一种负载外源干细胞的注射型胶原材料及其在心肌损伤修复中的应用

摘要

本发明公开了一种负载外源干细胞的注射型胶原材料及其在心肌损伤修复中的应用。本发明保护一种产品包括干细胞和胶原材料；胶原材料的制备方法：(1)取牛筋膜组织，去除表面的肌肉和脂肪，用水清洗；(2)置于含磷酸三丁酯的液体中浸泡；(3)置于水中浸泡并清洗；(4)置于NaCl溶液中浸泡；(5)置于水中浸泡并清洗；(6)置于表面活性剂溶液中浸泡；(7)置于水中浸泡并清洗；(8)置于NaOH溶液中浸泡；(9)置于水中浸泡并清洗；(10)冷冻干燥，得到干燥组织；(11)溶于醋酸溶液；(12)透析；(13)冷冻干燥，得到干粉状胶原材料；所述产品的功能为治疗心肌损伤。本发明对于心肌损伤治疗具有重大的应用价值。

说明书

技术领域

本发明涉及一种负载外源干细胞的注射型胶原材料及其在心肌损伤修复中的应用。

背景技术

外源干细胞移植是心肌损伤修复的重要手段，干细胞可以通过分化或旁分泌作用促进心肌损伤修复。其中，间充质干细胞是损伤修复中倍受关注和极具应用前景的细胞。这类细胞具有自我更新和广泛的分化潜能以及强大的营养和免疫调节活性，同时易于分离和培养，已在心肌损伤疾病的组织损伤修复中显示出重要的治疗作用。

目前间充质干细胞治疗心肌梗死已开展大量临床研究，clinical trail网站注册的相关研究就有100多项，这些研究初步证明可减少心肌梗死面积并改善心功能，但进一步研究表明，干细胞移植后容易扩散，很难在损伤部位定植，影响治疗效果。如何促进干细胞在损伤部位的定植是干细胞治疗心肌梗死需要解决的关键问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种负载外源干细胞的注射型胶原材料及其在心肌损伤修复中的应用。

本发明首先保护一种产品，包括干细胞和胶原材料；

所述胶原材料的制备方法包括如下步骤：

(1)取牛筋膜组织，去除表面的肌肉和脂肪，用水清洗；

(2)取完成步骤(1)的组织，置于含磷酸三丁酯的液体中浸泡；

(3)取完成步骤(2)的组织，置于水中浸泡并清洗；

(4)取完成步骤(3)的组织，置于NaCl溶液中浸泡；

(5)取完成步骤(4)的组织，置于水中浸泡并清洗；

(6)取完成步骤(5)的组织，置于表面活性剂溶液中浸泡；

(7)取完成步骤(6)的组织，置于水中浸泡并清洗；

(8)取完成步骤(7)的组织，置于NaOH溶液中浸泡；

(9)取完成步骤(8)的组织，置于水中浸泡并清洗；

(10)取完成步骤(9)的组织，进行冷冻干燥，得到干燥组织；

(11)取步骤(10)得到的干燥组织，溶于醋酸溶液，然后将体系pH调至6-8；

(12)将完成步骤(11)的整个体系转移到透析袋在水中进行透析；

(13)完成步骤(12)后，收集透析袋内的整个体系，然后进行冷冻干燥，得到干粉，即为干粉状胶原材料；

所述产品的功能为治疗心肌损伤。

所述胶原材料的制备方法还包括如下步骤(14)：取步骤(13)得到的干粉状胶原材料，用溶剂溶解，得到凝胶状胶原材料。

步骤(1)中，所述水为去离子水。

步骤(2)中，含磷酸三丁酯的液体是将磷酸三丁酯和水混合得到的。步骤(2)中，磷酸三丁酯的浓度可为0.5g/100ml-1.5g/100ml，具体可为1g/100ml。步骤(2)中，浸泡的温度可为2℃-16℃，具体可为4℃。步骤(2)中，浸泡的时间可为18小时-72小时，具体可为48小时。

步骤(3)中，所述水为去离子水。步骤(3)中，浸泡温度可为2℃-16℃，具体可为4℃。步骤(3)中，浸泡并清洗可为“每5分钟-15分钟换水，共换水10次-20次”，具体可为“每10分钟换水，共换水15次，最后一次换水10分钟后完成本步骤”。

步骤(4)中，NaCl溶液是将NaCl溶于pH7.6、25mmol/L的Tris-HCl缓冲液得到的。步骤(4)中，NaCl的浓度可为1M-2M，具体可为1.5M。步骤(4)中，浸泡的温度可为2℃-16℃，具体可为4℃。步骤(4)中，浸泡的时间为10分钟-60分钟，具体可为40分钟。

步骤(5)中，所述水为去离子水。步骤(5)中，浸泡温度可为2℃-16℃，具体可为4℃。步骤(5)中，浸泡并清洗可为“每5分钟-15分钟换水，共换水8次-20次”，具体可为“每10分钟换水，共换水9次，最后一次换水10分钟后完成本步骤”。

步骤(6)中，表面活性剂溶液为表面活性剂水溶液。步骤(6)中，表面活性剂溶液中，表面活性剂的浓度可为1％-5％(体积比)，具体可为3％(体积比)。步骤(6)中，表面活性剂可为Tween-20、Tween-21、Tween-40、Tween-60、Tween-61、Tween-80、Tween-81、Tween-85、Triton-100、Triton-114等。步骤(6)中，浸泡的温度可为2℃-16℃，具体可为4℃。步骤(6)中，浸泡的时间为30分钟-120分钟，具体可为80分钟。

步骤(7)中，所述水为去离子水。步骤(7)中，浸泡温度可为2℃-16℃，具体可为4℃。步骤(7)中，浸泡并清洗可为“每15分钟-25分钟换水，共换水15次-25次”，具体可为“每20分钟换水，共换水19次，最后一次换水20分钟后完成本步骤”。

步骤(8)中，NaOH溶液为NaOH水溶液。步骤(8)中，NaOH溶液中，NaOH的浓度可为0.5M-4M，具体可为2M。步骤(8)中，浸泡的温度可为2℃-16℃，具体可为4℃。步骤(8)中，浸泡的时间为10分钟-60分钟，具体可为30分钟。

步骤(9)中，所述水为去离子水。步骤(9)中，浸泡温度可为2℃-16℃，具体可为4℃。步骤(9)中，浸泡并清洗可为“每3分钟-10分钟换水，共换水15次-25次”，具体可为“每5分钟换水，共换水19次，最后一次换水5分钟后完成本步骤”。

