与玉米细胞壁消化率相关的分子标记及其鉴别引物和应用

摘要

本发明涉及一个与玉米细胞壁消化率相关的分子标记及其鉴别引物和应用，属于植物基因工程技术领域，所述标记是由野生型的第307个位点碱基由T突变为A；所述突变能够导致CAD酶活性丧失，进而影响细胞壁中木质素水平，并导致细胞壁消化率增加29.5％。本发明提供了该单碱基突变的检测方法，以及该单碱基突变后对玉米细胞壁消化率的影响，为今后的分子育种提供新的靶标。

说明书

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及与玉米红棕色叶脉突变体bm1相关的CAD基因编码区单碱基突变及其标记物，所述改变的基因促成玉米木质素成份变化的表型，进而提高玉米细胞壁消化率。

背景技术

玉米(Zea mays L.)属禾本科玉蜀黍属一年生C4草本植物，是“粮-能-饲”多用作物。植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和木质素组成，它们是决定生物质能源转化效率和牧草品质的重要因素。解析与玉米的木质素代谢途径相关的调控机制，改变木质素成份进而增加细胞壁消化率，对玉米的遗传育种具有重要的现实指导意义。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一个与玉米细胞壁消化率相关的分子标记，该标记是由野生型的第307个位点碱基由野生型的胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸(T)突变为腺嘌呤脱氧核糖核苷酸(A)；所述突变能够导致CAD酶活性丧失，进而影响细胞壁中木质素水平。

本发明的第二个目的是提供一种鉴定上述分子标记的引物，用于快速鉴定该位点突变，所述的引物序列为ZmCAD2F：AAATCATGGCTTTGGTTTGA；ZmCAD2R：CCTTATCTCGTCCACTTCTCG。

进一步，用于鉴别的PCR反应体系为50μL，其中正/反向引物各2μL，DNA模板4μL，PrimeSATR高保真DNA扩增酶0.5μL，反应buffer25μL，dNTP 4μL，ddH₂O补足至50μL。反应程序为：98℃，4分钟预变性；98℃变性10秒，61℃退火5秒，72℃延伸2分钟，反应34个循环；72℃链延伸7分钟，12℃终止反应，扩增的DNA条带457bp。

本发明还提供上述分子标记在玉米新品中培育中的应用。

1、本发明利用分子生物学手段，通过PCR扩增获得玉米CAD基因的突变位点，并以此位点开发分子标记，可用于快速鉴定cad突变体；

2、本发明从木质素合成关键酶CAD基因入手，分析玉米木质素合成对细胞壁消化率的影响机制，能够为高细胞壁消化率玉米的育种提供新的方向。

本发明与现有技术相比的有益效果：

1、本发明中玉米cad突变体的鉴定，是从木质素自身合成途径解析木质素含量和成份变化对细胞壁消化率的影响。通过突变体中细胞壁成份的分析和木质纤维消化率的测试，提供一种生物量不变、木质素含量不变，但木质素单体成份降低，进而提高细胞壁消化率的种质资源，为玉米和其他单子叶禾本科植物的定向设计育种提供了新的突破方向。

2、本发明中cad突变体中CAD基因单碱基突变的分子标记物，能够提供一种快速鉴定方法，为分子标记辅助选择育种提供了新的靶标，大大节约了农作物的育种周期。

附图说明

图1玉米cad突变体表型及间苯三酚染色。A和B分别为野生型和cad突变体叶脉表型；C和D分别为野生型和cad突变体间苯三酚染色图。

图2玉米cad突变体中CAD基因的突变位点。A和B分别为野生型和cad突变体中CAD基因的测序结果(297位-317位)，其中，307位为突变位点。

图3CAD单碱基突变的酶活性检测。A和B分别表型突变后和未突变的酶活色谱图。

图4玉米cad突变体木质素总量和单体含量。A和B分别表示木质素总量和单体含量。

图5玉米cad突变体叶脉的细胞壁纤维素总量、酶解糖含量和糖化效率。A，B和C分别表示纤维素总量、酶解糖含量和细胞壁糖化效率。

具体实施方式

下面对一个细胞壁消化率相关的分子标记物的具体数据进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定发明的范围。下述实施例中所用的材料、试剂和分子标记探针等，如无特殊说明，均可从公司通过商业途径购买。

