Os350蛋白及其编码基因在调控植物育性中的应用

摘要

本发明公开了Os350蛋白及其编码基因在调控植物育性中的应用。本发明提供了Os350蛋白或其相关生物材料在调控植物育性中的应用；所述Os350蛋白为SEQ ID No.1或将SEQ ID No.1经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或与其具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质或为在其N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。本发明实验证明Os350基因可以调控植物的育性，在农业生产中的育种、产种过程中获得雄性不育系，特别是具有创造人工可控制雄性不育以及创造转基因生物安全的受体材料上具有重要的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及Os350蛋白及其编码基因在调控植物育性中的应用。

背景技术

植物雄配子体花粉的形成包括小孢子的发生和雄配子的形成两个过程。小孢子的发生这一过程都在幼小的花药中进行，包括小孢子母细胞的形成，减数分裂过程以及四分体的分散过程。雄配子体即花粉粒是小孢子经过两次有丝分裂形成的，其中包含被称作雄配子的精细胞。在花粉发育的这一系列过程中涉及到众多相关基因，只有它们按照一定的时空顺序正常表达，才能保证可育花粉的形成。

我国的雄性不育研究和利用在国际上处于领先地位。近年来应用现代细胞生物学技术、遗传学和分子生物学手段对模式植物水稻和拟南芥的雄性不育过程做了深入的研究，取得了一些新的研究结果，如：拟南芥中的Ems1、CER1、AtGSL2基因和水稻UDT1、MSP1、GAMYB、UDPG、WDA1基因等，上述基因的突变直接导致了植株的育性降低，有的完全不育。Ems1编码一个受体激酶基因，该基因主要参与花粉母细胞、绒毡层的发育；UDT1基因是小孢子发育的关键基因，该基因主要作用于减数分裂时期，它对于绒毡层细胞的发育、小孢子母细胞的减数分裂以及中层的降解起作用；GAMYB基因对于小孢子母细胞紧贴绒毡层细胞吸收营养进而进行正常的减数分裂是必需的；WDA1基因对于水稻花粉壁蜡质层形成是必需的。对它们的研究加深了对植物雄性不育机理的理解。

发明内容

本发明的目的是提供Os350蛋白及其编码基因在调控植物育性中的应用。

第一方面，本发明要求保护Os350蛋白或其相关生物材料在调控植物育性中的应用。

所述Os350蛋白可为如下任一所示蛋白质：

(A1)氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；

(A2)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

(A3)与(A1)-(A2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；

(A4)在(A1)-(A3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。

所述相关生物材料可为如下(B1)-(B3)中任一：

(B1)编码所述Os350蛋白的核酸分子；

(B2)含有步骤(B1)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系；

(B3)能够抑制所述Os350蛋白表达的生物材料。

第二方面，本发明要求保护Os350蛋白或其相关生物材料在如下任一中的应用：

(a1)调控植物结实率；

(a2)调控植物花粉发育；

(a3)调控植物药室发育。

所Os350蛋白为前文(A1)-(A4)中任一所示蛋白质。所述相关生物材料为前文(B1)-(B3)中任一所示。

在第一方面中，所述调控植物育性可体现为：所述Os350蛋白的表达量和/或活性改变，影响所述植物的育性。

在第二方面中，所述调控植物结实率可体现为：所述Os350蛋白的表达量和/或活性改变，影响所述植物的结实率。所述调控植物花粉发育可体现为：所述Os350蛋白的表达量和/或活性改变，影响所述植物的花粉发育。所述调控植物药室发育可体现为：所述Os350蛋白的表达量和/或活性改变，影响所述植物的药室发育。

进一步地，在本发明的具体实施例中，所述调控植物育性具体体现为：所述Os350蛋白或其编码基因在所述植物中的活性和/或表达量降低，植物的育性降低；所述调控植物结实率具体体现为：所述Os350蛋白或其编码基因在所述植物中的活性和/或表达量降低，所述植物的结实率降低；所述调控植物花粉发育具体体现为：所述Os350蛋白或其编码基因在所述植物中的活性和/或表达量降低，抑制所述植物的花粉发育；所述调控植物药室发育具体体现为：所述Os350蛋白或其编码基因在所述植物中的活性和/或表达量降低，抑制所述植物的药室发育。

