一种用于铜绿微囊藻的抑藻剂

摘要

本发明公开了一种用于铜绿微囊藻的抑藻剂，所述的抑藻剂由壬酸、亚油酸组成，壬酸、亚油酸的体积比为1：1，抑藻剂在铜绿微囊藻液中适用的浓度范围为0.04-0.08 mL/L。本发明与现有技术相比，选择了两种不同脂肪酸即壬酸和亚油酸进行联合，通过利用三种不同评价体系对联合脂肪酸的抑制效果进行了评价，结果表明两者组合的确具有良好的协同抑藻效应，并且成本低廉、环境友好和安全。

说明书

技术领域

本发明属于抑藻剂，特别属于铜绿微囊藻的抑藻剂。

背景技术

目前，利用化感物质抑制藻类生长是水华治理的主要研究方向。由于 化感物质是水生植物生长过程中产生的次生代谢产物，一般在自然环 境中能够降解，不会在生态系统中长期积累，所以具有良好的生态安 全性。化感物质按照其化学结构总体可分为5大类，分别为：芳香族、 含氧杂环化合物、萜类和含氮化合物、脂肪族。但迄今为止，利用单 一化感物质作为抑藻剂的比较多，但有的化感物质的价格比较高，或 者有气味，均不利于抑藻剂的使用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种用于铜绿微囊藻的复合的抑藻 剂。

本发明解决问题的技术方案为：一种用于铜绿微囊藻的抑藻剂，所述 的抑藻剂由壬酸（CH₃（CH₂）₇COOH）、亚油酸（CH₃（CH₂）₄CH=CHC H₂CH=CH(CH₂)₇COOH）组成，壬酸、亚油酸的体积比为1：1，抑藻剂在 铜绿微囊藻液中适用的浓度范围为0.04-0.08 mL/L。

所述的壬酸的纯度大于97.5%；

亚油酸的纯度大于80%；

所述的铜绿微囊藻的密度适用范围为1.0×10⁵—1.3×10⁶(个/毫升)。

本发明联合脂肪酸的作用机理表现为细胞膜通透性增加、自由基增多 ，但细胞内抗氧化酶系统活性却逐渐降低，这一方面说明两脂肪酸联 合作用具有作用时间快，抑制效能高，超过了细胞内抗氧化酶系统对 抗外界胁迫的应激能力。另外，由于壬酸在分子量和碳链长度上远小 于亚油酸，容易进入细胞膜，对细胞内部结构造成更直接的影响。

本发明与现有技术相比，选择了两种不同脂肪酸即壬酸和亚油酸进行 联合，由于亚油酸属于长链多不饱和脂肪酸(亚油酸为顺，顺-9，12- 十八碳二烯酸，18:3Δ9c, 12c)，具有非常显著的抑藻特性，壬酸属 短链饱和脂肪酸，同样具有非常好的抑藻效果。虽然前期的研究发现 碳链越短抑藻效果越好，但是碳链越短，其刺激性气味越浓重，环境 很不友好。壬酸也具有一定的刺激性气味，但相对较轻微；癸酸属于 偶数碳脂肪酸，抑藻效果与壬酸相比具有显著性差异，到十一烷酸(十 一酸)已是固体，不仅难溶解，其抑藻效果较癸酸更差。考虑到两种脂 肪酸的价格(亚油酸明显较壬酸价高，包括工业级亚油酸)、不同结构 (这样在作用机理上可能产生互补)、不同理化性质(单纯壬酸具有轻微 特殊气味)，为达到最好的抑藻效果，且成本低廉、环境友好和安全， 故选择这两种脂肪酸进行优化组合，以便取长补短。通过利用三种不 同评价体系对联合脂肪酸的抑制效果进行了评价，结果表明两者组合 的确具有良好的协同抑藻效应。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作详细的说明。