步骤(10)中，所述冷冻干燥的时间可为24小时-72小时，具体可为48小时。

步骤(11)中，所述醋酸溶液为醋酸水溶液。步骤(11)中，醋酸溶液为0.05M-1M醋酸溶液，具体可为0.5M醋酸溶液。步骤(11)中，干燥组织与醋酸溶液的配比为“1g-5g：100ml-500ml”，具体配比可为“1g-5g：150ml”或“3g：100ml-500ml”，具体配比可为“3g：150ml”。步骤(11)中，醋酸溶液为预冷的醋酸溶液。所述预冷的温度为2℃-16℃，具体可为4℃。步骤(11)中，溶于醋酸溶液的实现方式可为“2℃-16℃搅拌2小时-24小时”，具体可为“4℃搅拌12小时”。步骤(11)中，体系pH调至7。步骤(11)中，用NaOH水溶液调pH，具体用4M NaOH水溶液调pH。

步骤(12)中，所述透析袋的截留分子量为1000Da-100kDa，具体可为3000Da。步骤(12)中，所述水为去离子水。步骤(12)中，透析的时间可为3天-10天，具体可为7天。步骤(12)中，透析过程中每天换水，具体可每天换水3次。步骤(12)中，透析的温度为2℃-16℃，具体可为4℃。

步骤(13)中，所述冷冻干燥的时间可为24小时-72小时，具体可为48小时。

步骤(14)中，溶剂可为生理盐水或磷酸盐缓冲液。所述磷酸盐缓冲液可为pH7-8的磷酸盐缓冲液，具体可为pH7.4的PBS缓冲液。步骤(14)中，干粉状胶原材料与溶剂的配比可为“0.2-4g：100ml”，具体可为“3g：100ml”。

干细胞和干粉状胶原材料的配比可为“10³个细胞-10¹²个细胞：1mg-100mg胶原材料”，具体可为“10⁸个细胞：1mg-20mg胶原材料”，更具体可为“10⁸个细胞：15mg胶原材料”。

干细胞和凝胶状胶原材料的配比可为“10³个细胞-10¹²个细胞：100μl-1000μl胶原材料”，具体可为“10⁷个细胞-10⁹个细胞：400μl-600μl胶原材料”，更具体可为“10⁸个细胞：500μl胶原材料”。

所述产品的制备方法具体可为：将3体积份细胞悬液与1体积份凝胶状胶原材料混合，得到所述产品。所述细胞悬液是将干细胞用溶剂(例如生理盐水或PBS缓冲液)悬浮得到的。每2ml产品中，含有10⁷-10⁹个干细胞，具体含有10⁸个干细胞。

本发明还保护一种负载干细胞的胶原材料，其制备方法包括如下步骤：

(1)取牛筋膜组织，去除表面的肌肉和脂肪，用水清洗；

(2)取完成步骤(1)的组织，置于含磷酸三丁酯的液体中浸泡；

(3)取完成步骤(2)的组织，置于水中浸泡并清洗；

(4)取完成步骤(3)的组织，置于NaCl溶液中浸泡；

(5)取完成步骤(4)的组织，置于水中浸泡并清洗；

(6)取完成步骤(5)的组织，置于表面活性剂溶液中浸泡；

(7)取完成步骤(6)的组织，置于水中浸泡并清洗；

(8)取完成步骤(7)的组织，置于NaOH溶液中浸泡；

(9)取完成步骤(8)的组织，置于水中浸泡并清洗；

(10)取完成步骤(9)的组织，进行冷冻干燥，得到干燥组织；

(11)取步骤(10)得到的干燥组织，溶于醋酸溶液，然后将体系pH调至6-8；

(12)将完成步骤(11)的整个体系转移到透析袋在水中进行透析；

(13)完成步骤(12)后，收集透析袋内的整个体系，然后进行冷冻干燥，得到干粉，即为干粉状胶原材料；

(14)将干细胞、干粉状胶原材料和溶剂混合，得到负载干细胞的胶原材料。

步骤(1)中，所述水为去离子水。

步骤(2)中，含磷酸三丁酯的液体是将磷酸三丁酯和水混合得到的。步骤(2)中，磷酸三丁酯的浓度可为0.5g/100ml-1.5g/100ml，具体可为1g/100ml。步骤(2)中，浸泡的温度可为2℃-16℃，具体可为4℃。步骤(2)中，浸泡的时间可为18小时-72小时，具体可为48小时。

步骤(3)中，所述水为去离子水。步骤(3)中，浸泡温度可为2℃-16℃，具体可为4℃。步骤(3)中，浸泡并清洗可为“每5分钟-15分钟换水，共换水10次-20次”，具体可为“每10分钟换水，共换水15次，最后一次换水10分钟后完成本步骤”。

步骤(4)中，NaCl溶液是将NaCl溶于pH7.6、25mmol/L的Tris-HCl缓冲液得到的。步骤(4)中，NaCl的浓度可为1M-2M，具体可为1.5M。步骤(4)中，浸泡的温度可为2℃-16℃，具体可为4℃。步骤(4)中，浸泡的时间为10分钟-60分钟，具体可为40分钟。

步骤(5)中，所述水为去离子水。步骤(5)中，浸泡温度可为2℃-16℃，具体可为4℃。步骤(5)中，浸泡并清洗可为“每5分钟-15分钟换水，共换水8次-20次”，具体可为“每10分钟换水，共换水9次，最后一次换水10分钟后完成本步骤”。

步骤(6)中，表面活性剂溶液为表面活性剂水溶液。步骤(6)中，表面活性剂溶液中，表面活性剂的浓度可为1％-5％(体积比)，具体可为3％(体积比)。步骤(6)中，表面活性剂可为Tween-20、Tween-21、Tween-40、Tween-60、Tween-61、Tween-80、Tween-81、Tween-85、Triton-100、Triton-114等。步骤(6)中，浸泡的温度可为2℃-16℃，具体可为4℃。步骤(6)中，浸泡的时间为30分钟-120分钟，具体可为80分钟。

步骤(7)中，所述水为去离子水。步骤(7)中，浸泡温度可为2℃-16℃，具体可为4℃。步骤(7)中，浸泡并清洗可为“每15分钟-25分钟换水，共换水15次-25次”，具体可为“每20分钟换水，共换水19次，最后一次换水20分钟后完成本步骤”。

步骤(8)中，NaOH溶液为NaOH水溶液。步骤(8)中，NaOH溶液中，NaOH的浓度可为0.5M-4M，具体可为2M。步骤(8)中，浸泡的温度可为2℃-16℃，具体可为4℃。步骤(8)中，浸泡的时间为10分钟-60分钟，具体可为30分钟。

步骤(9)中，所述水为去离子水。步骤(9)中，浸泡温度可为2℃-16℃，具体可为4℃。步骤(9)中，浸泡并清洗可为“每3分钟-10分钟换水，共换水15次-25次”，具体可为“每5分钟换水，共换水19次，最后一次换水5分钟后完成本步骤”。

