一种通过培养龙牙楤木体细胞胚生产有用次生代谢物质的方法

摘要

一种通过培养龙牙楤木体细胞胚生产有用次生代谢物质的方法，其特征是：1)从无菌实生苗根段获得的胚性愈伤组织分别在分化培养条件和增殖培养条件下进行摇瓶悬浮培养；2)根据体细胞胚不同发育状况定期取材，并计算它们的生物生长量；3)分析体细胞胚各发育时期材料中楤木总皂苷、齐墩果酸、总黄酮的累积；4)体细胞胚苗中各成分含量最高，总皂苷占栽培植株根中含量的29.7％；齐墩果酸占栽培植株根中含量的29.9％；总黄酮占栽培植株叶中含量的42.8％，且体细胞胚苗中三种物质累积效率最高，分别为：总皂苷6.72mg/周、齐墩果酸3.42mg/周、总黄酮7.36mg/周。

说明书

技术领域

本发明专利涉及通过组织培养龙牙楤木体细胞胚发生，体细胞胚苗中三种有用次生代谢物质：楤木总 皂苷、齐墩果酸、总黄酮有效累积的培养方法。本发明属农业生物技术领域。

背景技术

龙牙楤木(Aralia elata Seem.)为五加科落叶灌木或小乔木。其根皮中主要含有楤木皂苷和黄酮类 等重要药用成分，而皂苷的主要成分是齐墩果酸型皂苷(王玉萍等，中国中药杂志，1998，23(9)：519-521)。 楤木皂苷和黄酮类具有抗炎、镇静、利尿、强心、抗氧化、抗病毒、抗糖尿病并发症等多种生理活性及药 理作用，且无毒害。近年来的研究显示龙牙楤木皂苷在免疫调节、肿瘤防治方面有很显著的作用，这使其 在国际市场上越来越受到人们的关注(王忠壮等，上海：第二军医大学出版社，2001)。然而龙牙楤木的 野生资源由于破坏性、掠夺性连年多茬采收，甚至割茎移栽，使其资源接近濒危(高德武等，国土与自然 资源研究，2001(3)：77-78)。

而通过细胞培养生产有用次生代谢物是一条可选的解决问题的途径。通常情况下，植物次生代谢物的 积累与植物细胞的分化程度有关，分化程度越高，次生代谢物的积累也越多。体细胞胚是一种很好的培养 材料。虽然以快繁为目的体细胞胚规模化培养有不少研究报道，例如：生物反应器培养挪威云杉(Picea  abies)、白云杉(Picea glauca)、仙客来(Cyclamen persicum)、白桦(Betula pendula)的体细胞胚 等。而以研究次生代谢物质累积为目的的大量培养的报道却不多。在刺五加体细胞胚培养中，其外植体材 料有从胚性细胞开始的，也有从鱼雷胚开始的(邢朝斌等，中草药，2009，40(8)：1302-1305)，而且仅 仅是考察了其生物生长量，对其中的有效成分未做分析。从胚性愈伤组织到体细胞胚发生发育的过程是细 胞有序的分化、发育的过程，而该过程中目的次生代谢物的累积具体如何还未查到相关报道。龙牙楤木方 面的研究也未见报道。本发明的目的是通过培养龙牙楤木体细胞胚发生，提供一种有效生产三种次生代谢 物质(总皂苷、齐墩果酸、总黄酮)的方法，为龙牙楤木规模化培养生产药用产物提供一种培养技术。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用体细胞胚发生过程中的特殊发育材料，更有效地生产有用次生代谢物质 的方法。具体发明内容如下。