本发明的脂肪酸对藻类的抑制率(inhibition rate)公式为：

IR = (1-N/N0)×100%

式中，IR—抑制率；

N—加入脂肪酸组的藻密度(个/毫升)；

N0—对照组藻密度(个/毫升)。

将脂肪酸的浓度与生长抑制率作一元线性回归，求出半效应浓度EC₅₀( mL/L)。

数据采用Excel 2010和SPSS 17.0软件处理，各组间差异采用单因素 方差分析(one-way ANOVA)，P<0.05表示有显著性差异，P<0.01表示 有极显著差异。

脂肪酸的联合作用评价方法采用毒性单位法(Toxicity Unit，TU)(M arking et al., 1975)、相加指数法(Addition Index，AI)(Mar king，1977)和相似性参数法(Similarity Parameter，SP)(Christe nsen et al., 1989)进行评价。

(1) 毒性单位法(TU)规定混合物中第i组分的毒性单位为：

TU_i = C_i / LC_50,i

式中：C_i—混合物中i组分的浓度， LC_50,i—i组分单独作用时的半致死 浓度。

对于一个N组分的混合物来说，混合物的毒性单位等于各组分毒 性单位之和(M)，即，

$M=T{U}_{\mathrm{mix}}=\underset{i=1}{\overset{N}{\Sigma }}{\mathrm{TU}}_i$

若令，

M₀ = M / (TU_i)_max

则

当M=1时，为相加作用；当M>M₀时，为拮抗作用；当M<1时，为协同作 用；当M=M₀时，为无相加或独立作用；当M₀>M>1时，为部分相加作用 。

(2) 相加指数法(AI)是在毒性单位概念的基础上提出的，定义如下：

当M=1时，AI=M-1；当M<1时，AI=1/M-1；当M>1时，AI=1-M。

AI的评价标准是：

当AI=0时，为简单的相加作用；当AI<0时，为拮抗作用；当AI>0时， 为协同作用。

(3) 相似性参数法(SP)是通过引入相似性参数λ分析二元或多元混合 物的联合效应，对于N组分的混合物，则有：

$\underset{i=1}{\overset{N}{\Sigma }}{\left({\mathrm{TU}}_i\right)}^{1/\lambda }=1$

对于已知的混合物中各组分的毒性单位，可以通过尝试法(Trial an d error)求得λ值。λ评价标准为：

当λ=1时，为简单相加作用；当λ>1时，为协同作用；当0<λ<1时， 为拮抗或小于相加作用；当λ=0时，为独立作用。

本发明的藻液中核酸含量的变化通过测定离心后上清液的OD₂₆₀ 来反映；

蛋白含量变化通过测定离心后上清液的OD₂₈₀来反映；

电导率(EC)的变化使用DDS-11A型电导率仪(上海雷磁新泾仪器有限公 司)测定；

氧自由基(O₂^―?)含量参照萧华山等(1999)的方法测定；

过氧化氢酶(CAT)活性的测定参照Patra等(1978)方法；

过氧化物酶(POD)活性测定参照改进的Cakmak等(1992)方法。

实施例1：

将对数生长期的铜绿微囊藻藻液倒入50 mL锥形瓶中，再倒入BG-11培 养基（参考中国科学院水生生物研究生淡水藻种库藻种信息）使藻细 胞的起始密度为7.0×10⁵ 个/毫升，体积为20 mL。分别配制不同浓 度的抑藻剂（壬酸、亚油酸的体积比为1：1）、壬酸、亚油酸，测定 其对铜绿微囊藻的抑制率， 其结果如表1、2、3所示：

表1  壬酸和亚油酸联合对铜绿微囊藻的抑制率(%)

表中数据为平均值±SE(n=3)。

表2：壬酸对铜绿微囊藻的抑制率(%)

表中数据为平均值±SE(n=3)。

表3 亚油酸对铜绿微囊藻的抑制率(%)

表中数据为平均值±SE(n=3)