步骤(10)中，所述冷冻干燥的时间可为24小时-72小时，具体可为48小时。

步骤(11)中，所述醋酸溶液为醋酸水溶液。步骤(11)中，醋酸溶液为0.05M-1M醋酸溶液，具体可为0.5M醋酸溶液。步骤(11)中，干燥组织与醋酸溶液的配比为“1g-5g：100ml-500ml”，具体配比可为“1g-5g：150ml”或“3g：100ml-500ml”，具体配比可为“3g：150ml”。步骤(11)中，醋酸溶液为预冷的醋酸溶液。所述预冷的温度为2℃-16℃，具体可为4℃。步骤(11)中，溶于醋酸溶液的实现方式可为“2℃-16℃搅拌2小时-24小时”，具体可为“4℃搅拌12小时”。步骤(11)中，体系pH调至7。步骤(11)中，用NaOH水溶液调pH，具体用4M NaOH水溶液调pH。

步骤(12)中，所述透析袋的截留分子量为1000Da-100kDa，具体可为3000Da。步骤(12)中，所述水为去离子水。步骤(12)中，透析的时间可为3天-10天，具体可为7天。步骤(12)中，透析过程中每天换水，具体可每天换水3次。步骤(12)中，透析的温度为2℃-16℃，具体可为4℃。

步骤(13)中，所述冷冻干燥的时间可为24小时-72小时，具体可为48小时。

步骤(14)中，溶剂可为生理盐水或磷酸盐缓冲液。所述磷酸盐缓冲液可为pH7-8的磷酸盐缓冲液，具体可为pH7.4的PBS缓冲液。步骤(14)中，干粉状胶原材料与溶剂的配比可为“0.2-4g：100ml”，具体可为“3g：100ml”。

干细胞和干粉状胶原材料的配比可为“10³个细胞-10¹²个细胞：1mg-100mg胶原材料”，具体可为“10⁸个细胞：1mg-20mg胶原材料”，更具体可为“10⁸个细胞：15mg胶原材料”。

本发明还保护一种负载干细胞的胶原材料，其制备方法包括如下步骤：

(1)取牛筋膜组织，去除表面的肌肉和脂肪，用水清洗；

(2)取完成步骤(1)的组织，置于含磷酸三丁酯的液体中浸泡；

(3)取完成步骤(2)的组织，置于水中浸泡并清洗；

(4)取完成步骤(3)的组织，置于NaCl溶液中浸泡；

(5)取完成步骤(4)的组织，置于水中浸泡并清洗；

(6)取完成步骤(5)的组织，置于表面活性剂溶液中浸泡；

(7)取完成步骤(6)的组织，置于水中浸泡并清洗；

(8)取完成步骤(7)的组织，置于NaOH溶液中浸泡；

(9)取完成步骤(8)的组织，置于水中浸泡并清洗；

(10)取完成步骤(9)的组织，进行冷冻干燥，得到干燥组织；

(11)取步骤(10)得到的干燥组织，溶于醋酸溶液，然后将体系pH调至6-8；

(12)将完成步骤(11)的整个体系转移到透析袋在水中进行透析；

(13)完成步骤(12)后，收集透析袋内的整个体系，然后进行冷冻干燥，得到干粉，即为干粉状胶原材料；

(14)取步骤(13)得到的干粉状胶原材料，用溶剂溶解，得到凝胶状胶原材料；

(15)将干细胞和凝胶状胶原材料混合，得到负载干细胞的胶原材料。

步骤(1)中，所述水为去离子水。

步骤(2)中，含磷酸三丁酯的液体是将磷酸三丁酯和水混合得到的。步骤(2)中，磷酸三丁酯的浓度可为0.5g/100ml-1.5g/100ml，具体可为1g/100ml。步骤(2)中，浸泡的温度可为2℃-16℃，具体可为4℃。步骤(2)中，浸泡的时间可为18小时-72小时，具体可为48小时。

步骤(3)中，所述水为去离子水。步骤(3)中，浸泡温度可为2℃-16℃，具体可为4℃。步骤(3)中，浸泡并清洗可为“每5分钟-15分钟换水，共换水10次-20次”，具体可为“每10分钟换水，共换水15次，最后一次换水10分钟后完成本步骤”。

步骤(4)中，NaCl溶液是将NaCl溶于pH7.6、25mmol/L的Tris-HCl缓冲液得到的。步骤(4)中，NaCl的浓度可为1M-2M，具体可为1.5M。步骤(4)中，浸泡的温度可为2℃-16℃，具体可为4℃。步骤(4)中，浸泡的时间为10分钟-60分钟，具体可为40分钟。

步骤(5)中，所述水为去离子水。步骤(5)中，浸泡温度可为2℃-16℃，具体可为4℃。步骤(5)中，浸泡并清洗可为“每5分钟-15分钟换水，共换水8次-20次”，具体可为“每10分钟换水，共换水9次，最后一次换水10分钟后完成本步骤”。

步骤(6)中，表面活性剂溶液为表面活性剂水溶液。步骤(6)中，表面活性剂溶液中，表面活性剂的浓度可为1％-5％(体积比)，具体可为3％(体积比)。步骤(6)中，表面活性剂可为Tween-20、Tween-21、Tween-40、Tween-60、Tween-61、Tween-80、Tween-81、Tween-85、Triton-100、Triton-114等。步骤(6)中，浸泡的温度可为2℃-16℃，具体可为4℃。步骤(6)中，浸泡的时间为30分钟-120分钟，具体可为80分钟。

步骤(7)中，所述水为去离子水。步骤(7)中，浸泡温度可为2℃-16℃，具体可为4℃。步骤(7)中，浸泡并清洗可为“每15分钟-25分钟换水，共换水15次-25次”，具体可为“每20分钟换水，共换水19次，最后一次换水20分钟后完成本步骤”。

步骤(8)中，NaOH溶液为NaOH水溶液。步骤(8)中，NaOH溶液中，NaOH的浓度可为0.5M-4M，具体可为2M。步骤(8)中，浸泡的温度可为2℃-16℃，具体可为4℃。步骤(8)中，浸泡的时间为10分钟-60分钟，具体可为30分钟。

步骤(9)中，所述水为去离子水。步骤(9)中，浸泡温度可为2℃-16℃，具体可为4℃。步骤(9)中，浸泡并清洗可为“每3分钟-10分钟换水，共换水15次-25次”，具体可为“每5分钟换水，共换水19次，最后一次换水5分钟后完成本步骤”。

步骤(10)中，所述冷冻干燥的时间可为24小时-72小时，具体可为48小时。

步骤(11)中，所述醋酸溶液为醋酸水溶液。步骤(11)中，醋酸溶液为0.05M-1M醋酸溶液，具体可为0.5M醋酸溶液。步骤(11)中，干燥组织与醋酸溶液的配比为“1g-5g：100ml-500ml”，具体配比可为“1g-5g：150ml”或“3g：100ml-500ml”，具体配比可为“3g：150ml”。步骤(11)中，醋酸溶液为预冷的醋酸溶液。所述预冷的温度为2℃-16℃，具体可为4℃。步骤(11)中，溶于醋酸溶液的实现方式可为“2℃-16℃搅拌2小时-24小时”，具体可为“4℃搅拌12小时”。步骤(11)中，体系pH调至7。步骤(11)中，用NaOH水溶液调pH，具体用4M NaOH水溶液调pH。

