ath-eTM160在抑制microRNA160功能中的应用

摘要

本发明公开了ath-eTM160在抑制microRNA160功能中的应用。本发明提供的DNA分子，为如下(1）-(3）中任一一种的DNA分子：(1）序列表中的序列1自5′末端第8-187位核苷酸所示的DNA分子；(2）在严格条件下与（1）限定的DNA序列杂交且具有相同功能的DNA分子；(3）与（1）限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且具有相同功能的DNA分子。本发明的实验证明，在拟南芥中获得一段基因ath-eTM160，将其转入拟南芥中过表达，发现其可以抑制拟南芥中microRNA160的表达。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种ath-eTM160及其在抑制microRNA160 功能中的应用。

背景技术

MicroRNA（miRNA）是一类重要的小分子RNA，它们参与调控植物的生长发育以及 胁迫反应等多个途径。在植物中，miRNA主要通过降解靶基因的方式发挥作用。首先， 成熟的miRNA通过碱基互补匹配的方式与靶基因结合，然后引起结合位置靶基因mRNA 的切割（切割主要发生在互补区域的10与11位之间），进而导致靶基因的降解。最近， 有研究者报道了一个IPS1基因，虽然该基因能部分的与miR399序列互补匹配，但在 切割位置上IPS1形成3个碱基的凸起，该凸起使IPS1不能被miR399切割，也就不能 被降解。当细胞内高表达IPS1时，其与miR399结合，这导致miR399不能与其靶基因 结合，进而使其靶基因不受miR399调控。IPS1被称为内源的模拟靶基因（endogenous  Target Mimic-eTM）。IPS1可以作为抑制miR399的工具，应用于miR399的相关研究。 而其它miRNA的内源模拟靶基因未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种ath-eTM160及其在抑制microRNA160功能中的应用。

本发明提供的DNA分子，为一种内源DNA分子，命名为ath-eTM160，其为如下 (1）-(3）中任一一种的DNA分子：

(1）序列表中的序列1自5′末端第8-187位核苷酸所示的DNA分子；

(2）在严格条件下与（1）限定的DNA序列杂交且具有相同功能的DNA分子；

(3）与（1）限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少 具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98% 或至少具有99%同源性且具有相同功能的DNA分子。

上述严格条件可为如下：在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65°C下杂交,然后 用2×SSC,0.1%SDS和1×SSC,0.1%SDS各洗膜一次。

含有上述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本发明保护 的范围。

上述重组载体为将上述DNA分子插入表达载体中，得到的重组载体。在本发明的 实施例中，重组载体为序列表中的序列1自5′末端第8-187位核苷酸插入pCAMBIA1300 的Xba Ⅰ和Sac Ⅰ酶切位点间得到的载体

扩增上述DNA分子的全长或其任意片段的引物对也是本发明保护的范围。

上述DNA分子或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在调控植物中 microRNA160表达或其靶基因表达或改变植物叶片形状中的应用也是本发明保护的 范围；其中，所述microRNA160的核苷酸序列为序列表中的序列5。

上述应用中，所述microRNA160的靶基因为ARF10、ARF16和/或ARF17。ARF10 的核苷酸序列为序列表中的序列2；ARF16的核苷酸序列为序列表中的序列3；ARF17 的核苷酸序列为序列表中的序列4。

上述应用中，所述调控植物中microRNA160表达为抑制植物中microRNA160表 达；所述调控植物中microRNA160靶基因表达为提高植物中microRNA160靶基因表 达；所述改变植物叶片形状为增强植物叶片边缘锯齿化；所述植物具体为双子叶植物 或单子叶植物，所述双子叶植物进一步具体为拟南芥。

上述抑制植物中microRNA160表达通过提高目的植物中microRNA160表达实现。

上述应用为将上述DNA分子导入目的植物，得到转基因植物；

所述转基因植物具有如下1）-3）中至少一种特征：

1）所述转基因植物中microRNA160表达量低于所述目的植物；

2）所述转基因植物中microRNA160的靶基因ARF10、ARF16和/或ARF17表达量 均高于所述目的植物；

3）所述转基因植物叶片边缘锯齿化。

上述DNA分子通过上述重组载体导入目的植物中。

上述应用中，所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物，所述双子叶植物具体为 拟南芥。

本发明的实验证明，本发明在拟南芥中获得一段DNA分子ath-eTM160，将其转入 拟南芥中过表达，发现其可以抑制拟南芥中microRNA160的表达，且同时提高 microRNA160靶基因的表达，也同时呈现叶片锯齿形加重。因此，该基因可以作为内 源工具来调控microRNA160的功能。

附图说明

图1为PCR扩增得到ath-eTM160

图2为转基因拟南芥的PCR鉴定

图3为拟南芥ath-eTM160抑制mi croRNA160的功能

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、ath-eTM160基因的获得

1、拟南芥总RNA的提取

1）Trizol法提取：

(1)取适量野生型拟南芥（Arabidopsis thaliana，购自ABRC，美国）材料（0.1g） 加入液氮研磨15min,至粉末状，将粉末倒入2mL离心管（约占1/2管），然后立即加 入1mL Trizol试剂。将粉末与Trizol试剂混匀，在室温下孵育5min,以便核酸蛋白 复合体完全解离。