在第一方面和第二方面中，所述(B3)中，能够抑制所述Os350蛋白表达的生物材料可为如下任一：

(C1)针对编码所述Os350蛋白的基因组DNA序列的基因编辑工具；

所述基因编辑工具为序列特异核酸酶，所述序列特异核酸酶能够特异性剪切编码所述Os350蛋白的基因组DNA序列中的靶标序列；

(C2)编码所述基因编辑工具的核酸分子；

(C3)含有步骤(C3)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系。

第三方面，本发明要求保护一种培育具有如下(D1)-(D4)任一所示性状的植物品种的方法：

(D1)育性降低或者不育；

(D2)结实率降低；

(D3)花粉发育受到抑制；

(D4)药室发育受到抑制。

本发明所提供的培育具有如上(D1)-(D4)任一所示性状的植物品种的方法，包括使受体植物中Os350蛋白的表达量和/或活性降低的步骤。所Os350蛋白为前文(A1)-(A4)中任一所示蛋白质。

进一步地，本发明提供了一种培育如下(D1)-(D4)任一所示性状的转基因植物的方法，包括如下步骤：对受体植物中Os350蛋白的编码基因进行抑制表达，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比具有如下(D1)-(D4)任一所示性状；

(D1)育性降低或者不育；

(D2)结实率降低；

(D3)花粉发育受到抑制；

(D4)药室发育受到抑制。

所Os350蛋白为前文(A1)-(A4)中任一所示蛋白质。

在所述方法中，所述对受体植物中Os350蛋白的编码基因进行抑制表达是通过如下实现的：采用针对编码所述Os350蛋白的基因组DNA序列的基因编辑工具对所述受体植物中的所述Os350蛋白的基因组DNA序列进行基因编辑，使得所述受体植物中的所述Os350蛋白在翻译过程中提前终止，翻译不出有功能的全长蛋白；所述基因编辑工具为序列特异核酸酶，所述序列特异核酸酶能够特异性剪切所述Os350蛋白的基因组DNA序列中的靶标片段。

在上述各方面中，所述序列特异核酸酶均可为CRISPR/Cas9核酸酶、转录激活因子样效应因子核酸酶(transcription activator-like effector nucleases,TALEN)或锌指核酸酶(Zinc-finger nucleases,ZFN)。

所述序列特异核酸酶对所述靶标片段进行特异性剪切会造成所述靶标片段发生插入突变、缺失突变和/或替换突变，从而使所述受体植物中的所述Os350蛋白在翻译过程中提前终止，翻译不出有功能的全长蛋白。

进一步地，在本发明的具体实施例中，所述序列特异核酸酶为CRISPR/Cas9核酸酶；所述靶标片段为所述Os350蛋白的基因组DNA序列中符合5’-N_X-NGG-3’或5’-CCN-N_X-3’序列排列规则的片段；N表示A、G、C和T中的任一种，14≤X≤30，且X为整数，N_X表示X个连续的脱氧核糖核苷酸。

更进一步地，所述靶标片段的核苷酸序列为SEQ ID No.3。

在上述各方面中，所述“编码所述Os350蛋白的核酸分子”可为所述Os350蛋白的编码基因。

进一步地，所述Os350蛋白的编码基因可为如下任一所述的DNA分子：

(B1)SEQ ID No.2所示的DNA分子；

(B2)在严格条件下与(B1)限定的DNA分子杂交且编码所述Os350蛋白的DNA分子；

(B3)与(B1)或(B2)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码所述Os350蛋白的DNA分子。

