代谢生物标志物在急性胰腺炎中的应用

摘要

本发明公开了代谢生物标志物在急性胰腺炎中的应用。本发明通过收集正常与急性胰腺炎，以及药物治疗急性胰腺炎的样本，进行代谢组学分析，发现在不同治组中呈现显著性差异的代谢物，从而利用该代谢物预测急性胰腺炎，进而实现患者的个性化治疗。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及代谢生物标志物在急性胰腺炎中的应用。

背景技术

急性胰腺炎(Acute pancreatitis，AP)是指多种病因引起的胰酶激活，继以胰腺局部炎症反应为主要特征，病情较重者可发生全身炎症反应综合征(SIRS)，并可伴有器官功能障碍的疾病。其为临床常见的急腹症之一，近年来发病率呈增加的趋势，总体致死率为5％-10％。其常规治疗方法为禁食、胃肠减压、抑制胰液分泌、抗炎、对症支持治疗。目前国内外治疗AP的西药主要有以下几类：生长抑素及类似物(奥曲肽、施他宁等)、胰酶抑制剂(加贝酯、抑肽酶、乌司他丁等)、改善微循环药物(前列腺素E1制剂、血小板活化因子受体拮抗剂等)、抗生素、其他药物(氟尿嘧啶、钙离子拮抗剂)。但是在药物的使用上目前仍存在着各种争议，例如在抗生素的使用上Dellinger等(Dellinger EP,Tellado JM,Soto NE,Ashley SW,Barie PS,Dugernier T,et al.Early antibiotic treatment for severeacute necrotizing pancreatitis:a randomized,double-blind,placebo-controlledstudy.Ann Surg 2007,245:674-683.)不主张使用预防性抗生素，而DambrauskasZ等(Dambrauskas Z,Gulbinas A,Pundzius J,Barauskas G.Meta-analysis ofprophylactic parenteral antibiotic use in acute necrotizingpancreatitis.Medicina(Kaunas)2007,43:291-300.)认为AP患者预防性使用碳青霉烯类抗生素能够降低胰腺感染性坏死发生率和败血症发生率。在抑肽酶的使用上SetaT等(SetaT,Noguchi Y,Shimada T,Shikata S,Fukui T.Treatment of acute pancreatitis withprotease inhibitors:a meta-analysis.Eur J Gastroenterol Hepatol 2004,16:1287-1293.)认为抑肽酶可以有效的降低AP患者的死亡率，而Smith等(Smith M,Kocher HM,HuntBJ.Aprotinin in severe acute pancreatitis.Int J Clin Pract 2010,64:84-92.)研究认为近年来关于抑肽酶的研究设计都不合理。不过毋庸置疑的是西药都会存在着或多或少的不良反应，在临床治疗中需要监测病人的用药反应。

在我国，中药治疗AP具有良好的基础和历史，具有毒副作用少，多靶点等优势。近年来，中药研究进展飞速，不仅为医药产业提供了巨大的新药创制资源，更成为未来多靶点药物研发的源泉，弥补了西药治疗位点单一的不足。目前，指纹图谱技术和质谱色谱技术的应用，促进了中药有效成分的发现与鉴定，然而尚有许多中医药理论因缺少现代自然科学的支撑和验证，难以被社会所接受。

代谢组学(metabonomics)是研究生物体系受刺激或扰动后其代谢产物一内源性代谢物质种类、数量及其变化规律的科学。生命机体在病证状态和各类药物作用下，亦同样会引起全身水平的内源性代谢物及代谢网络变化。运用代谢组学技术考察和分析这些代谢物的变化，对于探究病证本质，阐明药物作用机理有极大的助益。

发明内容

为了弥补现有诊治技术的不足，本发明的目的在于提供一种与急性胰腺炎相关的代谢生物标志物，通过检测该代谢生物标志物的水平，可以判断患者是否患有急性胰腺炎，以及采用药物治疗后，急性胰腺炎是否有所好转，从而为急性胰腺炎的个性化诊治提供指导。