步骤(12)中，所述透析袋的截留分子量为1000Da-100kDa，具体可为3000Da。步骤(12)中，所述水为去离子水。步骤(12)中，透析的时间可为3天-10天，具体可为7天。步骤(12)中，透析过程中每天换水，具体可每天换水3次。步骤(12)中，透析的温度为2℃-16℃，具体可为4℃。

步骤(13)中，所述冷冻干燥的时间可为24小时-72小时，具体可为48小时。

步骤(14)中，溶剂可为生理盐水或磷酸盐缓冲液。所述磷酸盐缓冲液可为pH7-8的磷酸盐缓冲液，具体可为pH7.4的PBS缓冲液。步骤(14)中，干粉状胶原材料与溶剂的配比可为“0.2-4g：100ml”，具体可为“3g：100ml”。

步骤(15)中，干细胞和凝胶状胶原材料的配比可为“10³个细胞-10¹²个细胞：100μl-1000μl胶原材料”，具体可为“10⁷个细胞-10⁹个细胞：400μl-600μl胶原材料”，更具体可为“10⁸个细胞：500μl胶原材料”。

所述负载干细胞的胶原材料的制备方法具体包括：将3体积份细胞悬液与1体积份凝胶状胶原材料混合，得到所述产品。所述细胞悬液是将干细胞用溶剂(例如生理盐水或PBS缓冲液)悬浮得到的。每2ml负载干细胞的胶原材料中，含有10⁷-10⁹个干细胞，具体含有10⁸个干细胞。

本发明还保护一种负载干细胞的胶原材料的制备方法，包括如下步骤：

(1)取牛筋膜组织，去除表面的肌肉和脂肪，用水清洗；

(2)取完成步骤(1)的组织，置于含磷酸三丁酯的液体中浸泡；

(3)取完成步骤(2)的组织，置于水中浸泡并清洗；

(4)取完成步骤(3)的组织，置于NaCl溶液中浸泡；

(5)取完成步骤(4)的组织，置于水中浸泡并清洗；

(6)取完成步骤(5)的组织，置于表面活性剂溶液中浸泡；

(7)取完成步骤(6)的组织，置于水中浸泡并清洗；

(8)取完成步骤(7)的组织，置于NaOH溶液中浸泡；

(9)取完成步骤(8)的组织，置于水中浸泡并清洗；

(10)取完成步骤(9)的组织，进行冷冻干燥，得到干燥组织；

(11)取步骤(10)得到的干燥组织，溶于醋酸溶液，然后将体系pH调至6-8；

(12)将完成步骤(11)的整个体系转移到透析袋在水中进行透析；

(13)完成步骤(12)后，收集透析袋内的整个体系，然后进行冷冻干燥，得到干粉，即为干粉状胶原材料；

(14)将干细胞、干粉状胶原材料和溶剂混合，得到负载干细胞的胶原材料。

步骤(1)中，所述水为去离子水。

步骤(2)中，含磷酸三丁酯的液体是将磷酸三丁酯和水混合得到的。步骤(2)中，磷酸三丁酯的浓度可为0.5g/100ml-1.5g/100ml，具体可为1g/100ml。步骤(2)中，浸泡的温度可为2℃-16℃，具体可为4℃。步骤(2)中，浸泡的时间可为18小时-72小时，具体可为48小时。

步骤(3)中，所述水为去离子水。步骤(3)中，浸泡温度可为2℃-16℃，具体可为4℃。步骤(3)中，浸泡并清洗可为“每5分钟-15分钟换水，共换水10次-20次”，具体可为“每10分钟换水，共换水15次，最后一次换水10分钟后完成本步骤”。

步骤(4)中，NaCl溶液是将NaCl溶于pH7.6、25mmol/L的Tris-HCl缓冲液得到的。步骤(4)中，NaCl的浓度可为1M-2M，具体可为1.5M。步骤(4)中，浸泡的温度可为2℃-16℃，具体可为4℃。步骤(4)中，浸泡的时间为10分钟-60分钟，具体可为40分钟。

步骤(5)中，所述水为去离子水。步骤(5)中，浸泡温度可为2℃-16℃，具体可为4℃。步骤(5)中，浸泡并清洗可为“每5分钟-15分钟换水，共换水8次-20次”，具体可为“每10分钟换水，共换水9次，最后一次换水10分钟后完成本步骤”。

步骤(6)中，表面活性剂溶液为表面活性剂水溶液。步骤(6)中，表面活性剂溶液中，表面活性剂的浓度可为1％-5％(体积比)，具体可为3％(体积比)。步骤(6)中，表面活性剂可为Tween-20、Tween-21、Tween-40、Tween-60、Tween-61、Tween-80、Tween-81、Tween-85、Triton-100、Triton-114等。步骤(6)中，浸泡的温度可为2℃-16℃，具体可为4℃。步骤(6)中，浸泡的时间为30分钟-120分钟，具体可为80分钟。

步骤(7)中，所述水为去离子水。步骤(7)中，浸泡温度可为2℃-16℃，具体可为4℃。步骤(7)中，浸泡并清洗可为“每15分钟-25分钟换水，共换水15次-25次”，具体可为“每20分钟换水，共换水19次，最后一次换水20分钟后完成本步骤”。

步骤(8)中，NaOH溶液为NaOH水溶液。步骤(8)中，NaOH溶液中，NaOH的浓度可为0.5M-4M，具体可为2M。步骤(8)中，浸泡的温度可为2℃-16℃，具体可为4℃。步骤(8)中，浸泡的时间为10分钟-60分钟，具体可为30分钟。

步骤(9)中，所述水为去离子水。步骤(9)中，浸泡温度可为2℃-16℃，具体可为4℃。步骤(9)中，浸泡并清洗可为“每3分钟-10分钟换水，共换水15次-25次”，具体可为“每5分钟换水，共换水19次，最后一次换水5分钟后完成本步骤”。

步骤(10)中，所述冷冻干燥的时间可为24小时-72小时，具体可为48小时。

步骤(11)中，所述醋酸溶液为醋酸水溶液。步骤(11)中，醋酸溶液为0.05M-1M醋酸溶液，具体可为0.5M醋酸溶液。步骤(11)中，干燥组织与醋酸溶液的配比为“1g-5g：100ml-500ml”，具体配比可为“1g-5g：150ml”或“3g：100ml-500ml”，具体配比可为“3g：150ml”。步骤(11)中，醋酸溶液为预冷的醋酸溶液。所述预冷的温度为2℃-16℃，具体可为4℃。步骤(11)中，溶于醋酸溶液的实现方式可为“2℃-16℃搅拌2小时-24小时”，具体可为“4℃搅拌12小时”。步骤(11)中，体系pH调至7。步骤(11)中，用NaOH水溶液调pH，具体用4M NaOH水溶液调pH。

