用于检测营养代谢能力相关SNP位点的引物组、应用、产品及方法

摘要

本发明提供了一种用于检测营养代谢能力相关SNP位点的引物组、应用、产品及方法，涉及生物技术领域，本发明提供的用于检测营养代谢能力相关SNP位点的引物组，能够检测维生素A代谢能力、维生素B6代谢能力、维生素B12代谢能力、维生素C代谢能力、维生素D代谢能力、维生素E代谢能力、钙元素代谢能力、铁元素代谢能力、锌元素代谢能力、硒元素代谢能力、碘元素代谢能力、钠元素代谢能力、酒精代谢能力、叶酸代谢能力、乳糖代谢能力、不饱和脂肪酸代谢能力、饱和脂肪酸代谢能力、胆固醇代谢能力、碳水化合物代谢能力和咖啡因代谢能力，该引物组可以实现特异性检测，准确性高，能够极大的缩短检测周期，同时降低检测成本。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种用于检测营养代谢能力相关SNP位点的引物组、应用、产品及方法。

背景技术

营养元素在人体中发挥着不可替代的作用，是维持身体健康所必须的，主要包括维生素类、微量矿物质元素以及其他营养物质如乳糖、胆固醇、碳水化合物等。营养元素的缺乏和过量补充都会引发生理机能絮乱或导致其他疾病。大量研究显示，多种营养元素的吸收和代谢与基因的多态性有关，基因的变异会导致合成的代谢酶活性出现差异，从而使机体对营养物质的代谢和吸收产生差异。因此通过基因检测可以评估个体对不同营养物质的吸收代谢能力，及时进行饮食干预，以指导合理补充缺乏的营养元素。

单核苷酸多态性(single nucleotide polynorphism，SNP)是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，SNP在基因组中分布广泛，它是人类可遗传变异中最常见的一种，也是基因测序最常用的突变类型。营养代谢基因检测的位点属于点突变，且为胚系检测。用于SNP检测的方法主要有Sanger测序、Taqman法、高分辨率溶解曲线(HRM)、等位基因特异性PCR(ARMS)、基因芯片法等。但上述方法都存在一些缺点或不足，比如：Sanger测序虽为测序的金标准，可检出未知突变，但是该方法存在通量低，操作繁琐、上样量高等缺点；Taqman法只能检出已知突变，且探针合成价格较高；ARMS法检测灵敏度高，但引物设计困难，对技术人员要求较高等等。

综上，目前发现跟营养代谢相关的检测都是基于某一类或某一种营养元素，无法综合评估个体对多种营养元素的吸收和代谢能力。因此，亟需一种经济、快速、易操作的检测方法，为不同个体制定相应的营养补充方案，已达到精准摄入所需营养物质，合理满足膳食以外维生素、微量元素等的需求。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种用于检测营养代谢能力相关SNP位点的引物组，以至少缓解现有技术中存在的技术问题之一。

本发明的第二个目的在于提供上述的用于检测营养代谢能力相关SNP位点的引物组在制备检测营养代谢能力的产品中的应用。

本发明的第三个目的在于提供一种用于检测营养代谢能力的产品，以缓解现有技术中缺少能够高通量、易操作且低成本的针对营养元素代谢进行检测的产品的技术问题。

本发明的第四个目的在于提供一种检测营养代谢能力相关SNP位点的方法，以缓解现有的检测方法通量较低、操作繁琐、价格昂贵等技术问题。

本发明提供了一种用于检测营养代谢能力相关SNP位点的引物组，所述营养代谢能力包括：维生素A代谢能力、维生素B6代谢能力、维生素B12代谢能力、维生素C代谢能力、维生素D代谢能力、维生素E代谢能力、钙元素代谢能力、铁元素代谢能力、锌元素代谢能力、硒元素代谢能力、碘元素代谢能力、钠元素代谢能力、酒精代谢能力、叶酸代谢能力、乳糖代谢能力、不饱和脂肪酸代谢能力、饱和脂肪酸代谢能力、胆固醇代谢能力、碳水化合物代谢能力和咖啡因代谢能力。

本发明还提供了上述的用于检测营养代谢能力相关SNP位点的引物组在制备检测营养代谢能力的产品中的应用。

本发明还提供了一种用于检测营养代谢能力的产品，所述产品包括所述产品包括用于检测SNP位点的试剂和/或设备，以及上述的引物组。

另外，本发明还提供了一种检测营养代谢能力相关SNP位点的方法，所述方法包括应用上述的引物组对待测样品基因组中SNP位点的核苷酸进行检测。

本发明的有益技术效果：

1)本发明提供的用于检测营养代谢能力相关SNP位点的引物组，能够检测维生素A代谢能力、维生素B6代谢能力、维生素B12代谢能力、维生素C代谢能力、维生素D代谢能力、维生素E代谢能力、钙元素代谢能力、铁元素代谢能力、锌元素代谢能力、硒元素代谢能力、碘元素代谢能力、钠元素代谢能力、酒精代谢能力、叶酸代谢能力、乳糖代谢能力、不饱和脂肪酸代谢能力、饱和脂肪酸代谢能力、胆固醇代谢能力、碳水化合物代谢能力和咖啡因代谢能力，该引物组针对与营养代谢相关的主要突变位点进行设计，可以对与营养代谢相关的位点突变实现特异性检测，准确性高，且检测结果覆盖维生素、矿物质、酒精、叶酸、乳糖、胆固醇、咖啡因、碳水化合物、饱和/不饱和脂肪酸等大部分营养元素的突变位点，能够极大的缩短检测周期，同时降低检测成本，并且，检测结果既可以对某一项营养物质的需求进行预测，又可以综合评估多种营养物质的吸收能力，为个体的健康饮食提供科学参考。

2)本发明提供的引物组是通过更改优化，包括了引物靶向区段的适当调整、延伸引物方向调整以及引物序列的自身优化调整等，同时经大样本测试实验筛选得到，所有引物序列都能对样本进行准确分型，同时也能够达到质谱检测技术的要求，实现应用MassARRAY对待测样品的营养代谢能力进行快速有效的检测。

