如意珍宝丸/片在治疗血管性痴呆中的应用

摘要

本发明提供了藏药如意珍宝丸/片在治疗血管性痴呆中的应用，其中所述藏药由如下原料制成：珍珠母、沉香、石灰华、金礞石、红花、螃蟹、丁香、去核的毛诃子、肉豆蔻、豆蔻、余甘子、草果、香旱芹、檀香、黑种草子、降香、荜茇、去核的诃子、高良姜、甘草膏、肉桂、乳香、木香、决明子、水牛角或水牛角浓缩粉、黄葵子、短穗兔耳草、藏木香、人工麝香、人工牛黄或体外培育牛黄。

说明书

技术领域

本发明涉及医药领域，具体涉及藏药如意珍宝丸/片的新用途。

背景技术

血管性痴呆(vascular dementias，VD)，又称为多发梗塞性痴呆，是引起老年 期痴呆的第二大病因，在痴呆中占10％～50％。VD是一个综合征，而不是一个 单一的疾病，不同的血管病理变化均可引起VD症状，包括大、小动脉病变， 弥漫性缺血性白质病变，心脏脱落栓子的栓塞，血液动力学改变，出血，血液 学因素和遗传性疾病等。与VD有关的病理生理机制包括局灶性缺血性损害、 白质病变、其它与缺血有关的因子、功能因素。总之，是长期高血压、动脉硬 化、反复发生腔隙性梗塞、或其他原因的多发性梗塞，导致脑室扩大，皮质萎 缩，使相应的传导束破坏，逐渐出现的皮质下痴呆。

目前，血管性痴呆的诊断标准是采用美国神经病学会《神经病诊断和统计 手册》第四版(DSM-IV)，具体为：(1)发生多方面认知缺陷，表现为以下二者：记 忆缺陷(不能学习新资料或不能回忆所学到的资料)；至少有下列认知障碍之一： 失语、失用(虽然运动功能没有问题，但不能执行动作)、失认(虽然感觉功能没有 问题，但不能认识或识别物体)、执行管理功能的障碍(即计划、组织、安排次序、 抽象等)；(2)以上认知缺陷导致社交或职业功能缺陷，并可发现这些功能明显不 如以前；(3)存在局限性神经系统体征与症状(例如：深腱反射亢进、伸跖反射、 假性球麻痹、步态障碍、某一肢体软弱)；或有提示脑血管疾病的实验室依据(例 如，涉及皮层及白质的多梗塞)并可认为是此障碍的病因；(4)这些缺陷并非由于 谵妄所致。

血管性痴呆为一种多因素疾病，是现今唯一可以防治的痴呆类型，VD诊断 一旦确立即适合开始药物治疗认知症状。临床常用的治疗药物包括脑循环促进 剂、作用于神经递质的药物、神经元保护剂以及中药疗法，其中，中药疗法多 为辨证论治。

脑循环促进剂包括：氢麦角碱(Hydergine，二氢麦角碱，喜得镇，舒脑宁)， 可直接作用于DA和5-HT受体，降低脑血管阻力，增加脑血流量及脑对氧的 利用率，改善突触神经传递功能；阿司匹林(Aspirin)，抗血小板聚集药，广泛 应用于心脑血管病的防治；尼麦角林(Nicergoine，脑通)具有a受体阻滞的扩张 血管作用，增加脑血流量，加强脑细胞的新陈代谢、增加血氧和葡萄糖的利用， 此外，尚有促进多巴胺的代谢、促进脑部蛋白质的合成，抑制血小板聚集和抗 血栓等作用；萘呋胺酯(Naftidrofuryl，克拉瑞啶，脑加强)，是5-HT受体拮抗 剂，通过抗5-HT而减少缺血所致的神经元坏死，易透过血脑屏障可直接扩张脑 血管和外周血管，增加红细胞的变形性和降低血液稠度并能促进细胞代谢，对 细胞缺氧也有保护作用；己酮可可碱(Pentoxifylline)，具有扩张脑及外周血管的 作用，还可能通过影响红细胞的变形性、血小板粘附及血小板聚集性而发挥作 用，临床用于各种脑血管血流障碍性疾病；长春西汀(Vinpocetine)，能增加脑血 流量、改善大脑氧供给、降低血液粘稠度，对脑血管有较高的选择。