实施例1：突变体表型及分子鉴定

玉米cad突变体种子由EMS化学诱变花粉获得。使用普通营养土，发种、培育，持续观察表型，待幼苗大约生长至六叶期，叶脉出现红棕色的表型(图1中的A和B)。取红棕色叶脉新鲜组织，同时取非红色(B73)叶脉组织作为对照，使用间苯三酚对叶脉横切面进行染色，具体操作为：取200μL避光冷藏的5％间苯三酚滴在切片上，室温染色3分钟；滴加等体积50％盐酸，室温染色3分钟；滴加40％甘油。15分钟内完成观察记录。结果显示突变体颜色加深(图1中的C和D)，表明突变体中苯丙醛积累。

随后，我们用CTAB法提取基因组DNA，具体操作为：(1)取新鲜叶脉组织，液氮研磨后加入600μL 2％CTAB(同时加入2‰β-巯基乙醇)，65℃水浴30分钟；(2)加等体积氯仿：异戊醇(24:1)，剧烈震荡15秒，混匀，室温放置3分钟；(3)12000rpm离心10分钟，取上清至新的离心管，加入等体积预冷的异丙醇，颠倒混匀5-6次，室温沉淀10分钟；(4)12000rpm离心15分钟，弃去上清，加75％乙醇清洗沉淀1-2次，自然晾干，用50μL ddH₂O溶解沉淀，获得基因组DNA水溶液。分别使用引物ZmCAD2-ORFF、ZmCAD2-ORFR作为探针，PCR检测，引物序列如下：

ZmCAD2-ORFF：CGGCTTTCTTTCCCAACTCC

ZmCAD2-ORFR：CATTAAAAACTGACCATCCATCGT

PCR反应体系为50μL，其中正/反向引物各2μL，DNA模板4μL，PrimeSATR高保真DNA扩增酶0.5μL，反应buffer25μL，dNTP 4μL，ddH₂O补足至50μL。反应程序为：98℃，4分钟预变性；98℃变性10秒，61℃退火5秒，72℃延伸2分钟，反应34个循环；72℃链延伸7分钟，12℃终止反应。经检测，ZmCAD2的编码区未发生变化，测序结果显示307位核酸由野生型的胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸(T)突变为腺嘌呤脱氧核糖核苷酸(图2)。

为了进一步验证该位点的突变，我们设计了可用于快速鉴定该位点的分子探针。探针序列为：ZmCAD2F：AAATCATGGCTTTGGTTTGA；ZmCAD2R：CCTTATCTCGTCCACTTCTCG。PCR反应体系为50μL，其中正/反向引物各2μL，DNA模板4μL，PrimeSATR高保真DNA扩增酶0.5μL，反应buffer>2O补足至50μL。反应程序为：98℃，4分钟预变性；98℃变性10秒，61℃退火5秒，72℃延伸1分钟，反应34个循环；72℃链延伸7分钟，12℃终止反应。使用该探针可以简易、快速检测出457bp的DNA条带，用于突变位点的鉴定。