3)本发明提供的用于检测营养代谢能力的产品，包括用于检测SNP位点的试剂和/或设备以及本发明提供的引物组，该产品能够对与营养代谢相关的位点突变实现特异性检测，检测成本低、周期短、操作简单且准确度高，目前已投放市场，且经市场检验效果显著，获得极大商业上的回报，具有极大临床应用价值及更开阔的市场推广。

4)本发明提供的检测营养代谢能力相关SNP位点的方法，包括应用上述的引物组检测待测样品基因组中SNP位点的核苷酸。该方法应用本发明提供的引物组能够对维生素、矿物质、酒精、叶酸、乳糖、胆固醇、咖啡因、碳水化合物、饱和/不饱和脂肪酸等20种营养元素相关的39个基因的51个SNP位点进行检测，具有准确性强、灵敏度高、重复性好、成本低、检测周期短、结果直观无需生信介入等特点。

5)本发明首次将核酸质谱平台运用于多达20种营养物质代谢能力的基因检测中，极大的提高了检测效率，特别适用于批量检测。本发明克服了现有技术中一次性检测SNP位点较少的缺陷，且成本低廉，适用于广泛推广；本发明所需样本的适应性强，外周血和口腔脱落细胞均能较好的检出；发明适用于所有人群，尤其是备孕期及孕期女性、儿童以及需要营养均衡的人群等。

附图说明

图1为本发明实施例1提供的更改引物前的具体的聚类峰图；

图2为本发明实施例1提供的更改引物后的具体的聚类峰图；

图3为本发明实施例1提供的rs2298585位点同一例样本在更改引物前的峰图；

图4为本发明实施例1提供的rs2298585位点同一例样本在更改引物后的峰图；

图5为本发明实施例1提供的更改引物前的转化效率聚类图；

图6为本发明实施例1提供的更改引物后的转化效率聚类图；

图7为本发明实施例2提供的rs1801133位点的聚类图；

图8为本发明实施例2提供的rs2228570位点的聚类图；

图9为本发明实施例2提供的rs33972313位点的聚类图；

图10为本发明实施例2提供的rs6053005位点的聚类图。

具体实施方式

除非本文另有定义，连同本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清晰，然而，在任何潜在不明确性的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。在本申请中，除非另有说明，“或”的使用意味着“和/或”。此外，术语“包括”及其他形式的使用是非限制性的。

一般地，连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文所述来进行。连同本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法、以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。

根据本发明的一个方面，提供了一种用于检测营养代谢能力相关SNP位点的引物组，所述营养代谢能力包括：维生素A代谢能力、维生素B6代谢能力、维生素B12代谢能力、维生素C代谢能力、维生素D代谢能力、维生素E代谢能力、钙元素代谢能力、铁元素代谢能力、锌元素代谢能力、硒元素代谢能力、碘元素代谢能力、钠元素代谢能力、酒精代谢能力、叶酸代谢能力、乳糖代谢能力、不饱和脂肪酸代谢能力、饱和脂肪酸代谢能力、胆固醇代谢能力、碳水化合物代谢能力和咖啡因代谢能力。

本发明提供的用于检测营养代谢能力相关SNP位点的引物组，针对与营养代谢相关的主要突变位点进行设计，可以对与营养代谢相关的位点突变实现特异性检测，准确性高，且检测结果覆盖维生素、矿物质、酒精、叶酸、乳糖、胆固醇、咖啡因、碳水化合物、饱和/不饱和脂肪酸等大部分营养元素的突变位点，能够极大的缩短检测周期，同时降低检测成本，并且，检测结果既可以对某一项营养物质的需求进行预测，又可以综合评估多种营养物质的吸收能力，为个体的健康饮食提供科学参考。此外，本发明提供的引物组是通过更改优化及大样本测试实验筛选得到，所有引物序列都能对样本进行准确分型，同时也能够达到质谱检测技术的要求，实现应用MassARRAY对待测样品的营养代谢能力进行快速有效的检测。

在一些优选的实施方式中，所述营养代谢能力对应的SNP位点包括：rs1801394、rs174550、rs2298585、rs7975232、rs2241057、rs2108622、rs1544410、rs7501331、rs162036、rs7903146、rs2066702、rs964184、rs1801133、rs921943、rs2282679、rs671、rs10515552、rs12934922、rs41281112、rs1535、rs6053005、rs2228570、rs7412、rs3877899、rs182549、rs6133175、rs4654748、rs5082、rs1801131、rs1800629、rs5219、rs1799986、rs1229984、rs1047781、rs10741657、rs3760776、rs4988235、rs2031920、rs713041、rs762551、rs731236、rs602662、rs174575、rs13266634、rs1050450、rs429358、rs33972313、rs4343、rs855791、rs328和rs255012。

在一些优选的实施方式中，所述引物组序列如SEQ ID NO.1-102所示，或者与SEQID NO.1-102具有至少85％同一性。

可以理解的是，本发明中所述的引物对为PCR引物对。

需要进行说明的是，术语“同一性”指的是序列的相似性。“同一性”包括与本发明所述的SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.102所示的单链DNA具有至少85％(例如可以为，但不限于85％、90％、95％或者更高)同一性的核苷酸序列。

在一些优选的实施方式中，当实际应用需要延伸引物时，所述引物组还包括SEQID NO.103-153所示的51个延伸引物。

可以理解的是，本发明中引物对和延伸引物一一对应，且对应的引物对和延伸引物用于检测同一位点的核苷酸。例如，第一引物对包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的上游引物、如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的下游引物和如SEQ ID NO.103所示的核苷酸序列的延伸引物，上述引物均用于检测同一位点的核苷酸；第二引物对包括如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的上游引物、如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的下游引物和如SEQ IDNO.104所示的核苷酸序列的延伸引物，上述引物均用于检测同一位点的核苷酸；第三引物对包括如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列的上游引物、如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列的下游引物和如SEQ ID NO.105所示的核苷酸序列的延伸引物，上述引物均用于检测同一位点的核苷酸等。

