一种水环境中多种药物活性物质的快速检测方法

摘要

本发明涉及药物检测技术领域，具体涉及一种水环境中多种药物活性物质的快速检测方法。本发明方法通过优化内标种类和数量，在保证实验准确度、灵敏度和低检测限的条件下，大幅提高实验效率，降低实验成本。本方法适用于大部分环境水体介质，包括生活污水、医疗废水、污水处理厂出水、地表水和饮用水等，既可以用于对168种目标物的筛查，也可准确定量这些物质在环境样品中的含量。

说明书

技术领域

本发明涉及药物检测技术领域，具体涉及一种水环境中多种药物活性物质的检测方法。

背景技术

药物是用于预防、治疗及诊断疾病的物质，药物的产生是为了改善和提高人类的健康和福祉。全球医药市场的价值目前已经超过1万亿美元，并且依然在以约4％的年均速度继续增长^[1]。药物可以改善人类的生活质量，但是，增加的药物消耗使药物中的主要成份及及其代谢产物源源不断地排入水环境中。目前，药物活性物质在环境中无处不在，由于其在环境中地持续存在和非选择性的毒性效果，已经对生态环境和人类健康构成严重威胁^[2]，因此，此类物质也引起了全球性关注。

为了充分了解和控制水生环境中药物活性物质的浓度和风险就需要准确且灵敏的分析定量方法。目前，大多数定量这种新兴污染物的方法都采用以液相色谱和三重四级杆串联质谱为基础的检测体系，因为该分析仪器具有高精度、高灵敏度和高稳定性。由于目标化合物在环境中存在的浓度非常低，而且样品中通常存在复杂的基质干扰检测结果，在检测环境样品之前，这些样品通常会经过净化和浓缩的前处理步骤。最常用的样品前处理步骤就是固相萃取，即使水环境样品经过具有选择性吸附的固定相来达到从水中分离目标物质的效果。

传统的检测体系可以达到检测出环境中痕量药物活性物质的目的，但是存在两个主要的限制：(1)样品前处理和仪器分析消耗大量的人力和财力成本。目前，大多数药物活性物质的检测方法需要针对不同物质设计复杂的前处理步骤而且通常需要非常大的样品量，这其中就产生了大的采样、运输、人力、耗材和实验废物处理的成本；(2)同时检测药物活性物质数量有限。由于药物活性物质各不相同的化学性质，需要设计不同的检测体系，包括前处理方法和检测仪器条件等等。现有的检测方法大多数集中于检测几类结构相似的药物活性物质，而能同时检测的药物活性物质仅有几十种。

以美国EPA经典方法Method 1694：Pharmaceuticals and Personal CareProducts in Water，Soil，Sediment，and Biosolids by HPLC/MS/MS为例^[3]，该方法可以检测74种目标药物和个人护理品，但是每个样品需要用两种方法预处理各1000mL水样，该方法又将74种分为4组进行仪器检测，需要配置不同的流动相和梯度。跟据经验，该方法的前处理耗时约7小时/次(固相萃取流速按照5mL/min计算)，而将所有的物质全部检测出则需要1.6小时(未考虑流动相配置更换、仪器操作、实验人员休息时间)。该方法的样品处理和检测消耗大量的时间和人力成本，不仅对采样运输产生了很大的难度，而且对样品的保存提出了更高的要求；同时该方法也使用和消耗了大量化学试剂，增加了实验人员暴露于化学试剂下的风险，也会产生很多实验垃圾和废液。这一系列问题，限制了该方法的推广应用，从而限制了对药物活性物质环境行为的研究。

[1]Statista，Revenue of the worldwide pharmaceutical market from 2001to 2017(in billion U.S.dollars)Report，network：https://www.statista.com/topics/1764/global-pharmaceutical-industry/.Acquired in 24 July，2018..2018.

[2]Daughton，C.G.，2002.Environmental stewardship and drugs aspollutants.The Lancet 360，1035-1036.https://doi.org/10.1016/S0140-6736(02)11176-7.

[3]US EPA，Method 1694：pHarmaceuticals and Personal Care Products inWater，Soil，Sediment，and Biosolids by HPLC/MS/MS.United States EnvironmentalProtection Agency，2007.

