恩替卡韦分散片及其制备方法

摘要

本发明恩替卡韦分散片及其制备方法，属于药物制剂技术领域。所述1000片恩替卡韦分散片中含有的成分为恩替卡韦0.5g、乳糖70g、微晶纤维素20g、聚维酮K30 1.5g、羧甲淀粉钠7g、甜橙香精0.5g、阿司巴坦0.5g和硬脂酸镁0.5g，其中恩替卡韦分散片中含无水恩替卡韦为标示量的90.0%～110.0%。采用本发明的方法制备的分散片具有崩解快、溶出度高、分散均匀性好、含量均匀度好以及恩替卡韦含量高的优点，同时具有服用方便、携带方便，既可以作为普通片服用，又可放入水中迅速分散后服用，大大提高了临床用药的顺应性的优点。

说明书

技术领域

本发明属于药物制剂技术领域，具体涉及恩替卡韦分散片及其制备方法。

背景技术

恩替卡韦，分子式为C₁₂H₁₅N₅O₃·H₂O，分子量为295.3，其结构式为：

恩替卡韦是一种高效的抗病毒剂，临床研究已经显示了对乙肝病毒有良好的抑制作 用，由于恩替卡韦抗乙肝病毒的活性非常高，因此采用非常低的剂量就足以达到期望的治 疗效果，一般成人每日口服0.5mg或者1mg恩替卡韦就可达到很好的治疗作用。

恩替卡韦的口服剂型包括胶囊、分散片、滴丸等，中国专利CN1732943A、CN1732944A、 CN1732945A分别公开了其软胶囊、分散片以及滴丸的制剂形式。药典中对分散片的崩解 分散有明确要求，如何使分散片尽快地崩解、溶出，从而使人体更快地吸收发挥药效是人 们关注的问题。对于恩替卡韦制剂来说，其在单剂量中的含量比较小，仅为0.5mg或者 1mg，如此低的剂量通常使得各种制剂尤其是分散片中有效成分的含量在各单剂量之间难 以保持恒定，所以中国药典中针对小剂量的口服固体制剂要求检查其含量均匀度。此外， 在设计处方时，还需要考察所选用的非活性成分是否对制剂的稳定性造成影响等因素。

发明内容

本发明的目的在于公开了一种崩解符合要求、溶出速率好、含量均匀、质量稳定的恩 替卡韦分散片。

本发明的另一个目的在于公开了这种恩替卡韦分散片的制备方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

恩替卡韦分散片的制备方法，包括下述步骤：

(1)、按照每1000片恩替卡韦分散片中含有恩替卡韦0.5g、乳糖70g、微晶纤维素 20g、聚维酮K30 1.5g、羧甲淀粉钠7g、甜橙香精0.5g、阿司巴坦0.5g和硬脂酸镁0.5g 的量称取原材料；

(2)、称取所述量的聚维酮K30,用50%的乙醇溶液配成浓度为10%的聚维酮溶液；称 取所述量的恩替卡韦，加入到上述聚维酮溶液中，并在50-70℃水浴中溶解备用；

(3)、称取所述量的乳糖和微晶纤维素，混合均匀；用步骤(2)制成的溶液制备软材， 用50%乙醇溶液洗涤粘合剂放置容器，制粒；

(4)、湿颗粒于60±2℃烘干；30目整粒；

(5)、加入处方中剩余的辅料，混合均匀，并进行中间体含量测定；

(6)、根据中间体含量压片；制得恩替卡韦分散片，其中恩替卡韦分散片中含无水恩 替卡韦为标示量的90.0%～110.0%。

恩替卡韦分散片，其中，所述1000片恩替卡韦分散片中含有的成分为恩替卡韦0.5g、 乳糖70g、微晶纤维素20g、聚维酮K30 1.5g、羧甲淀粉钠7g、甜橙香精0.5g、阿司巴 坦0.5g和硬脂酸镁0.5g，其中恩替卡韦分散片中含无水恩替卡韦为标示量的90.0%～ 110.0%。

