MCD基因及其表达产物在制备诊疗肾癌分期或转移试剂中的应用

摘要

本发明涉及MCD基因及其表达产物在制备诊疗肾癌分期或转移试剂中的应用。通常情况，与癌症相关的基因根据其对肿瘤的作用被分为癌基因和抑癌基因，癌基因促进肿瘤的发生或发展，抑癌基因则相反。在本申请中发现MCD并非如此，MCD在肾癌早期发生时作为一个癌基因行使功能，但是当肾癌进行转移时，MCD将作为一个抑癌基因起作用。本申请打破现有对癌症相关基因的认识，具有重要的科研意义和临床应用价值。

说明书

技术领域

本申请涉及肿瘤基因诊断领域，具体涉及MCD基因及其表达产物在制备诊疗肾癌分期或转移试剂中的应用。

背景技术

肾癌是泌尿系统最为常见的恶性肿瘤之一，其发病率及死亡率近年来在中国逐年攀升。转移是肾癌致死的主要因素。原位局限性(localised)肾癌5年生存率约为93％，远端转移(metastatic)肾癌的5年生存率则降至12％，其中位生存期仅为5个月。不幸的是，在临床确诊的肾癌中，约四分之一的患者往往已出现或最终将发展为远端转移。然而，由于肾癌本身的复杂性，其肿瘤的发生和转移机制尚不清楚。

肥胖伴随的脂质代谢紊乱是肾癌的主要风险因素之一。丙二酰辅酶A脱羧酶(MCD)负责催化malonyl-CoA脱羧形成acetyl-CoA，从而与乙酰辅酶A羧化酶(ACC)协同控制malonyl-CoA的水平并维持脂质代谢稳态平衡，MCD缺乏症导致的临床表型多样，包括早期出现的轻中度的生长发育迟缓、心肌病、代谢紊乱、高乳酸血症、酮症、低血糖、肌张力低下、腹泻等，但是现有的研究中揭示MCD和肿瘤相关性的报道很少。迄今为止，关于MCD与肿瘤的研究只有两项。2009年，约翰霍普金斯大学Kuhajda等人发现沉默MCD表达或抑制MCD活性可以引起乳腺癌细胞MCF7发生凋亡；2014年，来自以色列的Eytan等人利用包括肾癌细胞在内的NCI-60肿瘤细胞库，以细胞增殖能力为指标筛选代谢相关基因中的潜在抗肿瘤靶标。结果发现MCD是肿瘤细胞增殖所必须的，沉默MCD能够显著抑制淋巴瘤和肾癌细胞增殖。综上所述，现有体外实验一致认为MCD在包括肾癌在内的肿瘤中作为一个癌基因行使功能。

肿瘤的发生和转移在恶性肿瘤里经常相伴出现，但二者机制不同，肿瘤的发生通常起始于多种信号通路的异常调节，包括线粒体介导的凋亡，调控细胞分裂和增殖的细胞周期校正点异常等，而肿瘤的转移与细胞的迁移能力和血管生成等相关，此外，肿瘤转移是基因突变与肿瘤微环境互作的结果。通常，与癌症相关的基因根据其对肿瘤的作用被分为癌基因和抑癌基因，癌基因促进肿瘤的发生或发展，抑癌基因则相反，抑制肿瘤的发生或发展。在本申请中，申请人基于临床数据的分析，发现MCD并非如此：MCD在肾癌早期发生时作为一个癌基因促进细胞增殖，但是当肾癌进行转移时，MCD作为一个抑癌基因起作用。本申请打破现有对癌症相关基因的认识，具有重要的科研意义和临床应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供MCD基因或其表达产物在制备肾癌诊断试剂中的应用。

进一步，诊断为分期诊断。MCD基因或其表达产物在制备肾癌分期诊断试剂中的应用，优选的，分期诊断为区分肾癌早期(I-III期)与晚期(IV)的分子辅助诊断。

MCD基因或其表达产物在IV期肾癌中表达量显著低于正常及早期(I-III期)肾癌，可作为诊断肾癌早期(I-III期)与晚期(IV)的分子标志物用于肾癌分期的辅助诊断。