可以理解的是，引物对及延伸引物的编号与上述SNP位点的顺序对应，即第一引物对及第一延伸引物对应检测rs1801394位点，第二引物对及第二延伸引物对应检测rs174550位点，第三引物对及第三延伸引物对应检测rs2298585位点。

进一步的，列举部分位点的正常基因型和营养缺陷基因型，具体见下表：

表1部分位点基因型对应表

在一些优选的实施方式中，所述营养代谢能力包括：维生素A代谢能力、维生素B6代谢能力、维生素B12代谢能力、维生素C代谢能力、维生素D代谢能力、维生素E代谢能力、钙元素代谢能力、铁元素代谢能力、锌元素代谢能力、硒元素代谢能力、碘元素代谢能力、钠元素代谢能力、酒精代谢能力、叶酸代谢能力、乳糖代谢能力、不饱和脂肪酸代谢能力、饱和脂肪酸代谢能力、胆固醇代谢能力、碳水化合物代谢能力和咖啡因代谢能力。

具体地，营养元素、基因及检测位点的对应关系如下表2所示：

表2检测位点

根据本发明的第二方面，提供了上述的用于检测营养代谢能力相关SNP位点的引物组在制备检测营养代谢能力的产品中的应用。

根据本发明的第三方面，提供了一种用于检测营养代谢能力的产品，所述产品包括上述的引物组。

该产品能够对与营养代谢相关的位点突变实现特异性检测，检测成本低、周期短、操作简单且准确度高，具有极大的临床应用价值及非常开阔的市场推广前景。

在一些优选的实施方式中，用于检测营养代谢能力的产品还包括用于检测SNP位点的试剂和/或设备。

可以理解的是，所述用于检测SNP位点的试剂和/或设备可以为可通过市售购得的、本领域用于检测SNP位点核苷酸的常规通用试剂和/或设备，例如，可以为用于检测SNP位点核苷酸的试剂或试剂盒，或者为用于检测SNP位点核苷酸的包括试剂的试剂盒。

在一些优选的实施方式中，所述试剂包括10×PCR Buffer、dNTP Mix、MgCl₂、Primer>

优选地，所述设备包括应用MassARRAY对SNP位点核苷酸进行检测的设备，优选地，所述设备包括MassARRAY CPM。

另外，本发明还提供了一种检测营养代谢能力相关SNP位点的方法，所述方法包括应用上述的引物组对待测样品基因组中SNP位点的核苷酸进行检测。

该方法应用本发明提供的引物组能够对维生素、矿物质、酒精、叶酸、乳糖、胆固醇、咖啡因、碳水化合物、饱和/不饱和脂肪酸等20种营养元素相关的39个基因的51个SNP位点进行检测，具有准确性强、灵敏度高、重复性好、成本低、检测周期短、结果直观无需生信介入等特点。

可以理解的是，本发明可以对待测样品的全基因组进行检测，也可以筛选特定基因进行检测(例如对rs1801394、rs174550、rs2298585、rs7975232、rs2241057、rs2108622、rs1544410、rs7501331、rs162036、rs7903146、rs2066702、rs964184、rs1801133、rs921943、rs2282679、rs671、rs10515552、rs12934922、rs41281112、rs1535、rs6053005、rs2228570、rs7412、rs3877899、rs182549、rs6133175、rs4654748、rs5082、rs1801131、rs1800629、rs5219、rs1799986、rs1229984、rs1047781、rs10741657、rs3760776、rs4988235、rs2031920、rs713041、rs762551、rs731236、rs602662、rs174575、rs13266634、rs1050450、rs429358、rs33972313、rs4343、rs855791、rs328和rs255012特定的基因进行检测)，当对特定的基因进行检测时，干扰更小，检测结果更加精确。

需要说明的是，本发明提供的检测营养代谢能力相关SNP位点的方法为非疾病的诊断与治疗目的。

在一些优选的实施方式中，应用上述的引物组对待测样品基因组进行PCR扩增和碱基延伸反应，然后应用MassARRAY对反应得到的产物进行检测，确定所述待测样品基因组中SNP位点的核苷酸。

MassARRAY基因分析技术基于MALDT-TOF飞行时间质谱技术，先通过PCR扩增目标序列，然后根据需要加入SNP序列特异延伸引物，在SNP位点上进行碱基的延伸。该技术应用质谱分析对质量的灵敏度特别高的特点，能够有效将仅有一个不同碱基的两段基因序列区别开，进而推到出SNP分型。

在本发明的优选实施方式中采用MassARRAY进行检测，实现了单一平台多基因位点的检测，极大的提高了检测效率，特别适用于批量检测，为个体化膳食提供参考。并且，所需样本的适应性强，外周血和口腔脱落细胞均能较好的检出。

优选地，所述方法还包括在碱基延伸反应前对PCR产物进行去磷酸化的步骤。具体地，使用虾碱性磷酸酶对PCR产物进行去磷酸化。

优选地，所述方法还包括在碱基延伸反应后对所述反应产物进行纯化的步骤，然后再应用MassARRAY检测所述反应产物。具体地，可使用树脂盐脱的方式对反应产物进行纯化。

在一些优选的实施方式中，将所述引物组分为如下3组检测待测样品基因组中SNP位点的核苷酸：

第一组包括检测rs1801394、rs174550、rs2298585、rs7975232、rs2241057、rs2108622、rs1544410、rs7501331、rs162036、rs7903146、rs2066702、rs964184、rs1801133、rs921943、rs2282679、rs671、rs10515552、rs12934922、rs41281112、rs1535、rs6053005和rs2228570的引物组；

第二组包括检测rs7412、rs3877899、rs182549、rs6133175、rs4654748、rs5082、rs1801131、rs1800629、rs5219、rs1799986、rs1229984、rs1047781、rs10741657、rs3760776、rs4988235和rs2031920的引物组；

第三组包括检测rs713041、rs762551、rs731236、rs602662、rs174575、rs13266634、rs1050450、rs429358、rs33972313、rs4343、rs855791、rs328和rs255012的引物组。