所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

在上述各方面中，所述植物可为单子叶植物。进一步地，所述单子叶植物可为禾本科植物。更进一步地，所述禾本科植物具体可为水稻。

在本发明中，所述不育为雄性不育。

本发明利用CRISPR/Cas9技术突变了水稻体内Os350基因的序列，得到水稻os350蛋白提前终止纯合突变体，通过实验证明：水稻350CRISPR纯合突变体(Os350)突变体雄蕊成熟花粉数目降低，说明Os350基因可以调控植物的育性，在农业生产中的育种、产种过程中获得雄性不育系，特别是具有创造人工可控制雄性不育以及创造转基因生物安全的受体材料上具有重要的应用前景。

附图说明

图1为Os350的基因结构及CRISPR突变位置示意图。

图2为350CRISPR纯合突变体构建的CRISPR/Cas9载体图谱。

图3为350CRISPR纯合突变体设计突变位点测序结果峰图。

图4为350CRISPR纯合突变体突变后氨基酸序列和野生型水稻植株(WT)氨基酸序列对比。

图5为350CRISPR纯合突变体(Os350)和野生型水稻植株(WT)的形态图。

图6为350CRISPR纯合突变体(Os350)和野生型水稻植株(WT)的育性统计。

图7为I-KI染色法观察350CRISPR纯合突变体(Os350)和野生型水稻植株(WT)的雄蕊育性。A为野生型与350CRISPR纯合突变体(Os350)结种后穗子比较(Bar＝10cm)；B为野生型体视镜下解剖的小花结构及花粉的I2-KI染色(Bar＝500μm)；C为野生型花药；D为350CRISPR纯合突变体(Os350)的解剖小花和花粉的I2-KI染色(Bar＝500μm)；E为350CRISPR纯合突变体(Os350)的花药。

图8为350CRISPR纯合突变体(Os350)和野生型水稻植株(WT)的雄蕊形态比较。A为350CRISPR纯合突变体(Os350)花药(Bar＝500μm)；B为350CRISPR纯合突变体(Os350)的雄蕊半薄切片图(Bar＝100μm)；C为野生型的花药(Bar＝500μm)；D为野生型的花药半薄切片图(Bar＝100μm)。

具体实施方式：

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、Os350基因突变体水稻的获得及鉴定

本发明所涉及的Os350基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

一、Os350基因突变体水稻的获得

Os350突变体为通过CRISPR-Cas9基因编辑技术进行基因编辑获得。设计靶点和基因结构示意图如图1。

在水稻基因组中根据Os350基因序列设计sgRNA序列，如下：

5’-CCCTTGTCATTATGTTATCTCTT-3’(SEQ>

1、CRISPR/Cas9质粒载体的构建

首先用玉米的组成型启动子ubiquitin启动子(UBI)连接hSpCas9(Cong,L.,Ran,F.A.,Cox,D.,Lin,S.,Barretto,R.,Habib,N.,Hsu,P.D.,Wu,X.,Jiang,W.,Marraffini,L.A.,et al.(2013).Multiplex genome engineering using CRISPR/Cassystems.Science 339,819-823.)序列到中间载体，然后把这整个表达单位插入到包含有HPT(hygromycin B phosphotransferase)基因的双元表达载体pCAMBIA1300中。利用点突变试剂盒(全式金，产品目录号FM111-02)把pCAMBIA1300背景骨架中的BsaI位点去除掉。由一个OsU6启动子(Feng,Z.,Zhang,B.,Ding,W.,Liu,X.,Yang,D.L.,Wei,P.,Cao,F.,Zhu,S.,Zhang,F.,Mao,Y.,et al.(2013).Efficient genome editing in plants using aCRISPR/Cas system.Cell research 23,1229-1232.)，一个两端酶切位点为2个BsaI位点的负选择标记基因ccdB和一个来源于pX260(Cong,L.,Ran,F.A.,Cox,D.,Lin,S.,Barretto,R.,Habib,N.,Hsu,P.D.,Wu,X.,Jiang,W.,Marraffini,L.A.,et al.(2013).Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.Science 339,819-823.)的sgRNA所组成的片段利用IN-Fusion克隆试剂盒(Takara，产品目录号No.639636)插入到载体中，最终形成CRISPR/Cas9质粒载体pBGK032(图2)。