肾癌的分期见表2。

进一步，诊断为转移诊断。MCD基因或其表达产物在制备肾癌转移诊断试剂中的应用。

MCD基因或其表达产物在发生转移的肾癌样本中显著低表达，其表达量低于非转移的肾癌样本或正常对照样本。

基于高通量测序方法和/或基于定量PCR方法和/或基于探针杂交方法检测样本中MCD基因的转录或基于免疫方法检测样本中MCD蛋白的表达情况。

优选采用northern杂交方法、表达谱芯片、核酶保护分析技术、RAKE法、原位杂交、基于微球的流式细胞术检测样本中MCD基因表达情况；采用western blot和/或ELISA和/或质谱和/胶体金法检测样本中MCD蛋白的表达情况。

本发明的目的在于提供MCD基因或其表达产物的促进剂在制备治疗肾癌的药物或制剂中的应用。

进一步，治疗肾癌的药物或制剂抑制肾癌细胞的转移，优选的，治疗肾癌的药物或制剂抑制肾癌细胞的迁移或侵袭。

进一步，所述促进剂激活MCD酶活性。

进一步，所述促进剂促进MCD基因或其表达产物的高表达。

本领域人员熟知促进基因的表达的促进剂通常是可采用下述方法中的一种和/或几种促进基因或其蛋白的表达：通过DNA水平调控MCD基因；通过转录水平及转录后水平促进MCD基因转录；通过翻译后水平促进MCD蛋白的表达；优选的，增加MCD基因的拷贝数、转染含MCD基因的过表达载体；激活MCD基因的表达、激活调控MCD基因表达的启动子、抑制负调控MCD基因表达的转录因子、采用RNA干扰技术对抑制MCD基因表达的抑制子进行干扰；抑制促进MCD基因mRNA降解的microRNA转录表达、导入促进MCD基因表达的microRNA；导入促进MCD基因编码蛋白的分子、抑制负调控MCD基因表达的蛋白、促进MCD基因表达的因子及蛋白的表达。

优选的，转染含MCD基因的过表达载体。

进一步，治疗肾癌的药物还包含药剂学上能接受的载体。

包含在本发明的药剂学上能接受的载体为在制剂时通常利用的载体，该载体包含乳糖(lactose)、右旋糖(dextrose)、蔗糖(sucrose)、山梨醇(sorbitol)、甘露醇(mannitol)、淀粉、阿拉伯橡胶、磷酸钙、藻酸盐(alginate)、凝胶(gelatin)、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone)、纤维素(cellulose)、水、糖浆、甲基纤维素(methyl cellulose)、羟基苯甲酸甲酯(methyl hydroxybenzoate)、丙基羟基苯甲酸丙酯(propyl hydroxybenzoate)、滑石、硬脂酸镁(stearic acid magnesium)及矿物油(mineral oil)等，但并非局限于此。

MCD(Malonyl-CoA Decarboxylase，ENSG00000103150，又名MLYCD)，MCD基因位于染色体16q24，在基因组中跨越17,058bp，更精确的分子位点为82,490,272-82,507,276；由5个外显子和4个内含子组成，外显子较小，内含子尺寸较大。MCD基因的蛋白质产物是丙二酰辅酶A脱羧酶，正常情况下有493个氨基酸，55kDa，分子量约为250000。

附图说明

图1是免疫组化染色检测肾癌组织和正常肾组织中的MCD表达差异及其与临床病理分期的相关性；A是免疫组化图；B是正常对照(70例)和IV期肾癌组织(28例)中MCD的差异表达情况图；C是MCD在各个分期的表达情况(I期216例，II期49例，III期14例，IV期28例)；

图2是MCD促进肾癌细胞增殖图；.A在ACHN细胞中利用shRNA沉默MCD；B在ACHN细胞中高表达MCD(WT)及其失活突变体(MT)；C沉默或高表达MCD及其突变体对于ACHN和786-O细胞增殖的影响；

