“A”， 能够结合七聚体形成的复合物通过受体介导的内吞进入细胞。在内吞小 体酸性pH的环境下，PA七聚体发生构象改变，形成一个管道，使EF 和LF进入胞液，分别发挥毒性作用。这三个蛋白本身都是无毒的，但 PA和LF的混合物称为致死毒素(Lethal toxin，LT)，可以导致实验动物 的致死性休克。PA和EF的混合物称为水肿毒素(Edema toxin，ET)，在 注射处可引起水肿。

炭疽的医学防护措施主要有预防和治疗二大方面。目前有效的预防 措施主要是接种炭疽疫苗，接触前1～2个月进行预防性接种，能为人员 提供免疫防护。有效的治疗措施主要有二大类：一类是炭疽杆菌的抑菌 剂和杀菌剂，其中包括抗菌素和噬菌体的溶菌成分；另一类是依据炭疽 病理模型设计的毒素抑制剂，主要包括炭疽毒素中和抗体、可溶性受体、 毒素突变体和小分子拮抗剂。

目前炭疽的治疗主要依靠抗菌素，多种抗菌素对炭疽有效，但如出 现以下情况，临床上往往不能奏效。

1、未能及时服用抗菌素：抗菌素一般需要在机体接触炭疽芽孢后的 48小时内使用，即繁殖体阶段使用，可以有效治疗。但炭疽感染的潜伏 期可以持续数小时甚至几天，这一阶段的症状表现类似流感，易误诊， 错过最佳治疗时机；

2、人体产生耐药性：抗菌素滥用是目前严重的世界公共卫生问题， 一些个体对许多抗菌素已产生抗药性，使得抗菌素治疗无效；

3、炭疽杆菌人为改构：将抗菌素抗性基因导入炭疽杆菌，使外用抗 菌素失效，这在现今基因操作技术上已完全可能。

抗菌素对吸入性炭疽的治疗虽然有效，但必须在感染初期立即使用， 抗菌素只能杀死人体组织内的部分炭疽热孢子和细菌，却不能抵抗孢子 和细菌在体内产生的大量毒素，而在感染晚期由于毒素的大量产生，仍 会导致患者死亡。目前国外的研究主要集中在发现能抵抗炭疽毒素的药 物方面，包括中和单抗、可溶性受体、PA突变体和小分子抑制剂等。中 和单抗因为具有保护性高，半衰期长，性质稳定等优点，成为目前最有 前景的炭疽毒素抑制剂。不管是抗菌素还是中和单抗，单独用药均存在 不足，设想在特殊情况下，联合应用抗菌素和中和性单抗可以相互弥补， 最大可能的发挥治疗作用。目前单抗和抗菌素联合用药处于临床研究阶 段。Pharmathene公司2009年开展的环丙沙星和Valortim(单抗)以及 Doxycycline和Valortim(单抗)联合用药的1期临床试验。

国内外的研究发现，抗LF/EF抗体能阻断LT/ET发挥活性，保护动物抵 抗炭疽毒素或者炭疽芽孢的攻击。但是无论是被动免疫还是治疗，效果 均不及抗PA抗体。而抗PA中和性抗体的作用要比针对炭疽毒素其他组分 的中和性抗体更加重要。①在感染初期，因荚膜表面有PA的存在，抗PA 抗体能与芽孢结合，增强巨噬细胞的吞噬作用，抑制出芽或通过氧化杀 死正在出芽的芽孢，因此，抗PA抗体具有抗芽孢的活性。②芽孢被巨噬 细胞吞噬后，导致巨噬细胞裂解，释放繁殖体，并伴有一定量的PA，LF 及EF的分泌表达，蛋白酶水解PA，装配成七聚体，结合LF和EF后内吞入 细胞发挥毒素作用。抗PA抗体可以通过抑制PA装配或与细胞结合来发挥 作用。

国内外的研究表明，在暴露于炭疽芽孢之前使用抗PA抗体，能够起 到预防炭疽感染保护机体的作用。而且，在攻毒后一定时间内给药(24～ 48h)仍能够起到保护作用，即使是在出现体征(如休克)后给药也可以 起到一定的治疗作用。已经有多家公司或研究机构进行抗炭疽抗体的研 究，其中有4家宣布完成I期临床研究(3家重组，1家为血液提取制品)， 2家公司正在进行I期临床(1家重组，1家血液提取的)， (www.clinicaltrial.gov)，多家公司正在进行临床前研究。

中国专利200480017547.7公开了一种抗炭疽PA抗原的单克隆抗体 (5E8)，但是该单抗在动物实验中，未能表现出良好的保护效果，因此 距离药物开发还具有较大的距离。中国专利200610165844.7也公开了一 种抗炭疽PA抗原的单克隆抗体(5E1)，但是发明人研究发现，在细胞水 平上，5E1与PA的结合力偏弱，不能用于以后的药物代谢动力学研究。