上述技术方案所述的恩替卡韦分散片，其中，所述恩替卡韦分散片中单个杂质不得过 0.5%,总杂质不得过2.0%。

上述技术方案所述的恩替卡韦分散片，其中，所述恩替卡韦分散片的溶出度为标示量 的80%以上。

上述技术方案所述的恩替卡韦分散片，其中，所述恩替卡韦分散片的分散均匀性为全 部崩解后通过二号筛。

本发明具有以下有益效果：

1、采用本发明的方法制备的分散片具有崩解快、溶出度高、分散均匀性好、含量均 匀度好以及恩替卡韦含量高的优点。

2、采用本发明的方法制备的分散片而且服用方便、携带方便，既可以作为普通片服 用，又可放入水中迅速分散后服用，大大提高了临床用药的顺应性。

具体实施方式：

为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体实施例对本发明的恩替卡韦分散片及 其制备方法作进一步的说明。

实施例1：恩替卡韦分散片的制备：

恩替卡韦分散片的制备方法，包括下述步骤：

(1)、按照1000片恩替卡韦分散片中含有恩替卡韦0.5g、乳糖70g、微晶纤维素20g、 聚维酮K30 1.5g、羧甲淀粉钠7g、甜橙香精0.5g、阿司巴坦0.5g和硬脂酸镁0.5g的量 称取原材料；

(2)、称取所述量的聚维酮K30,用50%的乙醇溶液配成浓度为10%的聚维酮溶液；称 取所述量的恩替卡韦，加入到上述聚维酮溶液中，并在50-70℃水浴中溶解备用；

(3)、称取所述量的乳糖和微晶纤维素，混合均匀；用步骤(2)制成的溶液制备软材（用 适量的50%乙醇溶液洗涤粘合剂放置容器），制粒；

(4)、湿颗粒于60±2℃烘干；30目整粒；

(5)、加入处方中剩余的辅料，混合均匀，并进行中间体含量测定；

(6)、根据中间体含量压片；制得恩替卡韦分散片，其中恩替卡韦分散片中含无水恩 替卡韦为标示量的90.0%～110.0%。

本发明的配方与制备方法是通过下述方法确定的：

处方工艺的确定：

本发明拟制备恩替卡韦分散片，根据分散片的特点，需要的辅料种类有填充剂、崩解 剂、粘合剂、润滑剂和矫味剂，各类辅料的具体如5.2.3.2所述。各中类型辅料的常规用 量为：填充剂70-90%，崩解剂3-10%，粘合剂1-3%，润滑剂0.5-2%，矫味剂为0.5-1%。 虽然恩替卡韦是难溶性药物，在水中的溶解度为2.4mg/ml，但本品的规格为0.5mg/片， 因此制剂中没必要加入增溶剂。

本发明采用湿颗粒法制粒压片，  一般的湿颗粒制粒压片的工艺是物料混合、制软材、 制湿颗粒、烘干、整粒、总混和压片。由于分散片对分散均匀性要求崩解后的颗粒能通过 2号筛（24目），加上本品的规格和片重比较小，颗粒太粗会影响片重差异，从而影响含 量均匀度，因此，本品拟采制成30-60目之间的颗粒；本品拟采用60℃进行烘干。因本 品的含量非常小，采用常规的混合方法无法使原料在物料中分散均匀，而等量递加混合方 法费时，又在大生产上无法实现，为了符合大生产要求，拟使用50%的乙醇溶液进行溶解 在制软材过程中加入，而本品需要加粘合剂，故最后将本品加入50%乙醇溶液配置的粘合 剂溶液中溶解。

本部分将对各类备选辅料进行筛选，由于恩替卡韦规格小，在片中的含量也比较少， 再加之该原料较贵重，故在对选择辅料种类时，先不加入原料，光用空白辅料进行筛选。 同时考虑填充剂的成本，故选用微晶纤维素为共有的填充剂，对不同的填充剂和崩解剂进 行筛选：

表1  空白辅料筛选

工艺：按照5.2.3.3的处方比例，将崩解剂混合均匀，加适量粘合剂30目制粒，60℃ 干燥，30目整粒，加入崩解剂和适量的硬脂酸镁混合均匀，压片，考查片剂的外观、硬 度、脆碎度和分散均匀性。（其中MCC含量为20%）

由于PVPP有较强的吸水性，使得片剂表面产生麻点，故PVPP的使用对生产过程的 环境湿度有较高的要求，为生产带来不便，因此剔除该辅料；而含甘露醇的片剂不但硬度 不如乳糖而且崩解时间也较长，因此剔除，最后剩下的辅料为：乳糖、微晶纤维素、羧甲 淀粉钠、硬脂酸镁、阿司帕坦和甜橙香精。