选择目的基因Os350基因序列形成23-bp的靶点序列(包括PAM)，靶点序列的特异性利用水稻基因组blast比对(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)(Hsu,P.D.,Scott,D.A.,Weinstein,J.A.,Ran,F.A.,Konermann,S.,Agarwala,V.,Li,Y.,Fine,E.J.,Wu,X.,Shalem,O.,et al.(2013).DNA targeting specificity of RNA-guidedCas9nucleases.Nature biotechnology 31,827-832.)进行反复确认。合成设计的靶点序列并且退火从而形成oligo adaptors(即SEQ ID No.3)。

质粒pBGK032用BsaI内切酶进行酶切进行线性化，并用DNA纯化回收试剂盒(天根，产品目录号DP214-03)回收，用10ng线性化的质粒pBGK032和0.05mM的oligo adaptors(即SEQ ID No.3)进行10μl反应体系的T4连接酶连接反应。然后把连接产物转化到E.coli感受态产生Os350基因靶点的CRISPR/Cas9质粒。

2、植物转化

Os350基因靶点的CRISPR/Cas9质粒被诱导转化到农杆菌EHA105。水稻的农杆菌转化由杭州百格生物技术有限公司进行，方法为2006年Nishimura实验室的方法(Nishimura,A.,Aichi,I.,and Matsuoka,M.(2006).A protocol for Agrobacterium-mediatedtransformation in rice.Nature protocols 1,2796-2802.)。

经过测序表明：本发明构建得到了350CRISPR纯合突变体(Os350)，其与野生型水稻(中花11)对比，在该基因的第2个外显子上出现4个bp(ATGT)缺失突变(图3)。

二、Os350基因突变体水稻鉴定

1、PCR扩增

以野生型水稻(中花11)植株和350CRISPR纯合突变体(Os350)水稻植株的基因组DNA为模板，分别在CRISPR目标编辑序列上下游200bp左右设计引物进行PCR扩增，分别得到PCR扩增产物。引物序列如下：

Os350-F：5’-GCCCCTAGACAGGTGGGTA-3’；

Os350-R：5’-TGCTGTTTGGTAGCTTGCAC-3’。

PCR反应体系(50μl)：2×KOD Mix 10μl、基因组DNA 2μl、10μM上游引物1μl、10μM下游引物1μl、KODase 1μl、ddH₂O补足20μl。

PCR反应条件：95℃5min；94℃30s，58℃30s，68℃40s，24个循环；68℃10min。

2、Os350基因测序

对步骤1中PCR扩增所得产物进行测序验证，检测结果如图3所示，从图3中可以看出，测序峰图在设计的21个bpCRSIPR/Cas9靶点位置350CRISPR纯合突变体(Os350)比野生型(WT)缺失了ATGT 4个bp的序列，突变形成的蛋白序列如图4所示，最终无完整的Os350蛋白。

实施例2、Os350基因突变体株系的表型鉴定

对实施例1中的经PCR鉴定的350CRISPR纯合突变体(Os350)和野生型水稻植株(中花11)的表型进行鉴定。每个株系取10株进行鉴定。具体步骤如下：

一、结实率检测

纯合350CRISPR纯合突变体(Os350)在营养生长阶段与野生型不存在差异，植株株高和分蘖数并没有变化(图5)。但在生殖生长阶段，野生型水稻植株每个小穗正常结实，结实率达90％；而350CRISPR纯合突变体(Os350)的开花时间正常，但最终每个小穗的结实率极低，只有15％左右最终形成种子(图6)。

二、雄蕊的染色观察

用I₂-KI对纯合350CRISPR纯合突变体(Os350)和野生型水稻植株(WT)花粉进行染色，并观察花粉形态。I-KI染色方法如下：1、配I₂-KI染液：0.5g>2-KI溶液，快速捣碎花药释花粉，显微镜下观察花粉并拍照。