(2)将离心管于4℃12000rpm离心15min。

(3)将上清液转移到新的2mL离心管中，并向其中加入等体积0.5ml氯仿，手动 剧烈振荡管体15s后，室温静至3min。

(4)将离心管于4℃12000rpm离心15min。

(5)将上层的水相转移至新的离心管中，向其中加入等体积的异丙醇以沉淀RNA。 混匀后，于－20℃静置10min。

(6)将离心管于4℃12000rpm离心10min。

(7)倒掉上清液，加入1mL 75%乙醇清洗RNA沉淀，振荡后，4℃12000rpm离心 3min。

(8)除去乙醇溶液，在超净台吹干。

(9)加入20μl不含RNA酶的水溶解沉淀，得到RNA溶液。

2）RNA的纯化（除DNA）

(1)将RNA溶液加水至39μl，按下表加入其余试剂，混匀。

混合溶液于37℃反应40min。

(2)向EP管内加入不含RNase的水450μl，使总体积达到500μl。

(3)向其中加入500μl水饱和酚，剧烈振荡，于4℃12000rpm离心10min。

(4)将上清液转移至新的离心管中，加入等体积氯仿，剧烈振荡，于4℃12000rpm 离心10min。

(5)将上清液转移至新的离心管中，加入等体积异丙醇，混匀。

(6)向离心管中加入1/10 V 3M NaAc溶液（pH 5.2）,-70℃放置过夜。

(7)于4℃12000rpm离心10min。

(8)倒掉上清液，加入1mL 75%乙醇清洗RNA沉淀，振荡后，4℃12000rpm离心 3min。

(9)除去乙醇溶液，在超净台吹干。

(10)加入20μl不含RNA酶的水溶解沉淀，得到总RNA。

2、拟南芥RNA的反转录

20μl的反转录反应体系中加入总RNA 5微克。

(1)按照以下体积把试剂和溶液加入PCR小管内

(2)70℃加热5min后迅速冰浴2min。

(3)向小管内按照以下体积加入试剂

(4)42℃反应1小时。

(5)95℃加热5min，终止反转录反应，得到cDNA。

3、ath-eTM160基因的获取

根据拟南芥基因组序列设计ath-eTM160的特异引物P1和P2，引物序列如下：

P1：ATCTAGATCTTCAGAGATGGCCTGACGA

P2：TGAGCTCAATCGTAATCCTAATCAGTGTT

以上面反转录得到的拟南芥cDNA为模板，扩增该基因，反应体系如下：

然后按照下列程序进行PCR扩增，

PCR结果如图1所示，M：Marker；P：PCR扩增产物，得到194bp的PCR产物。

将该PCR产物插入EZ-T载体（北京康润诚业生物科技有限公司）中，得到重组质 粒ath-eTM160-EZ-T，经过测序，该质粒上的PCR产物的核苷酸序列为序列表中的序 列1所示的核苷酸，其中序列表中的序列1自5’末端第8-187位核苷酸序列所示的 基因命名为ath-eTM160。

实施例2、转ath-eTM160拟南芥的获得及功能鉴定

一、转ath-eTM160拟南芥的获得

1、含有ath-eTM160过量表达重组载体的构建

将实施例1得到的质粒ath-eTM160-EZ-T用Xba Ⅰ和Sac Ⅰ限制性内切酶消化 ath-eTM160-EZ-T，回收约194bp的目的片断，同时用XbaⅠ和Sac Ⅰ限制性内切酶消 化表达载体pCAMBIA1300（购自CAMBIA，澳大利亚），回收载体片断，然后将目的片断 和载体片断连接，得到重组表达载体ath-eTM160-1300，将该重组表达载体送去测序， 结果该载体为将序列表中的序列1自5’末端第8-187位核苷酸插入pCAMBIA1300的 XbaⅠ和Sac Ⅰ酶切位点间得到的载体。

2、转ath-eTM160拟南芥的获得

将上述重组表达载体ath-eTM160-1300转入农杆菌AGL1（ATCC No.BAA-101，购 自ATCC）中，得到重组菌，提取该重组菌的质粒送去测序，该质粒为ath-eTM160-1300， 将含有该质粒的重组菌命名为AGL1/ath-eTM160-1300。

将重组菌AGL1/ath-eTM160-1300通过农杆菌侵染花序的方法进行拟南芥转化， 转化得到的种子铺在含有潮霉素抗性的培养基上筛选，得到T0代转ath-eTM160拟南 芥。

3、转ath-eTM160拟南芥的鉴定

1）基因组DNA的提取

（1）取一定量野生型拟南芥叶片，加入液氮，充分研磨后，将粉末倒入1.5ml 离心管中；

（2）待离心管中液氮挥发完全后，立即加入500ul DNA提取缓冲液（0.1mol/L Tris·HCl（pH 8.0），0.5mol/L NaCl，0.05mol/L EDTA，0.5%SDS），充分混匀后， 65℃保温30分钟，期间不断温和上下颠倒离心管，使样品与缓冲液充分混合；