处方的调整和确定

分散片中对制剂影响主要来自填充剂、崩解剂和粘合剂，而粘合剂不但有用量而且有 加入方法的选择，将以上4个影响因素分别设置三个水平进行优化，具体水平如表2所示， 优化正交表如表3所示：

表2  因素水平表

注：所谓内外加，为部分内加和部分外加。如崩解剂为内外加时，内加和外加部分各为总崩解 剂量的一半。

表3  正交设计表

处方：乳糖、MCC、粘合剂崩解剂的用量如表3所示，其余的辅料为阿司帕坦（0.5g）、 甜橙香精（0.5g）和硬脂酸镁（0.5），所有试验中，这三个的辅料加入量相同。

工艺：填充剂混合均匀，或加入崩解剂内加部分，混合均匀，用10%的PVP溶液适量 制软材，制粒，60±2℃烘干，30目整粒，压片。

考查项目：有关物质、分散均匀性、溶出度和硬度。

正交优化试验的各项目结果如下：

表4  处方优化正交试验结果

以溶出度为指标，正交优化后最好的因素水平为填充剂为乳糖70g，MCC为20g，粘 合剂用量为15ml，崩解剂用量为7g，崩解剂加入方式为外加；

以分散均匀性为指标，最好的因素水平为乳糖70g，MCC为20g，10%的PVP溶液用量 为15ml，崩解剂用量为7g，崩解剂加入方式为外加；

因此根据这两个指标，初步确定了各因素的用量和方法为：乳糖70g，MCC为20g， 粘合剂用量为15ml，崩解剂用量为7g，崩解剂加入方式为外加。

经过以上正交，初步确定处方如下：

初步确定工艺为：

(1)、称取处方量的聚维酮K30,用用50%的乙醇溶液配成浓度为10%的聚维酮溶液； 称取处方量的恩替卡韦，加入到上述聚维酮溶液中，并在50-70℃水浴中溶解备用；

(2)、称取处方量的乳糖和微晶纤维素，混合均匀；用②制成的溶液制备软材（用适 量的50%乙醇溶液洗涤粘合剂放置容器），制粒；

(3)、湿颗粒于60±2℃烘干；30目整粒；

(4)、加入处方中剩余的辅料，混合均匀，并进行中间体含量测定；

(5)、根据中间体含量压片；

(6)、成品进行质量全检；

(7)、合格产品包装。

并将该处方工艺进行5000片样品量的小试，对初步确定的处方和工艺进行简单验证 重复，结果如下：

含量：99.07%

有关物质：单个最大杂质0.07%,总杂质0.13%

溶出度：98.77%、98.09%、102.60%、98.56%、100.47% 99.12%

含量均匀度：符合分散片规定

分散均匀性：符合分散片规定

以上各指标均符合要求，随后对样品进行影响因素试验，影响因素试验结果如表5：

表5  影响因素试验结果

恩替卡韦分散片在4500Lx光照、60℃和高湿RH92.5%条件下放置10天，与0天比较， 除高湿5天及10天,因片剂吸湿性状发生改变外,其它各项指标均无明显改变，说明本品 质量稳定,但需密封防潮。

根据以上初步稳定性考查结果，最后确定处方工艺如下：

处方：

制备工艺：

(1)、称取处方量的聚维酮K30,用用50%的乙醇溶液配成浓度为10%的聚维酮溶液； 称取处方量的恩替卡韦，加入到上述聚维酮溶液中，并在50-70℃水浴中溶解备用；

(2)、称取处方量的乳糖和微晶纤维素，混合均匀；用②制成的溶液制备软材（用适 量的50%乙醇溶液洗涤粘合剂放置容器），制粒；

(3)、湿颗粒于60±2℃烘干；30目整粒；

(4)、加入处方中剩余的辅料，混合均匀，并进行中间体含量测定；

(5)、根据中间体含量压片；

(6)、成品进行质量全检；

(7)、合格产品包装。

以下通过具体试验例来说明本发明的制备方法以及制备所得的恩替卡韦分散片所具 有的有益效果：

试验例1：有关物质的测定：

(1)、色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以水-乙腈- 三氟乙酸（990：10：1）为流动相A，以水-乙腈-三氟乙酸（700：300：1）为流动相B， 按表6进行梯度度洗脱，检测波长为254nm。色谱图中拖尾因子按恩替卡韦峰计算在0.8～ 1.5之间，理论板数按恩替卡韦峰计算应不低于3000。