染色结果如图7所示，从图7中可以看出，野生型水稻的成熟花粉由于充满淀粉和其它代谢物，容易被染成深色，花粉呈圆形；而350CRISPR纯合突变体(Os350)中88％花粉不能被染成深色，花粉形态不规则、干瘪、发育不正常，说明350CRISPR纯合突变体(Os350)的花粉发育受到影响。

三、雄蕊的半薄切片观察

对纯合350CRISPR纯合突变体(Os350)和野生型水稻植株(WT)的雄蕊进行半薄观察。具体如下：取水稻花序分解成小花投入FAA固定液中，充分抽气，4℃固定过夜。按照50％-70％-80％-90％-100％乙醇梯度进行脱水，每个梯度30min。加入1:1混匀的无水乙醇和LR White树脂渗透过夜；然后加入纯LR White树脂渗透过夜。用八联排，厌氧包埋纯树脂，投入摆正材料，盖上盖子65℃聚合24h。聚合后，取出包埋块，用双面和单面刀片修块，用Leica半薄切片机进行4um厚切片，用尖镊子取下切片，放在有水滴的载玻片上，90摄氏度烤片台烤片。烤干厚滴上1％的甲苯胺蓝，5-10s后用清水冲洗，烤干。随后可进行显微镜下观察拍照。

结果如图8所示，从图8中可以看出，野生型花药的远轴侧药室体积较近轴侧偏大，4个药室都呈饱满的圆柱体状结构；350CRISPR纯合突变体(Os350)花药的远轴侧药室也是圆柱立体状，但并不像野生型饱满，近轴侧2个药室发育状态明显不如野生型，明显收缩，呈薄状组织结构，推测是药室发育停滞所导致。半薄切片结果更清楚地说明350CRISPR纯合突变体(Os350)具有不正常发育的近轴侧药室，从而导致花粉育性下降。

实验同时以转入pBGK032空载体的转基因水稻作为空载体对照。结果显示，空载体对照株系的结实率检测、雄蕊的染色观察和雄蕊的半薄切片观察结果均为未转基因的野生型对照水稻基本一致，无统计学差异。

<110> 北京大学

<120> Os350蛋白及其编码基因在调控植物育性中的应用

<130> GNCLN190555

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 113

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 1

Met Ala Ala Met Ala Leu Arg Ser Leu Val Arg Lys Val Met Pro Val

1 5 1015

Pro Ala Ala Leu Arg Arg Ala Pro Pro Ser Ser Arg Ser Leu His His

202530

Leu Glu Asp Lys Leu Arg Gly Thr Thr Ser Pro Lys Thr Thr Ala Pro

354045

Pro Gly Asn Gly Arg Gly Ser Tyr Phe Lys Asp Asn His Pro Thr Phe

505560

Ala Glu Leu Val Gln Arg Asp Thr Asp Arg Arg Ser Phe Asn Arg Met

65707580

Leu Val Ala Gly Ala Ala Ser Gly Tyr Ala Val Ala Leu Val Ile Met

859095

Leu Ser Leu Arg Arg Ser Val Lys Glu Asp Leu Arg Asn Asn Ile Tyr

100 105 110

Asp

<210> 2

<211> 342

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 2

atggcggcta tggcgctgcg ctctctcgtg aggaaggtca tgcccgtccc ggctgctctc 60

cgccgggcgc cgccgtcatc gcgctccctc caccacctcg aggataagct gcgtggcacg 120

acatctccca agactacagc tcctcctggc aatggcaggg gcagctattt caaagacaat 180

catccgactt ttgctgaatt ggttcaacga gatacagatc ggaggagctt caacaggatg 240

ttggtggcag gtgctgcttc aggctatgct gttgcccttg tcattatgtt atctcttcgc 300

cgtagtgtga aggaagatct tcgcaataac atctacgact ag 342

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

cccttgtcat tatgttatct ctt 23