本发明提供了地榆酸双内酯在制备诊断急性胰腺炎的产品中的应用。

进一步，所述产品包括通过色谱、光谱或质谱仪/光谱法进行检测代谢物含量的试剂。

进一步，所述色谱包括GC，CE,LC,HPLC和UHPLC；光谱包括UV/Vis，IR，NIR和NMR；质谱仪/光谱法包括ESI、四极质谱仪、离子阱质谱仪、TOF(飞行时间)质谱仪、Orbitrap质谱仪、扇形磁场质谱仪、扇形静电场质谱仪、离子回旋共振(ICR)以及它们的组合，包括单级四极杆(Q)和三级四极杆((QqQ)，QqTOF，TOF-TOF，Q-Orbitrap，APCI-QqQ，APCI-QqTOF，MALDI-QqQ，MALDI-QqTOF和MALDI-TOF-TOF。

本发明提供了地榆酸双内酯在制备预测药物治疗急性胰腺炎的治疗应答产品中的应用。

进一步，所述产品包括检测地榆酸双内酯含量的试剂。

本发明提供了地榆酸双内酯在构建预测急性胰腺炎患者使用药物治疗急性胰腺炎的治疗应答计算模型中的应用。

本发明提供了地榆酸双内酯在筛选治疗急性胰腺炎的候选药物中的应用。

本发明提供了一种筛选治疗急性胰腺炎的候选药物的方法，若待筛选物质可以显著增加地榆酸双内酯的水平，则该待筛选物质是治疗急性胰腺炎的候选药物。

本发明提供了一种治疗急性胰腺炎的联合用药物，所述联合用药物为大黄酸与和厚朴酚。

进一步，所述联合用药物还包括药学上可接受的载体。

本发明提供了上面所述的联合用药物在制备治疗胰腺炎的药物组合物中的应用。

本发明的优点和有益效果：

本发明首次发现了与急性胰腺炎相关的代谢物-地榆酸双内酯，通过检测地榆酸双内酯的水平，可以判断受试者是否患有急性胰腺炎。

本发明首次发现了药物治疗可以改变代谢物-地榆酸双内酯的水平，通过检测地榆酸双内酯的水平，可以判断受试者对药物的治疗应答反应。

本发明提供了一种筛选治疗急性胰腺炎候选药物的方法，通过检测地榆酸双内酯的水平，判断待筛选物是否是治疗胰腺炎的候选药物。

附图说明

图1是小鼠血清淀粉酶含量图。

图2是小鼠胰腺组织图。

图3是小鼠胰腺组织病理改变图。

图4是QC样本正负离子(ES+/-)模式BPI和TIC图，其中，图A是正离子(ES+)模式BPI图，图B是正离子(ES+)模式TIC图，图C是负离子(ES-)模式BPI图，图D是负离子(ES-)模式TIC图。

图5是OPLS-DA分析图。

图6是代谢物差异表达图。

具体实施方式

为了评估代谢物与急性胰腺炎之间的相关性，本发明通过收集正常与急性胰腺炎，以及药物治疗急性胰腺炎的样本，综合分析样品的代谢组学，首次发现了与急性胰腺炎相关的代谢物地榆酸双内酯，将代谢物与胰腺炎信息整合，从而实现急性胰腺炎患者的个性化诊治。

本文使用的术语“代谢生物标志物”或短的“生物标志物”被定义为适合作为急性胰腺炎存在和状态的指标化合物，这种化合物是哺乳动物体内的代谢过程中出现的代谢物或代谢化合物。术语“生物标志物”和“代谢生物标志物”通常在本发明的上下文中同义使用，并且通常是指一种代谢物的量或两种或更多种代谢物的含量或比率。因此，术语“代谢生物标志物”或“生物标志物”也包括两种或更多种代谢物之间的含量或比率。

地榆酸双内酯，化合物ID为HMDB29274，分子式为C₂₁H₁₀O₁₃，在胰腺炎样本中的含量下降，使用药物治疗后，该化合物的水平显著上调，且与正常对照无显著差异。