从表1—表3可看出，壬酸和亚油酸在单独或联合时均对铜绿微 囊藻有抑制作用。随着浓度的升高，抑制率逐渐增大。比较3种脂肪酸 处理组，发现联合脂肪酸处理组比壬酸和亚油酸处理组的抑制率高， 说明这两种脂肪酸联合作用可能对铜绿微囊藻具有协同效应。在第6d 时，浓度为0.16 mL L^-1的各脂肪酸处理组，壬酸的抑制率为90.28% ，亚油酸的抑制率为87.67%，联合脂肪酸为90.85%。EC₅₀均按第8d计算 ，壬酸对铜绿微囊藻的EC₅₀为0.0031 mL L^-1，亚油酸为0.0045 mL  L^-1，联合脂肪酸为0.0025 mL L^-1。

故本发明的抑藻剂中，壬酸、亚油酸的混合浓度为0.04-0.08 mL/L。

表4联合作用评价参数

从表4中可看出，根据毒性单位法，M<1，此方法评价结果为协同效应 ；根据相加指数法，当M<1时AI=1/M-1，计算得AI>0，即为协同效应； 根据相似性参数法，通过尝试法计算得λ>1，评价为协同效应。通过 上述3种方法对壬酸和亚油酸进行联合效应评价，均表现为协同效应， 充分说明了壬酸和亚油酸对铜绿微囊藻具有协同作用，也的确证明了 这两种脂肪酸联合比单独时对铜绿微囊藻的抑制效 应要强。

实施例2：

将对数生长期的铜绿微囊藻藻液倒入50 mL锥形瓶中，再倒入培养基 使藻细胞的起始密度为7.0×10⁵ 个/毫升，体积为20 mL。分别配制 不同浓度的抑藻剂（壬酸、亚油酸的体积比为1：1）测定其对铜绿微 囊藻藻液蛋白含量的影响，其结果如表5所示：表5  壬酸和亚油酸 联合时对铜绿微囊藻藻液蛋白含量的影响

表中数据为平均值±SE(n=3)，

^*与同期对照组比较，P＜0.05；^**与同期对照组比较，P＜0.01

由表5可知，铜绿微囊藻在壬酸和亚油酸联合作用下随浓度的增加藻液 蛋白含量有所增加，1.0×10^-2 mL L^-1处理组相对于同期对照组藻液 蛋白含量有极其明显的升高(P<0.01)，说明铜绿微囊藻在联合脂肪酸 的作用下细胞膜受到损伤，随着加入的脂肪酸浓度越来越大，细胞内 蛋白外渗量增多。

实施例3：

将对数生长期的铜绿微囊藻藻液倒入50 mL锥形瓶中，再倒入培养基 使藻细胞的起始密度为7.0×10⁵ 个/毫升，体积为20 mL。分别配制 不同浓度的抑藻剂（壬酸、亚油酸的体积比为1：1）测定其对铜绿微 囊藻藻液核酸含量的影响，其结果如表6所示：表6  壬酸和亚油酸 联合时对铜绿微囊藻藻液核酸含量的影响

表中数据为平均值±SE(n=3)。

^*与同期对照组比较，P＜0.05；^**与同期对照组比较，P＜0.01

表6为铜绿微囊藻藻液核酸含量的变化情况。从表中可看出，第2d时藻 液核酸含量随脂肪酸浓度的增加而逐渐增大，这是藻细胞对环境胁迫 的一种急性反应；第4d藻液核酸含量相对减少，这是藻细胞增强了对 亚油酸和壬酸胁迫的适应性，但随着脂肪酸作用时间的延长，到第6d 时藻液中核酸含量相对于对照组又继续升高且与对照组有显著性差异 (P<0.05)，这说明一方面藻细胞膜系统持续受损使细胞中核酸外渗， 另一方面由于胞内核酸被降解而释放出更多的单核苷酸，因此表现为 增色效应。

实施例4：

将对数生长期的铜绿微囊藻藻液倒入50 mL锥形瓶中，再倒入培养基 使藻细胞的起始密度为7.0×10⁵ 个/毫升，体积为20 mL。分别配制 不同浓度的抑藻剂（壬酸、亚油酸的体积比为1：1）测定其对铜绿微 囊藻藻液电导率的影响，其结果如表7所示：