因此本发明的目的就是提供具有更高的亲合力和良好保护效果，人 源化程度更高的抗炭疽PA毒素的单克隆抗体。

发明内容

本发明通过单克隆抗体技术筛选到了对炭疽PA抗原具有高度亲合 力的单克隆抗体，并获取了赋予所述抗体优异特性的重链和轻链可变区 的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸和核苷酸序列，并对所述抗体的重 链和轻链恒定区以及可变区FR1-4区进行了人源化改造，最终获得了具 有特异的抗原结合性、优异的毒素中和活性以及良好的动物保护功能。

本发明首先公开了一种抗炭疽PA抗原的单克隆抗体，所述单克隆抗 体的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列如SEQ ID NO 2第45-54、69-87、120-129位氨基酸序列所示，在本发明中，同时以SEQ  ID NO12、14和16分别表示重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区的 氨基酸序列；轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列如 SEQ ID NO18第46-55、71-77、110-118位氨基酸序列所示，在本发明中， 同时以SEQ ID NO28、30、32分别表示轻链可变区的CDR1、CDR2和 CDR3区的氨基酸序列。

在本发明的一个优选技术方案中，所述单克隆抗体重链可变区的 FR1-FR4区氨基酸序列分别如SEQ ID NO4、6、8、10所示，重链恒定 区的氨基酸序列如SEQ ID NO34所示；轻链可变区的FR1-FR4区氨基 酸序列分别如SEQ ID NO20、22、24、26所示，轻链恒定区的氨基酸序 列如SEQ ID NO36所示。该抗体的重链可变区及轻链可变区的FR1-FR4 区以及重链恒定区和轻链恒定区均是经过人源化改造的序列，而CDR区 未进行人源化改造，故称之为人源化抗体。

所述单克隆抗体重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO 2第1-140位 氨基酸序列所示，重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO 34所示；轻链 可变区氨基酸序列如SEQ ID NO 18第1-128位氨基酸序列所示，轻链恒 定区的氨基酸序列如SEQ ID NO 36所示。该抗体的重链恒定区和轻链恒 定区是经过人源化改造的序列，而重链可变区及轻链可变区未进行人源 化改造，故称之为嵌合抗体。

在本发明的又一个优选技术方案中，所述单克隆抗体重链全长氨基 酸序列如SEQ ID NO 2所示，轻链全长氨基酸序列如SEQ ID NO 18所示。 该抗体的重链可变区和恒定区，轻链可变区和恒定区未进行人源化改造， 故称之为鼠源抗体。

本发明还提供了编码上述单克隆抗体重链和轻链的核酸，在一个优 选的技术方案中，所述人源化抗体的重链的可变区的CDR1、CDR2和 CDR3区的碱基编码序列分别如SEQ ID NO 1第133-162、184-255、 358-387位核苷酸所示，在本发明中，同时以SEQ ID NO11、13和15分 别表示重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区的碱基编码序列；FR1-FR4 区碱基序列分别如SEQ ID NO3、5、7、9所示，重链恒定区的碱基编码 序列如SEQ ID NO33所示；所述人源化抗体轻链的可变区的CDR1、 CDR2和CDR3区的碱基编码序列如SEQ ID NO3第136-165、211-231、 328-354所示，在本发明中，同时以SEQ ID NO27、29和31分别表示轻 链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区的碱基编码序列；FR1-FR4区碱基 序列分别如SEQ ID NO19、21、23、25所示，轻链恒定区的碱基编码序 列如SEQ ID NO35所示。

在另一个优选技术方案中，所述嵌合抗体的重链可变区的碱基编码 序列如SEQ ID NO1第1-420位核苷酸所示，重链恒定区的碱基编码序 列如SEQ ID NO33所示；所述轻链可变区的碱基编码序列如SEQ ID NO 3第1-384位核苷酸所示，轻链恒定区的碱基编码序列如SEQ ID NO35 所示。

在又一个优选技术方案中，所述鼠源抗体重链的碱基编码序列如 SEQ ID NO1所示，所述轻链的碱基编码序列如SEQ ID NO 17所示。

本发明还提供了含有上述编码单克隆抗体重链或轻链的核苷酸编码 的表达载体。

在一个优选的技术方案中，所述载体为pMH3S分泌型真核表达载 体。

本发明还提供了一种含有上述表达载体的宿主细胞。

在一个优选的技术方案中，所述细胞为CHO-S细胞。

本发明还提供了上述任一单克隆抗体在制备炭疽治疗药物中的应 用。所述单克隆抗体可以作为药物分子特异性识别和结合炭疽PA抗原， 从而抑制PA装配或与细胞结合来发挥作用，预防炭疽感染或者治疗炭疽 感染性疾病。

本发明还提供了一种药物组合物，所述组合物含有上述任一单克隆 抗体，以及可药用的载体。

本发明还提供了一种含有上述任一单克隆抗体的免疫交联物，其特 征在于，所述单克隆抗体与效应分子连接。所述单克隆抗体在免疫交联 物中起靶向作用，可以将具有特殊生化效应的效应分子递送至炭疽病原 体上，发挥治疗效应，细胞毒素、或者放射性同位素均可以作为效应分 子与上述单克隆抗体形成免疫交联物。