作用于神经递质的药物包括：多奈哌齐(Donepezil，安理申)：可逆性地抑制 乙酰胆碱酯酶(AchE)引起的乙酰胆酰水解而增加受体部位的乙酰胆碱含量，多 奈哌齐可能还有其他机制，包括对肽的处置、神经递质受体或Ca2+通道的直 接作用；哈伯因(huperzine)：其主要成分是从天然植物千层塔中提取的一种生物 碱(石杉碱甲)，属于可逆性胆碱酯酶抑制剂，易透过血脑屏障，有促进记忆再 现和增强记忆保持的作用。

神经元保护剂包括：美金刚(Memantine)：脑部缺血缺氧可导致突触前兴奋性 氨基酸释放和再摄取减少，过量的EAA可激活突触后EAA受体(主要是NMDA 受体和AMPA受体)，加重神经细胞损害，美金刚作为非竟争性NMDA受体拮抗 剂，能够减轻大脑缺血缺氧过程中的神经损伤；尼莫地平(Nimodipine)：为钙通道 阻断剂，能有效调节细胞内钙水平，抑制钙超载造成的神经细胞损伤，促进受 损神经元的再生。

如意珍宝丸为传统藏药，成方于公元13世纪，载于藏医药学家仁青坚赞 所著的《秘诀珍珠串》一书中。其组方根据藏医学原理，选用生长在世界屋 脊特殊生态环境的天然、珍贵、稀有藏药材，并以现代科学方法与传统工艺 相结合精制而成。主要由珍珠母、沉香、石灰华、金礞石、红花、螃蟹、丁香、 毛诃子(去核)、肉豆蔻、豆蔻、余甘子、草果、香旱芹、檀香、黑种草子、降香、 荜茇、诃子、高良姜、甘草膏、肉桂、乳香、木香、决明子、水牛角、黄葵子、 短穗兔耳草、藏木香、人工麝香、牛黄珍珠母、沉香、甘草等30种药材组成， 其功能主治为清热，醒脑开窍，舒筋通络，用于瘟热、陈旧热症、白脉病、四 肢麻木、瘫痪、口眼歪斜、神志不清、肢体僵直、关节不利。

如意珍宝片为如意珍宝丸的改进剂型，参照如意珍宝丸的制备标准，以片 剂的方式提供，方便服用。目前尚无关于如意珍宝丸/片治疗血管性痴呆或相关 疾病的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供藏药的新医药用途，即提供如意珍宝丸/片在治疗血 管性痴呆(Vascular Dementia，VD)中的应用。所述藏药由下述原料制成：

珍珠母22.69重量份、沉香22.69重量份、石灰华22.69重量份、金礞石6.81 重量份、红花22.69重量份、螃蟹11.34重量份、丁香9.07重量份、去核的毛诃 子22.69重量份、肉豆蔻9.07重量份、豆蔻9.07重量份、余甘子29.49重量份、 草果6.81重量份、香旱芹9.07重量份、檀香18.15重量份、黑种草子9.07重量 份、降香74.86重量份、荜茇6.81重量份、去核的诃子29.49重量份、高良姜 18.15重量份、甘草膏9.07重量份、肉桂11.34重量份、乳香13.61重量份、木 香18.15重量份、决明子13.61重量份、水牛角或水牛角浓缩粉9.07重量份、黄 葵子11.34重量份、短穗兔耳草34.03重量份、藏木香18.15重量份、人工麝香 0.45重量份、人工牛黄或体外培育牛黄0.45重量份。

本发明所述的藏药可以以任何适宜服用的口服剂型提供，例如丸剂、胶囊剂、 片剂、散剂和颗粒剂，优选的剂型为丸剂或片剂，如意珍宝丸/片可以为传统的 如意珍宝丸，也可以为改进的以片剂形式提供的如意珍宝片。