该分组综合考虑到延伸引物大小，保证了每组内引物间互相无干扰。

具体地，采用如下方式进行分组：通过MassARRAY网址在线设计引物(AssayDesign Suite)，调整相关参数：首先是Preset设置为Moderate Multiplexing iPLEX，相应的Multiplex Level自动更改为24；然后Advanced Settings中Retrieve and FormatSequences的Flank size改为500，Identify Optimal Primer Areas的Maximum改为300bp；Design Assays/Multiple的Min Peak Separation改为20；最后点击运行，最终51个位点被分为三组。

下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

本发明实施例中用到的主要试剂信息如下：

本发明实施例中用到的主要仪器信息如下：

实施例1引物的设计和优化，反应体系的建立

1.1引物的设计和优化

通过MassARRAY网址的引物设计软件(Assay Design Suite)，调整相关参数，完成51个位点的PCR和UEP的引物设计，导出设计好的引物及各参数文件，并合成引物。按照引物配置表配制扩增引物MIX和延伸引物MIX，并微调延伸引物MIX直至符合要求。然后进行引物测试和优化。具体步骤如下：

(1)将基因组DNA样本稀释至10ng/μl，按下表配制PCR反应MIX(以下为单个样本量)

表3 PCR反应体系

封膜，vortex混匀30秒，4000rpm离心1分钟，将板放上PCR仪进行以下热循环：

(2)虾碱性磷酸酶消化(SAP)

取出PCR板，4000rpm离心1分钟，按下表配制SAP反应体系(以下为单个样本量)：

表4 SAP反应体系

每个反应孔加2μl SAP混液，封膜，vortex混匀30秒，4000rpm离心1分钟，将板放上PCR仪进行以下热循环：

温度(℃)时间3740min855min4保温

(3)单碱基延伸(EXT)

取出PCR板，4000rpm离心1分钟，按下表配制EXT反应体系，其中Extend PrimerMix为三组位点不同的延伸引物混液(以下为单个样本量)：

表5 EXT反应体系

每个反应孔加入2μl延伸混液，封膜，vortex混匀30秒，4000rpm离心1分钟，将板放上PCR仪进行以下热循环：

(4)树脂脱盐

①把洁净树脂(Resin)铺平在dimple plate应孔上，风干最少10分钟；

②样本板取出，板式离心机4000rpm离心1分钟；

③样本板每一个有样本的孔里加入16μl水，封板；

④板式离心机(ThermoFisher)4000rpm离心30秒；

⑤轻轻将样本板凌空翻转，放在已放树脂的dimple plate上，然后将dimpleplate连样本板一起翻转(过程中两快板不可水平移动)，让树脂掉到孔里；

⑥取下dimple plate，样本板封板，旋转器上颠倒摇匀15-30分钟；

⑦4000rpm离心5分钟。

(5)Dispensing点样

使用MassARRAY CPM将样本点到对应的SpectroCHIP(芯片)上。

(6)MALDI-TOF

使用MALDI-TOF(基质辅助激光解吸电离-飞行时间)质谱仪获得数据。

以rs2298585位点引物优化为例(靶向区域调整、UEP引物方向调整)：

rs2298585位点杂合样本出现高低峰现象，经过重新设计PCR引物(更改前上游引物序列为：ACGTTGGATGTCAGAAACAACTTCAAACCC，更改前下游引物序列为：ACGTTGGATGGCTGTAATTCAAGAGAGGTG)和更改UEP引物方向(更改前UEP序列为：cTCAAACCCTACAGGGA)后按照上述步骤进行测试，发现新更改的PCR引物和UEP引物测试效果更好，杂合高低峰现象改善，测试过64例样本均未出现no call，更改引物前及更改引物后的具体的聚类峰图分别如图1和图2所示。从图1可以看出杂合样本的聚类偏右下角且均为no call，而图2中杂合样本的聚类正常且都成功报出位点基因型，这说明更改后的引物优于更改前的引物，符合本项目的检出要求。rs2298585位点同一例样本在更改引物前和更改引物后的峰图分别如图3及图4所示。从图中可以看出更改前该样本的检测峰图上T型峰的峰高是C型峰的2倍以上，软件无法成功报出基因型，而更改后T型峰的峰高与C型峰的峰高相差无几，软件可成功报出该样本的TC基因型。

以rs7412位点引物优化为例(引物序列调整)：

rs7412位点软件设计的引物扩增效率不高，即使通过增加该位点的PCR引物还有部分样本无法达到50％的转化效率，后分析该位点的PCR引物后发现该位点的上游引物(更改前上游引物序列为：ACGTTGGATGTAAGCGGCTCCTCCGCGAT)自身会形成二聚体和发夹结构，且发夹结构的解链温度高达69.3℃，而我们扩增程序的退火温度只有56℃，后通过更改该引物序列上的一个碱基使其发夹结构消失。测试后发现更改PCR扩增引物后UEP引物的转化效率大大改善，更改引物前和更改引物后的转化效率聚类图分别如图5和图6所示(纵坐标代表UEP引物转化效率百分比)。从图中可以看出更改前UEP的转化效率在30％～75％，更改后UEP的转化效率集中在90％左右，杂合样本的转化效率均达到100％，说明更改后PCR引物的扩增效率优于更改前，使得UEP有更多的底物进行延伸反应。

上述rs2298585和rs7412仅为示例性优化，本申请经过对大部引物的多次更改和反复优化测试，筛选出最优PCR扩增引物及单碱基延伸(UEP)引物序列和体系，具体引物序列参见表6和7的引物序列。