本发明提供的单克隆抗体由于在重链和轻链可变区具有独特的 CDR1-3区序列，使所述抗体对炭疽杆菌具有特异的识别和结合能力。在 ELISA检测PA与单抗的结合活性的实验中，本发明的人源化单抗灵敏度 为8ng/ml，可以用于药物代谢研究。而鼠源单抗的灵敏度为4-8ng/ml。显 示本发明提供的抗炭疽PA抗原的单克隆抗体具有高度特异的PA结合活 性。

本发明提供的单克隆抗体也显示出了优异的毒素中和活性。人源化 抗体的EC₅₀为0.063ug/ml，嵌合抗体的EC₅₀为0.070ug/ml，而中国专利 200610165844.7公开的抗炭疽PA抗原的单克隆抗体5E1的EC₅₀为 0.167ug/ml(EC₅₀值越低保护效果越好)。实验结果证明本发明的单抗较 以前的5E1单抗在细胞水平显示更好的保护效果。

本发明提供的单克隆抗体还显示了在制备炭疽治疗药物中的用途。 在大鼠毒素模型上(PA+LF)抗体的保护效果评价实验中，本发明所提 供的嵌合单抗存活达到83％(5/6)，人源化单抗的存活达到80％(4/5)， 而中国专利200480017547.7所公开的人源单抗组大鼠全部死亡。该实验 显示了本发明提供的单克隆抗体具有良好的动物保护功能，可以应用于 制备炭疽治疗药物。

附图说明

图1人源化抗体重链可变区(V_H)和轻链可变区(V_L)基因克隆的 电泳鉴定图；

图2人IgGl重链恒定区基因(C_H)和人Kappa轻链恒定区基因(C_K) 克隆的电泳鉴定图；

图3人源化抗体重链基因(H)和轻链基因(L)克隆的电泳鉴定图；

图4pMD-H和pMD-L的酶切鉴定结果图；

图5pMH3S的构建流程图；

图6pMH3S-H酶切鉴定结果图；

图7pMH3S-L酶切鉴定结果图；

图8pMH3S-H的构建流程图；

图9pMH3S-L的构建流程图；

图10纯化的人源化抗体的SDS-PAGE检测结果图；

图11单克隆抗体对PA抗原敏感性的ELISA检测图；

图12体外细胞毒素模型上三种类型抗体的EC₅₀曲线图；

图13大鼠毒素模型上三种类型抗体的动物存活曲线图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将 会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明权 利要求所限定的范围构成进一步的限定。

实施例1.鼠源单抗基因的克隆

1.1鼠源单抗的制备

以重组炭疽保护性抗原为免疫原，采用常规单克隆抗体制备方法获得 的1株高亲和力、高特异性的鼠源性抗PA单抗5E11杂交瘤细胞株，分 泌的抗体分子亚型为IgGl，轻链为Kappa亚型。

1.2单抗5E11轻重链基因的克隆

单抗由可变区和恒定区构成，因为鼠单抗的可变区基因变异大，而 恒定区的基因序列非常保守，因此采用5′-RACE方法进行克隆，其基本 原理是在未知序列的5′端添加引物序列，与3′端的保守序列进行PCR扩 增。获得的鼠源单抗基因可用于构建表达载体，然后转染哺乳动物细胞， 获得稳定表达的细胞株，最终获得表达产物，以便与哺乳动物细胞表达 的嵌合抗体和人源化抗体进行功能比较研究。

操作步骤如下包括A：总RNA的提取；B：RNA的去磷酸化；C： 去帽子反应；D：5′-RACE适配子连接；E：反转录反应；F：外引物 PCR反应；G：内引物反应；H：琼脂糖凝胶电泳；I：切胶回收特异性 PCR产物连接到T载体上进行DNA序列测定；J：BLAST检索分析序列 的正确。具体参考说明书(TaKaRa，D315)。简单描述如下：

A总RNA的提取：取处于对数生长期的5E11杂交瘤细胞(5×10⁶)， 采用Trizol一步法提取总RNA，取少量进行紫外分光光度计定量及1％ 琼脂糖凝胶电泳检测。

B RNA的去磷酸化：使用CIAP(TaKaRa，D315)，反应体系50ul， 包括总RNA2ul(1ug/ul)，NRAse抑制剂1ul(40U/UL)，10×缓冲液5ul， CIAP0.6ul，(16U/ul)，50℃反应1小时。

C去帽子反应：CIAP处理过的RNA7ul，NRAse抑制剂1ul(40U/ul)， 10×缓冲液1ul，TAP1ul，(0.5U/ul)，37℃反应1小时。

D5′-RACE适配子连接：连接体系40ul，依次加入CIAP/TAP处理 过的RNA5ul，5′RACE适配子(15uM)1ul，NRAse的水4ul；65℃反 应5分钟后，冰上放置2分钟，然后依次加入NRAse抑制剂1ul(40U/UL)， 5×连接缓冲液8ul，40％的PEG600020ul，T4RNA连接酶1ul，16℃反 应1小时。