通过对患血管性痴呆的大鼠模型(VD大鼠)施用高、中、低剂量的如意珍 宝片，通过动物行为学实验、递质含量测定实验和大鼠脑血流量观察证明，如 意珍宝片能显著的提高VD大鼠空间和条件性刺激的学习记忆能力和改善VD大 鼠的协调能力；对脑内递质NE、DA、5-HT、ASP有非常好的保护作用，对血 清内GABA也有保护作用；能显著增加VD大鼠脑血流量，从而改善因脑供血 不足引起的脑损伤。因此如意珍宝丸/片临床上可用于治疗血管性痴呆。

具体实施方式

下面通过对本发明较佳实施方式的描述，详细说明但不限制本发明。

1、实验材料

1.1供试品：如意珍宝片由甘肃奇正藏药有限公司提供。

处方和制备方法：

取以重量计的以下成分：珍珠母22.69g、沉香22.69g、石灰华22.69g、金 礞石6.81g、红花22.69g、螃蟹11.34g、丁香9.07g、去核的毛诃子22.69g、肉 豆蔻9.07g、豆蔻9.07g、余甘子29.49g、草果6.81g、香旱芹9.07g、檀香18.15g、 黑种草子9.07g、降香74.86g、荜茇6.81g、去核的诃子29.49g、高良姜18.15g、 甘草膏9.07g、肉桂11.34g、乳香13.61g、木香18.15g、决明子13.61g、水牛角 或水牛角浓缩粉9.07g、黄葵子11.34g、短穗兔耳草34.03g、藏木香18.15g、人 工麝香0.45g、人工牛黄或体外培育牛黄0.45g；

将除人工牛黄或体外培育牛黄、水牛角或水牛角浓缩粉、人工麝香、甘草 膏外的其它成份粉碎成细粉或超微粉碎，加入人工牛黄或体外培育牛黄、水牛 角细粉或水牛角浓缩粉、人工麝香，过筛，混匀，用甘草膏加适量水制粒、干 燥，压片，包衣，即得。