表6 PCR引物序列

WELLSNP_IDPCR上游引物PCR下游引物W1rs1801394ACGTTGGATGGCTCTAACCTTATCGGATTCACGTTGGATGATATGCTACACAGCCGGGACW1rs174550ACGTTGGATGCCCTTCAAAAGTACCAAGGCACGTTGGATGTCCTGGCAGATTCATTTGGCW1rs2298585ACGTTGGATGGCCACTGGGTTTGATATAAGACGTTGGATGTTCCATCTCTAACATTCATAW1rs7975232ACGTTGGATGACCGGTCAGCAGTCATAGAGACGTTGGATGAGAGAAGAAGGCACAGGAGCW1rs2241057ACGTTGGATGGAGAAGCTGCAGTGCACACAACGTTGGATGCTGCTCTCAATGAGGCGGTCW1rs2108622ACGTTGGATGCTAGGAGCCTTGGAATGGACACGTTGGATGTGCCTCATCAGTGTTTTCGGW1rs1544410ACGTTGGATGAATGTTGAGCCCAGTTCACGACGTTGGATGGAGGAACTAGATAAGCAGGGW1rs7501331ACGTTGGATGCAGTAGACTTGGCCATCTTCACGTTGGATGTTCAGAATGCAGAAGTGGGW1rs162036ACGTTGGATGCACCGCATCAGGGCTATTACACGTTGGATGTAAAAGAGAGCACTGCGTCCW1rs7903146ACGTTGGATGTCTCTGCCTCAAAACCTAGCACGTTGGATGAACTAAGGGTGCCTCATACGW1rs2066702ACGTTGGATGCAACAAGCATGTGGGTTGTCACGTTGGATGCTCTATTGCCTCAAAACGTCW1rs964184ACGTTGGATGGGAACTTGAAGTCTAGTGGGACGTTGGATGCCTCCATGACACTAATCACCW1rs1801133ACGTTGGATGGTGCATGCCTTCACAAAGCGACGTTGGATGCACTTGAAGGAGAAGGTGTCW1rs921943ACGTTGGATGAAAGAGACCCTGCATTTTCACGTTGGATGCCCGTGTAGAGCTTCTAACTW1rs2282679ACGTTGGATGATGCCCAGCAAATCTCTGTCACGTTGGATGGAGGGACTACTACTTGCTTCW1rs671ACGTTGGATGAGGTCCCACACTCACAGTTTACGTTGGATGTTGGTGGCTACAAGATGTCGW1rs10515552ACGTTGGATGGAGACTACTCACCAATAGCCACGTTGGATGGCCAAGTTCCAGATGGAATCW1rs12934922ACGTTGGATGTCAAGATGGCAACCGCATACACGTTGGATGTTCTCCTCCCTGTGGAAAGCW1rs41281112ACGTTGGATGTGACTTTCGAGATGGAGCTGACGTTGGATGGAATCATACCAGTGAAGCCCW1rs1535ACGTTGGATGGCTCACATCTCTCCTAACAGACGTTGGATGAGGACCAGAAATGACGAGACW1rs6053005ACGTTGGATGGCATATCCAATGAAATCACTGACGTTGGATGGTGGATTCTACTTGTCCTACW1rs2228570ACGTTGGATGTGGCCTGCTTGCTGTTCTTAACGTTGGATGAAGTCTCCAGGGTCAGGCAW2rs7412ACGTTGGATGTAAGCGGCTCCTCCTCGATACGTTGGATGACGCGGCCCTGTTCCACCAW2rs3877899ACGTTGGATGTGCTGACCCTTGTGCTTATGACGTTGGATGTCAGAGAATCAGCAACCAGGW2rs182549ACGTTGGATGCCTACCCTATCAGTAAAGGCACGTTGGATGCCAAAGTACTGGGACAAAGGW2rs6133175ACGTTGGATGAGCTGAGGCACATCCCACAACGTTGGATGGACGATCTCCAGACAGAGAAW2rs4654748ACGTTGGATGTGGTTTTGGCAGCAATAGGGACGTTGGATGCCCCTTTCCTTCTCATACACW2rs5082ACGTTGGATGTTTGAGATCTGAGGTCCTTGACGTTGGATGCATGGGTTGATATGTCAGAGW2rs1801131ACGTTGGATGTCTACCTGAAGAGCAAGTCCACGTTGGATGTCTCCCGAGAGGTAAAGAACW2rs1800629ACGTTGGATGCTGATTTGTGTGTAGGACCCACGTTGGATGGGAGGCAATAGGTTTTGAGGW2rs5219ACGTTGGATGCGTTGCAGTTGCCTTTCTTGACGTTGGATGAGGAATACGTGCTGACACGCW2rs1799986ACGTTGGATGAGCTGTGTGTTCCCATGTCCACGTTGGATGAAAAGTCCTTACCTCGGCAGW2rs1229984ACGTTGGATGTTGCCACTAACCACGTGGTCACGTTGGATGCTGAATCTGAACAGCTTCTCW2rs1047781ACGTTGGATGATAGTCCCCTCGGCGAACATACGTTGGATGTGGCAGAACTACCACCTGAAW2rs10741657ACGTTGGATGTAGAAAACGCCTGGTGGTTGACGTTGGATGTAGCAGTTGATCTCAGCTCCW2rs3760776ACGTTGGATGCAGGGAGCTATGCAAACTTCACGTTGGATGGGGAGTGAGAGAGTTTAAGGW2rs4988235ACGTTGGATGATGTACTAGTAGGCCTCTGCACGTTGGATGCAACCTAAGGAGGAGAGTTCW2rs2031920ACGTTGGATGGTTCTTAATTCATAGGTTGCACGTTGGATGCAAGTGATTTGGCTGGATTGW3rs713041ACGTTGGATGTGCCCCACTATTTCTAGCTCACGTTGGATGGTCATGAGTGCCGGTGGAAW3rs762551ACGTTGGATGCTAAGCTCCATCTACCATGCACGTTGGATGGAATCTTGAGGCTCCTTTCCW3rs731236ACGTTGGATGGTCTGCAGTGTGTTGGACAGACGTTGGATGTGCCTTCTTCTCTATCCCCGW3rs602662ACGTTGGATGCTTCGTGGTCACCAGTAATGACGTTGGATGAATGCCATCGCCAGCAAACAW3rs174575ACGTTGGATGCGAGAGCCCTCTGGAAATGACGTTGGATGAAGGGAGCAGACAGATGACGW3rs13266634ACGTTGGATGGCAATTTCTCTCCGAACCACACGTTGGATGGCAATCAGTGCTAATCTCCCW3rs1050450ACGTTGGATGTTGGGGCGCACCCTCTCTTCACGTTGGATGTGAAAACCCCCCCGAGACAW3rs429358ACGTTGGATGCTGTCCAAGGAGCTTCAGGACGTTGGATGGAGCATGGCCTGCACCTCGW3rs33972313ACGTTGGATGTCAAGGTCAGGACATAGCAGACGTTGGATGAGGTTAGCCTGGACAGAGACW3rs4343ACGTTGGATGCATGCCCATAACAGGTCTTCACGTTGGATGCCTACCAGATCTGACGAATGW3rs855791ACGTTGGATGATGTGCAGTTGATCCCACAGACGTTGGATGATCCTTCTTGCCCTTGCGGTW3rs328ACGTTGGATGAGCTTTAGCCCAGAATGCTCACGTTGGATGAAAGGCACCTGCGGTATTTGW3rs255012ACGTTGGATGGGTTCTGATGTTTGCTAGTCACGTTGGATGCCTCCATAGAACCACACATC