E反转录反应：反应体系包括连接后的RNA为6ul，随机引物0.5ul， 55×缓冲液2ul，dNTP1ul，NRAse抑制剂0.25ul(40U/UL)，MMLV0.25 ul(200U/ul)。混匀，30℃10min，50℃60min，5℃5min。反应产物置于 -20℃备用。

F外引物PCR反应：反应体系为Ex Taq聚合酶(5U/μL)0.25μL； 10×Ex Taq Buffer5μL；dNTP Mixture(各2.5mM)4μL；模板cDNA2.5μL； 5′RACE外引物2ul，特异性外引物2ul，加灭菌蒸馏水至50μL，混匀， 瞬时离心后，置PCR仪上反应。反应条件：94℃预变性3分钟，接着 94℃30s，52℃30s，72℃1min，35个循环，最后72℃延伸7min。

G内引物反应：除模板为外引物反应液，引物使用内引物外，其余 反应液体同外引物PCR反应。

H琼脂糖凝胶电泳：扩增产物H和L经琼脂糖凝胶(1％)电泳后， 切胶分离靶片段。通过凝胶纯化试剂盒(BIO BASIC INC)回收纯化后， 凝胶电泳鉴定。

I切胶回收特异性PCR产物连接到T载体上进行DNA序列测定： 将回收后的PCR产物连入pMD18-T载体。连接反应体系为：pMD18-T 载体1ul，PCR产物凝胶纯化重链(或轻链)3ul，去离子水1ul，连接缓冲液 5ul，混匀后16℃过夜，转化大肠杆菌DH5α，筛选重组克隆，然后采用 通用测序引物测序。获得的质粒命名为pMD-mouse-H和pMD-mouse-L。

测序后，对获得的基因序列用Vector NTI软件进行分析，鼠源单抗 重链全长为1392个碱基，其中1-420位碱基编码可变区，421-1392位碱 基编码恒定区。可变区包括4个框架区(Fragment region，FR)和3个 CDR(Complementary determinant region，CDR)，其中1-57位碱基编码信 号肽，58-129位碱基编码FR1，133-162碱基编码CDR1；163-183碱基 编码FR2，205-261碱基编码CDR2；256-357碱基编码FR3，358-387碱 基编碱基码CDR3；388-420碱基编码FR4。

鼠源单抗轻链全长为708个碱基，包括1-384位碱基编码可变区和 385-708位碱基编码的恒定区。对可变区进行注释，1-66位碱基编码信号 肽，67-135位碱基编码FR1，136-165碱基编码CDR1；166-210位碱基 编码FR2，211-231位碱基编码CDR2；232-327碱基编码FR3；328-354 碱基编码CDR3；355-384碱基编码FR4。

实施例2.嵌合抗体基因的克隆

鼠源抗体相对于人体，属于异源蛋白应用于人体具有明显的抗宿主 抗体反应，因此常采用人源化改造的策略降低免疫原性，简单方便的方 法是进行恒定区的人源化，用人的恒定区替换鼠的恒定区，即构建嵌合 抗体。

2.1人恒定区的密码子优化及全基因合成

采用优化的密码子可以提高蛋白的表达，首先采用软件对人IgGl重 链恒定区(GenBank登录号：Z17370)和人Kappa轻链恒定区基因(GenBank 登录号：GI：341915149)按照鼠密码子偏好进行优化，优化后的两条基因 序列(基因序列分别为SEQ ID NO33和SEQ ID NO35，委托博迈德进行 全基因合成，并克隆到T载体上(分别命名为T-OPTI-hu-IgGl-C_H和 T-OPTI-hu-C_KAPPA)进行序列测定。

2.2嵌合抗体基因全分子的克隆

根据扩增获得基因序列和密码子优化后恒定区基因序列，设计引物， 5E11-V_H-up：5′-GAATTCTGAGGTGAGGCTGGTGGAATCTGG-3′； 5E11-V_H-

lower：5-′TTGGTGCTGGCGGCCAGGCTTGAGGAGACTGTGAGAGTGG -3′；Op-

IgGl-up：5-′AGCCTGGCCGCCAGCACCAA-3′；Op-IgGl-down：5- ′GCGGCCGCTTACTTGCCGGGGCTCAGGCTCAG-3′。其中， 5E11-V_H-UP和5E11-V_H-lower用于扩增可变区，Op-IgGl-up和 Op-IgGl-down用于扩增人IgGl重链恒定区。5E11-V_H-up和 Op-IgGl-down用于扩增嵌合抗体全长重链。

轻链引物：

5E11-V_L-up：5′-GAATTCTGAAATCGTTCTCACCCAGTCTCC-3′； 5E11-V_L-lower：5-

′GATGAACACGCTGGGGGCGGCCACGGTTTTTATTTCCAACTTTGTC CCC-3′；Op-kappa-up：5-′ACCGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATC-3′； Op-kappa-down：5-′GCGGCCGCTTAGCACTCGCCCCTGTTGAAGCTCT TG-3′。其中，5E11-V_L-up和5E11-V_L-lower用于扩增轻链可变区，Op- kappa-up和Op-kappa-down用于扩增人Kappa亚型轻链恒定区。 5E11-V_L-up和Op-kappa-down用于扩增轻链全长。

