一对转录激活子样效应因子核酸酶L3和R1及其编码基因与应用

摘要

本发明公开了一对转录激活子样效应因子核酸酶及其编码基因与应用。这对转录激活子样效应因子核酸酶（TALEN）由一对DNA识别蛋白分别与Fok1DNA内切酶的两个异源亚基融合得到，可以特异性地识别人RHD或RHCE基因exon1上的两个相邻位点。将这对转录激活子样效应因子核酸酶同时转入宿主细胞时，其能对宿主细胞基因的exon1位点打靶，并使打靶位点发生基因突变，从而实现对人RHCE或RHD基因的靶向修饰，具有特异性强、打靶效率高、准确度高等优点。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一对转录激活子样效应因子核酸酶及其编码 基因与应用。

背景技术

常见的血型系统除了ABO血型，还有Rh血型。Rh血型分为Rh+和Rh-。RH阳性者 可以接受RH阴性者的血液，但RH阴性者不能接受RH阳性者血液，因为RH阳性血液 中的抗原将刺激RH阴性人体产生RH抗体。如果再次输入RH阳性血液，即可导致溶 血性输血反应。而根据有关资料介绍，Rh阳性血型在中国汉族及大多数民族人中约占 99.7%，所以造成在我国Rh-的血型极为稀少，有很多病人因为没有合适配型的血液而 失去生命。因此Rh-血也有熊猫血之称。

已经鉴定出的Rh血型系统的抗原有50多种，其中抗原D,C,c,E,和e是最 要的。其中抗原D由RHD基因表达，抗原C，c,E,e由RHCE基因表达，如果能把该两 个基因敲除，则RH阳性的血液则变成RH阴性。

因RHD基因和RHCE基因同源性较高，本发明针对RHD基因和RHCE基因中的一段 完全相同的序列，设计TALEN，已达到基因敲除的目的

按照人类的意愿对基因组进行定向靶向修饰一直是许多科学家的梦想。在内源的 基因组上特异地删除或加入我们需要的序列，这样可以构建出各种动物模型用于生物 学基础研究和疾病机理研究

人们一直没有找到简单高效的方法对基因组进行基因组靶向修饰。传统的基因打 靶技术依赖于细胞内自然发生的同源染色体随机交换，其打靶效率非常低，通常只有 10^-6-10^-8，这种打靶方法只在小鼠中得到了广泛了应用，而在其他模式动物及大型哺 乳动物中都因效率太低而得不到广泛应用。

近年发展很快的序列特异的核酸酶可以用于精确的基因组靶向修饰。一般由序列 特异的核酸酶由一个DNA识别结构域和一个非特异性核酸内切酶结构域构成。原理是 首先由DNA识别域把核酸酶定位到需要编辑的基因组区域，然后非特异性核酸内切酶 切断双链DNA从而造成DNA双链断裂（double-strand break，DSB），引入的DSB激 活的DNA自我修复可以引起基因的突变和促进该位点DNA同源重组。锌指核酸酶 （Zinc-finger nucleases，ZFN）是现在研究最清楚也是应用最广的序列特异的核酸 酶。其原理是两个锌指蛋白特异识别两段相隔5-7bp的DNA序列，并把与之融合表达 的非特异性DNA切割蛋白Fok1的两个单聚体定位到了一起，DNA切割蛋白形成双聚体 时可以切断该位置的双链DNA，从而造成DSB。ZFN的出现使基因组靶向修饰技术向前 迈进了一大步，然而，ZFN技术还存在靶向不确定性、效率低、拖把率高等问题，研 究者很难自行设计出特异和高效的靶向基因组目的序列的锌指核酸酶仍然是制约ZFN 广泛应用的瓶颈。而商业购买高效特异的锌指核酸酶又价格昂贵（20万人民币/基因）， 一般研究者或商业公司根本无法承受这笔费用。

2009年两个研究组发现植物病原体Xanthomonas中的一种可以调节植物基因表达 的转录激活子样效应因子（transcription activator-like effector，TALE）表现出 DNA结合特异性，而其识别密码具有模块化和简单化的特点，为科学家们开发出更简 易的新型基因组靶向修饰技术带来了新希望。

TALE与Fok1融合后即形成转录激活子样效应因子核酸酶（transcription  activator-like effector nucleases，TALEN）。TALEN的打靶原理与ZFN相同，只 是识别特异DNA的蛋白不同。TALEs由数十个特异性识别DNA的串联“蛋白模块”和 两侧的N-末端及C-末端序列组成。每个“蛋白模块”包含34个氨基酸，第12和13 位残基是靶向识别的关键位点，被称作重复可变的di-residues（RVDs）位点。然而 不同于每个锌指蛋白识别特异性的三联体碱基，TALEs上的每个RVDs仅能识别一个碱 基。