（3）以12,000rpm室温离心15分钟；

（4）将上清液转移至另一离心管；

（5）加入等体积tris-酚，抽提一遍；

（6）再用等体积的氯仿抽提一遍；

（7）取上清，加入等体积异丙醇，轻柔晃动离心管，使异丙醇与上清液充分混 匀，-20静置10分钟,以12,000rpm离心10分钟；

（8）用70%的乙醇洗剂，DNA沉淀在超净工作台吹干后，用灭菌双蒸水溶解备用， 得到基因组DNA。

2）转基因拟南芥的PCR鉴定

以上述提取T0代转ath-eTM160拟南芥的叶片的基因组DNA，然后用35S启动子的 特异引物P3和ath-eTM160的特异引物P2进行转基因植物的PCR鉴定。P3引物序列 如下：P3：AACAGAACTCGCCGTAAAGACTG

结果如图2所示，1、2、3分别为T0代转ath-eTM160拟南芥的PCR产物；+：PCR 反应的正对照；-：以野生型拟南芥为模板的PCR反应负对照，得到701bp的为阳性转 基因植物，共得到20株阳性T0代转ath-eTM160拟南芥。

采用同样的方法将空载体pCAMBIA1300转入野生型拟南芥中，得到T0代转空载 体拟南芥，采用上述引物进行鉴定，没有目的片段，说明为阳性T0代转空载体拟南芥。

二、转ath-eTM160拟南芥的获得及功能鉴定

1、表型观察

将编号为1和10的阳性T0代转ath-eTM160拟南芥（OE-ath-eTM160（1）、 OE-ath-eTM160（10））、野生型拟南芥（WT）和T0代转空载体拟南芥分别播种。

第15天观察叶片，结果如图3A所示，A为转基因株系的表型分析；可以看出， 与野生型拟南芥相比，阳性T0代转ath-eTM160拟南芥的叶片边缘锯齿化增强。

野生型拟南芥和T0代转空载体拟南芥结果无显著差异。

2、定量PCR检测microRNA160的靶基因

已有研究报道指出，microRNA160在拟南芥中有3个靶基因（ARF10，ARF1和 ARF17)，而过量表达其中任何一个突变的靶基因（突变后不能被microRNA160调控）， 都能引起类似过量表达ath-eTM160的表型（The Plant cell 17,1360-1375）。

分别提取编号为1和10的阳性T0代转ath-eTM160拟南芥（OE-ath-eTM160（1）、 OE-ath-eTM160（10））、野生型拟南芥（WT）和T0代转空载体拟南芥的幼苗RNA，反 转录得到cDNA。

以上述cDNA为模板，定量PCR检测microRNA160的3个靶基因ARF10，ARF16 和ARF17；每个株系6株，实验重复三次，结果取平均值。

靶基因ARF10的定量PCR引物如下：

sense primer：GATTCCGCAGCCATTTGAGT，

antisense primer：GATGGTGATCCGAAGAGTTG；

靶基因ARF16的定量PCR引物如下

sense primer：CCCCTTATTAGATCAAGCCC，

antisense primer：GAGGAGGTGGTCTATTCAAGT；

靶基因ARF17的定量PCR引物如下

sense primer：GCACCTGATCCAAGTCCTTC，

antisense primer：GGTGAATAGCTGGGGAGGAT；

内参为ACT2基因，扩增的引物为：

sense primer：GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG，

antisense primer：AACGACCTTAATCTTCATGCTGC；

定量PCR的结果如图3B所示，为定量PCR检测microRNA160的3个靶基因；

OE-ath-eTM160（1）中的ARF10、ARF16和ARF17的相对表达量分别为2.4、2.0、 4.9；

OE-ath-eTM160（10）中的ARF10、ARF16和ARF17的相对表达量分别为3.6、2.7、 6.4；

野生型拟南芥（WT）中的ARF10、ARF16和ARF17的相对表达量分别为1.0、1.0、 1.0；

野生型拟南芥和T0代转空载体拟南芥结果无显著差异。

定量PCR结果显示，这3个靶基因在转ath-eTM160株系中也的确有不同程度的上 调表达。

3、Northern检测microRNA160在转基因株系中的表达

分别提取编号为1和10的阳性T0代转ath-eTM160拟南芥（OE-ath-eTM160（1）、 OE-ath-eTM160（10））、野生型拟南芥（WT）和T0代转空载体拟南芥生长约15天的整 株苗子的RNA，以TGGCATACAGGGAGCCAGGCA为探针，进行Northern。

结果如图3C所示，为Northern检测microRNA160在转基因株系中的表达，看出， microRNA160（miR160）在转ath-eTM160拟南芥株系中的表达显著下降。

野生型拟南芥和T0代转空载体拟南芥结果无显著差异。

综上所述，得到了一个拟南芥的ath-eTM160，该基因能抑制microRNA160的表达， 从而影响植物的生长发育。