生物样本取自哺乳动物，优选为小鼠，大鼠，豚鼠，狗，小型猪或人，最优选为人。任何含有目标代谢物的生物样品在本文中是有用的。实例包括，但不限于，血液(血清/血浆)、脑脊髓液(CSF)、尿液、粪便、呼气、唾液或任何组织的活检样品。

对于测定生物样品中代谢物浓度，使用定量分析方法，例如色谱法、光谱法和质谱法，而质谱法是特别优选的。色谱可以包括GC，LC，HPLC和UHPLC；光谱可包括UV/Vis，IR和NMR；质谱分析器/光谱可以包括ESI-QqQ，ESI-QqTOF，MALDI-QqQ，MALDI-QqTOF和MALDI-TOF-TOF。更优选地，质量分析器/光谱分析包括四极杆质量分析器，离子阱质谱分析器，TOF(飞行时间)质量分析器、轨道阱质量分析器、磁式扇形质量分析器、静电场扇形质量分析器(Electrostatic Sector Mass Analyzer)、离子回旋共振(ICR)以及质量分析器的组合(包括单四极杆(Q)和三重四极杆(QqQ)，QqTOF，TOF-TOF，Q轨道阱)。优选是使用FLA-和HPLC-串联质谱法。

其中，GC＝气相色谱，CE＝毛细管电泳，LC＝液相色谱，HPLC＝高度液相色谱，UHPLC＝超高效液相色谱，UV-Vis＝紫外可见，IR＝红外，NIR＝近红外，NMR＝核磁共振，ESI＝电子喷雾电离，MALDI＝基质辅助激光解吸/电离，TOF＝飞行时间，APCI＝大气压化学电离，QqQ＝三重四极杆配置(也称为Qlq2Q3(Q1和Q3四极杆是质量过滤器，q2是无质量分辨四极杆(no mass-resolving quadrupole)))。

尽管使用一种代谢物对于诊断急性胰腺炎疾病就足够了，但使用一种或多种，两种或多种，三种或多种，或四种或多种这样的代谢物包括在本发明内，并且在许多情况中，这是优选的。可以分析代谢物，并且以任意组合用于诊断。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。

实施例1中药对急性胰腺炎的治疗

1、实验材料

1.1实验主要材料

表1使用材料清单

1.2实验主要器材

手术器械：无菌显微弯镊2把，眼科剪2把，持针钳1把，手术刀1把。

其他：干棉球，医用棉签，缝合线，手术灯，手术板，固定橡皮筋，酒精棉，无菌纱布，无菌培养皿，生理盐水，10mL注射器，1mL注射器，4号缝合针。

2、实验方法

2.1动物分组

30只SPF级C57BL/6小鼠，雄性，8周龄，20g左右，适应性饲养1周后随机分为五组，每组6只，分组情况如表2所示：

表2小鼠分组情况

2.2药物配制

表3药物配制

2.3动物模型构建及药物处理

实验小鼠制模前禁食12h，不禁水。对照组注射等体积生理盐水，其余各组接受7次腹腔注射雨蛙肽(50μg/kg，每次间隔1h)，最后一次注射完后，腹腔注射30mg/kg剂量的LPS，制备AP模型。大黄酸治疗组、和厚朴酚治疗组、大黄酸+和厚朴酚治疗组于首次注射雨蛙肽后1h、5h、9h分别尾静脉注射0.2％大黄酸4mg/kg，腹腔注射和厚朴酚5mg/kg。

2.4血清和胰腺的收集

模型构建完成后，即首次注射雨蛙肽7h后，小鼠眼眶采血。于首次腹腔注射雨蛙肽12h后在无菌状态下进行小鼠眼球取血，全血室温放置2h或4℃过夜后，6000r/min，离心5min，收集血清，-80℃保存备用。同时取胰腺组织，拍照，在同样的位置将胰腺组织分为2份，1份用福尔马林溶液固定，1份直接液氮速冻后放-80℃冻存备用。

