一种用于鸡毒支原体、鸡滑液囊支原体和副鸡禽杆菌多重PCR检测引物组、试剂盒及应用

摘要

本发明提供了一种用于鸡毒支原体、鸡滑液囊支原体和副鸡禽杆菌多重PCR检测引物组，属于分子检测技术领域，所述引物组包括MS‑F、MS‑R、MG‑F、MG‑R、APG‑F和APG‑R；所述MG‑F、MG‑R、MS‑F、MS‑R、APG‑F和APG‑R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：6所示。经过验证，本发明的引物组具有良好的特异性和灵敏度。

说明书

技术领域

本发明涉及分子检测技术领域，尤其涉及一种用于鸡毒支原体、鸡滑液囊支原体和副鸡禽杆菌多重PCR检测的引物组、试剂盒及应用。

背景技术

鸡毒支原体(Mycoplasma Gallisepticum，MG)又称鸡毒霉形体或鸡败血支原体，1943年，Delaplane等首次从感染鸡群中分离到该病原体，由该病原引发的鸡毒支原体病呈世界性分布，美国鸡群中该病的感染率可达73％，马来西亚鸡群中该病血清阳性率为26％。本病在我国流行范围较广，数据显示我国鸡毒支原体感染阳性率已达50％～80％，成为威胁我国养禽业的重要疾病之一。鸡毒支原体不同菌株的感染性和致病性不同，主要临床表现为流鼻涕、流眼泪、咳嗽，严重时呼吸困难或张口呼吸，可听到湿性啰音。临床上鸡毒支原体常常与某些细菌、病毒协同感染，导致鸡呼吸道疾病的症状加剧，死亡率升高。

鸡滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae，MS)又称为滑液囊霉形体，是禽类重要的病原体之一。鸡滑液囊支原体病是由滑液囊支原体引起的鸡、火鸡和珍珠鸡等家禽的一种急性或慢性传染病。鸡滑液囊支原体以侵害关节的滑液囊膜及腱鞘为主，引起关节渗出性滑膜炎、腱鞘炎及跗关节和脚垫肿胀。鸡滑液囊支原体对鸡的危害主要是引起传染性滑膜炎，剖检变化为关节渗出性的滑液囊炎及腱鞘滑膜炎，导致鸡明显的跛行、生长发育迟缓及酮体等级下降等，当与传染性支气管炎、新城疫等呼吸道疾病并发时还可表现为亚临床型呼吸道疾病，此外还造成生长发育迟缓、胴体降级、产蛋率下降等，近年来，鸡滑液囊支原体病流行广泛，给养鸡业造成了严重的经济损失，该病一年四季均有发生，以春季最为易发，我国鸡滑液囊支原体的检出率呈逐年升高的趋势，一般情况下3～16周龄和10～24周龄的成年鸡可发生急性感染，急性感染后出现的慢性感染可持续终生。

副鸡禽杆菌(Avibacteriumparagallinarum)原名副鸡嗜血杆菌引起鸡的传染性鼻炎，是一种鸡的急性上呼吸道疾病。该病一般呈急性发病，在鸡群中传播迅速。该病临床症状主要表现为结膜充血、甩鼻、面部肿胀、眼流泪、厌食和腹泻，其引起的经济损失主要是蛋鸡产蛋率下降(10％～40％)，育成鸡和肉鸡生长不良及淘汰率增加。该病于1920年由Beach首先报道，但直到1931年才分离到该病的病原体。目前该病已呈世界性分布，对世界养鸡业造成了巨大的经济损失。