实施例2：突变体的CAD酶活性检测

为了验证上述单碱基突变对CAD酶活性的影响，我们针对野生型该位点进行了人工定点突变(CADm)，并分别体外表达了野生型CAD和突变CADm。突变方法采用OverlappingPCR，体外重组蛋白的表达使用大肠杆菌系统。方法均使用常规分子生物学技术。具体操作为：(1)CAD原CDS片段及定点突变片段CADm获得，序列扩增引物：ZmCAD2F1：ATGGGGAGCCTGGCGTCCG；ZmCAD2R1：TCAGTTGCTGGCCGCATCC；ZmCAD2mF1：GCCGCGAGTGCAGCCCCTG；ZmCAD2mR1：CAGGGGCTGCACTCGCGGC；ZmCAD2BamHIF1：CGGGATCCCGATGGGGAGCCTGGCGTCCG；ZmCAD2HindIIIR1:CCA AGCTTGGTCAGTTGCTGGCCGCATCC。CAD原CDS片段扩增：第一轮PCR反应体系为50μL，ZmCAD2F1/ZmCAD2R1各2μL，DNA模板4μL，PrimeSATR高保真DNA扩增酶0.5μL，反应buffer>2O补足至50μL。反应程序为：98℃，4分钟预变性；98℃变性10秒，58℃退火5秒，72℃延伸1分钟，反应34个循环；72℃链延伸7分钟，12℃终止反应。然后以第一轮PCR得到的片段为模板进行二轮PCR，反应体系为50μL，ZmCAD2BamHIF1/ZmCAD2HindIIIR1各2μL，模板4μL，PrimeSATR高保真DNA扩增酶0.5μL，反应buffer>2O补足至50μL。反应程序为：98℃，4分钟预变性；98℃变性10秒，58℃退火5秒，72℃延伸1分钟，反应34个循环；72℃链延伸7分钟，12℃终止反应。最终得到CAD原CDS片段。CAD定点突变片段扩增：分别以ZmCAD2F1/ZmCAD2mR1和ZmCAD2mF1/ZmCAD2R1为引物进行PCR，PCR反应体系为50μL，正向/反向引物各2μL，DNA模板4μL，PrimeSATR高保真DNA扩增酶0.5μL，反应buffer>2O补足至50μL。反应程序为：98℃，4分钟预变性；98℃变性10秒，58℃退火5秒，72℃延伸30秒，反应34个循环；72℃链延伸7分钟，12℃终止反应；然后将两次PCR得到的片段混合，用作模板，以ZmCAD2F1/ZmCAD2R1为引物，进行二轮PCR，PCR反应体系为50μL，正向/反向引物各2μL，模板4μL，PrimeSATR高保真DNA扩增酶0.5μL，反应buffer>2O补足至50μL。反应程序为：98℃，4分钟预变性；98℃变性10秒，58℃退火5秒，72℃延伸1分钟，反应34个循环；72℃链延伸7分钟，12℃终止反应。最后以第二轮PCR得到的片段为模板，进行三轮PCR，反应体系为50μL，ZmCAD2BamHIF1/ZmCAD2HindIIIR1各2μL，模板4μL，PrimeSATR高保真DNA扩增酶0.5μL，反应buffer>2O补足至50μL。反应程序为：98℃，4分钟预变性；98℃变性10秒，58℃退火5秒，72℃延伸1分钟，反应34个循环；72℃链延伸7分钟，12℃终止反应。最终得到CAD定点突变片段CADm。(2)原核表达载体构建：用限制性内切酶BamHI和HindIII分别对CAD、CADm片段和pET32a质粒进行酶切，反应体系为20μL，CAD片段/CADm片段/pET32a质粒1μg，BamHI>2O补足至20μL。37℃孵育4小时，切胶回收。然后将酶切过的CAD和CADm片段分别与酶切过的pET32a质粒连接，反应体系为10μL，酶切过的CAD片段/CADm片段3μL，酶切过的pET32a质粒1μL，反应buffer>2O补足至20μL。16℃孵育2小时，转化DH5α，鉴定并测序。将测序正确的质粒再次转化到BL21中，鉴定，挑取阳性单菌落摇菌过夜，用作种子菌液。(3)重组蛋白获得，按照1:100比例转接种子菌液到LB液体培养基中，摇至OD600＝0.6～0.8，加0.1-0.3mMIPTG,18℃诱导约10～12小时；离心收集菌体，用预冷的Lysis>2PO₄，300mM>2PO₄，300mM>

