一种肝癌细胞的抑制剂及其在抑制肿瘤生长方面的应用

摘要

本发明公开一种肝癌细胞的抑制剂。所述的一种肝癌细胞的抑制剂包括PPARγ激动剂与AKT抑制剂曲西立滨，所述的PPARγ激动剂为罗格列酮或15d-PGJ

说明书

技术领域

本发明涉及一种肿瘤细胞的抑制剂，特别一种肝癌细胞抑制剂及其在抑制肿瘤生长方面的应用。

背景技术

肝癌（HCC）是世界范围内排列第五位的最常见的恶性肿瘤，而由于其对化疗的耐受以及手术后极高的复发和转移特性使其成为致死率第三的恶性肿瘤。近年来越来越多的研究证明，HCC的发生可能起源于一群具有干性的细胞亚群，这群细胞被称为肿瘤起始细胞(tumor-initiating cells，TICs)或是肿瘤干细胞（cancer stem cells）。这群细胞表达特定的表面标记，具有自我更新、分化、形成肿瘤以及化疗耐受的特性。虽然，目前索拉菲尼（sorafenib）已经用于靶向治疗HCC，但是其对肿瘤的抑制作用以及肝癌病人的存活率并不是很好。因此，如果采用能够抑制TICs的治疗策略可能是靶向治疗HCC的有效手段。

过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ）即PPARγ激动剂是核受体超家族中的一类配体依赖性的核转录因子。

PPARγ激动剂主要包括内源性的配体15d-PGJ₂以及人工合成的抗糖尿病药物噻唑烷二酮类家族成员，如罗格列酮（rosiglitazone）、曲格列酮（troglitazone）、环格列酮（ciglitazone）、吡格列酮（pioglitazone）以及恩格列酮（englitazone）。配体活化PPARγ后，诱导靶基因的表达进而调控一系列的生理学进程，例如代谢、细胞分化、凋亡以及组织炎症等。

PPARγ激动剂在不同的肿瘤细胞中也被报道能够抑制细胞增殖、诱导凋亡及分化。更有研究表明，在HCC的肿瘤组织中，尤其是在低分化的肿瘤组织中PPARγ的表达明显受到抑制，而且PPARγ激动剂可抑制HCC的形成、侵袭及转移。

AKT是维持正常生命活动的重要信号传导分子，其持续活化与肿瘤的发生发展密切相关，是一重要的癌基因。同时，AKT的异常活化是肝癌复发和预后不良的一种危险因素。抑制AKT的活性可抑制肿瘤细胞的生长。

然而，迄今为止，联合PPARγ激动剂与AKT抑制剂能否有效地靶向肝肿瘤起始细胞从而抑制肿瘤生长仍然不是很清楚。

发明内容

本发明的目的就是为了研究上述的PPARγ激动剂与AKT抑制剂联合能否有效地靶向肝肿瘤起始细胞从而抑制肿瘤生长等技术问题，最终提供一种肝癌细胞的抑制剂及其在抑制肿瘤生长方面的应用。

本发明的技术原理

在人肝癌细胞系中PPARγ激动剂通过NOX2诱导产生的活性氧（reactive oxygen species，ROS）有效地抑制HCC细胞的干性表型；然而，ROS的上调引起AKT的高度活化，活化的AKT又以负反馈的形式调控ROS的水平，进而影响PPARγ激动剂对HCC细胞的干性表型的调节。因此，PPARγ激动剂罗格列酮及AKT抑制剂曲西立滨（triciribine）联合在体内呈现出对肿瘤生长抑制的协同作用，并能抑制肿瘤组织中细胞的干性表型。由PPARγ激动剂与AKT抑制剂组成的一种新的肝癌细胞抑制剂的治疗策略有望用于临床治疗肝癌。

本发明的技术方案

一种肝癌细胞的抑制剂，包括PPARγ激动剂和AKT抑制剂；

所述的PPARγ激动剂优选为罗格列酮或15d-PGJ₂；

所述的AKT抑制剂优选为曲西立滨；

通过针对皮下接种GFP⁺ Huh7细胞的BALB/C雄性裸鼠的试验表明，所述的肝癌细胞的抑制剂中，按质量比计算，PPARγ激动剂罗格列酮：AKT抑制剂曲西立滨为100：1；

通过对肝癌细胞Huh7的实验结果表明，所述的肝癌细胞的抑制剂中，按质量摩尔比计算，PPARγ激动剂15d-PGJ₂：AKT抑制剂曲西立滨为1g：20-100μmol。