表6  梯度洗脱表

(2)、测定法取实施例1制备所得的恩替卡韦分散片细粉适量(相当于恩替卡韦 3.5mg)，精密称定，置100ml量瓶中，加入0.01mol/L盐酸溶液适量，振摇，超声30分 钟使溶解，放至室温，用0.01mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，取溶液适量以每分钟3000 转离心10分钟，取上清液，滤过，作为供试品溶液；另取恩替卡韦对照品约22mg，精 密称定，置50ml量瓶中,加甲醇25ml,超声使溶解，加0.01mol/L盐酸溶液至刻度，摇匀， 取该溶液2.0ml，置25ml量瓶中，加0.01mol/L盐酸溶液稀释至刻度，作为对照品溶液。 取对照溶液20μl，注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量 程的10%；精密量取供试品溶液和对照溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录的色谱 图。供试品溶液色谱图中如显杂质峰，单一杂质峰面积不得大于对照溶液主成分峰面积的 1/2（0.5%）；各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主成分峰面积的2倍（2.0%）。

(3)、三批样品及市售品有关物质检查

按照本步骤的有关物质测定方法对本发明制备所得的三批样品以及市场销售产品(简称 市售品)博路定（恩替卡韦片）进行有关物质检查，测定结果见表7；博路定（恩替卡韦 片）由上海施贵宝制药有限公司生产，批号：LT0607682（规格：0.5mg）。

表7  恩替卡韦分散片有关物质检查

  批号   第1批   第2批   第3批   博路定   最大单个杂质（%）   0.08   0.20   0.25   0.39   总杂质（%）   0.22   0.28   0.33   0.65

(4)、有关物质的结论

三批本发明制备药物中有关物质测定结果均小于1%，本品经4500Lx光照、高温60 ℃、高湿90%RH条件下考察10天，40℃、75% RH条件加速6个月和25℃、60%RH留样9 个月，有关物质与0个月比较均无明显增加，说明本品在上述条件下稳定，杂质数量及总 量无明显增加，在后期的考察中并没有增加新的降解产物，表明产品质量稳定，但为了严 格控制产品质量，我们将“有关物质”列入质量标准中，限度为：单个杂质不得过0.5%, 总杂质不得过2.0%，应符合规定。

试验例2：含量均匀度测定：

(1)、色谱条件

采用HPLC法测定含量均匀度，色谱条件、配制方法、测定浓度及进样量均与含量测 定相同。具体如下：照高效液相色谱法（中国药典2005年版二部附录VD）测定。

色谱条件与系统适用性试验  用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以水-乙腈-三氟乙 酸（990：10：1）为流动相A，以水-乙腈-三氟乙酸（700：300：1）为流动相B，按表1 进行梯度度洗脱，流速为1.0ml/min，检测波长为254nm，柱温30℃。色谱图中拖尾因子 按恩替卡韦峰计算在0.8～1.5之间，理论板数按恩替卡韦峰计算应不低于3000。

(2)、含量均匀度测定方法

取实施例1制备所得的恩替卡韦分散片1片，倾入20ml量瓶中，加入约80％稀释剂 0.01mol/l盐酸溶液，充分振摇，超声30分钟使溶解，放至室温，用稀释剂稀释至刻度， 摇匀，取溶液在3000转/分钟条件下离心10分钟，取上清液，滤过，取续滤液作为供试 品溶液，照含量测定项下的色谱条件测定，精密量取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图。

(3)、三批样品含量均匀度的测定

取实施例1制备所得的恩替卡韦分散片三批，依法测定含量均匀度，结果见表8。

表8  恩替卡韦分散片均匀度检查结果

结论：以上试验数据表明，HPLC法测定本品的含量均匀度，方法可行。因本品规格为 0.5mg，考虑到剂量太小,故按照中国药典2005年版要求，将本品的含量均匀度检查列入 质量标准中,限度为20%,应符合规定。

试验例3：溶出度测定:

(1)、检查方法：

取实施例1制备所得的恩替卡韦分散片，照溶出度测定法（中国药典2005年版二部 附录X C第三法），以0.05mol/L磷酸二氢钾溶液（用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值 为6.8）200ml为溶剂，转速为每分钟50转，依法操作，经30分钟时，取溶液适量，滤 过，取续滤液作为供试品溶液；另精密称取恩替卡韦对照品适量，加0.05mol/L磷酸二氢 钾溶液制成每1ml中约含2.5μg的溶液，作为对照品溶液。照高效液相色谱法（中国药典 2005年版二部附录VD）测定，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以水-乙腈（92：8） 为流动相，流速为1.0ml/min,检测波长254nm。分别精密量取供试品溶液和对照品溶液各 20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算每粒分散片的溶出量，限度 为标示量的80%，应符合规定。

(2)、样品溶出度检查

取实施例1制备所得的恩替卡韦分散片三批，照上述溶出度测定法测定，结果见表 9。

表9  恩替卡韦分散片三批样品溶出结果

  批号   第1批   第2批   第3批   博路定   溶出量（%）   100.77   101.69   100.76   92.9

结果表明：本品30分钟溶出量均在标示量的80%以上，药典中对溶出度限的一般要 求为75%，考虑到本品的溶出情况，故将本品的溶出度限度订为标示量的80%。

试验例4：分散均匀性

本品为分散片，根据中国药典2005年版二部附录中“片剂”项下的通则规定，分散 片需检查“分散均匀性”，按药典规定操作。

方法：取实施例1制备所得的恩替卡韦分散片2片，置20℃±1℃的100ml的水中， 振摇3分钟，应全部崩解并通过二号筛。

结果：三批样品均符合规定，见表10。

表10  分散均匀性检查结果

  批号   结果   第1批   均崩解并过二号筛   第2批   均崩解并过二号筛   第3批   均崩解并过二号筛

试验例5：恩替卡韦分散片中恩替卡韦含量测定：

(1)、方法：照高效液相色谱法（中国药典2005年版二部附录VD）测定。

色谱条件与系统适应性试验  用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以水-乙腈-三氟 乙酸（990：10：1）为流动相A，以水-乙腈-三氟乙酸（700：300：1）为流动相B，按表 11进行梯度度洗脱，检测波长为254nm。色谱图中拖尾因子按恩替卡韦峰计算在0.8～1.5 之间，理论板数按恩替卡韦峰计算应不低于3000。

表11  梯度洗脱表

时间（min）     流动相组成

  A（%）   B（%）   0～3.5   100   0   3.5～21   100～69   0～31   21～24   69～51   31～49   24～27   51～0   49～100   27～28   0～100   100～0   28～35   100   0

测定法  取实施例1制备所得的恩替卡韦分散片细粉适量（相当于恩替卡韦 3.5mg），精密称定，置100ml量瓶中，加入0.01mol/L盐酸溶液适量，振摇，超声30 分钟使溶解，放至室温，用0.01mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，取溶液适量以每分钟 3000转离心10分钟，取上清液，滤过，精密量取续滤液20μl注入液相色谱仪，记录色 谱图。另取恩替卡韦对照品约22mg，精密称定，置50ml量瓶中,加甲醇25ml,超声使溶 解，加0.01mol/L盐酸溶液至刻度，摇匀，取该溶液2.0ml，置25ml量瓶中，加0.01mol/L 盐酸溶液稀释至刻度，同法测定，按外标法以峰面积计算，即得。

(2)、含量测定结果：取实施例1制备所得的恩替卡韦分散片，照含量测定的方法测 定，结果见表12。

表12  三批样品的测定结果

结果：三批样品均符合规定。

通过上述研究表明，用本色谱条件下的高效液相法可准确测定本品的恩替卡韦含量， 实测3批样品含量，结果均符合规定，且系统适应性均能符合规定，将本项内容列入质量 标准中。

以下通过药效学实验来说明本发明方法制备所得的恩替卡韦分散片所具有的治疗效 果：

试验例6：体外抗病毒活性：

按EC₅₀(降低HepG2 2.2.15细胞系细胞外病毒颗粒50%所需药物浓度)计算，恩替卡韦 是目前最有效的抗HBV核苷类似物。而恩替卡韦的CC₅₀(对50％细胞产生毒性作用浓度) 是EC₅₀的8000倍(30μmol/L对0.004μmoL/L)。在鸭原代肝细胞模型中，恩替卡韦的EC₅₀为0.13nmol/L。