MG和APG感染后鸡均表现出呼吸道症状，有些MS感染的病鸡亦可出现呼吸道症状，这为三种病的确诊带来极大的困难。

目前，现有技术只能实现鸡毒支原体、鸡滑液囊支原体和副鸡禽杆菌的单重或双重检测，而不能实现鸡毒支原体、鸡滑液囊支原体和副鸡禽杆菌的同时检测。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于鸡毒支原体、鸡滑液囊支原体和副鸡禽杆菌多重PCR检测的引物组、试剂盒及应用，具有特异性强、灵敏度高的优点。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种用于鸡毒支原体、鸡滑液囊支原体和副鸡禽杆菌多重PCR检测引物组，包括MS-F、MS-R、MG-F、MG-R、APG-F和APG-R；所述MG-F、MG-R、MS-F、MS-R、APG-F和APG-R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：6所示。

本发明还提供了一种用于鸡毒支原体、鸡滑液囊支原体和副鸡禽杆菌的多重PCR检测的试剂盒，所述试剂盒包括上述方案所述引物组。

优选的，所述试剂盒还包括PCR Mix和H₂O。

优选的，所述试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品。

优选的，所述阳性对照品包括鸡毒支原体基因组DNA、鸡滑液囊支原体基因组DNA和副鸡禽杆菌基因组DNA；所述阴性对照品为双蒸水。

本发明还提供了上述方案所述的试剂盒在非诊断目的的鸡毒支原体、鸡滑液囊支原体和副鸡禽杆菌多重PCR检测中的应用，所述应用包括以下步骤：

1)提取待测样品的基因组DNA；

2)以提取待测样品的基因组DNA为模板，利用上述方案所述引物组，进行多重PCR扩增反应，获得多重PCR扩增产物；

3)多重PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测；

若扩增出长度为453bp的特异性片段，检测结果为鸡毒支原体阳性，若未扩增出长度为453bp的特异性片段，检测结果为鸡毒支原体阴性；

若扩增出长度为328bp的特异性片段，检测结果为鸡滑液囊支原体阳性；若未扩增出长度为328bp的特异性片段，检测结果为鸡滑液囊支原体阴性；

若扩增出长度为241bp的特异性片段，检测结果为副鸡禽杆菌阳性；若未扩增出长度为241bp的特异性片段，检测结果为副鸡禽杆菌阴性。

优选的，步骤2)中所述多重PCR扩增反应使用的反应体系以25μL计包括：

MS-F和MS-R各0.25μL，MG-F和MG-R各0.5μL，APG-F和APG-R各0.5μL，PCRMix 12.5μL，H₂O>

所述引物组由以下终浓度的成分组成：MS-F和MS-R的浓度独立为10uM/L，MG-F和MG-R的浓度独立为10uM/L，APG-F和APG-R的浓度独立为10uM/L。

优选的，所述多重PCR扩增反应的程序为：95℃5min，[95℃30S，53℃30S，72℃1min]，72℃10min；所述[95℃30S，53℃30S，72℃1min]进行25个循环。

本发明的有益效果：本发明提供了一种用于鸡毒支原体、鸡滑液囊支原体和副鸡禽杆菌多重PCR检测引物组，包括MS-F、MS-R、MG-F、MG-R、APG-F和APG-R；所述MG-F、MG-R、MS-F、MS-R、APG-F和APG-R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：6所示。经过特异性实验验证，利用本发明的引物组进行多重PCR扩增，能够同时扩增出453bp、328bp和241bp三个特异性片段，大肠杆菌、鸡白痢沙门氏菌、禽多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌和阴性对照均未扩增出目的片段，表明本发明的引物组具有良好的特异性。并且，经过灵敏度实验验证，利用本发明的引物组进行扩增，MG、MS、APG的最低检出量均为5×10^-3ng/μL，可见本发明的引物组灵敏度良好。

附图说明：

图1为实施例1中非诊断目的的鸡毒支原体、鸡滑液囊支原体和副鸡禽杆菌多重PCR检测的特异性验证结果；

图2为实施例2中非诊断目的的鸡毒支原体、鸡滑液囊支原体和副鸡禽杆菌多重PCR检测的灵敏度验证结果。

具体实施方式

本发明提供了一种用于鸡毒支原体、鸡滑液囊支原体和副鸡禽杆菌多重PCR检测引物组，包括MS-F、MS-R、MG-F、MG-R、APG-F和APG-R；所述MG-F、MG-R、MS-F、MS-R、APG-F和APG-R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：6所示。