发明内容

为克服现有技术缺陷，本发明提供一种高效且灵敏的、可同时检测168药物活性物质的方法。具体来讲，本发明通过提高样品前处理效率和改进液相色谱条件实现针对41大类共计168种药物活性物质(目前世界上基于LC-MS/MS体系同时检测出药物活性物质最多的方法)的高效样品处理和检测的目的。本发明方法采用内标法，优化内标种类和数量，保证实验准确度、灵敏度和低检测限的条件下，大幅提高实验效率，降低实验成本。本方法适用于大部分环境水体介质，包括生活污水、医疗废水、污水处理厂出水、地表水和饮用水等，既可以用于对168种目标物的筛查，也可准确定量其中162种物质在环境样品中的含量；其余6种(表1中标*物质)物质可以通过直接进样方法定量。

本发明技术方案如下：

一种水环境中多种药物活性物质的快速检测方法，包括样品前处理和采用HPLC-MS/MS法进行检测。具体如下：

目标物

168种目标药物的选择是根据Drugs.com网站上统计的不同药物在世界范围内使用量最大，处方频率最高以及跟据之前研究表明的环境危害最大的药物组合而成，主要包括7大类药物活性物质：抗哮喘、抗糖尿病、抗高血压、抗生素、解热-阵痛-抗炎药、激素和精神类药物，这7大类药物又可分成41小类还包括17种常见药物活性物质代谢物和5种衍生物，以确保对药物活性物质的全面、准确分析，见表1。

同位素内标和校准物质

本发明方法采用内标法来修正在样品制备和分析过程中目标物的损失。根据表1中目标物质的化学结构、理化性质(pKa和logP)和仪器条件下的相应强度和保留时间，选择29种同位素内标。同时，选取两种非目标物的同位素内标即阿特拉津-D₅(Atrazine-D₅)和三氯苯氧乙酸-D₄(Trichlorophenocyacetic>4)作为内标回收率的定量参考，以便深入了解仪器性能和基质效应。

样品前处理

a.直接进样方法

适用于环境浓度较高，一般高于或等于1000ng/L的目标物质，此类物质富集后很容易超过仪器检测限，导致检测结果的不准确。

a1.样品处理

如图1所示，取2mL样品，离心(13,000转/分钟，4℃)，用2mL注射器抽取上清液，并通过针孔滤膜过滤，丢弃前0.4mL样品用于平衡真空滤膜的吸附，从余下的过滤液中抽取0.4mL置于棕色自动进样小瓶中。然后，加入20ng目标物的同位素内标(见表1)后，使用甲醇将样品定量至0.5mL，涡旋混匀，作为供试样品液。进一步地，还可以在该供试样品液中加入两种非目标物的同位素内标即阿特拉津-D₅和三氯苯氧乙酸-D₄，作为内标回收率的定量参考，以便深入了解仪器性能和基质效应。

b.富集定量方法

适用于环境浓度较低，一般低于1000ng/L的目标物质，一般难以直接通过仪器检出，需要进行浓缩，提高浓度后再检测。

b1.定性检测

b1.1样品处理

取50mL的水样，将样品在10000转/分，4℃条件下离心5分钟，已达到分离固体颗粒物的目的。然后，向样品中加入25mg Na₂EDTA来抑制金属离子对目标物质的干扰。

b1.2样品富集

固相萃取小柱的填料为Cleanert PEP-2。

首先活化固相萃取小柱的填料。使用3mL甲醇，加入固相萃取小柱，使之自然流下至无液体滴下为止，此步骤进行两次。使用超纯水3mL活化固相萃取小柱，达到最佳吸附效果，此步骤重复两次。

将上述样品以～5mL/分钟的速度通过活化后的固相萃取小柱。样品完全经过填料后，加入3mL超纯水冲洗填料，此步骤重复两次。然后负压条件下将填料抽干15分钟后加入分两次分别加入2mL甲醇洗脱目标物，并将洗脱液氮吹浓缩至恰好吹干。

之后，主要基于作为内标回收率的定量参考以便深入了解仪器性能和基质效应的目的，可选地向目标物中先加入20ng两种非目标物同位素内标(即阿特拉津-D5和三氯苯氧乙酸-D₄。然后再使用20∶80(V∶V)的甲醇∶水混合溶剂定容，作为供试样品液。

b2.定量检测

b2.1样品处理

如图1所示，取50mL的水样2份，分别加入两个离心管中，并分别加入20ng目标物的同位素内标(见表1)，将样品在10000转/分，4℃条件下离心5分钟，已达到分离固体颗粒物的目的。然后，分别向样品中加入25mg Na₂EDTA来抑制金属离子对目标物质的干扰(为对样品中加入等量的Na₂EDTA，可将其溶解于水溶液中然后加入对应体积的溶液)。然后分别使用盐酸、氨水将两个样品分别调节至pH＝3±0.5和pH＝7±0.5，使水样酸度达到最佳的固相萃取条件。

b2.2样品富集

固相萃取小柱的填料为Cleanert PEP-2。

首先活化固相萃取小柱的填料。将3mL甲醇加入固相萃取小柱，使之自然流下至无液体滴下为止，此步骤进行两次。使用相应pH(3和7)超纯水3mL活化固相萃取小柱，使填料适应样品pH值，达到最佳吸附效果，此步骤重复两次。

