一种能在低磷环境下促进木荷苗高及地径增长的内生真菌

摘要

本发明公开了一种能在低磷环境下促进木荷苗高及地径增长的内生真菌，该内生真菌MG37为葡萄座腔菌（Botryosphaeria sp.），已于2019年4月8日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏号为CGMCC No.17477。该菌株是从木荷的根中分离纯化得到的，其能够缓解磷胁迫条件对植株苗高和地径生长的制约，能够在低磷环境下促进木荷苗高及地径的增长，从而促进植株生长。

说明书

技术领域

本发明属于微生物领域，具体涉及一种能在低磷环境下促进木荷苗高及地径增长的内生真菌。

背景技术

磷是植物生长发育所需的三大营养元素之一，磷素缺乏会影响植物光合、物质能量转化等生命活动代谢过程。我国南方土壤普遍缺磷，且土壤中的磷几乎以无效磷的方式存在，可供植物吸收利用的部分很少。在低磷环境下，植物会自身演化一系列响应机制以缓解磷素供应不足对其生长的制约，如增加对环境中可利用性磷的吸收利用效率，减少生命过程对磷素的消耗和加速磷素的循环利用等。

木荷因具有优化林分结构、改良土壤肥力等多种优良特性，在我国的种植面积不断扩大，是我国重要的防火、绿化和用材树种。近年来，由于市场对木荷的需求量不断增大，引起木荷人工林的过度开发，加之粗放的木荷人工林经营模式，导致木荷林产量不断下降。此外，由于我国南方土壤普遍缺磷，可供植物吸收利用的有效磷含量很低。磷元素作为植物生长发育所需三大营养元素之一，磷素供应不足使木荷生长代谢过程受阻，造成木荷品质变差、林分产量降低，严重限制木荷人工林的发展规模。因此，提高木荷林的产量和品质，解决木荷林低产低效问题，尤其是低磷环境对木荷生长的制约，是目前木荷人工林经营过程中面临最大的挑战。

国内外学者已从植物体内筛选出多种具有促生和解磷效果的内生真菌，但目前的研究主要集中于禾木科植物相关菌株的筛选，有关于木本植物，尤其是对木荷内生真菌筛选鉴定的研究鲜见报道。从木荷组织器官中筛选出对木荷生长和抗逆性有益的内生真菌，建立木荷-内生真菌共生体系，以期获得可促进木荷生长，提高木荷在低磷胁迫下抗逆性的内生真菌，可为丰富木本植物内生真菌的菌种信息以及为木荷人工林经营制造生物菌肥提供数据基础和参考依据。

发明内容

本发明的目的在于提供一种在低磷环境下能促进木荷苗高及地径增长的内生真菌。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种能在低磷环境下促进木荷苗高及地径增长的内生真菌，该内生真菌MG37为葡萄座腔菌（Botryosphaeria>），已于2019年4月8日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏号为CGMCC No. 17477。MG37在土豆葡萄糖培养基（PDA培养基）上培养时，初期菌落成白色，气生菌丝茂盛，培养后期菌落颜色开始变深，逐渐呈墨绿色至黑色。分生孢子呈纺锤形，顶端略纯。分生孢子整体无色、光滑薄壁，无隔，其大小在23.5±2.1×5.8±0.5μｍ。分生孢子形成的最适温度是26-28℃左右，当温度达到15℃以上时，分生孢子可直接在水中萌发。葡萄座腔菌的子囊座呈近球形，子囊孢子发育成熟后子囊壳顶端出现小孔，内含长棒状、双层膜的子囊，子囊中通常含有８个子囊孢子，子囊孢子呈无色、无隔、椭圆形近纺锤形，中间或近1/3处最宽，大小约为27.3±4.1×17.1±1.75μｍ。

本发明提供的菌株是从木荷的根中分离纯化得到的，其可制备成菌液，通过根际土壤浇施或苗木直接接种的方式用于低磷环境下木荷苗木的种植。

所述菌液的制备方法为：将所述菌株接入液体培养基中，摇床恒温培养72h后，将所得培养液用无菌水稀释至5.5×10⁶个•L^-1，即得。所述液体培养基配方为：蛋白胨5.0g，酵母浸出粉2.0g，葡萄糖（C₆H₁₂O₆•H₂O）20.0g，磷酸二氢钾（KH₂PO₄）1.0g，硫酸镁（MgSO₄•7H₂O）0.5g，超纯水1000ml，pH>