2.5血清淀粉酶的检测

采用上海酶联生物科技有限公司的小鼠淀粉酶(AMS)试剂盒(ELISA)检测血清淀粉酶含量。

1)从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条。

2)加样：每孔各加入标准品或待测样品50μL，加酶标抗体工作液50μL。将反应板充分混匀后置37℃恒温箱温育60min。

3)洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干。

4)每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

5)每孔加入50μL终止液，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

6)以标准品为横坐标，OD值为纵坐标，画出标准曲线。根据样品OD值在该曲线图上查出相应样本中待测因子蛋白含量。

2.6胰腺组织的HE染色

1)石蜡切片制作

①切片：包埋后的组织块经修整后，用切片机切成5μm的石蜡带。

②贴片：将组织石蜡块在50℃温水中展片，然后用处理干净的载玻片捞片，组织带可黏在载玻片上。

③烤片：60℃恒温箱内烤片2h。

2)脱蜡和水化

①60℃恒温箱中烘烤20min。

②二甲苯中浸泡10min，更换二甲苯后再浸泡10min；

③无水乙醇中浸泡5min；

④95％乙醇中浸泡5min；

⑤70％乙醇中浸泡5min；

⑥50％乙醇中浸泡5min；

⑦纯水中浸泡5min；

3)苏木素染色5min；盐酸乙醇分化5s；

4)自来水返蓝15min。

5)伊红染色5min。

6)95％乙醇快速清洗2次。

7)无水乙醇2min快速脱水，二甲苯透明5min*3。

8)树胶封片，镜检拍照。

3、实验结果

3.1小鼠血清淀粉酶含量

7h，12h小鼠血清淀粉酶含量如图1所示(*：与对照组相比，p<0.05，**：与对照组相比，p<0.01，#：与模型组相比，p<0.05，##：与模型组相比，p<0.01)，首次腹腔注射雨蛙肽7h后，测得胰腺炎小鼠模型中血清淀粉酶含量显著高于空白对照组和给药治疗组，说明小鼠胰腺炎模型构建成功，而大黄酸和厚朴酚力联合用药组的效果显著优于单独用药的效果。

3.2小鼠胰腺组织图片

首次注射雨蛙肽12h后，取胰腺组织拍照，结果如图2所示，相较空白对照组，模型组动物的胰腺组织有明显的水肿，大黄酸+和厚朴酚联合用药比单独使用这两种药物效果好，能够缓解胰腺炎模型小鼠的胰腺组织水肿现象。

3.3HE染色结果

HE染色结果如图3所示，与空白对照组相比，胰腺炎模型组的细胞间间隙较大，且细胞核较多，说明炎症模型会导致巨噬细胞等聚集在炎症周围。大黄酸治疗组、和厚朴酚治疗组相对胰腺炎模型组，细胞间间隙有所减小，细胞核数目也减少了。大黄酸+和厚朴酚联合用药组相对胰腺炎模型组，能明显减少细胞核的数目，细胞间间隙也有所减小，说明联合用药能够缓解胰腺炎炎症。

实施例2筛选与影响急性胰腺炎的相关的代谢物

1、样本的收集

本实验收集实施例中空白对照组、模型组以及大黄酸+和厚朴酚联合治疗组的小鼠组织样本各10例。

2、实验信息

2.1仪器及试剂

表4试剂

表5仪器

2.2实验方法

2.2.1代谢物提取

1)取100mg组织，加入500μL的裂解液(MeOH：H₂O＝1:1)；

2)在组织破碎仪中打碎，6,500MHz，1min，振荡3次；

3)涡旋混匀后，在-20℃冰箱中放置过夜；

4)离心：4℃，13,000rpm，20min；

5)取相同体积上清液冻干；

6)加入100μL裂解液复溶，超声5min；

7)离心：4℃，13,000rpm，20min；

8)取上清液上机。

2.2.2仪器参数

1)液相条件

柱温(℃):45

样品温度(℃):4

液相流速:0.35ml/min

A相:水+0.1％甲酸

B相:乙腈+0.1％甲酸

表6液相条件

2)质谱条件

在正离子采集模式下，Masslynx软件基于MSE功能对样品进行一级、二级质谱数据采集。毛细管电压：2.5kV，锥孔电压24V，离子源温度100℃，去溶剂气流速800L/h，锥孔气流速50L/h，14min内对m/z为50-1500Da的离子进行扫描，0.2s/循环。