将培养萌发7天的无菌实生苗根部切成1cm根段接种到1/2SH+3.0mg/L IBA+0.2mg/L KT培养条 件下诱导胚性愈伤组织，并在同样条件下进行愈伤组织的增殖。将0.8g胚性愈伤组织分别接种入装有50mL 分化培养基和增殖培养基的150ml玻璃三角瓶中进行摇瓶悬浮培养，该分化培养基和增殖培养基的组成分 别是1/2SH+1.0mg/L IBA+0.2mg/L KT+20g/L蔗糖，1/2SH+3.0mg/L IBA+0.2mg/L KT+20g/L 蔗糖。摇床转速为110rpm/min。每隔2周继代一次。增殖悬浮培养的胚性愈伤组织4周后取材，烘干称重。 分化悬浮培养的愈伤组织培养2周时，细胞分化为球形胚，此时取材，烘干称重。悬浮培养4周后体细胞胚 发育到鱼雷和子叶胚时，转入固体培养，在无任何植物生长调节剂的WPM培养基中进行萌发。待生长3周后， 取材烘干称重。分析上述所取的愈伤组织、球形和心形体细胞胚、鱼雷和子叶体细胞胚、体细胞胚萌发苗 中的楤木总皂苷、齐墩果酸、总黄酮含量。以6-7月份采集的3-4年生人工栽培苗木根和当年生叶片为对照 样品。楤木总皂苷和总黄酮含量分别以齐墩果酸和芦丁为标准品，采用分光光度法分析，监测波长分别为 540和510nm。齐墩果酸含量以相同物质为标准品，采用高压液相(HPLC)分析。体细胞胚苗中各成分的 含量最高，分别为：总皂苷2.1％，占栽培植株根中含量的29.7％；齐墩果酸1.04％，占栽培植株根中含量的 29.9％；总黄酮2.3％，占栽培植株叶中含量的42.8％。分析出各种成分的含量后，根据生长速率(干重g/ 周)算出其累积效率(mg/周)＝各成分含量(％)*生长速率(mg/周)。上述体细胞胚发生过程的各材料中， 体细胞胚苗的三种物质累积效率最高，分别为：总皂苷6.72mg/周、齐墩果酸3.42mg/周、总黄酮7.36mg/ 周。

本发明中所用的培养基都是按常规处理(调整pH值为5.8，经过高温高压灭菌(121℃、1.5个大气 压、15分钟))后使用的，培养环境为常规组织培养室(温度24～26℃，光照强度1000～1500Lx，光/ 暗周期16h/8h，湿度60％～70％)。

本发明的优点：

1、培养材料的生物量快速增值。从细胞到体细胞胚苗是一根有序生长的过程，可在短时间内使培养材料 生物量大量增加。

2、悬浮培养体系均匀，次生代谢物合成稳定。因为体细胞胚发生发育的材料相对同步，悬浮颗粒大小相 对一致。克服了细胞培养过程中细胞无序生长造成的颗粒大小不均匀，悬浮培养系统不稳定的弊端。从而 培养材料内次生代谢物的合成较稳定。

3、本发明为进一步的扩大培养生产有用次生代谢物质提供了依据。

附图说明

图1体细胞胚发生及其再生：A-根段经4周的培养诱导的胚性愈伤组织；B-增殖的胚性愈伤组织；C-胚性 愈伤组织悬浮培养2周后分化形成的球形体细胞胚；D-形成的球形胚的扩大图；E-继续悬浮培养2周后， 发育形成的鱼雷和子叶体细胞胚；F-倒入不含植物生长调节剂的WPM固体培养基中培养3周后，萌发形成 的体细胞胚苗

图2胚性愈伤组织和处于不同发育时期的体细胞胚中总皂苷的量

图3标准品(a)和体细胞胚苗(b)的HPLC图谱(箭头表示齐墩果酸峰)

图4胚性愈伤组织和处于不同发育时期的体细胞胚中齐墩果酸含量

图5胚性愈伤组织及不同发育时期体细胞胚中总黄酮的含量

图6胚性愈伤组织及不同发育时期体细胞胚中总皂苷、齐墩果酸、总黄酮的累积效率

具体实施方式

实例1龙牙檧木胚性愈伤组织的诱导和增殖

1)种子层积及胚培养龙牙楤木(由东北林业大学生命科学学院王秀华教授鉴定)种子采自黑龙江省林业 多种经营研究所(牡丹江市)种子园。种子与湿沙混合后于4℃冰箱层积4个月后，选择开荚的、合子胚 发育成熟的种子，去除种皮，在超净工作台中先用70％的酒精消毒3分，再用5％次氯酸钠消毒12分钟， 然后用灭菌水冲洗5遍。用镊子取出合子胚，接种于事先准备好的1/2MS培养基中，使胚萌发长成无菌小 苗。

2)诱导胚性愈伤组织及其增殖：上述无菌实生苗培养7天后，将其根部切成1cm根段作为外植体，接种 到1/2SH+IBA 3.0mg/L+KT 0.2mg/L培养条件诱导胚性愈伤组织，并在同样条件下进行愈伤组织的 增殖。