性状：本品为薄膜衣片，除去薄膜衣后显棕色至红棕色；气微香，味苦、甘。

规格：每片重0.5g。

批号：20101113。

1.2阳性对照药品

1.2.1盐酸多奈哌齐片(安理申)，卫材(中国)药业有限公司制造，批号：110110A，

生产日期：2011年1月，有效期至2013年12月，规格：5mg/片。保存条件： 常温。

1.2.2甲磺酸双氢麦角碱(喜得镇)，天津华津制药有限公司，批号：9M862T，

生产日期：2009年12月，有效期至2012年11月，规格：1mg/片。保存条件： 常温。

1.3试剂

1.3.1戊巴比妥钠：中国医药(集团)上海化学试剂公司，批号：100808。

1.3.2生理盐水：山东齐都药业有限公司，批号：20041208。

1.3.3磷酸二氢钾：天津市化学试剂三厂，批号：20041208。

1.3.4甲醇：天津市康科德科技有限公司，批号：20111209。

1.3.5醋酸钠：天津市化学试剂三厂，批号：20090926。

1.3.6硼酸钠：，天津市化学试剂三厂，批号：20100120。

1.3.7二巯基乙醇：北京鼎国生物技术，批号：20111203。

1.3.8天冬氨酸：上海源叶生物科技有限公司，批号：20110503。

1.3.9r-氨基丁酸：上海源叶生物科技有限公司，批号：20110503。

1.3.10去甲肾上腺素：中国食品药品检定研究所，批号：100169-201103。

1.3.11多巴胺：Augsburg，C13082000，批号：00714。

1.3.125-羟色胺：Sigma，H9523，批号：1001156278。

1.3.13美托洛尔：阿斯利康制药有限公司，批号：1108091。

1.3.14青霉素钠：哈药集团制药总厂，批号：101214706，80万单位/0.5g/支。

1.4仪器与耗材

1.4.1MG-3型迷宫刺激器，河南省原阳县振华教学仪器厂。

1.4.2PB-203型电子天平，METTLER-TOLEDO GROUP生产。

1.4.31200series高效液相色谱仪，Agilent Technologies co。

1.4.413300型低温离心机，Thermo science co。

1.4.5G&G T2000型电子天平，美国双杰兄弟(集团)有限公司。

1.5实验动物

1.5.1SD大鼠

250只SPF级雄性大鼠，由北京维通利华实验动物技术有限公司(生产许 可证号：SCXK(京)2006-0009)，动物质量合格证号：0247353。

2.给药途径、方法、剂量、频率和用药期限的确定

给药途径：口服。

给药方式：灌胃。

给药体积：大鼠：10ml/kg。

剂量设计依据：

如意珍宝片：口服一次4-5片，一日2次，每片重0.5g。人以70kg体重计， 大鼠体表等效剂量为0.419g/kg，根据血瘀实验结果1.6g/kg才有显著的活血 化瘀作用，故药效实验剂量为：

大鼠：1.6g生药/kg、0.8g生药/kg、0.4g生药/kg。

多奈哌齐：临床用量，每日剂量为5mg/人，5mg/人/天相当于大鼠体表等效 剂量为0.419mg/kg，剂量设定为：大鼠：0.4mg/kg。

甲磺酸双氢麦角碱：临床用量，每日最大剂量为6mg/人，6mg/人/天相当于 大鼠体表等效剂量为0.502mg/kg，剂量设定为：大鼠：0.5mg/kg。

3.药物配制方法及给药浓度

3.1如意珍宝片

取如意珍宝片64片，加少量去离子水研磨均匀后，去离子水定容至200ml， 为高剂量药液，浓度为0.16g/ml。用去离子水将高剂量药液等比稀释，配制中 (0.08g/ml)、低(0.04g/ml)剂量药液。

3.2多奈哌齐

取多奈哌齐片2片(5mg/片)，加少量去离子水研磨均匀后，去离子水定容 至250ml，剂量为0.04mg/ml。

3.3甲磺酸双氢麦角碱

取甲磺酸双氢麦角碱片13片(1mg/片)，加少量去离子水研磨均匀后，去离 子水定容至260ml，剂量为0.5mg/ml。

4.数据处理与分析

采用SPSS11.0One-Way ANOVA(单因素方差分析)对数据进行方差分析后， 采用t检验进行组间比较。

【实施例1】VD大鼠模型的制作及实验动物分组

250只成年健康雄性SD大鼠，先经MG-3型Y型迷宫训练，淘汰反应过 于迟钝或对电刺激特别敏感的大鼠(淘汰31只大鼠)。随机挑选20只大鼠作为 假手术组，剩余199只大鼠采用改良双侧颈总动脉永久性结扎法制作VD动物 模型。大鼠术前12h禁食，大鼠称重，灌胃给予美托洛尔(0.5mg/kg)，半小时 后腹腔注射1％戊巴比妥钠(4.5ml/kg)麻醉，术前眼眶放血3ml，大鼠仰卧固 定，备皮，消毒，颈部正中切口，钝性分离胸骨舌骨肌和胸锁乳突肌后便可见 到颈总动脉搏动，钝性分离双侧颈总动脉，0号线结扎其远近心端，并从中间剪 断，缝合切口，放回笼中保温饲养，术后及次日注射1％青霉素钠4ml/kg(剂量 为6.4万单位/kg)，术后灌胃给予美托洛尔(0.5mg/kg)每日一次，连续给予1 周，加强VD大鼠脑缺血效果(手术过程中死亡28只)。假手术组大鼠分离颈 总动脉后缝合切口。

手术结束后，大鼠恢复2天后检测造模是否成功，171只手术大鼠进行Y 迷宫检测，筛选原则为正确次数大于10次以上淘汰。其中合格大鼠为122只， 随机分为6组，除模型组22只外，其余各组每组20只，各组大鼠每日上午灌 胃给药一次，连续给药3周，模型组与假手术组给予同体积去离子水。每组随 机挑选10只大鼠做行为学实验，末次给药结束后，注射1％戊巴比妥纳(4.5ml/kg) 麻醉大鼠进行脑血流量检测，检测结束后直接断头取脑进行脑内单胺类递质和 氨基酸类递质指标检测。其余各组大鼠，给药结束后立即腹主动脉取血，离心 取上清液进行血清内氨基酸类递质指标检测、取脑进行组织病理检测。