表7 UEP引物序列

WELLSNP_IDUEP_SEQW1rs1801394CACAGCTTGCTCACAW1rs174550AGGCCTACAAGGTCTCW1rs2298585aCACATGATCTCAAAGCW1rs7975232GGGATTGAGCAGTGAGGW1rs2241057gcaaAGGGCAAGGACTACTW1rs2108622cacccCAGGGTCCGGCCACAW1rs1544410GAGCCTGAGTATTGGGAATGW1rs7501331gggaCGTGGCTGTTGTAGATW1rs162036gaAGGGCTGTTACCTTTCTTCW1rs7903146GAGCTAAGCACTTTTTAGATAW1rs2066702TCTTCTTTCCTATTGCAGTATCW1rs964184GGAAAAATGACAATAAACAGATW1rs1801133gggagGCGTGATGATGAAATCGW1rs921943GACCCTGCATTTTCTAGAATCAAW1rs2282679ATCTCTGTCTCTTAATTATCTCACAW1rs671gggaCCACACTCACAGTTTTCACTTW1rs10515552ggccGAATCAAGTCCAGCACCATTAW1rs12934922agagGGCAACCGCATACATCCGGAGW1rs41281112ggggcGCTGGGCTGCTTAGACAGTCAW1rs1535gttgaATCTCTCCTAACAGAGGACTAGW1rs6053005GTAATTAGATGAATGTAATTGTACATAW1rs2228570gggtGCCTGCTTGCTGTTCTTACAGGGAW2rs7412CGATGACCTGCAGAAGW2rs3877899GCAGGATGAGTAGGAGW2rs182549ccCATTCTCAGCTGGGCW2rs6133175TCTTGTAACAAAGGGCTW2rs4654748tGGGTGTGGGGTAATGTCW2rs5082CTGAGGTCCTTGGACTTGAW2rs1801131GAGGAGCTGACCAGTGAAGW2rs1800629ccgtAGGCTGAACCCCGTCCW2rs5219ccctGCACGGTACCTGGGCTW2rs1799986aggggCCAGGACTGCATGGAW2rs1229984ggacCCACGTGGTCATCTGTGW2rs1047781cctctGACGTACACCCCCGGGAW2rs10741657aattGGAGATACTTTAGCAGGCW2rs3760776gagCTGGAATACTGGTTTTGAGW2rs4988235GGCAATACAGATAAGATAATGTAGW2rs2031920AAAGATTCATTGTTAATATAAAAGTAW3rs713041CCCTGCCCACGCCCTW3rs762551CTACCATGCGTCCTGW3rs731236GGTCCTGGATGGCCTCW3rs602662cCATTGACACCTCCCACW3rs174575CTCTGGAAATGGCTGAGW3rs13266634tttCCACTTGGCTGTCCCW3rs1050450tCCTGCTGTCTCAAGGGCW3rs429358GCGGACATGGAGGACGTGW3rs33972313acagAGCAGAGCAGCCACAW3rs4343aacatGTCTTCATATTTCCGGGAW3rs855791ggacCAGGACCTGTGCAGCGAGGW3rs328tctgTAGCCCAGAATGCTCACCAGCCTW3rs255012CTAATAATTTATTTAATGCCTAAATTCA

实施例2反应体系的验证

本发明在体系优化过程中，每个检测位点都有2～3个样本经过Sanger测序的验证，经比对结果都一致，确认本发明检测的结果准确无误。本发明在确认最优反应体系后又进行了一系列的验证实验，包括准确性、精密度以及人员比对和不同批次引物间的比对实验。具体的验证方案如下：

(1)准确性实验验证方案：51个位点各选取一例样本进行Sanger测序，并比对sanger测序与MassARRAY的结果，一致性大于95％则验证通过。

(2)精密度实验验证方案：挑取3例外周血样本和对应的3例口腔拭子样本，每个样本重复3次进行一个批次的检测，共检测3个批次，外周血和口腔拭子结果一致性100％，批间精密度和批内精密度的一致性大于95％则验证通过。

(3)人员比对和试剂比对实验验证方案：上述(2)中配制两个批次的引物(批次A和批次B)，操作员甲使用引物批次A检测批次1，使用引物批次B检测批次2，操作员乙使用引物批次B检测批次3，比较人员和试剂间的结果，一致性大于95％则验证通过。

具体的验证过程如下：首先按照本发明实施例1提供的体系加量表配制两个批次的扩增引物MIX和延伸引物MIX，分别命名为批次A和批次B。然后按照实施例1中的操作步骤，分别进行PCR扩增、虾碱性磷酸酶消耗、单碱基延伸、树脂脱盐和MassARRAY CPM点样分析等步骤后进行结果分析。准确性和精密度结果见下表，因精密度实验批次内和批次间的结果均一致，故只列出6个样本的检测结果。