上述的一种肝癌细胞的抑制剂在抑制肝癌细胞生长方面的应用。

本发明的有益效果

本发明的一种肝癌细胞的抑制剂，由于含有PPARγ激动剂罗格列酮或15d-PGJ₂和AKT抑制剂曲西立滨，针对人肝癌细胞系特别是Huh7的实验研究表明，PPARγ激动剂罗格列酮和AKT抑制剂曲西立滨或PPARγ激动剂15d-PGJ₂和AKT抑制剂曲西立滨组成的肝癌细胞的抑制剂均可以协同抑制HCC细胞的干性表型，从而抑制肝癌细胞的生长。

进一步，通过针对皮下接种GFP⁺ Huh7细胞的BALB/C雄性裸鼠试验，可以得出PPARγ激动剂罗格列酮和AKT抑制剂曲西立滨序贯联合给药达到了协同抑制肿瘤生长的作用，并且比单独PPARγ激动剂在抑制肿瘤生长方面的抑制率增加42%、比单独AKT抑制剂在抑制肿瘤生长方面的抑制率增加30.5%。

附图说明

图1A、PPARγ激动剂15d-PGJ₂和自由基清除剂NAC分别处理Huh7及SK-Hep1细胞后，细胞内的ROS含量变化统计图（*,P<0.05;**,P<0.01vs对照组）；

图1B、PPARγ激动剂15d-PGJ₂分别处理Huh7和SK-Hep1细胞后，NOX2表达量的示意图；

图1C1、添加自由基清除剂NAC后，PPARγ激动剂15d-PGJ₂处理Huh7细胞后，AKT及磷酸化AKT表达量示意图；

图1C2、添加自由基清除剂NAC后，PPARγ激动剂罗格列酮处理Huh7细胞后，AKT及磷酸化AKT表达量示意图； 

图1D、AKT抑制剂曲西立滨处理Huh7细胞后，NOX2、AKT及磷酸化AKT表达量的示意图；

图1E、PPARγ激动剂15d-PGJ₂与AKT抑制剂曲西立滨联合处理Huh7细胞后，ROS表达量变化的统计图（*,P<0.05;**,P<0.01）；

图2A1、PPARγ激动剂15d-PGJ₂与AKT抑制剂曲西立滨联合处理Huh7细胞后，细胞凋亡情况的统计图（*,P<0.05）；

图2A2、PPARγ激动剂罗格列酮与AKT抑制剂曲西立滨联合处理Huh7细胞后，细胞凋亡情况的统计图；

图2B、PPARγ激动剂15d-PGJ₂与AKT抑制剂曲西立滨联合处理Huh7细胞后，细胞成球能力的统计图，图中■>=100μm表示肿瘤细胞球的直径大于等于100μm，□50-100μm表示肿瘤细胞球的直径大于50μm而小于100μm；

图2C、PPARγ激动剂15d-PGJ₂与AKT抑制剂曲西立滨联合处理Huh7细胞后，CD133⁺细胞数的统计图（*, P < 0.05; **, P < 0.01）；

图2D、PPARγ激动剂罗格列酮与AKT抑制剂曲西立滨联合处理Huh7细胞后，CD133⁺细胞数的统计图（*, P < 0.05）；

图3A、实施例3中的罗格列酮处理组、曲西立滨处理组以及序贯联合给药方案示意图；

图3B、随时间变化，不同给药方式对小鼠皮下荷瘤体积大小的影响；

图3C、不同给药方式对小鼠皮下荷瘤所形成的肿瘤的重量的影响；

图3D、不同给药方式对小鼠皮下荷瘤所形成的肿瘤组织中CD133⁺细胞所占比例的统计图（*,P<0.05;**,P<0.01）。

具体实施方式

下面通过具体实施例并结合附图对本发明进一步阐述，但并不限制本发明。

本发明所用的材料

细胞系及实验动物

人肝癌细胞系：Huh7细胞购自日本Riken Cell Bank，SK-Hep1细胞购自American Type Culture Collection (ATCC)。

6~8周龄雄性BALB/C裸鼠，购自上海必凯实验动物有限责任公司，饲养于华东师范大学动物房。小鼠置于恒温（25-27°C）、恒湿（45-50%）、无特殊病原菌（SPF级）环境下饲养，灭菌处理的水和饲料供动物自由摄入。