图3是MCD抑制肾癌细胞迁移及侵袭图；A划痕愈合实验；B是transwell实验；C是RTCA(matrigel)实施监测高表达MCD对于细胞侵袭能力的影响；

图4是MCD在体抑制肾癌转移图；A是8周龄雌性裸鼠尾静脉注射ACHN-GFP稳定细胞株，8周后终止实验，肺离体成像照片；B实验中获得的肺切片HE染色，箭头所示为肿瘤转移灶。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。

实施例1组织芯片及统计分析

实验方法：

制备包括307例肾癌组织和70例正常肾组织的组织芯片(由上海芯超公司制备)。

表1肾癌TNM分期

表2肾癌Ⅰ-Ⅳ分期

免疫组化实验：

1.将组织芯片放在65℃恒温箱中烤片2h,利于脱蜡和防止脱片；

2.依次在二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ中各30min,无水酒精、95％乙醇Ⅰ、95％乙醇Ⅱ和80％乙醇内各5min,最后将切片浸入水中；

3.PBS冲洗,5min×3次；

4.微波抗原修复：用微波炉将柠檬酸缓冲液加热至95℃后把组织切片放入柠檬酸缓冲液内,微波炉调至大火3min,后调至中火8min,修复完毕后让柠檬酸缓冲液自然冷却至室温；

5.PBS冲洗,5min×3次；

6.去除内源性过氧化物酶活性：在切片上滴加50μL3％双氧水,室温孵育10min；

7.PBS冲洗,5min×3次；

8.封闭：把切片甩干、擦净,用50μL 10％羊血清(PBS稀释)室温封闭30min后甩干(勿洗)；

9.一抗孵育：滴加50μL稀释后的MCD一抗(Abcam,ab95945)5μg/ml 4℃过夜。

10.第二天将切片取出,37℃恒温箱复温30min,PBS冲洗,5min×3次。

11.滴加100μL增强酶标山羊抗兔IgG聚合物,室温孵育30min；

12.PBS冲洗,5min×3次；

13.DAB显色：1mL DAB+1滴显色液(避光,现用现配),取出切片,擦净液体,滴加100μL DAB,镜下观察染色程度,变色后及时终止(用自来水冲洗)；

14.苏木素染色2min,自来水冲洗1min；盐酸分化1s,自来水冲洗1min；最后用碳酸锂返蓝1min,流水冲洗1min；

15.梯度乙醇脱水：80％乙醇、95％乙醇Ⅰ、95％乙醇Ⅱ、无水酒精Ⅰ和无水酒精Ⅱ脱水各3min；

16.二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ内浸泡各3min；

中性树脂封片,待树脂凝固后,在显微镜下拍照。

实验结果：

免疫组化结果显示：MCD定位于细胞质，在肾小管中的表达量高于肾小球，MCD的表达与肾癌组织病理学分级相关，MCD在IV期肾癌组织中的表达显著低于癌旁正常组织(图1A-1B，P<0.01)；在I、II、III期的表达显著高于IV期(图1C，P<0.05)，MCD的表达水平与TNM分期(P<0.01)和远端转移相关(P<0.001，表3)，MCD的表达水平与年龄(P＝0.173)、性别(P＝0.144)、肿瘤大小(P＝0.915)、淋巴结转移(P＝0.521)无显著相关性(表3)。同时我们也随机取27例肾癌患者的肾癌组织和癌旁组织，发现MCD在肾癌发生转移阶段表达量显著降低，提示一方面其低表达可以作为肾癌转移的标志物，另一方面特异性的上调或活化MCD可能抑制肾癌转移的发生。

表3 MCD在肾癌组织中的表达

**P-value<0.01shows statistical significance.

实施例2体外细胞实验

实验方法：

Transwell实验

(1)细胞培养、铺板；

(2)提前在24孔板底部加入600μl含有10％胎牛血清的完全培养基放于细胞培养箱孵育2h；

(3)胰酶消化肾癌细胞3min，用完全培养基中止胰酶消化，置于15mL离心管，800rpm，25℃，离心3min，然后用无血清培养基重悬细胞，计数同前，取ACHN 8×10⁴个/孔，786O>4个/孔，置于200μL的细胞悬液中，加入上室，在细胞培养箱中培养12h；