表8准确性的验证结果

经51例样本的MassARRAY结果和Sanger结果的比对可知，本发明的体系验证实验的准确性为100％。

表9精密度的验证结果

经3例外周血样本和对应3例口腔拭子样本的3个批次的检测结果比对，可知本发明的体系的批间精密度、批内精密度以及人员间比对和试剂间比对的一致性均为100％。

因本发明检测位点较多，故在此随机选取4个位点rs1801133、rs2228570、rs33972313和rs6053005，上述4个位点的聚类图分别如图7、图8、图9和图10所示。从上述附图结果中同样可以得出，本发明的体系的批间精密度、批内精密度以及人员间比对和试剂间比对的一致性均为100％。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京先声医学检验有限公司

江苏先声医学诊断有限公司

北京先声医学检验实验室有限公司

<120> 用于检测营养代谢能力相关SNP位点的引物组、应用、产品及方法

<160> 153

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

acgttggatg gctctaacct tatcggattc 30

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

acgttggatg atatgctaca cagccgggac 30

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

acgttggatg cccttcaaaa gtaccaaggc 30

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

acgttggatg tcctggcaga ttcatttggc 30

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

acgttggatg gccactgggt ttgatataag 30

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

acgttggatg ttccatctct aacattcata 30

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

acgttggatg accggtcagc agtcatagag 30

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

acgttggatg agagaagaag gcacaggagc 30

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

acgttggatg gagaagctgc agtgcacaca 30

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

acgttggatg ctgctctcaa tgaggcggtc 30

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

acgttggatg ctaggagcct tggaatggac 30

<210> 12

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

acgttggatg tgcctcatca gtgttttcgg 30

<210> 13

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

acgttggatg aatgttgagc ccagttcacg 30

<210> 14

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

acgttggatg gaggaactag ataagcaggg 30

<210> 15

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

acgttggatg cagtagactt ggccatcttc 30

<210> 16

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

acgttggatg ttcagaatgc agaagtggg 29

<210> 17

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

acgttggatg caccgcatca gggctattac 30

<210> 18

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

acgttggatg taaaagagag cactgcgtcc 30

<210> 19

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

acgttggatg tctctgcctc aaaacctagc 30

<210> 20

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

acgttggatg aactaagggt gcctcatacg 30

<210> 21

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

acgttggatg caacaagcat gtgggttgtc 30

<210> 22

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

acgttggatg ctctattgcc tcaaaacgtc 30

<210> 23

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

acgttggatg ggaacttgaa gtctagtggg 30

<210> 24

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

acgttggatg cctccatgac actaatcacc 30

<210> 25

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

acgttggatg gtgcatgcct tcacaaagcg 30

<210> 26

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

acgttggatg cacttgaagg agaaggtgtc 30

<210> 27

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

acgttggatg aaagagaccc tgcattttc 29

<210> 28

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

acgttggatg cccgtgtaga gcttctaact 30

<210> 29

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

acgttggatg atgcccagca aatctctgtc 30

<210> 30

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

acgttggatg gagggactac tacttgcttc 30

<210> 31

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

acgttggatg aggtcccaca ctcacagttt 30

<210> 32

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

acgttggatg ttggtggcta caagatgtcg 30

<210> 33

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

acgttggatg gagactactc accaatagcc 30

<210> 34

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

acgttggatg gccaagttcc agatggaatc 30

<210> 35

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

acgttggatg tcaagatggc aaccgcatac 30

<210> 36

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

acgttggatg ttctcctccc tgtggaaagc 30

<210> 37

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

acgttggatg tgactttcga gatggagctg 30

<210> 38

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 38

acgttggatg gaatcatacc agtgaagccc 30

<210> 39

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 39

acgttggatg gctcacatct ctcctaacag 30

<210> 40

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 40

acgttggatg aggaccagaa atgacgagac 30

<210> 41

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 41

acgttggatg gcatatccaa tgaaatcact g 31

<210> 42

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 42

acgttggatg gtggattcta cttgtcctac 30

<210> 43

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 43

acgttggatg tggcctgctt gctgttctta 30

<210> 44

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 44

acgttggatg aagtctccag ggtcaggca 29

<210> 45

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 45

acgttggatg taagcggctc ctcctcgat 29

<210> 46

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 46

acgttggatg acgcggccct gttccacca 29

<210> 47

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 47

acgttggatg tgctgaccct tgtgcttatg 30

<210> 48

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 48

acgttggatg tcagagaatc agcaaccagg 30

<210> 49

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 49

acgttggatg cctaccctat cagtaaaggc 30

<210> 50

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 50

acgttggatg ccaaagtact gggacaaagg 30

<210> 51

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 51

acgttggatg agctgaggca catcccaca 29

<210> 52

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 52

acgttggatg gacgatctcc agacagagaa 30

<210> 53

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 53

acgttggatg tggttttggc agcaataggg 30

<210> 54

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 54

acgttggatg cccctttcct tctcatacac 30

<210> 55

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 55

acgttggatg tttgagatct gaggtccttg 30

<210> 56

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 56

acgttggatg catgggttga tatgtcagag 30

<210> 57

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 57

acgttggatg tctacctgaa gagcaagtcc 30

<210> 58

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 58

acgttggatg tctcccgaga ggtaaagaac 30

<210> 59

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 59

acgttggatg ctgatttgtg tgtaggaccc 30

<210> 60

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 60

acgttggatg ggaggcaata ggttttgagg 30

<210> 61

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 61

acgttggatg cgttgcagtt gcctttcttg 30

<210> 62

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 62

acgttggatg aggaatacgt gctgacacgc 30

<210> 63

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 63

acgttggatg agctgtgtgt tcccatgtcc 30

<210> 64

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 64

acgttggatg aaaagtcctt acctcggcag 30

<210> 65

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 65

acgttggatg ttgccactaa ccacgtggtc 30

<210> 66

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 66

acgttggatg ctgaatctga acagcttctc 30

<210> 67

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 67

acgttggatg atagtcccct cggcgaacat 30

<210> 68

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 68

acgttggatg tggcagaact accacctgaa 30

<210> 69

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 69

acgttggatg tagaaaacgc ctggtggttg 30

<210> 70

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 70

acgttggatg tagcagttga tctcagctcc 30

<210> 71

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 71

acgttggatg cagggagcta tgcaaacttc 30

<210> 72

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 72

acgttggatg gggagtgaga gagtttaagg 30

<210> 73

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 73

acgttggatg atgtactagt aggcctctgc 30

<210> 74

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 74