   主要试剂

名称公司DMEM /F12 1:1培养液GIBCO高糖DMEM培养液GIBCO0.25%胰酶+0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)GIBCO15d-PGJ₂Sigma和Cayman Chemical7-AADSigmaFITC-Annexin VBDB27GIBCOBCA蛋白定量试剂盒ThermobFGFR&DDHEInvitrogenECL发光试剂盒ThermoEGFR&DMTTSigmaNACCalbiochemPenstrep双抗GIBCORNAiso PlusTaKaRasiRNASigmaSYBR Premix Ex Taq^TMTaKaRaDNaseIRoche胶原酶ISigma胶原酶IVSigma水解酶Sigma罗格列酮Cayman Chemical和GlaxoSmithKline曲西立滨Santa Cruz胎牛血清GIBCO辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠二抗Santa cruz辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗Santa cruz鼠抗α-tubulin单克隆抗体Santa cruz兔抗AKT单克隆抗体Cell signal technology兔抗CD133单克隆抗体Cell signal technology兔抗GAPDH单克隆抗体Santa cruz兔抗NOX2单克隆抗体Abcam兔抗P-AKT（Ser473）单克隆抗体Cell signal technology荧光素PE标记的鼠抗人CD133单克隆抗体Miltenyi Biotec脂质体Lipofectamine^TM2000Invitrogen

主要仪器

名称公司ChemiDoc^TM>Bio-RadFACS Calibur^TM流式细胞仪BD BiosciencesMini-PROTEAM微型垂直电泳槽Bio-Rad常温离心机Sorvall倒置显微镜（Axiovert 201）ZEISS低吸附培养板Costar电子天平（PC440）Mettler台式冷冻离心机Beckman counter通用型酶标仪（EXL 800）BIO-TEK微量核酸蛋白定量仪Thermo微型电泳转移槽Bio-Rad细胞培养箱Thermo

所用的肿瘤消化液：胶原酶I 0.05mg/ml，胶原酶IV 0.05mg/ml，水解酶0.025mg/ml，DNase I 0.01mg/ml，5%胎牛血清，用1640配制。

本发明所用的Western blotting检测方法，具体操作步骤如下，但不仅限于此：

将培养有细胞的培养皿置于冰上，吸走细胞培养液，加入2-3 ml 4℃预冷的PBS，重复清洗2次，随后加入1ml的PBS，用干净的细胞刮将细胞刮于培养皿的一侧，然后用移液枪将细胞悬液移至1.5ml离心管中，300×g 4℃离心5min，弃上清液。每管加一定量的RIPA蛋白裂解液（含一定量的PMSF、Complete蛋白酶抑制剂和PhosSTOP磷酸酶抑制剂）。冰中放置裂解60min。12,000×g 4℃离心30min，将离心后的上清转移至0.5ml的离心管中，取2μl用于蛋白浓度测定。取20-50μg按比例加入5×SDS-PAGE上样缓冲液并已变性的待测蛋白样品，加入已制备好的PAGE胶（5%浓缩胶和10%分离胶），进行电泳：浓缩胶70V，分离胶140V，直至溴酚蓝迁移至底部，停止电泳。用湿转法将SDS-PAGE中的蛋白转移至NC膜上，于4℃、100V转膜1~2h。转膜结束后，5%脱脂奶粉（PBS配制）中，于脱色摇床上室温封闭1h。然后用一抗稀释液稀释的特异性抗体，与膜共孵育，于室温孵育2-3h或是4℃过夜。随后用TBST洗膜三次，每次5min；加入用含5%BSA的TBST稀释的相应二抗（1：5000），与膜室温共孵育1-2h。最后ECL显色（ECL显色试剂盒），然后，通过ChemiDoc^TM XRS成像系统分析电泳后所得的特异性条带，从而获得相应的蛋白表达图谱。

实施例1

PPARγ激动剂处理的肝癌细胞中NOX2诱导的ROS形成与AKT的活化存在负反馈调控

（一）、流式细胞术检测PPARγ激动剂对肝癌细胞中活性氧的影响，仅以Huh7和SK-Hep1细胞进行举例，但并不限制在其他肝癌细胞系的应用

Huh7和SK-Hep1细胞分别在37℃、5% CO₂及饱和湿度的条件下进行培养，细胞维持培养基均为DMEM高糖培养液，包含10%胎牛血清、100μg/ml链霉素和100U/ml青霉素。待细胞贴壁后，均换为含1%胎牛血清的DMEM高糖培养液后，并在培养液中加入以下试剂：15d-PGJ₂或自由基清除剂NAC或DMSO。