GAATTC为Eco RI的酶切位点，GCGGCCGC为Not I的酶切位点。

PCR反应体系：50μl反应体系中含有：10×buffer5ul；dNTP(0.2mM) 4ul；Pyrobest Taq酶0.25ul；上下游引物各0.5ul(重链恒定区Op-IgGl-up 和Op-IgGl-down，轻链恒定区用Op-kappa-up和Op-kappa-down)；轻 重链可变区基因的扩增使用模板为pMD-mouse-H和pMD-mouse-L，恒 定区的扩增使用模板为T-OPTI-hu-IgGl-C_H和T-OPTI-hu-C_Kappa，各取 0.1ul质粒作为模板；用纯水补足到50μl。PCR反应参数：预变性94℃ 5min；94℃30s，58℃30s，72℃1min20s；25循环。最后72℃5min。

PCR产物回收纯化：PCR反应产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，切胶 并用BBI公司的回收试剂盒回收。

嵌合抗体L、H链基因的扩增：将5E11V_H和人IgGl亚类C_H基因的PCR 扩增产物50ul进行纯化，回收后备用。取纯化后产物各1ul为模板，以扩 增嵌合抗体重链基因；将5E11V_L和人KAPPA型基因的PCR扩增产物50ul 进行纯化，回收后备用进行嵌合抗体L链基因的扩增。PCR反应参数：94℃ 预变性3min，接着扩增25个循环，每个循环包括94℃变性25s，50℃复 性25s，72℃延伸60s，最后72℃延伸5min。

嵌合抗体L、H链基因PCR产物连接到T载体上进行DNA序列测 定：将回收后的PCR产物连入pMD18-T载体。连接反应体系为：pMD18-T 载体1ul，PCR产物凝胶纯化重链(或轻链)3ul，去离子水1ul，连接缓冲液 5ul，混匀后16℃过夜，转化大肠杆菌DH5α，筛选重组克隆，然后采用 通用测序引物测序。获得的质粒命名为pMD-chimeric-H和pMD-chimeric -L。

实施例3.人源化单抗基因的克隆

3.1人源化单抗基因设计

嵌合抗体即用人的恒定区基因替换掉鼠的恒定区基因，相比鼠源抗 体人源化程度达到75％。进一步人源化的方法是对可变区进行人源化。 基本的策略是保持互补决定区(CDR)氨基酸系列不变，将框架区氨基 酸序列依次检索人源的抗体库，获得最大同源性的序列，将相应的位点 进行突变。

重链可变区的FR1，FR2和FR4分别与gb：AAS85990.1， gb：ADW08153.1，emb：CAK50646.1具有100％的同源性，不改变氨基酸序 列。FR3与emb：CAR62720.1具有88％的同源性，在4个氨基酸位置存在差 异，进行定点突变。共改变4个氨基酸。

轻链可变区的FR1与emb：CAA80562.1具有74％的同源性，突变6个氨 基酸。FR2与gb：ABB54406.1具有80％的同源性，有3个氨基酸的差异，改 变其中的2个氨基酸，与CDR相邻的1个氨基酸未进行改变。FR3与gb： AAQ21830.1具有84％的同源性，对差异的3个氨基酸进行突变。共进行11 个氨基酸突变。

3.2抗PA单抗人源化可变区基因的化学合成

设计好的可变区人源化序列委托博迈德生物技术公司人工合成全 基因，并克隆到T载体上，分别命名为pMD-humanized-V_H和pMD- humanized-V_L，测序正确后进行后续的研究。

3.3人源化全分子基因的克隆

根据人源化后的轻重链可变区基因序列和密码子优化后人恒定区基 因序列，设计引物，因为突变的氨基酸位于内部所以使用的引物同嵌合 抗体的构建。

重链引物：

5E11-V_H-up：5′-GAATTCTGAGGTGAGGCTGGTGGAATCTGG-3′；

5E11-V_H-lower：5-′TTGGTGCTGGCGGCCAGGCTTGAGGAGACTGTGA GAGTGG-3′；

Op-IgGl-up：5-′AGCCTGGCCGCCAGCACCAA-3′；

Op-IgGl-down：5-′GCGGCCGCTTACTTGCCGGGGCTCAGGCTCAG-3′。

其中，5E11-V_H-UP和5E11-V_H-lower用于扩增可变区，Op-IgGl-up和 Op-IgGl-down用于扩增人IgGl重链恒定区，5E11-V_H-up和 Op-IgGl-down用于扩增嵌合抗体全长重链。