将上述两个样品以～5mL/分钟的速度分别通过活化后的两个固相萃取小柱。样品完全经过填料后，加入3mL未调pH的超纯水冲洗填料，此步骤重复两次。然后，负压条件下将填料抽干15分钟后加入分两次分别加入2mL甲醇洗脱目标物，并将洗脱液氮吹浓缩至恰好吹干。

之后，主要基于作为内标回收率的定量参考以便深入了解仪器性能和基质效应的目的，可选地向吹干后的洗脱液中先加入20ng两种非目标物同位素内标(即阿特拉津-D₅和三氯苯氧乙酸-D₄。然后再用甲醇分别定容到0.1mL，涡旋后，再分别加入含0.125％甲酸的超纯水定容至0.5mL，最终定溶液为含有0.1％甲酸的20∶80(V∶V)甲醇∶水。最后超声5秒种后，涡旋混匀，转入棕色进样小瓶，作为供试样品液。所制得的供试样品液中，甲酸含量为0.1％(体积浓度)。进一步地，所制得的供试样品液中，溶剂为甲醇∶水＝20∶80(V∶V)。

仪器分析

本发明方法采用HPLC-MS/MS分析仪器，其主要参数及配件包括：检测模式selected reaction monitoring(SRM)；电喷雾源(ESI)正离子模式电压5500V，负离子模式电压-4500V；离子源温度：500℃。

所用液相色谱检测使用以下流动相：

流动相A：含0.1％甲酸的超纯水(体积浓度)，流动相B：含0.1％甲酸的乙腈(体积浓度)，流速0.4mL/分钟正负粒子模式使用相同的流动相及梯度，流动相梯度见下表：

采用C18反向液相色谱柱，优选规格为50×3.0mm，2.6μm；正离子模式样品进样体积10μL，负离子模式20μL。

本发明方法的技术关键点在于：

1、本方法可同时检测和定量168种常见药物活性物质及其部分代谢物、衍生物；

2、优选29种同位素内标，见表1，用于168种物质的定量，既提高了定量的准确定，相对于一一对应内标又节省了大量成本。

3、提供定性和定量两种检测模式，可以满足在水环境种不同浓度的目标物质的检测，相比仅有富集后检测的检测方更满足实际需求；

4、对固相萃取填料的选择和对应设计的活化及洗脱流程，相较以往更加简洁，相比以往方法，使用更少样品量，并优选绝对回收率更高的固相萃取填料类型，提高方法的准确性；

5、样品氮吹后定容步骤和溶剂比例，保证目标物质被溶解，并优化加入甲酸比例，提高目标物质的仪器响应；

6、采用较短色谱柱同时跟据色谱柱特性调整的流动相比例，可以达到保证物质分离和保留的前提下，显著缩短检测时间和效果；

7、使用SRM模式，将检测范围缩小至物质保留时间的前后30秒，可以通过屏蔽干扰峰来提高目标物峰的辨识度，从而提高目标峰的自动确认效率、提高数据处理速度。

有益效果

1.本发明通过品前处理设计和液相色谱条件改善实现针对8大类41小类类共计168种常见药物活性物质及代谢物、衍生物的检测和定量，是目前世界上基于LC-MS/MS体系同时检测出药物活性物质最多的方法。

2.相较于常见的方法，本方法不仅在目标物质数量上有很大提升、同时通过优化样品处理关键步骤及耗材，调整液相色谱条件和参数，实现了显著降低检测时间的目的，前处理时间可缩短至～2小时/次，总计检测时间可缩短至27分钟/样品，同时显著减少了危险试剂的使用量：甲醇消耗量：～10.1mL/样品；乙腈消耗量：～3.3mL/样品，相比US EPA1694方法有机试剂使用效率提高10倍。