其中，

单独处理组1：加入15d-PGJ₂（0.5μg/ml）；

单独处理组2：加入自由基清除剂NAC（10mM）；

联合处理组：加入15d-PGJ₂（0.5μg/ml）+自由基清除剂NAC（10mM）； 

对照组：加入与15d-PGJ₂等体积的DMSO。

处理三天后，去除培养有待分析细胞的培养皿中的培养液，将所得的细胞分别用PBS洗一次，然后分别加入含DHE（终浓度为5μM）的DMEM培养液1ml，并将待分析细胞于37℃、5%CO₂的条件下培养30min后，用胰酶消化收集细胞于流式管中，用PBS洗2次，每次200-300×g，离心5min，去上清，最后用200μl PBS重悬细胞，以标准程序用FACS Calibur^TM流式细胞仪检测各不同组细胞中ROS含量变化水平，结果如图1A所示，从图1A中可以看出，无论是Huh7细胞或SK-Hep1细胞，经15d-PGJ₂单独处理后，细胞中的ROS水平明显高于对照组（其显著性差异P<0.01）；

而经自由基清除剂NAC单独处理后，细胞中的ROS水平下降；

进一步，在15d-PGJ₂与NAC的联合处理组中，NAC逆转了15d-PGJ₂诱导的ROS增加，并具有显著性差异（P<0.5）。

（二）、Western blotting检测PPARγ激动剂和AKT抑制剂分别对肝癌细胞中NOX2、AKT及磷酸化AKT表达的影响

（1）、PPARγ激动剂15d-PGJ₂分别对Huh7和SK-Hep1细胞中NOX2表达的影响

Huh7和SK-Hep1细胞分别在37℃、5% CO₂及饱和湿度的条件下进行培养，细胞维持培养基均为DMEM高糖培养液，包含10%胎牛血清、100μg/ml链霉素和100U/ml青霉素。待细胞贴壁后，均换为含1%胎牛血清的DMEM高糖培养液，并在培养液中加入以下试剂：15d-PGJ₂或DMSO。

其中，

处理组加入终浓度为0.5μg/ml的15d-PGJ₂，对照组加入相应量的DMSO，处理不同的时间（针对不同细胞，具体处理时间见图1B）后用Western blotting检测NOX2蛋白、α-tubulin、GAPDH的表达情况，结果见图1B所示。

从图1B中可以看出在Huh7细胞中，内参蛋白α-tubulin的表达一致，表明蛋白的上样量是一致的，而主要控制ROS产生的NADPH氧化酶家族之一的NOX2蛋白在经过15d-PGJ₂处理后表达量上升，从而表明15d-PGJ₂促进了NOX2蛋白的表达。

进一步，在SK-Hep1细胞中，内参蛋白GAPDH的表达一致，表明蛋白的上样量是一致的，而主要控制ROS产生的NADPH氧化酶家族之一的NOX2蛋白在经过15d-PGJ₂处理后表达量上升，从而表明15d-PGJ₂促进了NOX2蛋白的表达。

（2）、添加自由基清除剂NAC后，PPARγ激动剂15d-PGJ₂对Huh7细胞中AKT及磷酸化AKT表达的影响；

Huh7细胞分别在37℃、5% CO₂及饱和湿度的条件下进行培养，细胞维持培养基均为DMEM高糖培养液，包含10%胎牛血清、100μg/ml链霉素和100U/ml青霉素。待细胞贴壁后，均换为含1%胎牛血清的DMEM高糖培养液，并在培养液中加入以下试剂：15d-PGJ₂或自由基清除剂NAC或DMSO。

其中，

处理组加入终浓度为10μM的自由基清除剂NAC，对照组加入与自由基清除剂NAC等体积的DMSO，然后各组再分别经终浓度为0.5μg/ml的15d-PGJ₂处理0h、1h、3h、6h、9h、24h后用Western blotting检测AKT、P-AKT(Ser473)、GAPDH的表达情况，结果见图1C1。

从图1C1中可以看出，内参蛋白GAPDH的表达一致，表明蛋白的上样量是一致的，表明15d-PGJ₂处理促进了AKT的磷酸化，而预处理NAC可以显著抑制AKT的磷酸化。