步骤(12)中，所述透析袋的截留分子量为1000Da-100kDa，具体可为3000Da。步骤(12)中，所述水为去离子水。步骤(12)中，透析的时间可为3天-10天，具体可为7天。步骤(12)中，透析过程中每天换水，具体可每天换水3次。步骤(12)中，透析的温度为2℃-16℃，具体可为4℃。

步骤(13)中，所述冷冻干燥的时间可为24小时-72小时，具体可为48小时。

步骤(14)中，溶剂可为生理盐水或磷酸盐缓冲液。所述磷酸盐缓冲液可为pH7-8的磷酸盐缓冲液，具体可为pH7.4的PBS缓冲液。步骤(14)中，干粉状胶原材料与溶剂的配比可为“0.2-4g：100ml”，具体可为“3g：100ml”。

干细胞和干粉状胶原材料的配比可为“10³个细胞-10¹²个细胞：1mg-100mg胶原材料”，具体可为“10⁸个细胞：1mg-20mg胶原材料”，更具体可为“10⁸个细胞：15mg胶原材料”。

本发明还保护一种负载干细胞的胶原材料的制备方法，包括如下步骤：

(1)取牛筋膜组织，去除表面的肌肉和脂肪，用水清洗；

(2)取完成步骤(1)的组织，置于含磷酸三丁酯的液体中浸泡；

(3)取完成步骤(2)的组织，置于水中浸泡并清洗；

(4)取完成步骤(3)的组织，置于NaCl溶液中浸泡；

(5)取完成步骤(4)的组织，置于水中浸泡并清洗；

(6)取完成步骤(5)的组织，置于表面活性剂溶液中浸泡；

(7)取完成步骤(6)的组织，置于水中浸泡并清洗；

(8)取完成步骤(7)的组织，置于NaOH溶液中浸泡；

(9)取完成步骤(8)的组织，置于水中浸泡并清洗；

(10)取完成步骤(9)的组织，进行冷冻干燥，得到干燥组织；

(11)取步骤(10)得到的干燥组织，溶于醋酸溶液，然后将体系pH调至6-8；

(12)将完成步骤(11)的整个体系转移到透析袋在水中进行透析；

(13)完成步骤(12)后，收集透析袋内的整个体系，然后进行冷冻干燥，得到干粉，即为干粉状胶原材料；

(14)取步骤(13)得到的干粉状胶原材料，用溶剂溶解，得到凝胶状胶原材料；

(15)将干细胞和凝胶状胶原材料混合，得到负载干细胞的胶原材料。

步骤(1)中，所述水为去离子水。

步骤(2)中，含磷酸三丁酯的液体是将磷酸三丁酯和水混合得到的。步骤(2)中，磷酸三丁酯的浓度可为0.5g/100ml-1.5g/100ml，具体可为1g/100ml。步骤(2)中，浸泡的温度可为2℃-16℃，具体可为4℃。步骤(2)中，浸泡的时间可为18小时-72小时，具体可为48小时。

步骤(3)中，所述水为去离子水。步骤(3)中，浸泡温度可为2℃-16℃，具体可为4℃。步骤(3)中，浸泡并清洗可为“每5分钟-15分钟换水，共换水10次-20次”，具体可为“每10分钟换水，共换水15次，最后一次换水10分钟后完成本步骤”。

步骤(4)中，NaCl溶液是将NaCl溶于pH7.6、25mmol/L的Tris-HCl缓冲液得到的。步骤(4)中，NaCl的浓度可为1M-2M，具体可为1.5M。步骤(4)中，浸泡的温度可为2℃-16℃，具体可为4℃。步骤(4)中，浸泡的时间为10分钟-60分钟，具体可为40分钟。

步骤(5)中，所述水为去离子水。步骤(5)中，浸泡温度可为2℃-16℃，具体可为4℃。步骤(5)中，浸泡并清洗可为“每5分钟-15分钟换水，共换水8次-20次”，具体可为“每10分钟换水，共换水9次，最后一次换水10分钟后完成本步骤”。

步骤(6)中，表面活性剂溶液为表面活性剂水溶液。步骤(6)中，表面活性剂溶液中，表面活性剂的浓度可为1％-5％(体积比)，具体可为3％(体积比)。步骤(6)中，表面活性剂可为Tween-20、Tween-21、Tween-40、Tween-60、Tween-61、Tween-80、Tween-81、Tween-85、Triton-100、Triton-114等。步骤(6)中，浸泡的温度可为2℃-16℃，具体可为4℃。步骤(6)中，浸泡的时间为30分钟-120分钟，具体可为80分钟。

步骤(7)中，所述水为去离子水。步骤(7)中，浸泡温度可为2℃-16℃，具体可为4℃。步骤(7)中，浸泡并清洗可为“每15分钟-25分钟换水，共换水15次-25次”，具体可为“每20分钟换水，共换水19次，最后一次换水20分钟后完成本步骤”。

步骤(8)中，NaOH溶液为NaOH水溶液。步骤(8)中，NaOH溶液中，NaOH的浓度可为0.5M-4M，具体可为2M。步骤(8)中，浸泡的温度可为2℃-16℃，具体可为4℃。步骤(8)中，浸泡的时间为10分钟-60分钟，具体可为30分钟。

步骤(9)中，所述水为去离子水。步骤(9)中，浸泡温度可为2℃-16℃，具体可为4℃。步骤(9)中，浸泡并清洗可为“每3分钟-10分钟换水，共换水15次-25次”，具体可为“每5分钟换水，共换水19次，最后一次换水5分钟后完成本步骤”。

步骤(10)中，所述冷冻干燥的时间可为24小时-72小时，具体可为48小时。

步骤(11)中，所述醋酸溶液为醋酸水溶液。步骤(11)中，醋酸溶液为0.05M-1M醋酸溶液，具体可为0.5M醋酸溶液。步骤(11)中，干燥组织与醋酸溶液的配比为“1g-5g：100ml-500ml”，具体配比可为“1g-5g：150ml”或“3g：100ml-500ml”，具体配比可为“3g：150ml”。步骤(11)中，醋酸溶液为预冷的醋酸溶液。所述预冷的温度为2℃-16℃，具体可为4℃。步骤(11)中，溶于醋酸溶液的实现方式可为“2℃-16℃搅拌2小时-24小时”，具体可为“4℃搅拌12小时”。步骤(11)中，体系pH调至7。步骤(11)中，用NaOH水溶液调pH，具体用4M NaOH水溶液调pH。

步骤(12)中，所述透析袋的截留分子量为1000Da-100kDa，具体可为3000Da。步骤(12)中，所述水为去离子水。步骤(12)中，透析的时间可为3天-10天，具体可为7天。步骤(12)中，透析过程中每天换水，具体可每天换水3次。步骤(12)中，透析的温度为2℃-16℃，具体可为4℃。