【实施例2】行为学实验

1如意珍宝片对VD大鼠学习记忆的影响

各组大鼠应用MG-3型Y-型迷宫测试其记忆成绩。Y迷宫由三个相同的臂 组成，分别称为I臂、II臂、III臂。迷宫底铺设直径0.2cm，长14cm，间距1cm 的电栅，可以通电刺激。三臂顶端各装有15W信号灯，灯光作为电击的信号， 以训练大鼠辨别灯光刺激及安全方位的能力。实验时其中有一条臂尽头的灯发 出亮光，此时该臂底部电栅无电流通过为安全区，另两臂的灯不亮，底部电网 通电，为非安全区。安全区与非安全区随机改变。实验前先将大鼠放入迷宫， 让其自由活动，适应5min，训练日大鼠在起步区予以电击致其逃至安全区，灯 光持续10s，然后熄灯休息5s，开始下一次操作，一共测试15次。次日为测试 日同训练日操作，记录15次测试中正确反应次数进行统计分析。实验在黑暗、 安静环境下进行。规定大鼠受电击后从起步区直接逃至安全区的反应称为“正 确反应”，否则为“错误反应”。结果见表1。

结果显示，与假手术组比较，给药前模型动物正确次数非常显著的减少，表 明VD模型制作成功。给药2周和给药3周模型组正确次数均非常显著的减少， VD大鼠的学习记忆能力显著下降，其中给药2周P＜0.001，给药3周显著性为 P＜0.01。与模型组比较，给药2周，多奈哌齐、如意珍宝片高剂量均能非常显著 的增加正确次数(显著性分别为P＜0.01，P＜0.001)，给药3周，多奈哌齐、如 意珍宝片高、中剂量也均能显著的增加正确次数(显著性分别为P＜0.05，P＜0.01， P＜0.05)。喜得镇组各项指标均无显著性差异。实验结果表明如意珍宝片能显著 的提高VD大鼠空间和条件性刺激的学习记忆能力。

表1如意珍宝片对VD大鼠Y迷宫实验的影响

^*P与假手术组比，^**P＜0.01，^***P＜0.001；#P与模型组比，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001

Y-迷宫实验结果显示，给药2周，如意珍宝片高剂量组能非常显著的增加逃 避电刺激反应的正确次数，给药3周，如意珍宝片高、中剂量也均能显著的提 高正确次数。实验表明，如意珍宝片能改善VD大鼠空间和条件性刺激的学习 记忆能力。

2如意珍宝片对VD大鼠握绳时间的影响

给药3周，对各组大鼠进行握绳实验，检测实验大鼠的协调能力。将一根 直径为5mm的尼龙绳水平方向系在离地面1m处，垂直下方地面上垫海绵软垫。 将实验大鼠双前爪放在尼龙绳上，然后松手，记录松手到大鼠掉落之间的时间t。

结果见表2。

结果显示，与假手术组比较，模型组大鼠握绳时间非常显著的降低。与模 型组比较，多奈哌齐组、如意珍宝片组高、中、低剂量均能显著的延长握绳时 间。实验结果表明如意珍宝片能显著的延长VD大鼠握绳时间，显著改善VD大 鼠协调能力。

表2如意珍宝片对VD大鼠握绳时间的影响

^*P与假手术组比，^**P＜0.01；#P与模型组比，#P＜0.05，

握绳实验结果显示，如意珍宝片高、中、低剂量组对VD大鼠握绳时间均 有显著的延长，表明如意珍宝片能显著改善VD大鼠运动协调性。

【实施例3】递质含量测定实验

1如意珍宝片对VD大鼠脑内单胺类递质的影响

脑匀浆样品的制备：

实验结束后大鼠直接断头，在冰台上剥离出大鼠全脑(保留大脑及间脑)， 称重。按0.1g脑(湿重)加入1ml 5％高氯酸的比例加入高氯酸，放入玻璃匀 浆管内，冰浴下匀浆。将匀浆液收集于1.5ml离心管中，于12000r/min，-4℃离 心20min，取上清液进样检测。