（3）、添加自由基清除剂NAC后，PPARγ激动剂罗格列酮对Huh7细胞中AKT及磷酸化AKT表达的影响；

Huh7细胞分别在37℃、5% CO₂及饱和湿度的条件下进行培养，细胞维持培养基均为DMEM高糖培养液，包含10%胎牛血清、100μg/ml链霉素和100U/ml青霉素。待细胞贴壁后，均换为含1%胎牛血清的DMEM高糖培养液，并在培养液中加入以下试剂：罗格列酮或自由基清除剂NAC或DMSO。

其中，

处理组加入终浓度为10μM的自由基清除剂NAC，对照组加入与自由基清除剂NAC等体积的DMSO，然后各组再分别加入浓度为0μM、5μM、20μM和50μM的罗格列酮，处理24h后，用Western blotting检测AKT、P-AKT(Ser473)、GAPDH的表达情况，结果见图1C2。

从图1C2中可以看出罗格列酮具有相类似的促进AKT的磷酸化，而预处理NAC可以显著抑制AKT的磷酸化。这表明PPARγ激动剂通过ROS活化AKT。

（4）、AKT抑制剂曲西立滨对Huh7细胞中NOX2、AKT及磷酸化AKT表达的影响

Huh7细胞分别在37℃、5% CO₂及饱和湿度的条件下进行培养，细胞维持培养基均为DMEM高糖培养液，包含10%胎牛血清、100μg/ml链霉素和100U/ml青霉素。待细胞贴壁后，均换为含1%胎牛血清的DMEM高糖培养液，并在培养液中加入以下试剂：曲西立滨或DMSO。

其中，

处理组加入浓度分别为0μM、1μM、10μM、50μM、100μM的AKT抑制剂曲西立滨，对照组加入与处理组所用的曲西立滨等体积的DMSO，处理24h后用Western blotting检测NOX2蛋白、AKT、P-AKT(Ser473)、GAPDH的表达情况，结果见图1D所示。

从图1D中可以看出，内参蛋白GAPDH的表达一致，表明蛋白的上样量是一致的，进一步表明AKT抑制剂曲西立滨处理促进了NOX2的表达，而抑制了AKT的磷酸化。

通过上述的分析结果，表明PPARγ激动剂促进了NOX2的表达及AKT的磷酸化，而抑制AKT的磷酸化可促进NOX2的表达,从而表明PPARγ激动剂诱导的AKT的磷酸化与NOX2的表达之间存在负反馈。

（三）、流式细胞术检测PPARγ激动剂15d-PGJ₂与曲西立滨联合对肝癌细胞中ROS的影响，仅以Huh7细胞进行举例，但并不限制在其他肝癌细胞系的应用

Huh7细胞在37℃、5% CO₂及饱和湿度的条件下进行培养，细胞维持培养基为DMEM高糖培养液，包含10%胎牛血清、100μg/ml链霉素和100U/ml青霉素。待细胞贴壁后，换为含1%胎牛血清的DMEM高糖培养液，并在培养液中加入以下试剂：15d-PGJ₂、曲西立滨或DMSO。其中，

单独处理组1：加入15d-PGJ₂（0.5μg/ml）；

单独处理组2：加入曲西立滨（10μM）；

单独处理组3：加入曲西立滨（50μM）；

联合处理组1：加入15d-PGJ₂（0.5μg/ml）与曲西立滨（10μM）；

联合处理组2：加入15d-PGJ₂（0.5μg/ml）与曲西立滨（50μM）；

对照组：加入与15d-PGJ₂等体积的DMSO；

处理三天后，去除培养有待分析细胞的培养皿中的培养液，所得的细胞用PBS洗一次。然后加入含DHE（终浓度为5μM）的DMEM培养液1ml，并将待分析细胞于37℃、5% CO₂的条件下培养30min。用胰酶消化收集细胞于流式管中，用PBS洗2次，每次200-300×g，离心5min，去上清。最后用200μl PBS重悬细胞，以标准程序用FACS Calibur^TM流式细胞仪检测各不同组细胞中ROS含量变化水平，结果如图1E所示。

从图1E中可以看出，将15d-PGJ₂与曲西立滨共同作用Huh7细胞，可显著提高ROS的形成，且在15d-PGJ₂量相同的情况下，随着曲西立滨量的增加，ROS的量增加（其显著性差异P<0.05）。