本发明中，所述MS-F和MS-R针对MS heat shock ATP-dependent protease基因序列进行设计；所述MS heat shockATP-dependentprotease基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示；所述MG-F和MG-R针对MG gapA基因序列进行设计；所述MG gapA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示；所述APG-F和APG-R针对APG hagA基因序列进行设计；所述APG hagA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示；所述引物组的利用PrimerPlex 2多重PCR引物设计软件设计；本发明的具体实施过程中，所述引物组由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

本发明还提供了一种用于鸡毒支原体、鸡滑液囊支原体和副鸡禽杆菌的多重PCR检测的试剂盒，所述试剂盒包括上述方案所述引物组。

本发明中，所述引物组优选的由以下终浓度的成分组成：MS-F和MS-R的浓度独立为10uM/L，MG-F和MG-R的浓度独立为10uM/L，APG-F和APG-R的浓度独立为10uM/L。

本发明中，所述引物组能够同时、高效的对目的片段进行扩增。

本发明中，所述试剂盒优选的还包括PCR Mix和H₂O；所述PCR>

本发明中，所述试剂盒优选的还包括阳性对照品和阴性对照品；所述阳性对照品优选的包括鸡毒支原体基因组DNA、鸡滑液囊支原体基因组DNA和副鸡禽杆菌基因组DNA；所述阴性对照品优选为双蒸水。

本发明还提供了上述方案所述的试剂盒在非诊断目的的鸡毒支原体、鸡滑液囊支原体和副鸡禽杆菌多重PCR检测中的应用，所述应用包括以下步骤：

1)提取待测样品的基因组DNA；

2)以提取待测样品的基因组DNA为模板，利用上述方案所述引物组，进行多重PCR扩增反应，获得多重PCR扩增产物；

3)多重PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测；

若扩增出长度为453bp的特异性片段，检测结果为鸡毒支原体阳性，若未扩增出长度为453bp的特异性片段，检测结果为鸡毒支原体阴性；

若扩增出长度为328bp的特异性片段，检测结果为鸡滑液囊支原体阳性；若未扩增出长度为328bp的特异性片段，检测结果为鸡滑液囊支原体阴性；

若扩增出长度为241bp的特异性片段，检测结果为副鸡禽杆菌阳性；若未扩增出长度为241bp的特异性片段，检测结果为副鸡禽杆菌阴性。

本发明首先提取待测样品的基因组DNA；本发明对所述待测样品的基因组DNA的提取方法没有特殊限定，采用本领域常规的基因组DNA提取方法即可。本发明具体实施过程中，所述基因组DNA按照TIANamp Bacteria DNAKit细菌基因组DNA提取试剂盒说明书进行；所述TIANamp Bacteria DNAKit细菌基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。

本发明在提取待测样品的基因组DNA后，以提取待测样品的基因组DNA为模板，利用上述方案所述引物组，进行多重PCR扩增反应，获得多重PCR扩增产物。

本发明中，所述多重PCR扩增反应使用的反应体系以25μL计优选的包括：MS-F和MS-R各0.25μL，MG-F和MG-R各0.5μL，APG-F和APG-R各0.5μL，PCRMix 12.5μL，H₂O7μL，待测样品的基因组DNA>

本发明中，所述多重PCR扩增反应的程序为：95℃5min，[95℃30S，53℃30S，72℃1min]，72℃10min；所述[95℃30S，53℃30S，72℃1min]进行25个循环。