轻链引物：

5E11-V_L-up：5′-GAATTCTGAAATCGTTCTCACCCAGTCTCC-3′；

5E11-V_L-lower：5-′GATGAACACGCTGGGGGCGGCCACGGTTTTTATTT CCAACTTTGTCCCC-3′；

Op-kappa-up：5-′ACCGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATC-3′；

Op-kappa-down：5-′GCGGCCGCTTAGCACTCGCCCCTGTTGAAGCT CTTG-3′。

其中，5E11-V_L-up和5E11-V_L-lower用于扩增轻链可变区，Op- kappa-up和Op-kappa-down用于扩增人Kappa亚型轻链恒定区， 5E11-V_L-up和Op-kappa-down用于扩增轻链全长。

GAATTC为ECo RI的酶切位点，GCGGCCGC为Not I的酶切位点。

50μl PCR反应体系含有：10×buffer5ul；dNTP(0.2mM)4ul；Pyrobest Taq酶0.25ul；上下游引物各0.5ul(重链恒定区Op-IgGl-up和 Op-IgGl-down，轻链恒定区用Op-kappa-up和Op-kappa-down)；轻重链 可变区基因的扩增使用模板为pMD-mouse-H和pMD-mouse-L，恒定区 的扩增使用模板为T-OPTI-hu-IgGl-C_H和T-OPTI-hu-C_KAPPA，各取0.1ul 质粒作为模板；用纯水补足到50μl。PCR反应参数：预变性94℃5min； 94℃30s，58℃30s，72℃1min20s；25循环。最后72℃5min。

PCR产物回收纯化：PCR反应产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，切胶 并用BBI公司的回收试剂盒回收。电泳结果见(见附图1，图2)。图1中 M泳道为分子量标记，1泳道和2泳道分别为人源化的V_H和人源化的V_K片 段。图2中，M泳道为分子量标记，1泳道和2泳道分别为C_H和C_K片段。

人源化抗体L、H链基因的扩增：将5E11V_H和人IgGl亚类C_H基因的 PCR扩增产物50ul进行纯化，回收后备用。取纯化后产物各1ul为模板， 以扩增人源化抗体重链基因；将5E11V_L和人KAPPA型基因的PCR扩增产 物50ul进行纯化，回收后备用进行人源化抗体L链基因的扩增。PCR反应 参数：94℃预变性3min，接着扩增25个循环，每个循环包括94℃变性25s， 50℃复性25s，72℃延伸60s，最后72℃延伸5min。PCR电泳结果(见附 图3)。图3中，M泳道为分子量标记，1泳道和2泳道分别为人源化的L和 人源化的H片段。

人源化抗体L、H链基因PCR产物连接到T载体上进行DNA序列 测定：将回收后的PCR产物连入pMD18-T载体。连接反应体系为： pMD18-T载体1ul，PCR产物凝胶纯化重链(或轻链)3ul，去离子水1ul， 连接缓冲液5ul，混匀后16℃过夜，转化大肠杆菌DH5α，筛选重组克 隆，然后采用通用测序引物测序。获得的质粒命名为pMD-humanized-H 和pMD-humanized-L。酶切鉴定结果见图4，M泳道为分子量标记，1泳 道和2泳道分别为pMD-humanized-H单酶切(Not I)和双酶切(Eco RI/Not I)；3泳道和4泳道分别为pMD-humanized-L单酶切(Not I)和 双酶切(Eco RI/Not I)。

实施例4.鼠单抗，人-鼠嵌合抗体和人源化抗体基因表达质粒的构建

4.1构建策略

不管是轻链还是重链，在5′端设计引物时引入Eco R I的酶切位点，在 3′端引入Not I酶切位点，克隆到pMD-T载体上，经过DNA序列测定正确 后，用Eco R I/Not I酶切pMD-mouse-H(pMD-Chimeric-H或pMD- humanized-H)得到约1.4kb的片段，亚克隆到pMH3S的相应位点，得到鼠 源抗体的重链表达质粒pMH3S-mouse-H(嵌合抗体重链表达质粒 pMH3S-Chimeric-H或人源化抗体的重链表达质粒pMH3S-humanized-H)； 同样的方法，用EcoRI/Not1酶切pMD-mouse-L(pMD-Chimeric-L或pMD- humanized-L)得到约0.7片段，亚克隆到pMH3S的相应位点，得到鼠源抗体 轻链的表达质粒pMH3S-mouse-L(嵌合抗体轻链的表达质粒 pMH3S-Chimeric-L或人源化抗体轻链的表达质粒pMH3S-humanized-L)。

4.2pMH3S分泌型真核表达载体的构建

以常用的真核表达载体pcDNA3.1(+)(Invitrogen公司，产品目录号 V790-20)为基本骨架，将Kozak序列(GCCGCCACCATGA/G)和修改 后的人组织纤溶酶原信号肽序列融合基因(见SEQ ID NO：3)克隆到表达 载体的多克隆位点区，构建成pMH3S分泌型真核表达载体。修改后的基 因中，通过将融合基因核苷酸序列5′端第70-78位的TCGAACAGC(编码 氨基酸S-N-S)，突变成TCGAATTCT(编码氨基酸S-N-S)，在保证氨基 酸序列不改变的前提下引入Eco RI的酶切位点(GAATTC)方便目的基因 直接通过Eco RI位点连接到pMH3S载体上，信号肽与目的基因之间没有 多余的氨基酸，目的蛋白可以分泌到上清中，方便下游的纯化。