综上所述，PPARγ激动剂15d-PGJ₂或罗格列酮诱导的AKT活化能够负反馈抑制NOX2引起的ROS上升。

实施例2

PPARγ激动剂和AKT抑制剂协同抑制肝癌细胞的生长及干性表型

（一）、PPARγ激动剂15d-PGJ₂与AKT抑制剂曲西立滨联合对肝癌细胞凋亡的影响，仅以Huh7细胞进行举例，但并不限制在其他肝癌细胞系的应用

Huh7细胞在37℃、5% CO₂及饱和湿度的条件下进行培养，细胞维持培养基为DMEM高糖培养液，包含10%胎牛血清、100μg/ml链霉素和100U/ml青霉素。待细胞贴壁后，换为含1%胎牛血清的DMEM高糖培养液，并在培养液中加入以下试剂：15d-PGJ₂、曲西立滨或DMSO。

其中，

单独处理组1：加入15d-PGJ₂（0.5μg/ml）；

单独处理组2：加入曲西立滨（10μM）；

单独处理组3：加入曲西立滨（50μM）；

联合处理组1：加入15d-PGJ₂（0.5μg/ml）+曲西立滨（10μM）；

联合处理组2：加入15d-PGJ₂（0.5μg/ml）+曲西立滨（50μM）；

对照组：加入与15d-PGJ₂等体积的DMSO。

处理48h后，用胰酶将待测细胞从培养皿上消化下来，收集至离心管中，用PBS清洗一次，重悬于结合缓冲液中，并调整细胞浓度至1×10⁶个/ml。取100μl的细胞悬液至流式管中，加入5μl Annexin V和5μl 7-AAD，室温避光孵育15 min，然后再加入400μl的结合缓冲液，混匀后用流式细胞仪检测细胞凋亡情况，结果如图2A1所示。

从图2A1中可以看出，15d-PGJ₂和曲西立滨联合处理组与15d-PGJ₂单独处理组和曲西立滨单独处理组相比，15d-PGJ₂和曲西立滨联合处理组能够显著引起细胞凋亡（其显著性差异P<0.05）。

（二）、PPARγ激动剂罗格列酮与AKT抑制剂曲西立滨联合对肝癌细胞凋亡的影响，仅以Huh7细胞进行举例，但并不限制在其他肝癌细胞系的应用

Huh7细胞在37℃、5% CO₂及饱和湿度的条件下进行培养，细胞维持培养基为DMEM高糖培养液，包含10%胎牛血清、100μg/ml链霉素和100U/ml青霉素。待细胞贴壁后，换为含1%胎牛血清的DMEM高糖培养液，并在培养液中加入以下试剂：罗格列酮、曲西立滨或DMSO。其中，

单独处理组1：加入罗格列酮（20μM）；

单独处理组2：加入曲西立滨（50μM）；

联合处理组：加入罗格列酮（20μM）+曲西立滨（50μM）；

对照组：加入与罗格列酮等体积的DMSO。

处理48h后，用胰酶将待测细胞从培养皿上消化下来，收集至离心管中，用PBS清洗一次，重悬于结合缓冲液中，并调整细胞浓度至1×10⁶个/ml。取100μl的细胞悬液至流式管中，加入5μl Annexin V和5μl 7-AAD，室温避光孵育15 min，然后再加入400μl的结合缓冲液，混匀后用流式细胞仪检测细胞凋亡情况，结果如图2A2所示。

从图2A2中可以看出，罗格列酮和曲西立滨联合处理组与罗格列酮单独处理组和曲西立滨单独处理组相比，罗格列酮和曲西立滨联合处理组能够显著引起细胞凋亡。

（三）、PPARγ激动剂15d-PGJ₂与ＡＫＴ抑制剂曲西立滨联合对肝癌细胞成球能力的影响，仅以Huh7细胞进行举例，但并不限制在其他肝癌细胞系的应用

将Huh7细胞用含1×B27、EGF (20 ng/ml) 和bFGF (20 ng/ml) 的1:1DMEM/F12培养液重悬成单细胞悬液，接种于低吸附型24孔培养板中，每孔250个细胞，分成4组，其中：