在负离子采集模式下，Masslynx软件基于MSE功能对样品进行一级、二级质谱数据采集。毛细管电压：2.5kV，锥孔电压25V，离子源温度100℃，去溶剂气流速600L/h，锥孔气流速10L/h，14min内对m/z为50-1500Da的离子进行扫描，0.2s/循环。

2.2.3上机检测

为了更好地采集数据，确保仪器的最佳状态，在正式样品上机前需要用QC样本做稳定性测试，一般将同一个QC样本重复进样10针左右，此样本为condition QC，待仪器稳定方可进样。每10针样本中间插入一个QC，确保仪器进样过程中的稳定性。

3、实验结果

3.1数据结果

在本次实验中正离子共检出了15013个features、负离子共检出了10431个features。其中QC样本的BPI(base peak intensity,基峰图)和TIC(total ionChromatogram，总离子流色谱图)如图4所示，图右上角表示峰强度，左上角标明样品名称。BPI图中的峰型比较窄、数量多，表明色谱分离效果好。

3.2数据质控

在仪器进行数据采集的过程中，将插在样品中间的QC样品做overlay，确定保留时间和峰强度基本保持不变；对QC样本进行PCA分析，主要是对数据进行降维分析，检测实验组间的差异性及组内的重复性，对QC样本的相关性进行分析，考察研究样本多次生物学实验的重复性，结果显示，在数据采集过程中，时间和峰强度基本保持不变；且QC样本相对集中在一起，不存在随时间变动的情况，任意两组重复实验共定量多肽强度值的Pearson相关系数均大于0.9，具有较好的一致性，说明实验仪器具有较好的稳定性。

4、数据分析

4.1PCA分析

将获得的原始数据导入Progenesis QI(Waters)软件进行统计分析，首先对数据进行Lockmass的质量分数校正和保留时间的峰对齐，然后对样本进行分组，导入EZinfo软件进行差异代谢物的筛选。PCA分析是EZinfo软件分析的第一步，主要是对数据进行降维分析，可以检测实验组间的差异性及组内的重复性。在二维图中，取前两个主成分PC1，PC2来表示样本，空间分布差异越小，表示两个样本的数据越接近。重复性较好的实验，同一组内的不同样本应该聚集在一个相对集中的范围内，并可以与其他组的数据聚集区域区分开。

4.2OPLS-DA(正交偏最小二乘法-判别分析)

为了消除与分类不相关的噪音信息，同时也为了筛选导致分类差异的可信代谢物，选取OPLS-DA分析过滤与分类不相关的信号，即正交信号，获得OPLS-DA模型，对模型的质量用交叉验证法进行检验(即用一部分样本数据制作分组模型，另外一部分数据用来测试已分组的模型)，得到的R2X和Q2分别代表模型可解释的变量和可预测度，可对模型的优劣进行判别(详见图5)，实验中的OPLS-DA模型的R2Y和Q2分别是99％和98％，表示模型有良好的可解释能力和可预测分组能力。通过模型分析对代谢物进行VIP打分筛选，VIP分数越高的代谢物，对分组的贡献越大，本实验选取VIP>1、P value<0.05的代谢物为差异代谢物。

5、结果

经过数据分析发现，代谢物地榆酸双内酯(Sanguisorbic acid dilactone)在空白对照组和模型组、治疗组和模型组间存在显著性差异，而在空白对照组和治疗组之间则无显著性差异(图6)，相比空白对照组，模型组中的地榆酸双内酯的含量显著减少，相比模型组，治疗组中的地榆酸双内酯的含量显著增加，说明地榆酸双内酯可作为标志物指示胰腺炎的发生，同时可以作为药物治疗有效性的监测指标，应用于药物治疗胰腺炎的效果判断。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。