构建过程：

1)首先人工合成Kozak序列(CCACCATG(A/G))和修改后的人 组织纤溶酶原信号肽序列的融合基因；

2)将pcDNA3.1(+)用EcoRI酶切后，用Klenow酶(TaKaRa，产品 目录号：D2140)补平，然后用小肠碱性磷酸酶CIP(NEB公司，产品目 录号：M0290V)去磷酸化避免自连；

3)将合成的基因和酶切后的载体用T4DNA连接酶(NEB公司，产 品目录号：M0202V)进行连接；

4)转化大肠杆菌DH5a感受态，挑选具有氨苄青霉素抗性的克隆；

5)用OMEGA质粒提取试剂盒提取质粒，并进行DNA序列测定，测 序鉴定后获得预期的pMH3S载体(pMH3S的构建流程见图5。)

4.3重链表达质粒的构建

用EcoRI和NotI(NEB公司)双酶切pMD-mouse-H(pMD-chimereic-H 或pMD-humanized-H)，用胶回收试剂盒(中国，BBI公司)回收H片段(长 度约1.4kb)连接到用EcoRI和Not I双酶切的pMH3S上，转化大肠杆菌 DH5α感受态，在100μg/ml的氨苄青霉素LB平板上培养，挑选抗性克隆进 行PCR检测(PCR条件同实施例1中的步骤(3))，PCR产物电泳检测阳性 后，随机挑选阳性克隆接种到LB培养基中培养过夜，次日用质粒提取试 剂盒(中国，OMEGA公司)提取质粒，对提取的质粒进行双酶切(Eco RI/Not I)鉴定，鉴定结果见图6。图6中，M泳道为分子量标记，1泳道为 质粒pMH3S-H用Not I进行单酶切线性化后的结果，2泳道为EcoRI/NotI双 酶切后的结果。表达载体构建流程见图8。

4.4pMH3S-L质粒的构建

用EcoRI和Not I(NEB公司)酶切pMD-mouse-L(pMD-chimereic-L 或pMD-humanized-L)，用胶回收试剂盒(中国，BBI公司)回收L片段 (长度约0.7kb)连接到用EcoRI和Not I双酶切的pMH3S上，转化大 肠杆菌DH5α感受态，在100μg/ml的氨苄青霉素LB平板上培养，挑选 抗性克隆进行PCR检测(PCR条件同实施例1中的步骤(3))，PCR产 物电泳检测阳性后，随机挑选阳性克隆接种到LB培养基中培养过夜，次 日用质粒提取试剂盒(中国，OMEGA公司)提取质粒，对提取的质粒 进行双酶切(Eco RI/Not I)鉴定，鉴定结果见图7。图7中，M泳道为 分子量标记，1泳道为质粒pMH3S-L用NotI进行单酶切后线性化后的结 果，2泳道为EcoRI/Not I双酶切后的结果。表达载体构建流程见图9。

实施例5.电转及细胞克隆的筛选

从液氮中取CHO-S细胞复苏，在T25方瓶中培养，培养基为 DMEM/F12+10％FBS，置于37℃、5％CO₂细胞培养箱(Forma)中培 养，长满后传入T75方瓶中。在T75方瓶中长满后，加入3ml胰酶消化 30s，吸弃胰酶，用PBS洗细胞两次离心后，取1.5×10⁷细胞用0.5ml PBS (pH7.2)重悬，取10μl鲑精，线性化的表达质粒10μg(轻链质粒 pMH3S-humanized-L3.3μg和的重链质粒pMH3S-humanized-H6.7μg二者 比例为1∶2)，加入到准备好的细胞当中，混匀后加入到预冷的2mm电转 杯中冰浴，用电转仪160V电击。

电转后的细胞分成两份置于直径10cm的塑料培养皿中，分别加入 10ml的含有10％FBS、无双抗的DMEM/F12培养基。置于37℃、5％CO₂ 细胞培养箱中培养。次日换新鲜的10ml的含有10％FBS、无双抗的 DMEM/F12培养基。待细胞长至50～60％满时，加入1.8mg/ml的G418， 隔天换液，洗掉死细胞，G418浓度始终维持在1.8mg/ml，直至细胞不再 死亡，克隆形成。将形成的克隆转移至96孔板中，用含有10％FBS、无 双抗的DMEM/F12培养基，G418浓度为0.6mg/ml，置于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养。检测表达量，筛选高表达的细胞克隆。

实施例6.发酵和纯化

从液氮中取出5E11-hu-1F3工程细胞复苏，在T25方瓶中培养，培养 基为DMEM/F12+10％FBS，长满后传入T75方瓶中，置于5％CO₂细胞培 养箱(Forma)中悬浮培养。