单独处理组1：加入15d-PGJ₂（0.5μg/ml）；

单独处理组2：加入曲西立滨（50μM）；

联合处理组：加入15d-PGJ₂（0.5μg/ml）+曲西立滨（50μM）；

对照组：加入与15d-PGJ₂等体积的DMSO。

细胞处理7d后，显微镜下观察、计数并拍照其成球情况，结果如图2B所示。

从图2B中可以看出，PPARγ激动剂15d-PGJ₂和ＡＫＴ抑制剂曲西立滨联合处理能够有效抑制Huh7细胞的成球能力。

（四）、PPARγ激动剂15d-PGJ₂与ＡＫＴ抑制剂曲西立滨联合对肝癌细胞中CD133⁺肿瘤起始细胞样亚群的影响，仅以Huh7细胞进行举例，但并不限制在其他肝癌细胞系的应用

Huh7细胞在37℃、5% CO₂及饱和湿度的条件下进行培养，细胞维持培养基为DMEM高糖培养液，包含10%胎牛血清、100μg/ml链霉素和100U/ml青霉素。待细胞贴壁后，换为含1%胎牛血清的DMEM高糖培养液。并在培养液中加入以下试剂：15d-PGJ₂、曲西立滨或DMSO。

其中，

单独处理组1：加入15d-PGJ₂（0.5μg/ml）；

单独处理组2：加入曲西立滨（10μM）；

单独处理组3：加入曲西立滨（50μM）；

联合处理组1：加入15d-PGJ₂（0.5μg/ml）+曲西立滨（10μM）；

联合处理组2：加入15d-PGJ₂（0.5μg/ml）+曲西立滨（50μM）；

对照组：加入与15d-PGJ₂等体积的DMSO。

用胰酶消化、收集待分析或分选的细胞于流式管中，用含0.5% BSA的PBS洗2次，每次200-300×g，离心5min，去上清。以10⁶个/ml的细胞浓度，加入100 μl的含有荧光素PE标记的鼠抗人CD133单克隆抗体（1:40）的10%山羊血清，重悬细胞，4℃避光孵育30min。接着用1ml含0.5% BSA的PBS洗2次，每次200-300 ×g，离心5 min，去上清。以10⁶个/ml的细胞浓度，加入100μl的含1/500 7-AAD的PBS重悬细胞，室温避光孵育5min。最后加入一定量含0.5%BSA的PBS，以标准程序用FACS Calibur^TM流式细胞仪检测CD133的表达，结果如图2C所示。

从图2C中可以看出PPARγ激动剂15d-PGJ₂与曲西立滨联合处理的Huh7细胞中，CD133⁺细胞数量显著减少（其显著性差异P<0.05）。

（五）、PPARγ激动剂罗格列酮与ＡＫＴ抑制剂曲西立滨联合对肝癌细胞中CD133⁺肿瘤起始细胞样亚群的影响，仅以Huh7细胞进行举例，但并不限制在其他肝癌细胞系的应用

Huh7细胞在37℃、5% CO₂及饱和湿度的条件下进行培养，细胞维持培养基为DMEM高糖培养液，包含10%胎牛血清、100μg/ml链霉素和100U/ml青霉素。待细胞贴壁后，换为含1%胎牛血清的DMEM高糖培养液。并在培养液中加入以下试剂：罗格列酮、曲西立滨或DMSO。

其中，

单独处理组1：加入罗格列酮（20μM）；

单独处理组2：加入曲西立滨（50μM）；

联合处理组：加入罗格列酮（20μM）+曲西立滨（50μM）；

对照组：加入与罗格列酮等体积的DMSO。

用胰酶消化、收集待分析或分选的细胞于流式管中，用含0.5% BSA的PBS洗2次，每次200-300×g，离心5min，去上清。以10⁶个/ml的细胞浓度，加入100 μl的含有荧光素PE标记的鼠抗人CD133单克隆抗体（1:40）的10%山羊血清，重悬细胞，4℃避光孵育30min。接着用1ml含0.5% BSA的PBS洗2次，每次200-300 ×g，离心5 min，去上清。以10⁶个/ml的细胞浓度，加入100μl的含1/500 7-AAD的PBS重悬细胞，室温避光孵育5min。最后加入一定量含0.5%BSA的PBS，以标准程序用FACS Calibur^TM流式细胞仪检测CD133的表达，结果如图2D所示。

从图2D中可以看出PPARγ激动剂罗格列酮与曲西立滨联合处理的Huh7细胞中，CD133⁺细胞数量显著减少（其显著性差异P<0.05）。

综上所述，PPARγ激动剂15d-PGJ₂与AKT抑制剂曲西立滨的联合或PPARγ激动剂罗格列酮与AKT抑制剂曲西立滨的联合均能协同抑制肝癌细胞的生长及干性表型。