实例2分析体细胞胚发育过程中有用物质的累积

1)体细胞胚发育过程中的生物增长量

将0.8g胚性愈伤组织分别接种入装有50mL分化培养基和增殖培养基的150mL玻璃三角瓶中进行摇 瓶悬浮培养，该分化培养基和增殖培养基的组成分别是1/2SH+1.0mg/L IBA+0.2mg/L KT+20g/L 蔗糖，1/2SH+3.0mg/L IBA+0.2mg/L KT+20g/L蔗糖。摇床转速为110rpm/min。每隔2周继代一次。 每次取3瓶。增殖悬浮培养的胚性愈伤组织4周后取材，取3-4瓶，烘干称重。分化悬浮培养的愈伤组织 培养2周时，细胞分化为球形球形胚，此时取材3瓶，烘干称重。悬浮培养4周后体细胞胚发育到鱼类和 子叶胚时，转入固体培养，在无任何植物生长调节剂的WPM培养基中进行萌发。待生长3周后，取材烘干 称重。统计上述各发育时期体细胞胚的生物生长量(干重)(＝收获量-接种量)和生长速率(＝生长量/培 养时间(周))结果如表1。从中可以看出从胚性愈伤组织发育到体细胞胚苗的生长量和生长速率都是最大 和最快的，分别为2.25g，0.32g/周。

表1各不同发育时期体细胞胚的生物生长量

注：运用Duncan多重比较。相同字母为相差不显著。

2)分析体细胞胚发育过程中三种有用次生代谢物：楤木总皂苷、齐墩果酸、总黄酮的累积

对上述体细胞胚发生过程中所取的不同发育时期各种材料中的楤木总皂苷、齐墩果酸、总黄酮含量进 行分析。

(1)分析楤木总皂苷累积量

A供试品溶液的制备取龙牙楤木干燥粉末0.5g，精密称定，加入无水乙醇溶液15mL，超声振荡25min，再 在70℃的恒温水浴中提取3次，每次1h，收集合并提取液，蒸干，残渣加5mL水溶解后，以乙醚萃取，至乙 醚层无色为止，收集合并水溶液，蒸干，残渣以甲醇溶解并定容至50ml，得楤木总皂苷样品溶液。 B标准曲线的绘制精确量取对照品溶液20、40、60、80、100μL，分别置于冰浴的试管中，精确加8％香 草醛-乙醇溶液0.5mL和70％硫酸5.0mL，摇匀，混合物于60℃恒温水浴加热10min，然后在冰浴中冷却 15min。设对照为空白试剂。于540nm波长处测其吸光度值。取3次重复平均值，以吸光度值为纵坐标， 齐墩果酸质量为横坐标，绘制齐墩果酸的标准曲线为Y＝0.002X+0.020，r＝0.9994，线性范围20～100μg。 C稳定性试验取样品供试液在室温下保存，分别于0、2、4、6h测定峰面积值，得峰面积RSD为1.1％，表 明供试品溶液在6h内稳定性良好。

D精密度试验取齐墩果酸标准溶液，按B中方法重复测定5次，记录吸光度，计算RSD为0.7％，说明仪器精 密度良好。

E重复性试验取同一样品5份，分别制备供试品溶液，测定吸光度，计算齐墩果酸的质量分数RSD为2.92％， 表明样品处理过程和测定方法均有良好的重现性。

G加样回收率试验取已知含量的龙牙楤木粉末，精密称定，加入适量齐墩果酸对照品液，照供试品测定 方法提取测定，计算回收率的RSD为2.93％，表明回收率较高

H样品测定取龙牙楤木不同样品，制备供试品溶液。精密吸取供试品溶液100μL，按标准曲线制备项下 的方法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品中齐墩果酸的量，计算即得。结果显示子叶体胚(1.14％) 总皂苷含量最低，约占栽培植株根中的16.1％；组培体胚苗中的较高(2.1％)，约占栽培植株根中总皂苷 的29.7％。

(2)分析齐墩果酸累积量

A色谱条件XTerraRMS C₁₈柱(250mm×4.6mm，5μm)。柱温为室温，流动相为乙腈-水(90∶10)；检测 波长210nm；体积流量1.0mL/min，进样量20μL。