(4)12h后，用镊子小心取出小室，吸干上室液体，移到加入800μl甲醇的孔中，室温固定30min；

(5)用镊子取出小室，吸干上室液体，用PBS轻轻漂洗2遍，移到加入800μl结晶紫染色液的孔中，室温染色15～30min；

(6)取出小室，用PBS轻轻漂洗数次，然后吸干上室液体，用湿润的棉签小心擦去上室底部膜表面上未穿过的细胞；

(7)把小室底面朝上，自然晾干后于倒置显微镜下随机选取5个视野拍照,然后进行细胞计数，统计结果。

划痕愈伤实验

(1)在六孔板背面，用用记号笔的细头标着直尺标记均匀的横线，约间隔0.5-1cm一道，横穿过孔，每孔画3条；

(2)细胞培养、细胞计数步骤同前，ACHN：80*10⁴个/孔，786O：50*10⁴个/孔，加入2mL完全培养基，铺种于6孔板；

(3)弃去旧培养基，用白枪头顺着预先划出的直线，注意用力均匀，然后用PBS轻轻漂洗数次直至洗净划下的细胞，加入完全培养基后拍照；

(4)放入37℃、5％CO₂培养箱中培养，，显微镜下观察细胞变化，取12h、24h在同一位置拍照。

(5)测量划痕距离，，依据公式计算迁移率，迁移率＝[(划痕初始宽度–迁移后划痕宽度)/划痕初始宽度]×100％。

RTCA细胞侵袭实验

(1)细胞培养同前；

(2)仪器及材料准备：CO₂培养箱及其他细胞培养设备、RTCA>

(3)Matrigel胶包被CIM-Plate上室：实验开始之前将matrigel胶从-20℃冰箱转移至4℃冰箱过夜融化。实验当天用预冷的无血清培养基按1:10比例稀释matrigel胶全程冰上操作，防止matrigel胶凝固。先向CIM-Plate上室孔中加入50μl稀释好的matrigel胶，再吸出30μl,每个孔中最终保留20μl matrigel胶包被CIM-Plate上室。注意事项：包被CIM-Plate最重要的是包被均匀，可通过先加入50μl再吸出30μl matrigel胶来实现,整个过程冰上操作，尽量小心并快速,避免产生气泡；

(4)CIM-Plate上室加好matrigel胶后，放在37℃细胞培养箱，包被至其凝固(约4h),凝固时上室置于CIM夹具上,保证悬空不触碰电极；

(5)CIM-Plate装配：

a.把CIM上室和下室依次从包装袋中取出,放于超净台内，将CIM夹具用75％酒精消毒后，放在超净台内,使蓝色标志点对准夹具的左上方,将下室放到夹具对应的凹槽内；

b.用排枪向下室的每个孔中加入165ul培养基(A-G孔为含血清培养基,H孔为无血清培养基)，注意事项：加液时避免产生气泡,使加入的培养基在下室的孔内形成凸面；

c.将夹具和下室沿着逆时针方向旋转90度，将上室中传感器一面放在下室上,注意对齐上室和下室的各孔。放置时注意对齐上、下室贴有蓝点的孔,避免产生气泡。将上室和下室对齐之后,立即双手向下按压,可听到两次卡卡的声音；