随后，我们使用上述获得的重组蛋白进行了CAD的体外酶活检测试验。酶活反应体系为：磷酸反应buffer 20μL，2mM NADPH 1μL，5mM芥子醛0.4μL，0.5mM重组蛋白1μL，加ddH₂O至100μL。30℃孵育30分钟，加入等体积甲醇终止反应。反应终止后，使用HPLC方法进行检测，结果表明CAD编码区307位的胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸突变为腺嘌呤脱氧核糖核苷酸之后，CAD酶活性丧失(图3)。

实施例3：突变体木质素含量及成份检测

木质素含量测定采用乙酰溴法。取野生型和突变体植株抽穗期同一叶位的叶脉，液氮研磨，经烘干后提取木质素分析。具体操作为：(1)使用甲醇：水和氯仿处理样品，获得细胞壁残渣；(2)称取50mg干燥的细胞壁残渣粉末放入10mL试管，加入5mL 25％乙酰溴，盖上盖子，50℃水浴4小时；(3)冷却后，3500rpm离心15分钟，将上清转移至10mL试管；(4)准备15mL试管，先加入2.5mL 2M NaOH和3mL醋酸，混匀，再加入上一步的液体1mL，混匀；(5)加入0.25mL羟胺，混匀，OD₂₈₀测定吸光度，计算木质素含量。测试结果显示，cad突变体叶脉中木质素含量与野生型中无显著差异(图4中的A)。

木质素成份检测使用Thioacidolysis方法。具体操作为：(1)配置裂解液，Dioxan：Bron Triflorate Ethyl Etherate：Ethernethiol＝35:1:4；(2)称取细胞壁残渣粉末50mg于样品管内，分别加入3mL裂解液，80℃，4小时；(3)每个样品管内加入100μL 2.5mg/mL二十二烷作为内标，再加入0.8mL饱和NaHCO₃和3mL二氯甲烷，混匀，2900rpm离心10分钟，萃取下层至玻璃管，再次加入3mL二氯甲烷，离心，萃取下层；(4)加入Na₂SO4，直至溶液澄清为止；(5)避光，氮气抽干，加入40μL吡啶、120μL>

实施例4：突变体的细胞壁消化率评估

为了评估cad突变体的细胞壁消化率，我们检测了细胞壁纤维素含量、酶解糖含量和细胞壁糖化效率。首先，分别取生长抽穗期的玉米叶脉，40℃干燥96小时，研磨粉碎后测试。测试方法为苯酚硫酸酯法[Dubois et al，Colorimetric method for determinationof sugars and related substances.1956,Analytical Chemistry,28:350-356]，具体测定方法如下：使用纤维素酶和纤维二糖酶混合物直接酶解细胞壁残留物72h，作为对照；使用1.5％H₂SO₄在121℃条件下预处理60分钟，再使用相同量的纤维素酶和纤维素二糖酶混合物酶解细胞壁残留物72小时，作为处理组。酶解产物使用苯酚硫酸酯法测定可发酵糖含量。糖化效率是酶解前后可发酵糖含量的差值与酶解前可发酵糖含量的比值。因此，依据公式：可发酵糖产量(g/plant)＝地上部细胞壁碳水化合物产量(g/plant)×糖化效率，计算出转基因植株的可发酵糖产量。测定结果显示，cad突变体中纤维素含量差异不大，糖化效率和酶解糖显著增加，分别增加了29.5％和31.2％(图5)。

序列表

<110> 齐鲁师范学院

中国科学院青岛生物能源与过程研究所

<120> 与玉米细胞壁消化率相关的分子标记及其鉴别引物和应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aaatcatggc tttggtttga 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccttatctcg tccacttctc g 21

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cggctttctt tcccaactcc 20

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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cattaaaaac tgaccatcca tcgt 24

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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atggggagcc tggcgtccg 19

<210> 6

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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tcagttgctg gccgcatcc 19

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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gccgcgagtg cagcccctg 19

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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caggggctgc actcgcggc 19

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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cgggatcccg atggggagcc tggcgtccg 29

<210> 10

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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ccaagcttgg tcagttgctg gccgcatcc 29