Sangamo BioSciences公司和哈佛大学的两个研究小组分别利用TALEs技术进行 了基因组靶向修饰相关研究，两篇研究论文发表在同一期的《自然生物技术》（Nature  Biotechnology）杂志上。

Edward Rebar领导的研究小组将带有不同C-末端TALE的截短片段连接到核酸酶 FokI的催化结构域上。当研究人员将构建的TALENs靶向内源性的人类NTF3和CCR5 基因时，证实TALENs能够特异性地对这些基因片段进行剪切。哈佛大学研究小组开发 了一种基于分层连接的策略来构建包含12个重复模块的TALEs。他们在保留RVDs的 基础上减少了每个模块的DNA序列，同时将剩余序列的重复性降到最低。进而通过12 重PCR获得了带有特异性连接序列的单体，并将其克隆至包含TALE N-末端和C-末端 序列的骨架载体中。为了构建TALE转录因子，研究人员又将TALE融合到一个转录因 子的激活域。在接下来的靶向性检测中，研究人员证实其能特异地使四个检测内源基 因中的两个基因表达上调。

今年7月MIT的Rudolf Jaenisch小组也验证了TALEN在人胚胎干细胞和人iPSC 中的打靶效果。其通过在五个位点的TALENs与之前其在相同位置的ZFNs的打靶效果 作对比，得出五组TALENs在打靶效率和精确度上都与从Sangamo BioSciences公司购 买的ZFNs相似，进一步验证了TALENs是非常好的基因组编辑工具。

发明内容

本发明提供了一对短肽，利用这对短肽构建获得的一对转录激活子样效应因子 （TALE）能够特异性地识别人RHD基因或RHCE基因组上的二段相邻核苷酸；利用这对 转录激活子样效应因子构建获得的一对转录激活子样效应因子核酸酶（TALEN），能够 对人RHD基因或RHCE基因进行准确、高效地打靶。

一对短肽，所述一对短肽分别具有如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的氨基酸 序列。

本发明提供了一对多核苷酸，所述一对多核苷酸分别编码上述的一对短肽。

优选地，所述一对多核苷酸分别具有如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的碱基 序列。

其中，所述的多核苷酸由分别识别人RHCE基因或RHD基因上核苷酸序列中相应碱 基的TALENs识别模块依序连接而成，其中，识别碱基A的TALENs识别模块为NIA， 识别碱基T的TALENs识别模块为NG-T，识别碱基C的TALENs识别模块为HD-C，识别 碱基G的TALENs识别模块为NK-G。

本发明还提供了一对蛋白质，所述一对蛋白质由上述的一对短肽两端分别加上转 录激活子样效应因子氨基酸序列框架的N端和C端组成；其中，所述的转录激活子样 效应因子氨基酸序列框架的N端和C端为天然的或经过人工改造的序列。

这对蛋白质可以分别特异性地识别人RHD基因或RHCE基因上的二段核苷酸序列， 所述二段核苷酸序列分别选自以下二个核苷酸序列：

（1）ctcattctcctct（SEQ ID NO:17序列）或者该序列的一个或二个核苷酸经 过取代所衍生的核苷酸序列；

（2）ctaaggaagcgtcatagt（SEQ ID NO:18序列）或该序列的一个或二个核 苷酸经过取代所衍生的核苷酸序列。

优选地，所述的这对蛋白质分别具有如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的氨基 酸序列。该蛋白质为转录激活子样效应因子，命名为RH-TALE-L3和RH-TALE-R1。

本发明还提供了一对多核苷酸，所述一对多核苷酸分别编码上述的一对蛋白质。

优选地，所述一对多核苷酸分别具有如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的碱基 序列。

本发明还提供了一对融合蛋白，所述一对融合蛋白由上述的一对蛋白质分别与 DNA切割蛋白融合而成。

优选地，所述的DNA切割蛋白为DNA内切酶。

优选地，所述的一对蛋白质分别与DNA切割蛋白的二个亚基融合。

更优选地，所述的DNA切割蛋白为天然的或经过人工改造的Fok1 DNA内切酶。

最优选地，所述一对融合蛋白分别具有如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的氨 基酸序列。该融合蛋白为转录激活子样效应因子核酸酶，命名为RH-TALEN-L3和 RH-TALEN-R1。