在抗病毒药物和机体免疫力作用下，乙肝病毒常常发生突变，从而导致乙肝病毒出现 耐药性。使用拉米夫定治疗慢性乙型肝炎3a后，67%－75%病人的HBV聚合酶B功能区 L528M，C功能区M552I或M552VB产生突变。为了评价这些突变对抗病毒药物敏感性的 影响，ONO等在野生型和5株突变HBV中对包括恩替卡韦在内的11个化合物进行了研究， 结果表明仅恩替卡韦和阿德福韦(Adefovir)对所有5株HBV突变体均有效。

以HepG2 2.2.15细胞系作为HBV复制的模型，检测HBV DNA的产生水平、HBV DNA 聚合酶活性水平以及细胞内游离的HBV DNA含量等，作为抗HBV效果的观察指标。Price 等人证实恩替卡韦对HBV的抑制率大于95%，但对于已经整合的HBV DNA转录为RNA 的过程则没有影响。以放射性标记的恩替卡韦进行研究，发现该药在2.2.15细胞系中能够 直接进行磷酸化修饰，并且渗入到HBV DNA中，相反，放射性标记的脱氧鸟苷，通过 一种“拯救”途径的代谢掺入到细胞的DNA中。这种核苷类似物有90％以上可掺入到 DNA位点，说明不是一种DNA的终止子。分析dGTP和碳环2’-脱氧鸟苷5’－三磷酸盐 的Km和Ki值表明，后者在细胞内低水平条件下就对HBV DNA聚合酶具有显著的抑 制作用^[2]。

恩替卡韦对HBV DNA多聚酶有选择性抑制作用，Ki为0.0012μM。在转染了野生型 HBV的人类HepG2细胞中，恩替卡韦抑制50%病毒DNA合成所需浓度(EC₅₀)为0.004μM； 对拉米夫定耐药病毒株(rtL 180M、rtM204V)的EC₅₀中位值为0.026μM(0.01~0.059μM)， 远远低于阿德福韦对HBV野生株的EC₅₀值；对在细胞培养液中生长的1型人类免疫缺陷 病毒(HIV)无临床相关活性(EC₅₀>10μM)。恩替卡韦对细胞培养中HBV复制的抑制作用比 拉米夫定强30~60倍。每天或每周使用一次恩替卡韦能够使北美土拨鼠和鸭的肝炎病毒 DNA水平降低4~8 log10。

在体外实验中，5μM用同位素标记的恩替卡韦与HepG2 2.2.15人肝脏细胞共同孵育 三天，细胞内三磷酸恩替卡韦的浓度为65.8%，相同条件下测得三磷酸拉米夫定浓度为 11.6%。恩替卡韦抑制转染的HepG2 2.2.15细胞内HBV DNA复制的半数有效浓度(EC₅₀) 为3.75nM，而拉米夫定为116nM，比前者低30倍以上。

细胞代谢

细胞的酶系统负责恩替卡韦的摄取和代谢。进入细胞后，恩替卡韦的代谢产物为二磷 酸和三磷酸形式的恩替卡韦，以后者为主。三磷酸形式的恩替卡韦在细胞内迅速积累，达 到EC₅₀的2000倍，其在细胞内的半衰期为15h。虽然将恩替卡韦磷酸化的酶系统尚不清楚， 恩替卡韦的磷酸化效率较其他核苷类似物为高。

抗病毒作用机制

体外实验证明，三磷酸形式的恩替卡韦主要通过抑制病毒聚合酶的引导、从前基因组 到负链的逆转录和DNA正链合成。三磷酸形式的恩替卡韦较自然dGTP更易被HBV聚合酶 识别和掺入核苷酸链，使核苷酸链合成中止。恩替卡韦引起的核苷酸链中止部位多在连续 两个脱氧鸟苷酸或多个不连续的脱氧鸟苷酸下游。这与LVD以及阿德福韦不同，后两者 会导致核苷酸链立刻中止。三磷酸形式的恩替卡韦可抑制耐LVD毒株的复制，但要求恩 替卡韦浓度更高(约30倍)。这一浓度在病人体内很容易达到。