d.向上室中加入30ul无血清培养基,轻轻拍打板的四周,使培养基均匀分布；

e.平衡检测板：将板放于5％CO2，37℃的细胞培养箱平衡1h；

f.测量基线：1h过后，将检测板放于RTCA DP监测台上，开始step 1进行基线检测；

(6)制备细胞悬液

1.实验前的细胞准备同前，但保证实验当天细胞汇合度约60-80％；

2.弃掉旧培养基，无菌PBS清洗2次；加入1mL含0.25％EDTA的胰酶,放入37℃细胞培养箱3min，细胞缩小变圆后，用1mL完全培养基中止消化；

3.将细胞轻轻吹散至均匀，转移至15mL离心管，于800rpm，25℃，离心5min；

4.离心后吸去上清，加入适量无血清培养基重悬计数，然后配制所需细胞悬液。注意事项：用于细胞传代次数应低于20代；

5.向CIM-Plate上室中加入100μL细胞悬液,每孔细胞数量为16*10⁴个细胞；

6.将CIM-Plate放于室温静置30min，使细胞沉于上室底面；

7.将CIM-Plate置于RTCA DP检测台,在系统自动扫描“Scan Plate”后,开始Step2,进行细胞侵袭的实时动态检测(每5min检测一次,持续96h)。

8.细胞侵袭96h后,停止实验；

9.分析细胞侵袭CI曲线,染色,于镜下观察细胞侵袭情况；

10.实验结束后，拆开CIM-Plate,将上下室分离,避免碰触上室底部的细胞；

11.用排枪吸去CIM-Plate上室内残留的培养基；

12.Diff-Quik快速染色法进行细胞染色,具体步骤如下：

·90％甲醇室温固定CIM上室细胞2min；

·将已固定好细胞的CIM-Plate上室置于缓冲液I中染色1min；

·将已固定好细胞的CIM-Plate上室置于缓冲液II中染色1min；

冲洗CIM-Plate上室去除未结合的染料(动作轻柔)。

干扰RNA设计：

SH-MCD1

Sense：5’-ccggaattctgaagcacttcacacgctcgagcgtgtgaagtgcttcagaatttttttg-3’(SEQ ID NO.1)

anti-sense：5’-aattcaaaaaaattctgaagcacttcacgctcgagcgtgtgaagtgcttcagaatt-3’(SEQ ID NO.2)

SHMCD2

Sense：5’-ccggaagattttgttcttctcttctctcgagagaagaga agaacaaaatctttttttg-3’(SEQ ID NO.3)

anti-sense：5’-aattcaaaaaaagattttgttcttctcttctctcgagagaagagaagaacaaaatctt-3’(SEQ ID NO.4)

control-shRNA

sense：5’-ccggcctaaggttaagtcgccctctcgagagcgagggcgacttaaccttaggtttttg-3’(SEQ ID NO.5)

anti-sense：5’-aattcaaaaacctaaggttaagtcgccctctcgagagcgagggcgacttaaccttagg-3’(SEQ ID NO.6)

研究发现，在原发性ccRCC来源的786-O细胞以及转移性pRCC来源的ACHN细胞系中，敲减MCD抑制细胞增殖，高表达MCD则促进细胞增殖，说明MCD确实是肾癌细胞增殖所必需的，这与前人体外研究结果一致(图2A-C)。值得注意的是，MCD失活突变体(L307R)则不能明显促进增殖，说明MCD促增殖能力与其催化的malonyl-CoA脱羧形成acetyl-CoA有关。

另一方面，与我们假说一致的是，抑制MCD表达显著促进细胞的迁移；反之，高表达野生型MCD则显著抑制细胞迁移(图3A-3C)。通过RTCA实时细胞监测，我们发现MCD高表达显著抑制细胞侵袭(图3C)。证明MCD确实抑制肾癌细胞的转移能力。同样，MCD失活突变体抑制及细胞迁移和侵袭的能力显著降低。该部分结果说明MCD抑制肾癌细胞的转移特性，且该作用依赖于MCD的酶活性。

实施例3动物实验

实验方法：

载体的构建：人源MCD cDNA购于山东维真生物科技有限公司，亚克隆到购买的慢病毒表达载体pCD513b-1，进而利用定点突变PCR获得T920G失活突变体。慢病毒制备：

慢病毒包装和转染

(1)将293T细胞铺种于60mm大皿中(300×10⁴细胞)，使20h后细胞密度达到70-80％，铺板后18-20h为最佳转染时间；

(2)约18h后，待细胞密度达到70-80％，进行转染；

(3)首先用5mL基础培养基给细胞换液，然后准备质粒，目的基因质粒：pSPAX2(包装质粒)：pMD.2G(包装质粒)比例为4:3:1，100mm培养皿共需要28μg质粒，质粒:转染试剂PEI比例为1:3(质量：体积)；