步骤(13)中，所述冷冻干燥的时间可为24小时-72小时，具体可为48小时。

步骤(14)中，溶剂可为生理盐水或磷酸盐缓冲液。所述磷酸盐缓冲液可为pH7-8的磷酸盐缓冲液，具体可为pH7.4的PBS缓冲液。步骤(14)中，干粉状胶原材料与溶剂的配比可为“0.2-4g：100ml”，具体可为“3g：100ml”。

步骤(15)中，干细胞和凝胶状胶原材料的配比可为“10³个细胞-10¹²个细胞：100μl-1000μl胶原材料”，具体可为“10⁷个细胞-10⁹个细胞：400μl-600μl胶原材料”，更具体可为“10⁸个细胞：500μl胶原材料”。

所述负载干细胞的胶原材料的制备方法具体包括：将3体积份细胞悬液与1体积份凝胶状胶原材料混合，得到所述产品。所述细胞悬液是将干细胞用溶剂(例如生理盐水或PBS缓冲液)悬浮得到的。每2ml负载干细胞的胶原材料中，含有10⁷-10⁹个干细胞，具体含有10⁸个干细胞。

本发明还保护一种产品，包括以上任一所述负载干细胞的胶原材料；所述产品的功能为治疗心肌损伤。

本发明还保护干细胞和胶原材料在制备产品中的应用；

所述胶原材料的制备方法包括如下步骤：

(1)取牛筋膜组织，去除表面的肌肉和脂肪，用水清洗；

(2)取完成步骤(1)的组织，置于含磷酸三丁酯的液体中浸泡；

(3)取完成步骤(2)的组织，置于水中浸泡并清洗；

(4)取完成步骤(3)的组织，置于NaCl溶液中浸泡；

(5)取完成步骤(4)的组织，置于水中浸泡并清洗；

(6)取完成步骤(5)的组织，置于表面活性剂溶液中浸泡；

(7)取完成步骤(6)的组织，置于水中浸泡并清洗；

(8)取完成步骤(7)的组织，置于NaOH溶液中浸泡；

(9)取完成步骤(8)的组织，置于水中浸泡并清洗；

(10)取完成步骤(9)的组织，进行冷冻干燥，得到干燥组织；

(11)取步骤(10)得到的干燥组织，溶于醋酸溶液，然后将体系pH调至6-8；

(12)将完成步骤(11)的整个体系转移到透析袋在水中进行透析；

(13)完成步骤(12)后，收集透析袋内的整个体系，然后进行冷冻干燥，得到干粉，即为干粉状胶原材料；

所述产品的功能为治疗心肌损伤。

所述胶原材料的制备方法还包括如下步骤(14)：取步骤(13)得到的干粉状胶原材料，用溶剂溶解，得到凝胶状胶原材料。

步骤(1)中，所述水为去离子水。

步骤(2)中，含磷酸三丁酯的液体是将磷酸三丁酯和水混合得到的。步骤(2)中，磷酸三丁酯的浓度可为0.5g/100ml-1.5g/100ml，具体可为1g/100ml。步骤(2)中，浸泡的温度可为2℃-16℃，具体可为4℃。步骤(2)中，浸泡的时间可为18小时-72小时，具体可为48小时。

步骤(3)中，所述水为去离子水。步骤(3)中，浸泡温度可为2℃-16℃，具体可为4℃。步骤(3)中，浸泡并清洗可为“每5分钟-15分钟换水，共换水10次-20次”，具体可为“每10分钟换水，共换水15次，最后一次换水10分钟后完成本步骤”。

步骤(4)中，NaCl溶液是将NaCl溶于pH7.6、25mmol/L的Tris-HCl缓冲液得到的。步骤(4)中，NaCl的浓度可为1M-2M，具体可为1.5M。步骤(4)中，浸泡的温度可为2℃-16℃，具体可为4℃。步骤(4)中，浸泡的时间为10分钟-60分钟，具体可为40分钟。

步骤(5)中，所述水为去离子水。步骤(5)中，浸泡温度可为2℃-16℃，具体可为4℃。步骤(5)中，浸泡并清洗可为“每5分钟-15分钟换水，共换水8次-20次”，具体可为“每10分钟换水，共换水9次，最后一次换水10分钟后完成本步骤”。

步骤(6)中，表面活性剂溶液为表面活性剂水溶液。步骤(6)中，表面活性剂溶液中，表面活性剂的浓度可为1％-5％(体积比)，具体可为3％(体积比)。步骤(6)中，表面活性剂可为Tween-20、Tween-21、Tween-40、Tween-60、Tween-61、Tween-80、Tween-81、Tween-85、Triton-100、Triton-114等。步骤(6)中，浸泡的温度可为2℃-16℃，具体可为4℃。步骤(6)中，浸泡的时间为30分钟-120分钟，具体可为80分钟。

步骤(7)中，所述水为去离子水。步骤(7)中，浸泡温度可为2℃-16℃，具体可为4℃。步骤(7)中，浸泡并清洗可为“每15分钟-25分钟换水，共换水15次-25次”，具体可为“每20分钟换水，共换水19次，最后一次换水20分钟后完成本步骤”。

步骤(8)中，NaOH溶液为NaOH水溶液。步骤(8)中，NaOH溶液中，NaOH的浓度可为0.5M-4M，具体可为2M。步骤(8)中，浸泡的温度可为2℃-16℃，具体可为4℃。步骤(8)中，浸泡的时间为10分钟-60分钟，具体可为30分钟。

步骤(9)中，所述水为去离子水。步骤(9)中，浸泡温度可为2℃-16℃，具体可为4℃。步骤(9)中，浸泡并清洗可为“每3分钟-10分钟换水，共换水15次-25次”，具体可为“每5分钟换水，共换水19次，最后一次换水5分钟后完成本步骤”。

步骤(10)中，所述冷冻干燥的时间可为24小时-72小时，具体可为48小时。

步骤(11)中，所述醋酸溶液为醋酸水溶液。步骤(11)中，醋酸溶液为0.05M-1M醋酸溶液，具体可为0.5M醋酸溶液。步骤(11)中，干燥组织与醋酸溶液的配比为“1g-5g：100ml-500ml”，具体配比可为“1g-5g：150ml”或“3g：100ml-500ml”，具体配比可为“3g：150ml”。步骤(11)中，醋酸溶液为预冷的醋酸溶液。所述预冷的温度为2℃-16℃，具体可为4℃。步骤(11)中，溶于醋酸溶液的实现方式可为“2℃-16℃搅拌2小时-24小时”，具体可为“4℃搅拌12小时”。步骤(11)中，体系pH调至7。步骤(11)中，用NaOH水溶液调pH，具体用4M NaOH水溶液调pH。

步骤(12)中，所述透析袋的截留分子量为1000Da-100kDa，具体可为3000Da。步骤(12)中，所述水为去离子水。步骤(12)中，透析的时间可为3天-10天，具体可为7天。步骤(12)中，透析过程中每天换水，具体可每天换水3次。步骤(12)中，透析的温度为2℃-16℃，具体可为4℃。