acgttggatg caacctaagg aggagagttc 30

<210> 75

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 75

acgttggatg gttcttaatt cataggttgc 30

<210> 76

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 76

acgttggatg caagtgattt ggctggattg 30

<210> 77

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 77

acgttggatg tgccccacta tttctagctc 30

<210> 78

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 78

acgttggatg gtcatgagtg ccggtggaa 29

<210> 79

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 79

acgttggatg ctaagctcca tctaccatgc 30

<210> 80

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 80

acgttggatg gaatcttgag gctcctttcc 30

<210> 81

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 81

acgttggatg gtctgcagtg tgttggacag 30

<210> 82

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 82

acgttggatg tgccttcttc tctatccccg 30

<210> 83

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 83

acgttggatg cttcgtggtc accagtaatg 30

<210> 84

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 84

acgttggatg aatgccatcg ccagcaaaca 30

<210> 85

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 85

acgttggatg cgagagccct ctggaaatg 29

<210> 86

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 86

acgttggatg aagggagcag acagatgacg 30

<210> 87

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 87

acgttggatg gcaatttctc tccgaaccac 30

<210> 88

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 88

acgttggatg gcaatcagtg ctaatctccc 30

<210> 89

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 89

acgttggatg ttggggcgca ccctctcttc 30

<210> 90

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 90

acgttggatg tgaaaacccc cccgagaca 29

<210> 91

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 91

acgttggatg ctgtccaagg agcttcagg 29

<210> 92

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 92

acgttggatg gagcatggcc tgcacctcg 29

<210> 93

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 93

acgttggatg tcaaggtcag gacatagcag 30

<210> 94

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 94

acgttggatg aggttagcct ggacagagac 30

<210> 95

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 95

acgttggatg catgcccata acaggtcttc 30

<210> 96

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 96

acgttggatg cctaccagat ctgacgaatg 30

<210> 97

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 97

acgttggatg atgtgcagtt gatcccacag 30

<210> 98

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 98

acgttggatg atccttcttg cccttgcggt 30

<210> 99

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 99

acgttggatg agctttagcc cagaatgctc 30

<210> 100

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 100

acgttggatg aaaggcacct gcggtatttg 30

<210> 101

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 101

acgttggatg ggttctgatg tttgctagtc 30

<210> 102

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 102

acgttggatg cctccataga accacacatc 30

<210> 103

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 103

cacagcttgc tcaca 15

<210> 104

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 104

aggcctacaa ggtctc 16

<210> 105

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 105

acacatgatc tcaaagc 17

<210> 106

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 106

gggattgagc agtgagg 17

<210> 107

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 107

gcaaagggca aggactact 19

<210> 108

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 108

caccccaggg tccggccaca 20

<210> 109

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 109

gagcctgagt attgggaatg 20

<210> 110

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 110

gggacgtggc tgttgtagat 20

<210> 111

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 111

gaagggctgt tacctttctt c 21

<210> 112

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 112

gagctaagca ctttttagat a 21

<210> 113

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 113

tcttctttcc tattgcagta tc 22

<210> 114

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 114

ggaaaaatga caataaacag at 22

<210> 115

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 115

gggaggcgtg atgatgaaat cg 22

<210> 116

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 116

gaccctgcat tttctagaat caa 23

<210> 117

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 117

atctctgtct cttaattatc tcaca 25

<210> 118

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 118

gggaccacac tcacagtttt cactt 25

<210> 119

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 119

ggccgaatca agtccagcac catta 25

<210> 120

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 120

agagggcaac cgcatacatc cggag 25

<210> 121

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 121

ggggcgctgg gctgcttaga cagtca 26

<210> 122

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 122

gttgaatctc tcctaacaga ggactag 27

<210> 123

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 123

gtaattagat gaatgtaatt gtacata 27

<210> 124

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 124

gggtgcctgc ttgctgttct tacaggga 28

<210> 125

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 125

cgatgacctg cagaag 16

<210> 126

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 126

gcaggatgag taggag 16

<210> 127

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 127

cccattctca gctgggc 17

<210> 128

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 128

tcttgtaaca aagggct 17

<210> 129

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 129

tgggtgtggg gtaatgtc 18

<210> 130

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 130

ctgaggtcct tggacttga 19

<210> 131

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 131

gaggagctga ccagtgaag 19

<210> 132

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 132

ccgtaggctg aaccccgtcc 20

<210> 133

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 133

ccctgcacgg tacctgggct 20

<210> 134

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 134

aggggccagg actgcatgga 20

<210> 135

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 135

ggacccacgt ggtcatctgt g 21

<210> 136

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 136

cctctgacgt acacccccgg ga 22

<210> 137

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 137

aattggagat actttagcag gc 22

<210> 138

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 138

gagctggaat actggttttg ag 22

<210> 139

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 139

ggcaatacag ataagataat gtag 24

<210> 140

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 140

aaagattcat tgttaatata aaagta 26

<210> 141

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 141

ccctgcccac gccct 15

<210> 142

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 142

ctaccatgcg tcctg 15

<210> 143

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 143

ggtcctggat ggcctc 16

<210> 144

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 144

ccattgacac ctcccac 17

<210> 145

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 145

ctctggaaat ggctgag 17

<210> 146

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 146

tttccacttg gctgtccc 18

<210> 147

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 147

tcctgctgtc tcaagggc 18

<210> 148

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 148

gcggacatgg aggacgtg 18

<210> 149

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 149

acagagcaga gcagccaca 19

<210> 150

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 150

aacatgtctt catatttccg gga 23

<210> 151

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 151

ggaccaggac ctgtgcagcg agg 23

<210> 152

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 152

tctgtagccc agaatgctca ccagcct 27

<210> 153

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 153

ctaataattt atttaatgcc taaattca 28