在T75方瓶中长满后，用胰酶消化，换自制悬浮培养基重悬，开始悬 浮培养，每天监测细胞密度及状态，根据细胞密度及状态补加培养基， 不断增加培养体积。当培养体积达到30ml时，将其转入150ml摇瓶中， 摇瓶置于37℃的培养箱内，转动速度为100rpm。继续增加培养体积，使 细胞密度维持在2-3×10⁶/ml。当培养体积达到150ml时，将其转入3L摇瓶 中，摇瓶置于37℃的培养箱内，转动速度为100rpm。继续增加培养体积， 使细胞密度维持在2-4×10⁶/ml。

当培养体积达到4L，将其转入10L的Wave反应器中。温度控制在 36.5℃，10L的Wave反应器的摇速为10转/分。当Wave反应器中的培 养体积达到7L，不再补加细胞基础培养液，根据葡萄糖消耗情况，细胞 采用流加(Fed-batch)方式培养，每日添加浓缩培养基，根据pH值情况 随时补充Na₂CO₃，使pH值维持在7.2左右，并将温度降低至34℃，使 细胞能够持续高密度生长。发酵完毕，使用Mab select sure介质进行纯化， 装填的层析柱体积为40ml，结合容量为30～50mg/ml。平衡缓冲液20 mM PBS，pH7.2；洗涤缓冲液0.1M柠檬酸缓冲液pH4.6；洗脱缓冲液 0.1M柠檬酸缓冲液pH3.8和0.1M柠檬酸缓冲液pH3.6；再生缓冲液0.1M 柠檬酸缓冲液pH3.0。

纯化的5E11-人源化进行非还原SDS-PAGE检测见图10，泳道M显 示低分子量蛋白标准，泳道1显示纯化后的人源化单抗，分子量与预期 相符。

实施例7.ELISA检测PA与单抗的结合活性

重组PA稀释成2μg/ml，100ul/孔包被酶联板，4℃过夜，次日用封 闭液(20mM PB，0.15M NaCl，5％的奶粉)37℃封闭1h后洗板，加入 样品后37℃孵育1h洗板，加入1：1000稀释的HRP标记的羊抗人Fc (Sigma，A0170)(或HRP标记的羊抗鼠，用于检测鼠单抗，Sigma， A3673)，37℃孵育1h后洗板，OPD显色，酶标仪测OD₄₅₀。

ELISA结果比较检测的灵敏度比较见图11：

5E1-人源化大于1ug/ml(即使浓度为1ug/ml时，不能显示是阳性结果， OD₄₅₀值不能达到阴性对照的2.1倍，图11未显示)，不能用于药物代谢 动力学研究；

5E11-人源化单抗灵敏度为4-8ng/ml，可以用于药物代谢研究。

5E11-鼠源单抗的灵敏度为4-8ng/ml。

实施例8.体外细胞保护试验检测抗体对致死毒素的中和活性

J774A.1细胞以10⁵/ml接种于96孔细胞培养板，37℃过夜培养。将用 培养液梯度稀释的待检抗体与100ng/mL PA和100ng/ml LF一起于37℃孵 育1h，细胞长至90％满时吸弃原细胞培养孔中培养液，将孵育1h后的待 测液体加入细胞培养孔中，100μl/孔，37℃孵育3h，加入20μl MTT(5 mg/mL)，37℃孵育30min，吸弃上清，每孔加入100μl盐酸异丙醇，振 荡至沉淀溶解。将无毒素对照孔记为细胞100％存活，无抗体对照孔(rPA 和rLF浓度均为100ng/ml)记为细胞全部死亡。通过酶联仪测OD₅₇₀，结 果通过GraphPad Prism软件来测定EC₅₀(50％ effective concentration半数 有效浓度)。

结果：见图12，对比中国专利200610165844.7公开的人源化单抗5E1， 本发明公开的鼠源单抗5E11，嵌合的5E11和人源化5E11进行毒素中和活 性的EC₅₀进行评价。不同单抗的EC₅₀如下，值越低保护效果越好。

5E1-人源化：0.167ug/ml；

5E11-嵌合：0.070ug/ml；

5E11-人源化：0.063ug/ml。

结论：5E11单抗较以前的5E1单抗在细胞水平显示更好的保护效果。

实施例9.大鼠毒素模型上(PA+LF)抗体的保护效果评价

使用体重200～250克的雄性Fisher344大鼠，其中5E11-嵌合单抗 组6只大鼠，5E11-人源化和5E8-人源单抗组每组5只大鼠，攻毒剂量为 40μgPA+10μgLF/大鼠，先尾静脉注射毒素(注射用生理盐水定容到 300μl)；攻毒后5分钟尾静脉注射5E11-嵌合单抗，5E11-人源化单抗和 5E8-人源单抗，单抗的剂量为320ug(注射用生理盐水定容到300μl)， 观察大鼠存活情况。

结果：见图13，5E11-嵌合单抗组的存活率为83％(5/6)，5E11-人源化 单抗的存活达到80％(4/5)，而5E8-人源单抗组大鼠全部死亡。该实验显 示了本发明提供的单克隆抗体具有良好的动物保护功能，可以应用于制 备炭疽治疗药物。