步骤(13)中，所述冷冻干燥的时间可为24小时-72小时，具体可为48小时。

步骤(14)中，溶剂可为生理盐水或磷酸盐缓冲液。所述磷酸盐缓冲液可为pH7-8的磷酸盐缓冲液，具体可为pH7.4的PBS缓冲液。步骤(14)中，干粉状胶原材料与溶剂的配比可为“0.2-4g：100ml”，具体可为“3g：100ml”。

干细胞和干粉状胶原材料的配比可为“10³个细胞-10¹²个细胞：1mg-100mg胶原材料”，具体可为“10⁸个细胞：1mg-20mg胶原材料”，更具体可为“10⁸个细胞：15mg胶原材料”。

干细胞和凝胶状胶原材料的配比可为“10³个细胞-10¹²个细胞：100μl-1000μl胶原材料”，具体可为“10⁷个细胞-10⁹个细胞：400μl-600μl胶原材料”，更具体可为“10⁸个细胞：500μl胶原材料”。

所述产品的制备方法具体可为：将3体积份细胞悬液与1体积份凝胶状胶原材料混合，得到所述产品。所述细胞悬液是将干细胞用溶剂(例如生理盐水或PBS缓冲液)悬浮得到的。每2ml负载干细胞的胶原材料中，含有10⁷-10⁹个干细胞，具体含有10⁸个干细胞。

本发明还保护以上任一所述负载干细胞的胶原材料在制备产品中的应用；所述产品的功能为治疗心肌损伤。

以上任一所述干细胞可为间充质干细胞。所述间充质干细胞具体可为脐带间充质干细胞。以上任一所述间充质干细胞具体可为人间充质干细胞。以上任一所述脐带间充质干细胞具体可为第1代脐带间充质干细胞至第6代脐带间充质干细胞，更具体可为第3代脐带间充质干细胞。

本发明提供的负载干细胞的胶原材料可以注射至心肌损伤部位，胶原材料支架起到吸附干细胞的作用，有效限制干细胞扩散，促进细胞在损伤部位的定植，有助于重塑心肌再生微环境，促进动物心脏功能的恢复。本发明对于心肌损伤治疗具有重大的应用价值。

附图说明

图1为利用超声心动法检测射血分数的结果。

图2为利用核磁共振检测心梗面积的结果。

图3为免疫荧光染色的结果。

图4为血管平滑肌细胞染色的结果。

图5为细胞增殖蛋白染色的结果。

图6为心肌特异性蛋白染色的结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例中，冷冻干燥均采用0.1Mpa真空度。如无特殊说明，实施例中的PBS缓冲液均为pH7.4的PBS缓冲液。巴马小型猪：重量15-20kg，泰和生物科技有限公司。完全培养基：含2％(体积百分含量)胎牛血清、40％(体积百分含量)MCDB201培养基、10μg/L血小板衍生生长因子、10μg/L碱性成纤维细胞生长因子、10μg/L表皮生长因子，余量为DF12培养基。消化液：含1.25g/L胰蛋白酶、0.02g/100ml乙二胺四乙酸，溶剂为pH7.6的PBS缓冲液。血小板衍生生长因子(PDGF-BB)：Peprotech公司,货号100-14B。碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)：peprotech公司，货号100-18B。表皮生长因子(EGF)：peprotech公司，货号AF-100-15。

实施例1、胶原材料的制备

1、取牛筋膜组织，去除表面多余肌肉和脂肪。

2、取步骤1得到的组织，用去离子水充分清洗，然后置于含磷酸三丁酯的液体中4℃浸泡48小时(每12小时换液，即更换新的含磷酸三丁酯的液体)。

含磷酸三丁酯的液体是将磷酸三丁酯和水混合得到的。本实施例中，磷酸三丁酯的浓度为1g/100ml。实际应用中，磷酸三丁酯的浓度为0.5g/100ml-1.5g/100ml均可。

实际应用中，2℃-16℃均可。

实际应用中，浸泡时间为18小时-72小时均可。

3、取完成步骤2的组织，置于去离子水中4℃浸泡(每10分钟更换去离子水，共换水15次，最后一次换水10分钟后完成本步骤)。

实际应用中，2℃-16℃均可。

实际应用中，可每5分钟-15分钟更换去离子水，共换水10次-20次。

4、取完成步骤3的组织，置于NaCl溶液中4℃浸泡40分钟。

NaCl溶液是将NaCl溶于pH7.6、25mmol/L的Tris-HCl缓冲液得到的。本实施例中，NaCl的浓度为1.5M。实际应用中，NaCl的浓度为1M-2M均可。

实际应用中，2℃-16℃均可。

实际应用中，浸泡时间为10分钟-60分钟均可。

5、取完成步骤4的组织，置于去离子水中4℃浸泡(每10分钟更换去离子水，共换水9次，最后一次换水10分钟后完成本步骤)。

实际应用中，2℃-16℃均可。

实际应用中，可每5分钟-15分钟更换去离子水，共换水8次-20次。

6、取完成步骤5的组织，置于表面活性剂溶液中浸泡。

本实施例中，采用的表面活性剂溶液为3％(体积比)Tween-20水溶液，4℃浸泡80分钟。

实际应用中，所述表面活性剂溶液为表面活性剂水溶液。

实际应用中，所述表面活性剂溶液中，表面活性剂的浓度为1％-5％(体积比)。

实际应用中，所述表面活性剂可为Tween-20、Tween-21、Tween-40、Tween-60、Tween-61、Tween-80、Tween-81、Tween-85、Triton-100、Triton-114等。