本发明在获得多重PCR扩增产物后，多重PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测；

若扩增出长度为453bp的特异性片段，检测结果为鸡毒支原体阳性，若未扩增出长度为453bp的特异性片段，检测结果为鸡毒支原体阴性；

若扩增出长度为328bp的特异性片段，检测结果为鸡滑液囊支原体阳性；若未扩增出长度为328bp的特异性片段，检测结果为鸡滑液囊支原体阴性；

若扩增出长度为241bp的特异性片段，检测结果为副鸡禽杆菌阳性；若未扩增出长度为241bp的特异性片段，检测结果为副鸡禽杆菌阴性。

本发明中，所述琼脂糖凝胶由琼脂糖和TAE缓冲液制备获得，所述琼脂糖与TAE缓冲液的质量体积比为1.5g:100mL。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1非诊断目的的鸡毒支原体、鸡滑液囊支原体和副鸡禽杆菌多重PCR检测的特异性验证

分别以双蒸水、鸡毒支原体、鸡滑液囊支原体和副鸡禽杆菌多重(MGMSAPG)混合DNA，大肠杆菌DNA、鸡白痢沙门菌DNA，禽多杀性巴氏杆菌DNA、金黄色葡萄球菌DNA为模板，使用以下反应体系进行多重PCR扩增。

反应体系以25μL计：

A：MS-F/R各0.25μL，MG-F/R各0.5μL，APG-F/R各0.5μL，Mix 12.5μL，H₂O>

B：MS-F/R各0.25μL，MG-F/R各0.5μL，APG-F/R各0.5μL，Mix 12.5μL，H₂O>

C：MS-F/R各0.25μL，MG-F/R各0.5μL，APG-F/R各0.5μL，Mix 12.5μL，H₂O>

D：MS-F/R各0.25μL，MG-F/R各0.5μL，APG-F/R各0.5μL，Mix 12.5μL，H₂O>

E：MS-F/R各0.25μL，MG-F/R各0.5μL，APG-F/R各0.5μL，Mix 12.5μL，H₂O>

F：MS-F/R各0.25μL，MG-F/R各0.5μL，APG-F/R各0.5μL，Mix 12.5μL，H₂O>

G：MS-F/R各0.25μL，MG-F/R各0.5μL，APG-F/R各0.5μL，Mix 12.5μL，H₂O>

H：MS-F/R各0.25μL，MG-F/R各0.5μL，APG-F/R各0.5μL，Mix 12.5μL，H₂O>

I：MS-F/R各0.25μL，MG-F/R各0.5μL，APG-F/R各0.5μL，Mix 12.5μL，H₂O>

扩增条件：95℃5min，[95℃30S，53℃30S，72℃1min]，72℃10min；所述[95℃30S，53℃30S，72℃1min]进行25个循环。

产物经1.5％琼脂糖凝胶(称取琼脂糖1.5g，溶于100mL TAE缓冲液中，加热溶解，制成1.5％琼脂糖凝胶)电泳检测，检测结果参见图1，图1中M：DL2000DNAMarker，1：体系A(阴性对照)，2：体系B(MG+MS+APG)，3：体系C(MG)，4：体系D(MS)，5：体系E(APG)，6：体系F(大肠杆菌)，7：体系G(鸡白痢沙门菌)，8：体系H(禽多杀性巴氏杆菌)，9：体系I(金黄色葡萄球菌)。

图1结果显示利用本发明的引物组进行多重PCR扩增，能够同时扩增出453bp、328bp和241bp三个特异性片段，大肠杆菌、鸡白痢沙门氏菌、禽多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌和阴性对照均未扩增出目的片段，表明本发明建立的多重PCR方法具有良好的特异性。

实施例2非诊断目的的鸡毒支原体、鸡滑液囊支原体和副鸡禽杆菌多重PCR检测的灵敏度验证

分别调整MG，MS，APG基因组DNA的初始浓度为5×10²ng/μL，分别取100μLMG、MS和APG基因组DNA等体积混合后进行10倍梯度稀释(10²～10^-7)，后每个稀释度取1μL混合DNA作为模板，按照如下反应体系进行多重PCR扩增，计算该多重PCR方法对MG、MS、APG的最低检出量，评价其灵敏度。