3.本方法相较以往方法可以大量节约包括人工成本、仪器使用成本、试剂成本等在内的实验操作成本，同时也可以节省包括采样、运输、废物处置等在内的实验室管理成本。

附图说明

图1表示本发明方法前处理操作流程。

图2为本发明方法上样过程图。

图3为实施例1正负离子模式目标物色谱图。

图4表示实施例1填料Cleanert PEP-2和对比例1填料Oasis HLB回收50ng/L样品时色谱峰面积比。

图5表示同定容比例对色谱峰保留的影响结果。

图6表示加入甲酸比例对目标物质相应的影响结果。

图7表示实验例2实验结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。

实施例1

样品来源：北京市某生活污水处理厂24小时混合进水，部分目标物浓度超过1000ng/L。

样品处理：

(1)直接进样：

取2mL污水样品置于2mL PE塑料离心管中，后在13000转/分钟条件下离心5分钟。使用注射器抽取上清液～1.5mL，然后使用PTFE材质真空滤膜过滤水样，将前～0.4mL过滤液丢弃，收集剩下的～1.1mL过滤液，后用1mL移液枪转移0.4mL过滤后水样于2mL进样小瓶中，加入20ng目标物的同位素内标(见表1)后，用甲醇定容至0.5mL，震荡摇匀后，准备进样测试。

(2)富集后进样：

量取50mL污水样品2份，分别放置于两个50mL离心管中，分别加入20ng同位素内标(即表1中记载的29种同位素)，后在10000转/分钟，4℃条件下离心5分钟。将2.5mL 10mg/mL的Na₂EDTA加入每个装有样品的离心管中后，使用盐酸或氨水将样品分别pH调节至3和7，静置15分钟。

样品富集：同时活化固相萃取小柱，先使用3mL甲醇加入Cleanert PEP-2(200mg，6mL)小柱中两次，每次自然流下，液体滴落时方可进行下一次活化；然后使用3mL与样品pH相同的超纯水(pH＝3或pH＝7)活化小柱两次，关闭固相萃取装置(SPE)通道使液体留存在小柱中，开始搭设上样装置，并倒入样品，如图2。完成后，打开SPE通道，使之自然滴下(或负压情况下控制流速约5mL/分钟)。待所有样品经过填料后，加入5mL高纯水冲洗填料两次，去除附着在填料上的离子和其他杂质，然后在负压条件下抽干15分钟(除去填料上的水分)。加入2mL甲醇洗脱目标物质两次，分别接收于两个8mL玻璃离心管中。

浓缩复溶：在35℃环境下将样品用氮气吹到恰好干，向吹干的样品中加入20ng的非目标物同位素内标(即阿特拉津-D₅和三氯苯氧乙酸-D₄)后，用甲醇定容至100μL后涡旋，利用甲醇较强的溶解性将附着在底部的目标物重新溶解，然后加入400μL的含0.125％甲酸的超纯水中，最终定容至500μL，作为供试样品液。该供试样品液中，甲酸含量为0.1％。

仪器参数：使用高效液相色谱为Shimadzu Prominence ultra-performanceliquid chromatography system，使用质谱为AB Sciex 4500 triple quadruple tandemmass spectrometry，色谱柱为反向C18色谱柱，规格为50×3.0mm，2.6μm。

液相条件：正离子进样量10μL，负离进样量20μL；流动相A：含0.1％甲酸的超纯水(体积浓度)，流动相B：含0.1％甲酸的乙腈(体积浓度)，流动相流速为0.4mL/分钟，色谱柱温为35℃。

质谱条件为：点喷雾电离源(ESI)，正负离子模式电压分别为5500V和-4500V，离子源温度为500℃，选择反应监测模式(SRM)。

流动相梯度见下表：

上样过程如图2所示。

目标物质的定性和定量：目标物质的确定是由其保留时间以及与同位素内标相对保留时间共同确定。目标物的定量是由目标峰和对应的同位素内标峰比例进行计算得到。

正负离子模式目标物色谱图如图3所示(A正离子模式目标物色谱峰图；B负离子模式目标物色谱峰图)，可见目标物分离度良好，无明显杂质干扰，相应灵敏，可用于定量。本方法的准确度、精密度、检测限以及环境检出浓度见表1。

对比例1

与实施例1的区别仅在于：将固相萃取小柱的填料替换为Oasis HLB。

实施例1填料Cleanert PEP-2和对比例1填料Oasis HLB回收50ng/L样品时色谱峰面积比见图4。为了突出比较两者的区别，74个大于5的数据点没有显示在图4中。图4中三角形代表的中位数明显大于1，且灰色区域代表的数据密度的峰值也大于1，说明填料Cleanert PEP-2使用的改性亲水亲脂填料对大多数目标物的回收效果好于多数传统方法使用的Oasis HLB亲水亲脂填料。