B供试品溶液的制备精密称取样品粉末0.2g，置于50mL量瓶中，加入80％乙醇5mL，超声提取3次， 每次30min，合并滤液，水浴蒸干，80％乙腈定容至3mL。0.45μm微孔滤膜滤过后备用。

C标准曲线的绘制精密称取齐墩果酸对照品0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg，置2mL量瓶中用甲醇溶解 并稀释至刻度制成对照品溶液。在A色谱条件下建立吸收峰面积和齐墩果酸含量的回归方程为：Y＝0.002X +0.020，r＝0.9994。表明齐墩果酸对照品在20～100μg时，吸收曲线呈现良好的线性关系。

D稳定性试验称取楤木样品0.5g，按B项下供试品溶液制备方法制备，在室温下保存，分别于0、2、 4、6、8h测定峰面积值，得峰面积的RSD为1.43％，表明供试品溶液在8h内稳定性良好。

E重现性试验称取同一楤木样品粉末5份，按B项下方法分别制得5份供试品溶液，测定峰面积，计算 齐墩果酸的质量分数RSD为1.38％，表明样品处理过程和测定方法均有良好的重现性。

F回收率试验精密称取已知量(齐墩果酸0.9994mg/g)楤木样品5份，分别精密加入0.5mg/mL齐墩 果酸对照品溶液1mL，按B项下方法，制备样品溶液，测定，RSD为0.63％，计算得加样回收率为98.26％，。 G样品测定在A色谱条件下测定供试品溶液，按照标准曲线制备项下的方法测定，计算出供试品中齐墩 果酸的量。结果显示体细胞胚苗中的齐墩果酸量最高(1.04％)，约占栽培植株根中的29.9％。

(3)分析总黄酮含量

A供试品溶液的制备采用超声波法对其总黄酮进行提取。将0.5g干燥粉末放入三角瓶中，加入50％乙 醇溶液40mL，密封好后于超声波反应器中提取90min，取滤液定容至50mL备用。

B确定测定波长精密量取芦丁对照液3mL，置25mL量瓶中，加5％亚硝酸钠溶液1mL，摇匀，静置6min； 加10％硝酸铝溶液1mL，摇匀，静置6min；加4％氢氧化钠10mL，再加50％乙醇至刻度，摇匀，静置15min； 最后置于比色皿中，在波长400～600nm之间测定吸光度，确定最大吸收波长为510nm。

C对照品溶液的制备精密称取芦丁对照品10.60mg，置50mL量瓶中，加入50％乙醇水溶液溶解，并稀 释至刻度，制成对照品溶液。

D标准曲线的绘制精密吸取芦丁(购自中国药品生物制品检定所，批号100080-200707)对照品溶液0.5、 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL，分别置于25mL量瓶中，加5％亚硝酸钠溶液1mL，摇匀，静置6min； 加10％硝酸铝溶液1mL，摇匀，静置6min；加4％氢氧化钠10mL，再加50％乙醇至刻度，摇匀，静置15min； 然后在510nm波长处测定吸光度，绘制标准曲线为Y＝0.1197X-0.0267，r＝0.9979，线性范围为 0.11～12.72mg。

E稳定性试验精确吸取供试品溶液置于10mL容量瓶中，按上述方法每隔10min测一次吸光度，连续测7次， 吸光度RSD为1.2％，表明供试品溶液在70min内稳定性良好。

F精密度试验取芦丁标准溶液，按D中方法重复测定5次，记录吸光度，计算RSD为2.187％，说明仪器精 密度良好。

G样品测定精密吸取供试品溶液2.0mL按标准曲线制备项下的方法测定吸光度，然后根据标准曲线计算 出供试品中总黄酮的量。结果显示龙牙楤木球形胚中的黄酮量最低(1.13％)，约占野生叶片的21％；体细 胞胚苗中的最高(2.3％)，约占野生叶片的42.8％。

(3)分析体细胞胚发生过程中不同发育时期材料中三种物质的累积效率

由上面1)、2)的分析，得到了不同发育时期材料中，总皂苷、齐墩果酸和总黄酮的含量以及在一定时 间内它们的生长速率，因此其各成分的累积效率(mg/周)＝各成分量(％)×生长速率(mg/周)。结果显 示3种成分累积效率最高的都是体细胞胚苗，分别为总皂苷6.72mg/周、齐墩果酸3.42mg/周、总黄酮7.36 mg/周。