本发明还提供了一对多核苷酸，所述一对多核苷酸分别编码上述的一对融合蛋白 质。

优选地，所述一对多核苷酸分别具有如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示的碱 基序列。

本发明还提供了一种包含上述一对多核苷酸中的任意一条多核苷酸的重组载体。

优选地，可以先将能特异性识别SEQ ID NO.17或SEQ ID NO.22所示碱基序列的 多核苷酸连接到中间载体pCMV-NLS-TALE backbone-Fok1(R)-intermediate上，再将 该中间载体连接到最终载体pEF1a-NLS-TALE backbone-Fok1(R)-pA或最终载体 pEF1a-NLS-TALE backbone-Fok1(L)-IRES-PUROpA上，构建获得包含编码转录激活子 样效应因子核酸酶基因的质粒载体，能表达转录激活子样效应因子核酸酶。

本发明还提供了一种用上述重组载体转化的宿主细胞。

优选地，所述宿主细胞为人离体细胞；更优选地，所述宿主细胞为人293T细胞。

本发明还提供了一种上述一对融合蛋白或上述一对多核苷酸在对人RHD基因或 RHCE基因靶向修饰中的应用。

优选地，所述一对融合蛋白分别具有如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的氨基 酸序列；所述一对多核苷酸分别具有如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示的碱基序 列。

本发明还提供了一种人RHD基因或RHCE基因基因打靶的方法，包括：将上述一对 融合蛋白或者上述一对多核苷酸或者含有这对多核苷酸的载体转入人离体细胞，于 30-37℃扩增培养1-4天，得到朊蛋白基因被靶向修饰的细胞。

优选地，所述一对融合蛋白分别具有如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的氨基 酸序列；所述一对多核苷酸分别具有如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示的碱基序 列。

优选地，所述人离体细胞中还转入有抗puro蛋白或能表达抗puro蛋白的质粒， 便于筛选。

本发明针对人RHD基因或RHCE基因的一个位点设计了一对转录激活子样效应因子 核酸酶（RH-TALEN-L3和RH-TALEN-R1），这对TALENs分别由可以识别RHD或RHCE基 因上一段核苷酸的DNA识别结构域与一个Fok1 DNA内切酶的两个异源亚基融合得到。 将这对转录激活子样效应因子核酸酶同时转入宿主细胞时，其能对宿主细胞RHD基因 或RHCE基因的位点打靶，并使打靶位点发生基因突变，包括碱基缺失、碱基插入等， 从而实现对人RHD基因或RHCE基因的靶向修饰，具有特异性强、打靶效率高、准确度 高等优点。

附图说明

图1为人工设计的转录激活子样效应因子核酸酶识别的DNA序列及位点；

图2为18个识别模块连接策略示意图；其中，

A：PCR为每个识别模块添加酶切识别序列和连接接头过程示意图；

B：PCR为每个识别模块添加酶切识别序列和连接接头后示意图；

C：PCR扩增6模块片段与中间载体示意图；

D:最终构建的TALEN质粒示意图；

图3为中间载体pCMV-NLS-TALE backbone-Fok1(R)-intermediate示意图；

图4为最终载体pEF1a-NLS-TALE backboneFok1(R)pA示意图；

图5为最终载体pEF1a-NLS-TALE backboneFok1(L)-IRESPURO-pA示意图；

图6为基因在打靶位点的基因型变化；其中，-表示碱基缺失，+表示碱基插入。

具体实施方式

以下实施例中所使用的技术，包括PCR扩增与检测、细胞转染等分子生物学技术， 以及细胞培养、检测技术等，除非特别说明，均为本领域内的技术人员已知的常规技 术；所使用的仪器设备、试剂和细胞系等，除非是本说明书特别注明，均为一般本领 域的研究和技术人员可以通过公共途径获得的。