对比例2

供试样品液A：与实施例1的区别仅在于：样品浓缩复溶时使所制得的供试样品液中水∶甲醇＝50∶50(V∶V)，且供试样品液中不含甲酸。

供试样品液B：与实施例1的区别仅在于：样品浓缩复溶时使所制得的供试样品液中水∶甲醇＝80∶20(V∶V)，且供试样品液中不含甲酸。

同定容比例对色谱峰保留的影响结果见图5。图5左侧(供试样品液A)为US EPA等方法种常见的溶液比例为水∶甲醇＝50∶50条件部分物质的色谱峰(以4种典型物质为例)，右侧为供试样品液B(水∶甲醇＝80∶20，V∶V)条件下对应的色谱峰，可见右侧峰形更好，更便于后续峰面积的积分和数据处理。

对比例3

与实施例1的区别仅在于：调整实施例1中供试样品液中甲酸含量分别为2％和5％(体积浓度)。

供试样品液中，加入甲酸比例对目标物质相应的影响结果见图6。图6中三角形是数据中位数，灰色区域代表数据密度。FA表示甲酸；“0.1％FA/0FA”为实施例1供试样品液(甲酸含量为“0.1)；“2％FA/0FA”、“5％FA/0FA”分别表示所制得的供试样品液中甲酸含量分别为2％、5％。

由图6可见，供试样品液中3种比例的甲酸都可以提高大部分目标物的相应，其中0.1％提高最为明显，且抑制更少的物质。US EPA方法采用的2％甲酸，相比之下增强效果没有0.1％明显，5％则会抑制更多物质的相应。

对比例4

与实施例1的区别仅在于：将液相色谱柱替换为反向C18色谱柱，规格为150×3.0mm，3.5μm.

结果表明，更换较长的液相色谱柱后在相同液相条件下会导致出峰时间的整体延长，以保留时间最长的同位素内标Norgestrel-D6为例，使用50mm色谱柱其保留时间为6.11分钟，使用150mm色谱柱时其保留时间为8.86分钟，较长的色谱柱显著增加了检测时间，从而增加仪器使用时间，增加耗材、试剂消耗，提高人工等成本。

实验例1方法学验证

实验结果验证遵循US EPA 1694验证方法，具体如下：

配置包含15个点，浓度范围为0.01-500μg/L的标准曲线(0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200、500μg/L)作为定量目标物物质浓度的参考。检测限(LOD)为3倍信噪比时目标物相应对应的浓度，定量限(LOQ)为10倍信噪比时目标物相应对应的浓度。

制备浓度为500ng/L纯水质控样品各6个，方法的准确度定义为以下公式：

其中测得浓度为质控样品的检测浓度，空白浓度是不加目标物超纯水中的检测浓度，制备浓度是指控样品的原始浓度。方法精确性为6个指控样品准确性的标准偏差。USEPA 1694方法中规定准确度为70-130％之间，准确度＜30％认为可以接受。

方法学验证结果见表1。

实验例2液相条件的优化

本实验选取洗脱能力更强的乙腈作为有机流动相，其它条件与实施例1相同。结果表明，乙腈作为有机流动相可以提高目标化合物洗脱的效率，但是造成亲水性物质，如acarbose(辛醇水分配系数logP＝-8.08)，4-acetaminophen sulfate(log P＝-4.37)不出峰或峰型差的情况，因此，在流动相比例0-1分钟，使用3％的有机相，用于增强亲水性目标物在色谱柱中的保留效果，改善峰型。1.1分钟起，将流动相比例调高到15％，快速增加有机相比例是由于较低有机相比例无法洗脱大部分亲脂性物质，因此，在少数亲水性目标物出峰后，相比US EPA中使用的有机相比例缓慢上升方式，会加快洗脱亲脂性物质，使色谱峰分布更加均匀，同时缩短检测时间，提高检测效率。1.1-9.6分钟，有机相比例缓慢上升匀速洗脱目标物，9.6分钟起，有机相比例提高到95％，原因在于此阶段，所有物质已经洗脱完毕，快速提高有机相比例可以提前对色谱柱进行清洗，缩短检测时间，同时洗脱残留有机物，保证精确度。如图7的目标物质的保留时间分布所示，该策略保证所有目标物质均匀的洗脱。

实验例3质谱条件的优化

红霉素在样品中不稳定，其存在形式受样品pH影响较大，在pH＝3的样品中，主要以脱水形式存在脱水红霉素存在，且相同浓度下相应远大于原物质因此，红霉素的检测质谱条件优化为以脱水红霉素为母离子。类似的情况，阿莫西林、盘尼西林和氨比西林在甲醇溶液中会于甲醇分子产生络合反应生成其对应衍生物，且在pH＝3的情况下，基本完全转化，因此，这些目标物的质谱条件优化为以其甲醇络合物为母离子(见表1)。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。