与LVD的交叉耐药

用可以稳定表达HBV野生株和LVD耐药变异株(包括四种变异模式：L180M+M204V， V173L+IJl80M+M204V，M2041和L180M+M204U的五种细胞系进行体外实验表明，恩替 卡韦对LVD耐药变异株的敏感性均低于野生株，下降程度在不同细胞系各不相同：恩替 卡韦对M2041变异病毒株的敏感性下降最明显(471倍)，对其他变异病毒株的敏感性下降 程度在37至164倍间。因此，恩替卡韦对LVD耐药变异株的抗病毒活性降低，对不同变异 病毒株的抗病毒活性降低程度不同。

试验例7：动物实验：

1、土拨鼠模型：

方法：恩替卡韦0.5mg·kg^-1口服，每日1次；动物：美洲土拨鼠

结果：给药5wk后动物血清中病毒DNA水平降低到检测不出的水平。但在给药8wk 后停药1～8wk，动物血清中病毒DNA水平出现了反弹。

如果继续维持给药，即在每日1次给药8wk后，改用同样剂量继续每周给药1次， 则在6只维持给药34mo的动物中，有4只动物的血清病毒DNA水平可保持在最低检测限 水平长达2a以上，且所有动物肝中的病毒抗原(表面和核心抗原)和cccDNA均显著降低， 而cccDNA的存在是肝细胞持续感染(慢性肝炎)和乙型肝炎复发的主要原因，目前应用的 主要抗病毒药物如干扰素、拉米夫定等，其作用靶点均在cccDNA水平之下，因此不能降 低体内cccDNA水平。

给予动物恩替卡韦0.02～0.5mg·kg^-1，1～3mo可有效降低动物血清中病毒DNA水平 和内源性乙肝病毒聚合酶活性。

给予恩替卡韦0.1或0.5mg·kg^-1，4wk后，动物血清中内源性病毒聚合酶水平约比 给药前降低1000倍。给药3mo后，动物血清中的病毒DNA降至检测不到的水平。

2、鸭模型：

方法：灌胃给予恩替卡韦0.01，0.1或1mg·kg^-1，每日1次，连续给药21d。动物： 北京鸭

结果：恩替卡韦的抗病毒活性呈剂量依赖性，即使是0.01mg·kg^-1的最低剂量，其抗 病毒活性也高于25mg·kg^-1的阳性对照药拉米夫定。

恩替卡韦组0.01，0.1和1mg·kg^-1以及拉米夫定组25mg·kg^-1血清病毒DNA水平分别 平均降低lg 3.1，lg 2.1，lg 0.97和lg 0.66。在降低鸭肝内的DHBV DNA水平方面，恩替卡 韦也比拉米夫定更有效。与阴性对照组相比，恩替卡韦组1mg·kg^-1中的共价闭合环状病毒 DNA(cccDNA)水平降低。

通过监测给药期间动物的体重增长值和临床症状发现，所有给药组动物均能良好耐受 恩替卡韦，给药组与对照组间的体重增长值无显著差异，表明在所用剂量范围内恩替卡韦 对动物的体重增长无明显影响。

3、美洲旱獭：

方法：口服恩替卡韦(0.05mg·kg^-1·d^-1)治疗21个月；动物：美洲旱獭。

结果：在治疗4周后，血清病毒DNA量已有明显下降，至32周时DNA量降低了8 个log10，即使较低剂量(0.02mg·kg^-1·d^-1)，亦有明显效果。在治疗14个月后，取肝穿刺标 本检测核心抗原和cccDNA均为阴性。停药21个月后血清中仍测不出病毒DNA，这表明 恩替卡韦不仅能抑制病毒的复制，而且对cccDNA亦有直接的影响。初步结果表明，恩替 卡韦还可减少或延迟美洲旱獭肝细胞性肝癌的发生。

4、转基因小鼠

方法：灌胃给予动物3.2mg·kg^-1剂量的恩替卡韦或灭菌生理盐水，每日1次，连续给 药10d。动物：乙型肝炎病毒的转基因小鼠

结果：恩替卡韦可显著降低小鼠肝中的HBV DNA含量，使雌性小鼠每微克细胞DNA 中的HBV DNA从原来的5.9pg降低到小于0.82pg，而雄性小鼠从原来的8.3pg·μg^-1降低到 小于1.1pg·μg^-1。在10d的研究中，动物均能良好耐受恩替卡韦，未见濒死或死亡情况发 生。

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