实施例1TALENs靶序列的设计

1、从NCBI上下载人RHCE基因（GENE ID：6006）和RHD基因组序列（GENE ID： 6007）

2、设计引物并PCR扩增基因组上打靶位点片段，并测序，其中，PCR引物及测序 引物见表1；

表1

3、设计TALENs识别序列（靶序列）：

根据测序得到的序列，并依照以下原则确定TALENs识别序列：

（1）第0位碱基为T（识别序列第一位之前的碱基为第0位）

（2）最后一位碱基为T

（3）识别序列长度在13-19之间

（4）二个识别序列之间的间隔序列（Spacer）长度控制在14-21之间（12,13 也可，但效率可能较低）

设计得到的靶序列位置如图1所示，具体序列见表2。

表2

  TALE名称   靶序列   RH-Tale-L1（SEQ ID NO:13）   ctcattctcctcttct   RH-Tale-L2（SEQ ID NO:14）   ctcattctcctctt   RH-Tale-L3（SEQ ID NO:1）   ctcattctcctct   RH-Tale-R1（SEQ ID NO:15）   ctaaggaagcgtcatagt   RH-Tale-R2（SEQ ID NO:16）   ctaaggaagcgtcat   RH-Tale-R3（SEQ ID NO:2）   ctaaggaagcgt

实施例2TALENs识别模块之间的连接及重组载体的构建

1、TALENs识别模块（modular）的获得

（1）合成分别识别碱基A、T、C、G的四个识别模块NI、NG、HD、NK， 序列见表3。

表3

（2）将四个片段连入pEASY-B载体（购自北京全式金公司），连接方法为：

①取PCR产物3μl；②加入1μl pEASY-B载体；③25℃，7min；④转化DH5a感 受态细胞，涂布卡纳霉素平板；⑤挑取克隆、小量提取质粒、酶切、测序，最后得到 连接到载体pEASY-B中的识别模块NI、NG、HD、NK。

2、识别模块之间的连接

连接策略：以19个识别模块的连接为例，说明连接策略。因最后一个可以识别碱 基T的半个模块已在载体上，所以只要连18个模块即可，连接示意图见图2。

（1）将识别序列（靶序列）分为三个部分（分别为表2中原序列S去掉最后一个 碱基，如下所示），即每条识别序列先分为三段，每段含有3-6个碱基，相应地每段对 应3-6个识别模块，先以每段为单位，将该段的3-6个识别模块连接。

（2）3-6个识别模块之间的连接方法

①PCR扩增添加酶切识别序列和连接接头

以6个识别模块之间的连接为例：图2（A）为6个模块PCR添加酶切识别序列和 连接接头过程示意图，其中引物F1、F7、F8、R6、R7、R8带有Bbs1酶切识别序列， 引物F2、F3、F4、F5、R1、R2、R3、R4、R5带有Bsa1酶切识别序列。Bbs1识别序列 为GAAGACNN‘NNNN，Bsa1的识别序列为GGTCTCN‘NNNN，这两个酶都属于typeIIs enzymes，同一个酶切识别序列可以产生多个粘性识别末端，理论上可以产生4⁴个粘 性识别末端，再加上每个模块的结尾和开头Gly密码子4种，Leu密码子6种的限制， 利用一个typeIIs enzyme可以产生24种接头。我们选取其中的16种设计了引物， 除了F1与R8外，F_n可与R_n+1的粘性末端相连，而不能与其他引物上的粘性末端相连。

同样地，如果是5模块，4模块，3模块连接，则分别在第4，第3，第2个连接 模块添加F4R6，F3R6，F2R6引物即可，相应的前面的模块和最后一个模块加的引物保 持不变，连接的片段数则相应的减少1、2、3个模块片段。

各个引物序列见表4。

表4

注：小写加粗字母为酶切位点的识别序列

PCR扩增体系（50μl）为：DNA模板（Template）：0.5μl（约50ng）；引物（Primer）： 每个1μl（50μM）；LA Taq酶（Takara）：0.3μl；10×缓冲液（buffer）：5μl；dNTP： 2.5μl（2.5μM）；ddH₂O：40.7μl。

PCR程序：95℃2min；95℃15s，55.8℃30s，72℃11s，36个循环；72℃ 延长10min。

PCR后即可得到如图2（B）中的片段，每个模块按照目的结合序列被加上不同的 内切酶识别序列和不同的接头，相同颜色的两个接头表示两者产生的粘性末端可以相 连。

②纯化

将所得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，确定浓度。使用天根公司的通用型DNA 纯化回收试剂盒（离心柱型）纯化PCR片段，纯化后在进行琼脂糖凝胶电泳标定各个 产物的浓度。

③酶切连接

因相邻的模块连接后不再能被Bsa1切开所以本连接可以酶切连接同时进行，酶切 连接体系为：模块：100ng/模块(3-6)；Bsa1(NEB):1μl；T4连接酶(fermentas): 1μl；T4连接酶缓冲液(NEB):2μl；ddH₂O:补至20μl。