表7  壬酸和亚油酸联合时对铜绿微囊藻藻液电导率的影响

表中数据为平均值±SE(n=3)。

^*与同期对照组比较，P＜0.05；^**与同期对照组比较，P＜0.01

表7显示了联合脂肪酸对铜绿微囊藻藻液的电导率。在第2d时，藻液中 电导率明显升高，到第4d趋于稳定，到第6d又较对照组有明显上升， 这与藻液中蛋白质以及核酸的变化趋势相似；但在第2d电导率的变化 尤其明显，这是因为环境胁迫，藻细胞膜首当其冲受到影响，一些小 分子物质如钾离子、磷酸根离子等外渗，造成藻液电导率的快速上升 。

实施例5：

将对数生长期的铜绿微囊藻藻液倒入50 mL锥形瓶中，再倒入培养基 使藻细胞的起始密度为7.0×10⁵ 个/毫升，体积为20 mL。分别配制 不同浓度的抑藻剂（壬酸、亚油酸的体积比为1：1）测定其对铜绿微 囊藻藻液O₂^―?的影响，其结果如表8所示：

表8  壬酸和亚油酸联合时对铜绿微囊藻O₂^―?含量的影响

表中数据为平均值±SE(n=3)。

 ^*与同期对照组比较，P＜0.05；^**与同期对照组比较，P＜0.01

如表8所示，在第2d时，处理组中随脂肪酸浓度的增加O₂^―?含量逐渐 升高，随着时间的推移，各处理组呈现先降低后升高的趋势。表明藻 细胞受到脂肪酸的胁迫后细胞膜脂质过氧化增加，但随着时间的延长 ，藻细胞数量在化感物质的作用下逐渐降低，导致自由基含量减少， 后由于脂肪酸含量被消耗，而藻细胞尚未全部死亡，又促使了O₂^―?含 量的积累。

实施例6：

将对数生长期的铜绿微囊藻藻液倒入50 mL锥形瓶中，再倒入培 养基使藻细胞的起始密度为7.0×10⁵ 个/毫升，体积为20 mL。分别 配制不同浓度的抑藻剂（壬酸、亚油酸的体积比为1：1）测定其对铜 绿微囊藻藻液CAT活力的影响，其结果如表9所示：

表9  壬酸和亚油酸联合时对铜绿微囊藻CAT活力的影响

表中数据为平均值±SE(n=3)。

 ^*与同期对照组比较，P＜0.05；^**与同期对照组比较，P＜0.01

表9为联合脂肪酸对铜绿微囊藻的影响。随着时间的变化，各组的CAT 活力均呈现下降趋势，与同期对照组相比，P<0.01。说明在联合脂肪 酸的作用下，藻细胞受到了重创，细胞内的应激反应下降，蛋白质合 成减少，故各组酶活力均下降。对对照组而言，后期的下降与细胞相 对老化，代谢率下降有关。

实施例7：

将对数生长期的铜绿微囊藻藻液倒入50 mL锥形瓶中，再倒入培养基 使藻细胞的起始密度为7.0×10⁵ 个/毫升，体积为20 mL。分别配制 不同浓度的抑藻剂（壬酸、亚油酸的体积比为1：1）测定其对 铜绿微囊藻藻液POD活力的影响，其结果如表10所示：表10  壬酸和 亚油酸联合时对铜绿微囊藻POD活力的影响

表中数据为平均值±SE(n=3)

 ^*与同期对照组比较，P＜0.05；^**与同期对照组比较，P＜0.01

表10显示了壬酸和亚油酸联合时对铜绿微囊藻POD活力的影响。从表中 可看出各处理组与同期对照组比较POD活力均呈下降趋势，且随时间变 化下降明显。这与上述CAT活力变化一致，再次说明了联合脂肪酸对铜 绿微囊藻有极快的抑制效率，使其抗氧化酶系统的活性降低，应激能 力下降。