本发明所得菌株能够缓解磷胁迫条件对植株苗高和地径生长的制约，能够在低磷环境下促进木荷苗高及地径的增长，从而能促进植株生长。

附图说明

图1为所得内生真菌MG37的菌落形态图。

具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。

实施例1 木荷内生真菌的分离

1. 主要仪器设备

超净工作台SW-CJ-1FD、恒温培养箱HH•B11-II、恒温培养振荡器zhwy-211B、万分之一天平AR1140、全自动立式灭菌器LMQ.C-4060、超纯水机P60-CW等。

2. 主要试剂和培养基

试剂：15%次氯酸钠、75%无水乙醇、引物PAGE 11-59bp OD 1-2、DNA电泳loadingbuffer、GoodViewTM 核酸染料、2×Tap PCR MasterMix、真菌DNA提取试剂盒、DNA纯化回收试剂盒。

培养基：（1）改良马丁琼脂培养基：蛋白胨5.0g，酵母浸出粉2.0g，葡萄糖（C₆H₁₂O₆•H₂O）20.0g，磷酸二氢钾（KH₂PO₄）1.0g，硫酸镁（MgSO₄•7H₂O）0.5g，琼脂15.0g，超纯水1000ml，pH>

（2）改良马丁液体培养基：蛋白胨5.0g，酵母浸出粉2.0g，葡萄糖（C₆H₁₂O₆•H₂O）20.0g，磷酸二氢钾（KH₂PO₄）1.0g，硫酸镁（MgSO₄•7H₂O）0.5g，超纯水1000ml，pH>

（3）磷酸三钙无机磷培养基（NBRIP）：葡萄糖（C₆H₁₂O₆•H₂O）10.0>4)₂SO₄）0.5>4•7H₂O）0.3>4•7H₂O）0.03>4•4H₂O）0.03>3(PO₄)₂）5.0>

3. 内生真菌的分离

（1）采用组织分离法，将木荷的根经流水冲洗干净阴干后于超净台内进行组织表面消毒，其操作流程为：75%无水乙醇消毒→无菌水清洗2~3遍→15%次氯酸钠消毒→无菌水清洗2~3遍。将消毒后的根用无菌刀片切去韧皮部再切成2mm×2mm大小，置于改良马丁琼脂培养基上，28℃恒温避光培养。

（2）消毒效果的验证：将消毒最后一步清洗样品的无菌水涂布于未使用的改良马丁琼脂培养基上，28℃恒温培养4~7d，若无菌体长出则为消毒干净。采用组织印迹法，将消毒后的样本组织于未使用的改良马丁琼脂培养基上轻轻滚动或紧贴培养基放置5min后取走做对照，28℃恒温培养4~7d，如无菌体长出则为消毒干净。各对照重复3次。

4. 内生真菌的纯化

待组织材料培养3~5d后，用接种针挑取组织周围菌落生长良好的菌丝，分别于新的马丁琼脂培养基上采用划线法进行菌株纯化，倒置于恒温培养箱内，28℃恒温避光培养4~7d。反复纯化3~4次，得到纯化菌株。将纯化后的菌株接入斜面培养基，于4℃保存。

5. 内生真菌的筛选

（1）平板初筛：采用三点接种法，将于改良马丁琼脂培养基上活化后的菌株接种于NBRIP培养基，28℃恒温培养7d。每个菌株三个重复，根据平板内透明圈的大小初步筛选具有解磷能力的菌株。

（2）摇瓶复筛：于100ml三角瓶内加入40ml NBRIP液体培养基（不含琼脂），高温（115℃、20min）灭菌备用。将于改良马丁琼脂培养基上活化后的菌株接种于NBRIP液体培养基，摇床培养7d（28℃、180r min-1）。用无菌移液器吸取1.5ml菌液于离心管离心10min（4℃、10000r min-1）,取上清液用钼蓝比色法测定菌液内有效P含量，得到目标菌株。每个菌株3个重复，以不接菌的NBRIP液体培养基为对照。

6. 内生真菌的DNA提取和鉴定

6.1 菌株总DNA的提取

将供试菌株用改良马丁琼脂培养基活化后，采用OMEGA 基因组DNA提取试剂盒（D3485-01）提取菌株的总DNA。

6.2 菌株18S rDNA的PCR扩增

利用真菌18S rDNA通用引物ITS1（5＇-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3＇）和ITRS4（5＇-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3＇）为正、反引物，扩增其ITS序列。