PCR酶切连接程序：37℃5min，20℃5min，3545个循环；80℃10min。

（3）将三段3-6模块的片段连接到中间载体pCMV-NLS-TALE  backbone-Fok1(R)-intermediate上

①扩增3-6模块片段

将上一步骤酶切连接的20μl产物全部进行琼脂糖凝胶电泳，会出现一个模块长 度倍数大小的一个数条有梯度的条带，切胶回收最上面的条带。把切回的小块凝胶小 心地放在带滤膜的200μl移液枪的枪头中，把枪头放在1.5ml离心管（EP管）中； 以最大转速离心5min，离心后用200μl的移液枪将枪头中没有全部甩到离心管中的 液体全部吹到离心管中；离心下来的液体既可作为PCR扩增多模块片段的模板之用。 PCR扩增的引物为F-assem和R-assem，序列见表5。

表5

  引物名称   引物序列   F-assem   CGGGAGCCGACGTCGACAG   R-assem   CGCTCGAGCGACACGCAGG

PCR体系（50μl）：模板：2μl；引物：each0.5μl（50μM）；Accuprime pfx: 0.3μl；10×缓冲液:5μl；ddH₂O:42.2μl。

PCR程序：95℃2min；95℃15s，64℃30s，68℃50s，35个循环；68℃ 延长10min。

②纯化PCR产物

将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，确认有无杂带以及目的条带的浓度。如果无杂 带或杂带相对于目的条带比例很低则用直接Kit纯化PCR产物；如果杂带较多则需要 胶回收纯化。纯化后电泳标定条带浓度。

③酶切中间载体pCMV-NLS-TALE backbone-Fok1(R)-intermediate

因最终载体上有bbs1酶切位点，而与3个3-6模块片段连接时，连接与bbs1的 酶切是同时进行的。所以不能直接连到最终载体上，而只能先连到没有bbs1酶切位点 的中间载体上。中间载体的示意图见图3。

中间载体酶切体系：质粒：5μg；BsmB1:2μl；DTT（100mM）：1μl；ddH₂O:补 足100μl。

37℃酶切过夜，酶切中每过两个小时补0.5μl BsmB1，并混匀，最好换一个管 子，以消除钉在管壁上未被酶切的环形质粒。酶切好后电泳确定质粒是否已全部线性 化。确定好后，Kit纯化酶切产物，电泳标定载体浓度。

④三片段与中间载体的连接

与Bsa1相同，Bbs1也是type IIs enzyme，酶切产生的粘性末端连接后是不能被 该酶切开的，所以这个连接也可以酶切连接同时进行的。

载体：100ng；模块：200ng/模块；Bbs1(fermentas):1μl；T4连接酶(fermentas): 1μl；T4连接酶缓冲液(NEB):2μl；ddH₂O:补至20μl。

酶切连接程序：PCR程序：37℃5min，20℃5min，3545个循环；80℃10min。

⑤转染，挑选克隆，小量提取质粒，酶切鉴定，测序鉴定

连接完后取10μl转化DH5a感受态，剩下的10μl于-20℃冻存。第二天挑一定 数量的单克隆（大于10个/板），第三天小量提取质粒，得到的质粒用BamH1和Pst1 酶切鉴定，连接正确的应该有2kb左右的条带，而自连的会有约550bp条带。酶切正 确后送测序，测序正确即可得到14-19个片段连接成功克隆了。测序引物见表6，其 中，连接成功的RH-TALE-L3和RH-TALE-R1的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:5，SEQ ID  NO:6所示；RH-TALE-L3中的12.5个模块的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，RH-TALE-R1 中的17.5个模块的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

表6

  引物名称  引物序列   TALE-正向测序  CTCCCCTTCAGCTGGACAC   TALE-反向测序  AGCTGGGCCACGATTGAC

（4）将连接入中间载体并测序正确的片段连入最终载体pEF1a-NLS-TALE  backbone-Fok1(R)-pA与pEF1a-NLS-TALE backbone-Fok1(L)-IRES-PURO-pA

最终载体pEF1a-NLS-TALEbackbone-Fok1(R)-pA与pEF1a-NLS-TALE  backbone-Fok1(L)-IRES-PURO-pA是在ZFN载体（购于Sigma公司）的基础上，用 BamHI+KpnI酶切后加上TALEN的N末端和C末端后得到的。最终载体的示意图见图4 与图5。