色谱条件：

色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus-C₁₈，150×4.6mm，5μm。

流动相为0.1mol/L的KH₂PO₄缓冲液-甲醇(体积比9∶1)。流速为0.7ml/min， 进样体积为20ul，柱温为35℃，荧光检测器的激发波长为254nm，发射波长为 338nm。

线性范围：

采用外标法，以不同浓度的标准液进样测定，以峰面积Y为纵坐标，进样 浓度X为横坐标作图，计算出线性回归方程，见表3。

表3NE，DA和5-HT的线性回归方程

表4结果显示，与假手术组比较，模型组大鼠脑内三种单胺类递质NE、DA、 5-HT含量均非常显著的减少(显著性均为P＜0.001)。与模型组比较，多奈哌齐、 喜得镇均能显著的抑制三种单胺类递质的减少(显著性均为P＜0.001)。如意珍 宝片组高、中、低剂量均能抑制脑内三种单胺类递质减少(其中DA高剂量组 显著性P＜0.05，其余显著性均为P＜0.001)。实验结果表明如意珍宝片对脑内三 种单胺类递质NE、DA、5-HT有非常好的保护作用。

表4如意珍宝片对VD大鼠脑内三种单胺类递质含量的影响

^*P与假手术组比，^***P＜0.001；#P与模型组比，#P＜0.05，###P＜0.001

备注：实验前模型组大鼠死亡2只，多奈哌齐组大鼠死亡2只、递质测定过程中假手术组损失2个样品。

2如意珍宝片对VD大鼠脑内氨基酸类递质的影响

脑匀浆样品的制备：

大鼠直接断头，在冰台上剥离出大鼠全脑(保留大脑及间脑)，称重。按0.1g 脑(湿重)加入1ml 5％高氯酸的比例加入高氯酸，放入玻璃匀浆管内，冰浴下 匀浆。将匀浆液收集于1.5ml离心管中，于12000r/min，-4℃离心20min，取上 清液进样检测。

色谱条件：

色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus-C₁₈，150×4.6mm，5μm。

流动相：1)水相：0.05M醋酸钠溶液，用醋酸调溶液的pH值为6.7。

2)有机相：97.5％甲醇与2.5％的四氢呋喃混合溶液。

各流动相使用前均用G₆垂熔漏斗过滤。

流速：1.0ml/min。

荧光学检测器波长设定：激发波长：340nm，发射波长：450nm。

衍生化试剂的配制：

将9mg OPA溶于167μl的甲醇中，再加入1.5ml 0.4M的硼酸钠与7μl的 二巯基乙醇，混合均匀，此溶液在4℃避光保存，每周重配一次。

检测：

精确吸取样品20μl，加入40μl衍生化试剂进行柱前衍生化后注入液相系统， 采用高压梯度洗脱，对相关的氨基酸进行分离，以荧光检测器检测。

线性范围：

采用外标法，以不同浓度的标准液进样测定，以峰面积Y为纵坐标，进样 浓度X为横坐标作图，计算出线性回归方程。

表5ASP和GABA的线性回归方程

结果(见表6)显示，与假手术组比较，模型组大鼠脑内ASP递质含量显 著的减少(显著性为P＜0.05)，GABA无显著性变化。与模型组比较，多奈哌齐 能显著抑制ASP的减少(显著性为P＜0.05)，喜得镇对ASP无显著性影响。如 意珍宝片组高、中剂量均能显著的抑制ASP减少(显著性分别为P＜0.05、 P＜0.001)，低剂量ASP亦有一定的升高。实验结果表明如意珍宝片对脑内ASP 递质有显著的保护作用。

表6如意珍宝片对VD大鼠脑内2种氨基酸类递质含量的影响

^*P与假手术组比，^*P＜0.05；#P与模型组比，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001