实施例3

PPARγ激动剂和AKT抑制剂协同抑制肿瘤生长

（一）、PPARγ激动剂罗格列酮与AKT抑制剂曲西立滨协同对肿瘤生长的影响，仅以Huh7细胞进行举例，但并不限制在其他肝癌细胞系的应用

将稳定表达绿色荧光蛋白即GFP的Huh7细胞体外正常培养，用胰酶消化对数生长期的Huh7细胞，先用PBS洗2次，然后用PBS将Huh7细胞浓度调成2×10⁷个细胞/ml，每只裸鼠皮下注射100μl，皮下荷瘤4天后开始给药，具体给药方式如图3A所示，分为4组：对照组、罗格列酮处理组（100mg/kg/day，灌胃给药）、曲西立滨处理组（1mg/kg/day，腹腔给药）以及序贯联合给药组：

对照组：腹腔注射100μlPBS或灌胃给500μl的水；

罗格列酮组：通过灌胃给药500μl含罗格列酮（100mg/kg/day）的水；

曲西立滨组：通过腹腔给药100μl含曲西立滨（1mg/kg/day）的PBS；

罗格列酮和曲西立滨序贯联合给药组：通过灌胃给药500μl含罗格列酮（100mg/kg/day）的水或通过腹腔注射100μl含曲西立滨（1mg/kg/day）的PBS。

每天用游标卡尺对肿瘤大小进行测量，最终肿瘤体积=长*（宽）²。最终结果如图3B所示。

从图3B中可以看出，罗格列酮和曲西立滨序贯联合给药组的肿瘤生长显著慢于单独给药组及对照组，显著性差异P<0.05。

给药14天后，无痛苦处死小鼠。从皮下剥离出肿瘤组织称重，结果见图3C，从图3C中可以看出，序贯联合给药组在实验结束时所形成的肿瘤的重量显著小于对照组，其抑制率为67.6%（显著性差异P<0.05），其比罗格列酮单独给药组在抑制肿瘤生长方面的抑制率增加了42%、比曲西立滨单独给药组在抑制肿瘤生长方面的抑制率增加了30.5%。

（二）、PPARγ激动剂与AKT抑制剂曲西立滨协同对肿瘤细胞中CD133⁺肿瘤起始细胞样亚群比例的影响，仅以Huh7细胞进行举例，但并不限制在其他肝癌细胞系的应用

上述（一）中各组所形成的肿瘤从皮下剥离出来后，取部分肿瘤组织放入盛有肿瘤消化液的1.5ml EP管中，用手术剪剪碎。移入盛有5ml肿瘤消化液的50ml离心管中，于空气摇床中37℃，150rpm摇1.5h。用100μm滤网过滤，4℃，1500 rpm离心5 min。去上清，加入10mL含0.5%BSA的PBS，4℃，1500 rpm离心5min。去上清，加入5mL红细胞裂解液（即将红细胞裂解母液用水10倍稀释所得到的液体），轻轻摇匀，静置5~10 min。加入20mL含0.5%BSA的PBS终止反应，4℃，1500 rpm离心5min。去上清，加入10mL含0.5%BSA的PBS，4℃，1500 rpm离心5min。以10⁶个/ml的细胞浓度，加入100μl的含有荧光素PE标记的鼠抗人CD133单克隆抗体（1:40）的10%山羊血清，重悬细胞，4℃避光孵育30min。接着用1ml含0.5% BSA的PBS洗2次，每次200-300×g，离心5 min，去上清。以10⁶个/ml的细胞浓度，加入100μl的含1/500 7-AAD的PBS重悬细胞，室温避光孵育5min。最后加入一定量含0.5%BSA的PBS，以标准程序用FACS Calibur^TM流式细胞仪检测CD133的表达，结果见图3D。

从图3D中可以看出，罗格列酮单独处理组及罗格列酮与曲西立滨序贯联合给药组都能够显著抑制CD133⁺肿瘤起始细胞样亚群的比例（显著性差异P<0.05）。

综上所述，即由PPARγ激动剂罗格列酮与AKT抑制剂曲西立滨联合组成的肝癌细胞抑制剂，能有效地协同抑制HCC肿瘤起始细胞亚群以及有效地抑制肿瘤生长，为临床治疗HCC提供了可能的有效治疗策略。

以上所述仅是本发明的实施方式的举例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。