反应体系：以25μL计包括：MS-F和MS-R各0.25μL，MG-F和MG-R各0.5μL，APG-F和APG-R各0.5μL，PCR Mix 12.5μL，H₂O7μL，鸡毒支原体、鸡滑液囊支原体和副鸡禽杆菌的基因组DNA各1μL。

实验结果参见图2，图2中M：DL2000DNAMarker，1：阴性对照、2：5×10²ng/μL、3：5×10¹ng/μL、4：5×10^-1ng/μL、5：5×10^-2ng/μL、6：5×10^-3ng/μL、7：5×10^-4ng/μL、8：5×10^-5ng/μL、9：5×10^-6ng/μL、10：5×10^-7ng/μL。

由图2可知，随着DNA浓度的逐渐减少，扩增产物的亮度逐渐降低，泳道7中已无扩增条带，说明MG、MS、APG的最低检出量均为5×10^-3ng/μL，灵敏度良好。

由以上实施例可知，本发明提供了一种用于鸡毒支原体、鸡滑液囊支原体和副鸡禽杆菌多重PCR检测引物组，该引物组具有良好的特异性和灵敏度。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>内蒙古自治区农牧业科学院

<120>一种用于鸡毒支原体、鸡滑液囊支原体和副鸡禽杆菌多重PCR检测引物组、试剂盒及应用

<160>9

<170>SIPOSequenceListing 1.0

<210>1

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>1

tcctttccat ttggatatag cg 22

<210>2

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>2

ctgtaccttt agcgttacca tc 22

<210>3

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>3

cggaataact cctcttgcct ta 22

<210>4

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>4

accgctgcat ctggaattaa ta 22

<210>5

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>5

caccaagcat cggttctgta a21

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>6

tcgctaccaa tacggtcagt20

<210>7

<211>511

<212>DNA

<213>鸡滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae)

<400>7

tatgtaatag taaaaactga cgaaatttcc tttccatttg gatatagcga agttttaatt60

ttagaacaag atagcatcga gttattagaa actactaaat ttaaatttaa aaatgaagat 120

cgtcttgtaa ttgtatatgc agaagatgta tacacagaag aagttaaatt tcttcaaaga 180

ggtctttata taaaacctct tgatgctaaa gaagttatgt atcaaggtga aaaagcattg 240

atactaactt ttaaagcatt gcattttttt gatatccaaa atttttcata tgaaatgaat 300

caagatgaaa ttatgtctgc taacttttta gttgatggta acgctaaagg tacagtaggt 360

tatgaaatgg ttcttagtgg acatattaat aatgtcgaag atgttaaaga aaatttaatg 420

aatgaattta gacaagatca aaacaaaatg aatttcttta gtatttttga aactcttgta 480

aataattcaa attcatttgg aattagcacc a511

<210>8

<211>546

<212>DNA

<213>鸡毒支原体(Mycoplasma Galliscepticum)

<400>8

gtgaaaaaac ttatttttaa attatcagtc ggaataactc ctcttgcctt aatcggttta60

ggtagttttg gattagcagt ttctggagct aagccaaata accttaaacc tattaaccaa 120

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aactctaact tcacatcact ttcaattgac ggtaccaacc caggtgcatt agttttaact 240

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ggtaatacaa acgatctaac tggtaaggtt ggattttatg atgctaacaa tagattgact 360

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gttcaacaag aacaaaagac taaagaccaa gtgtttgaaa actactttat gtctgatgca 540

cctgct546

<210>9

<211>397

<212>DNA

<213>副鸡禽杆菌(Avibacterium paragallinarum)

<400>9

atggtagccg tgtagattat acaccaagca tcggttctgt aactgctggt ttatcttacc60

gttttggtca aagtgcacca gttgttgaac ctaaggttgt tgcaaaaaca tttgcattaa 120

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