将连有正确片段的中间载体与两个最终载体同时用BamH1和Pst1双酶切，切胶回 收相应的片段。按照设计时的左右顺序将含有Modulars的TALE连入最终载体的左右 两个载体上。连接、转染、挑取克隆、小量抽取质粒，BamH1和Pst1双酶切鉴定，测 序鉴定。鉴定正确的克隆即为最终我们需要的TALENs质粒。

实施例3质粒的转染人293T细胞

1、在6孔板每个孔中加入100μl基质胶，来回晃动，使之铺满整个孔的底部， 铺好后置于5%CO₂培养箱中30min。

2、将培养IPS细胞T25瓶中的培养基吸出，PBS吸一遍，加入1mL0.25%胰酶， 来回晃动，使其均匀覆盖瓶底，置于5%CO₂培养箱中5min。

3、消化完成后加入1ml10%DMEM中和胰酶，将消化下来的细胞转移至15ml离心 管中，细胞计数，离心，1200rpm，5min。

4、用适量的10%DMEM重悬细胞，取200万293T细胞置于已铺好基质胶的6孔板 中，加入2ml新鲜的10%DMEM。

5、传代同时进行转染。

6、将构建好的RH-TALEN-L1，RH-TALEN-L2，RH-TALEN--L3，RH-TALEN-R1， RH-TALEN-R2，RH-TALEN-R3按表7两两配对组合转染细胞，共12种组合。

表7

  RHCE-TALEN-R1   RHCE-TALEN-R2   RHCE-TALEN-R3   RH-TALEN-L1   L1+R1   L1+R2   L1+R3   RH-TALEN-L2   L2+R1   L2+R2   L2+R3   RH-TALEN-L3   L3+R1   L3+R2   L3+R3

根据下列方案混合质粒、转染试剂和介质溶液：

体系中各成分的比例：TALEN-L：TALEN-R：Lv-EF1a-Mcherry=5:5:2

总DNA：opti MEM=2μg：100μl

总DNA：Fμgene=2μg：5μl

7、转染后第二天，即可在荧光显微镜下观察Mcherry荧光亮度以及转染效率。若 转染成功，则将6孔中的培养基吸掉，加入2.0μg/ml puro的2ml新鲜的10%DMEM。

8、置于5%CO₂培养箱中37℃培养两天，每天换2.0μg/ml puro的2ml新鲜的 10%DMEM培养液。

9、撤掉药杀，37℃的5%CO₂培养箱中培养至细胞量够抽基因鉴定之用，培养液换 为2ml10%DMEM。

实施例4细胞打靶鉴定

1、将药杀后的6孔板中用加入300μl0.25%胰酶，来回晃匀。37℃放置5min， 用枪吹打使所有细胞都被消化下来。

2、将300μl液体吸入1.5ml EP管中，用400μl的PBS洗6孔板两次，也加入 EP管中。

3、13200rpm/min离心5min，弃去上清液。

4、用直接PCRKit（thermo货号：F-140）抽提基因组，并PCR扩增打靶区域DNA 片段。

5、鉴定打靶细胞的基因型及打靶效率

将上述的RH-TALEN-L3/RH-TALEN-R1组合处理的293T细胞的基因组的PCR片段 加A后连入PMD18-T载体中，单克隆化DNA片段，送测序后得到RHD或RHCE基因的打 靶位点的基因型。

加A体系为：DNA：10μl

rTaq:0.5μl

10xbuffer：1.5

dNTP：0.5μl

ddH2O：2.5μl

然后混匀，置于72℃20min。

结果显示：共送30个样品测序有4个克隆发生了突变，见图6。其中三个克隆发 生了碱基删除，一个克隆发生了碱基插入。因为293T是三倍体，在假设细胞中没有双 敲除或三敲除的前提下，RH-TALEN-L3/RH-TALEN-R1组合使RH基因发生了突变的概 率是4/30*3，即40%。本研究只在RH基因的一个位点设计了TALENs分子就得到可以 定点修饰该基因的一对TALENs，并且效率非常高。可见TALENs技术的相较于ZFN技 术的优越性。该对多核苷酸可以识别SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18的核苷酸序列， 而且可以识别这二个序列的一个或二个核苷酸被取代后所衍生的核苷酸序列。该对多 核苷酸或其表达的融合蛋白是可以对人基因高效打靶的TALENs，它们为通过同源重组 修正RHD或RHCE基因的的突变或其他基因修饰提供了一个非常高效的工具。通过用本 发明多核苷酸转染人离体细胞或者将本发明融合蛋白注入人离体细胞中，可以促进同 源重组，插入目的基因，获得高经济价值的蛋白。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术 人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书 所限定的范围。