备注：实验前模型组大鼠死亡2只，多奈哌齐组大鼠死亡2只、递质测定过程中假手术组损失2个样品。

3如意珍宝片对VD大鼠血清内氨基酸类递质的影响

血清样品的制备：

实验结束后大鼠腹主动脉取血2ml，于3000r/min，离心10min，取上清。取 上清100ul，按1∶1比例加入5％高氯酸，于1.5ml离心管中震荡2min，静置2min， 于12000r/min，-4℃离心20min，取上清液进样检测。

色谱条件：

色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus-C₁₈，200×4.6mm。

流动相：1)水相：0.05M醋酸钠溶液，用醋酸调溶液的pH值为6.7。

2)有机相：97.5％甲醇与2.5％的四氢呋喃混合溶液。

各流动相使用前均用G₆垂熔漏斗过滤。

流速：1.0ml/min。

荧光学检测器波长设定：激发波长：340nm，发射波长：450nm。

衍生化试剂的配制：

将9mg OPA溶于167μl的甲醇中，再加入1.5ml 0.4M的硼酸钠与7μl 的二巯基乙醇，混合均匀，此溶液在4℃避光保存，每周重配一次。 检测：

精确吸取透析液20μl，加入40μl衍生化试剂进行柱前衍生化后注入液相 系统，采用高压梯度洗脱，对相关的氨基酸进行分离，以荧光检测器检测。

线性范围：

采用外标法，以不同浓度的标准液进样测定，以峰面积Y为纵坐标，进样 浓度X为横坐标作图，计算出线性回归方程。

表7ASP和GABA的线性回归方程

结果(见表8)显示，与假手术组比较，模型组大鼠外周血内递质GABA 含量显著的减少(显著性为P＜0.05)，ASP含量无显著性变化。与模型组比较， 多奈哌齐、喜得镇对GABA均无显著性影响。如意珍宝片高、中、低剂量均能 显著的抑制GABA递质减少(显著性分别为P＜0.01、P＜0.01、P＜0.05)。实验结 果表明如意珍宝片对血清内GABA递质有保护作用。

表8如意珍宝片对VD大鼠外周血中2种氨基酸类递质含量的影响

^*P与假手术组比，^*P＜0.05；#P与模型组比，#P＜0.05，##P＜0.01

备注：实验前假手术组大鼠死亡2只、模型组大鼠死亡4只、多奈哌齐组大鼠死亡2只。血清内氨基 酸递质测定过程中模型组4号样品、如意珍宝片高剂量组3号样品、如意珍宝片中剂量组1、5、7号样品 处理过程中损失。

脑组织递质含量结果显示，如意珍宝片组高、中、低剂量均能抑制脑内NE、 DA、5-HT 3种单胺类递质减少，如意珍宝片组高、中剂量均能显著的抑制ASP 递质减少，血清内递质含量结果显示，如意珍宝片组高、中、低剂量均能显著 的抑制GABA递质减少，实验结果表明，对脑内NE、DA、5-HT、ASP递质有 非常好的保护作用，对血清内GABA递质也有保护作用。

【实施例4】如意珍宝片对VD大鼠脑血流量的影响

实验结束后，各组大鼠进行多普勒超声检测，检测大鼠脑血流动力学的变 化。检测结果(见表9)显示，与假手术组比，脑血流量收缩期峰值血流速度、 舒张末期血流速度、平均血流速度均非常显著的低于假手术组，反映脑血流灌 注和供血严重不足，与模型组比，多奈哌齐组、如意珍宝片组中脑血流量收缩 期峰值血流速度、舒张末期血流速度、平均血流速度均非常显著的升高，实验 结果表明，如意珍宝片能显著性增加大鼠脑血流量，从而改善供血不足引起的 脑损伤。

表9如意珍宝片对VD大鼠脑血流量的影响

^*P与假手术组比，^**P＜0.01；#P与模型组比，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001

备注：脑血流量测定实验前多奈哌齐组大鼠死亡2只

脑血流量检测实验结果显示，如意珍宝片高、中、低剂量对脑血流量收缩 期峰值血流速度、舒张末期血流速度、平均血流速度均能非常显著的升高。实 验结果表明，如意珍宝片能通过增加VD大鼠脑血流量从而改善脑供血不足引 起的脑损伤。

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