25μlPCR扩增反应体系：

，

PCR反应条件：

。

6.3 PCR 产物回收

PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，割取目的条带，用天根回收试剂盒（DP214-03）进行纯化回收，进行测序。

6.4 菌株18S rDNA序列分析

将所得ITS rDNA序列提交NCBI数据库进行序列对比分析，选取与Genbank中同源性为99%以上的序列，初步确定菌株的属。

18S rDNA全序列：

TCGGGCTCGGCCGATCCTCCCACCCTTTGTGTACCTACCTCTGTTGCTTTGGCGGGCCGCGGTCCTCCGCGGCCGCCCCCCTCCCCGGGGGGTGGCCAGCGCCCGCCAGAGGACCATCAAACTCCAGTCAGTAAACGATGCAGTCTGAAAAACATTTAATAAACTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTTTGGTATTCCGAAGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTACAACCCTCAAGCTCTGCTTGGTATTGGGCACCGTCCTTTGCGGGCGCGCCTCAAAGACCTCGGCGGTGGCGTCTTGCCTCAAGCGTAGTAGAACATACATCTCGCTTCGGAGCGCAGGGCGTCGCCCGCCGGACGAACCTTCTGAACTTTTCTCAAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCCGGAGGAAA。

实施例2

菌液制备：将活化后的解磷菌接入40mL改良马丁液体培养基中，置于恒温摇床上培养72h（28℃、160 r•min^-1）。用血球计数法计算计算孢子数量，将培养后的菌液用无菌水按十倍稀释法稀释成5.5×10⁶个•L^-1。

本试验采用土培盆栽试验，试验所选木荷幼苗为一年生实生苗，平均苗高为20cm，平均地径为3.0mm，由福建省林业科学研究院提供。在2016年3月3日选取长势一致的木荷幼苗定植于直径15cm、高10cm的塑料盆内。实验所需土壤经过混匀称量，每盆放入等量（4kg）的黄心土，该土壤中养分含量见表1。经一个月恢复性生长后，于2016年4月3日开始接菌，连续3天于木荷根际土壤施入等浓度的100mL菌液。每种菌液处理4次重复，并以蒸馏水处理为空白对照。

表1 基质土壤养分情况 单位：mg/kg

低磷胁迫：根据预备试验和有关资料，以KH₂PO₄为磷肥设计了正常胁迫（16mg/kg）、轻度胁迫（8mg/kg），中度胁迫（4mg/kg）和重度胁迫（0mg/kg）4个磷处理，每个处理3个重复。于2016年4月18日进行低磷胁迫试验，并在胁迫试验后定期补充钾肥、氮肥及其他微量元素以满足木荷幼苗生长对营养元素的要求，分别在胁迫至15d、30d、45d、60d、90d和120d时进行全部木荷幼苗生长指标的测定。

苗高地径测定：采用钢尺测定苗高，数显游标卡尺测定胸径。结果见表2。

表2 低磷胁迫下内生真菌感染对木荷幼苗苗高、地径生长的影响

由表2可见，在4种不同程度供磷条件下，菌株MG37处理的苗高较对照处理分别增加了13.8%、25.4%、28.3%和48.7%，且在4种胁迫条件下与对照处理的差异均达到显著水平（P<0.05）；菌株MG37处理的地径较对照处理分别增加了1.5%、1.3%、3.0%和5.1%，且在重度胁迫条件下与对照处理的差异均达到显著水平（P<0.05）。表明菌株MG37能够缓解磷胁迫条件对植株苗高和地径生长的制约，在低磷环境下能够促进木荷苗高及地径的增长。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建农林大学

<120> 一种能在低磷环境下促进木荷苗高及地径增长的内生真菌

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<170> PatentIn version 3.3

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tcgggctcgg ccgatcctcc caccctttgt gtacctacct ctgttgcttt ggcgggccgc 60

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tttgcgggcg cgcctcaaag acctcggcgg tggcgtcttg cctcaagcgt agtagaacat 420

acatctcgct tcggagcgca gggcgtcgcc cgccggacga accttctgaa cttttctcaa 480

ggttgacctc ggatcaggta gggatacccg ctgaacttaa gcatatcaat aagccggagg 540

aaa 543

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