(4)准备2个1.5mL EP管，先各加入500μL opti-MEM，然后向其中一个1.5mL EP管中逐次加入目的质粒及包装质粒，另一个1.5mL EP管加入84μL PEI，室温静置5min；

(5)5min后，将PEI逐滴加入质粒中，迅速低速涡旋混匀，室温静置30min；

(6)静置过后，将转染混合物逐滴加入待转的细胞中，轻轻前后左右混匀，于镜下观察细胞状态，由于293T细胞较脆弱，转染后一定随时观察其状态；

(7)放置37℃，5％CO2细胞培养箱；

(8)转染后12小时换成新鲜完全培养基；

(9)在换液后的48h、72h、96h连续收集3次病毒原液，即培养基上清，先把收集的病毒原液放在4℃冰箱暂时储存，但尽量不要超过一周，避免降低病毒滴度；

(10)将收集的病毒原液1250rpm、5min离心,]，用0.45μm滤器过滤，去除杂质、分装冻存在-80℃；

(11)病毒浓缩：把15mL病毒原液移至100kD超滤柱收集池内，4000g，4℃，30min离心，将收集管内200μl的病毒浓缩液，分装于1.5mLEP管内，50μl/管，放在-80℃冰箱，可长期保存，避免反复冻融；

(12)病毒侵染：将侵染的目的细胞提前一天铺种于中皿内，待细胞的汇合度为50-60％左右为侵染的最佳时期。在侵染细胞前，更换3mL新鲜完全培养基，用100μl病毒浓缩液和polybrene(工作浓度为5μg/mL)混匀，加入细胞中。也可直接将未浓缩的2mL病毒液、polybrene和1mL新鲜的完全培养基混合后直接加入侵染的目的细胞；

(13)侵染6h后，用PBS洗三遍，更换新鲜的完全培养基；

(14)慢病毒介导的基因侵染细胞后，会在48h内陆续表达，期间可于荧光显微镜下观察绿色荧光表达情况，如果侵染效率不高，可以用病毒液反复侵染细胞。被病毒感染后，表达目的基因的细胞均为稳定细胞系。慢病毒侵染细胞的效率均可达100％，若效率较低可用相应的抗生素筛选稳定转染细胞系。

(15)通过病毒包装及病毒侵染，得到MCD-WT，MCD-MT高表达及对照(pCDH513b)ACHN稳定细胞株。

动物模型构建及处理：购于维通利华的6周龄雌性裸鼠随机分为3组，每组4只小鼠；利用以上获得的ACHN稳定细胞，消化重悬于1×10⁶细胞/200μl>

实验结果：

八周后，小鼠肺组织离体成像显示MCD高表达的ACHN细胞转移到肺部的GFP信号(图4A)以及肺切片中转移灶的数量(图4B)均显著低于对照组，而在注射MCD-MT-ACHN细胞的小鼠肺部转移信号较MCD-WT组有所回升。裸鼠移植瘤结果说明MCD在体内能够抑制肾癌细胞肺转移。

序列表

<110> 徐州医科大学

<120> MCD基因及其表达产物在制备诊疗肾癌分期或转移试剂中的应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ccggaattct gaagcacttc acacgctcga gcgtgtgaag tgcttcagaa tttttttg 58

<210> 2

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aattcaaaaa aattctgaag cacttcacgc tcgagcgtgt gaagtgcttc agaatt 56

<210> 3

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccggaagatt ttgttcttct cttctctcga gagaagagaa gaacaaaatc tttttttg 58

<210> 4

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aattcaaaaa aagattttgt tcttctcttc tctcgagaga agagaagaac aaaatctt 58

<210> 5

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ccggcctaag gttaagtcgc cctctcgaga gcgagggcga cttaacctta ggtttttg 58

<210> 6

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aattcaaaaa cctaaggtta agtcgccctc tcgagagcga gggcgactta accttagg 58