实际应用中，2℃-16℃均可。

实际应用中，浸泡时间为30分钟-120分钟。

7、取完成步骤6的组织，置于去离子水中4℃浸泡(每20分钟更换去离子水，共换水19次，最后一次换水20分钟后完成本步骤)。

实际应用中，2℃-16℃均可。

实际应用中，可每15分钟-25分钟更换去离子水，共换水15次-25次。

8、取完成步骤7的组织，置于2M NaOH水溶液中4℃浸泡30分钟。

实际应用中，可采用0.5M-4M NaOH水溶液。

实际应用中，2℃-16℃均可。

实际应用中，浸泡时间为10分钟-60分钟均可。

9、取完成步骤8的组织，置于去离子水中4℃浸泡(每5分钟更换去离子水，共换水19次，最后一次换水5分钟后完成本步骤)。

实际应用中，2℃-16℃均可。

实际应用中，可每3分钟-10分钟更换去离子水，共换水15次-25次。

10、取完成步骤9的组织，进行48小时的冷冻干燥，得到干燥的组织。

实际应用中，冷冻干燥24小时-72小时均可。

11、称取3g步骤10得到的干燥的组织，溶于150ml 4℃预冷的0.5M醋酸水溶液中，4℃搅拌12小时。

实际应用中，可采用取1g-5g步骤10得到的干燥组织。

实际应用中，可采用100ml-500ml醋酸水溶液。

实际应用中，可采用0.05M-1M醋酸水溶液。

实际应用中，2℃-16℃预冷均可。

实际应用中，2℃-16℃搅拌2小时-24小时均可。

12、完成步骤11后，在体系中加入4M NaOH水溶液，调pH为7。

实际应用中，调pH为6-8均可。

13、将完成步骤12的整个体系转移到透析袋(透析袋截留分子量为3000Da)中，将透析袋放入去离子水中，4℃透析7天(每天更换去离子水3次)。

实际应用中，可采用截留分子量为1000Da-100kDa的透析袋。

实际应用中，2℃-16℃均可。

实际应用中，透析3天-10天均可。

14、完成步骤13后，收集透析袋内的整个体系，进行48小时的冷冻干燥，得到干粉，即为干粉状胶原材料。

实际应用中，冷冻干燥24-72小时均可。

15、取3g步骤14得到的干粉，用100ml生理盐水溶解，得到凝胶状胶原材料。

实际应用中，也可采用磷酸盐缓冲液代替生理盐水作为溶剂。

实际应用中，干粉和溶剂的配比为可：0.2-4g：100ml。

实施例2、人脐带间充质干细胞的制备

1、将离体的人脐带剪成2cm左右的小段，用DPBS缓冲液洗3遍，至无血液存在。

2、完成步骤1后，取脐带段，剔除3根血管(两根脐动脉，一根脐静脉)。

3、完成步骤2后，取脐带段，剪碎，得到约3-5mm³组织块。

4、取T25细胞培养瓶，用1mL完全培养基润湿。

5、取完成步骤4的细胞培养瓶，将步骤3得到的组织块贴于底壁，底壁朝上培养12小时，然后翻转回底壁朝下培养12小时，然后加入1ml完全培养基并培养24小时，然后加入1ml完全培养基并培养24小时。培养条件：37℃、体积分数为5％的CO₂、饱和湿度。

6、完成步骤5后，吸弃上清，更换新的完全培养基，以后每周更换2次新的完全培养基，直至达到70％-80％汇合度。培养条件：37℃、体积分数为5％的CO₂、饱和湿度。

7、完成步骤6后，加入消化液进行消化，然后用完全培养基悬浮细胞(该细胞即为原代脐带间充质干细胞)。

8、进行持续传代。原代脐带间充质干细胞传代得到第1代脐带间充质干细胞，第1代脐带间充质干细胞传代得到第2代脐带间充质干细胞，第2代脐带间充质干细胞传代得到第3代脐带间充质干细胞。

每次传代的方法均为：用消化液消化细胞，然后用完全培养基悬浮，然后接种至细胞培养瓶中，然后将培养瓶置于37℃、5％CO₂、饱和湿度的培养箱中静置培养，直至达到70％～80％汇合度。

实施例3、负载脐带间充质干细胞的胶原材料注射心肌损伤部位的效果

试验动物为巴马小型猪。

一、制备心肌梗死模型动物

给试验动物耳后肌肉注射阿托品(0.05mg/kg)和安定(0.05mg/kg)，待出现反应迟钝、行走不稳的表征后，将试验动物固定于手术台上，备皮，耳缘静脉注射普利麻(4mg/kg)和万可松(2mg/kg)并且耳后肌肉注射芬太尼(0.01mg/只)以诱导麻醉。连接监护仪电极，气管插管接麻醉机控制呼吸，吸入氧流量为0.4-0.6L/min，术中以2％氨氟醚吸入维持麻醉，根据麻醉深度调节流量。胸骨左缘第3-4肋间开胸暴露心脏，于左冠状动脉前降支远端1/3处以5-0缝线结扎冠状动脉，以心电图特征性改变为指标确定模型制备成功。然后正常缝合。

二、分组给药

步骤一术后2个月，取心肌梗死模型动物，分成三组，每组15只，分别处理如下：

细胞/胶原组：按照步骤一的方法进行麻醉和开胸，然后将负载脐带间充质干细胞的胶原材料注射到心肌梗死部位(2ml/只)；

细胞组：按照步骤一的方法进行麻醉和开胸，然后将细胞悬液注射到心肌梗死部位(2ml/只)；

生理盐水组：按照步骤一的方法进行麻醉和开胸，然后将生理盐水注射到心肌梗死部位(2ml/只)。

负载脐带间充质干细胞的胶原材料的制备方法：取实施例2得到的第3代脐带间充质干细胞，用生理盐水悬浮，得到细胞悬液；将3体积份细胞悬液与1体积份实施例1制备的凝胶状胶原材料混合，得到负载脐带间充质干细胞的胶原材料。每2ml负载脐带间充质干细胞的胶原材料中，含有10⁸个脐带间充质干细胞。

细胞悬液的制备方法：取实施例2得到的第3代脐带间充质干细胞，用生理盐水悬浮，得到细胞悬液。每2ml细胞悬液中，含有10⁸个脐带间充质干细胞。

分别于注射1个月后、3个月后、6个月后和12个月后，利用超声心动法检测射血分数。结果见图1。细胞组动物的射血分数显著高于生理盐水组，细胞/胶原组动物的射血分数显著高于细胞组。结果表明，负载脐带间充质干细胞的胶原材料注射到心梗动物的心肌损伤部位，可促进动物心脏功能恢复，且效果显著优于注射脐带间充质干细胞。

分别于注射1个月后、3个月后和12个月后，利用核磁共振检测心梗面积。结果见图2。细胞/胶原组动物的心梗面积极其显著的小于细胞组和生理盐水组。结果表明，载脐带间充质干细胞的胶原材料注射到心梗动物的心肌损伤部位，可减少动物心梗后瘢痕形成。

分别于注射1个月后、3个月后和12个月后，每组处死5只动物，取心脏组织，进行组织切片，然后进行免疫荧光染色和组织化学染色。

免疫荧光染色中，利用人核抗原抗体Anti-Human Nuclear Antigen antibody(AHNA,abcam公司抗体，货号ab220202)对人脐带间充质干细胞染色(绿色)，利用α-SMA抗体(abcam公司抗体，货号ab5694)对血管染色(红色)。结果见图3。结果表明，负载脐带间充质干细胞的胶原材料注射到心梗动物心肌损伤部位，胶原材料可促进脐带间充质干细胞在损伤部位的定植及存活。

组织化学染色中，分别利用α-SMA抗体(abcam公司，货号ab5694)对血管平滑肌细胞染色，利用Ki67抗体(abcam公司，货号ab15580)对细胞增殖蛋白进行染色，利用cTnT抗体(abcam公司，货号ab10214)对心肌特异性蛋白进行染色。血管平滑肌细胞染色的结果见图4。细胞增殖蛋白染色的结果见图5。心肌特异性蛋白染色的结果见图6。结果表明，细胞/胶原组动物在梗死边缘区的血管数目、增殖细胞数目及心肌细胞数目明显多于细胞组和生理盐水组。结果表明，载脐带间充质干细胞的胶原材料注射到心梗动物的心肌损伤部位，可促进动物心梗后心肌组织再生。