从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法

摘要

本发明公开了一种从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法，本发明利用采用多重淋巴细胞表面标记物抗体的负筛选，以及快捷的荧光标记抗原物质方法的建立和利用荧光标记抗原物质来进行高特异性的筛选，从而实现对单个抗原特异性B淋巴细胞的高通量快速筛选，并且使最终获得抗体特异性B淋巴细胞的阳性率从传统杂交瘤方法的不足5％，提高至30％。所以，该方案不但能够极大程度缩短单克隆抗体开发的时间，而且能够大大提高所获得单克隆抗体的数量和多样性。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地指一种从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法。

背景技术

B淋巴细胞简称为B细胞，主要来源于骨髓中的多能干细胞。哺乳类动物B细胞的分化过程主要可分为前B细胞、不成熟B细胞、成熟B细胞、活化B细胞和浆细胞五个阶段。其中前B细胞和不成熟B细胞的分化是抗原非信赖的，其分化过程主要在骨髓中进行；成熟B细胞将通过淋巴系统的循环进入到外周血中，在受到抗原刺激之后，能够进一步分化成合成和分泌抗体的浆细胞。浆细胞能够生成对某一抗原特异性的免疫球蛋白IgG，并将其释放到体液中，即成为免疫抗体。来源于同一种类型的B淋巴细胞的单一抗体，被称为单克隆抗体，由于其具有理化性状高度均一、效价高、生物活性单一、特异性高而又易于大量制备等优点，目前被广泛应用于生物和医学研究中。

现在单克隆抗体的开发，在很大程度上还依赖于1975年美国分子生物学家G.J.F.克勒和C.米尔斯坦创建的杂交瘤技术，即通过利用经免疫后动物的脾脏细胞和永生化的骨髓瘤细胞来进行融合后，产生杂交瘤细胞，并通过多轮筛选来获得能产生单克隆抗体的杂交瘤细胞株。而该方法具有制备周期长、所产生的杂交瘤细胞存在基因的不稳定性、筛选的特异性和阳性率都较差、以及普适性差(即通过研发所获得某一物种的骨髓瘤细胞只能融合该物种的淋巴细胞，而不能应用于其他物种)等局限性，目前只被广泛应用于鼠单克隆抗体的制备上面。而对于兔、羊驼等其他种属的单克隆抗体，目前据研究所知，和鼠单克隆抗体相比，有着更加优良的特性，而无法或较难用传统的杂交瘤细胞方法获得。

因此，如何从经免疫后的动物体内，有效得分离出能特异性结合某目标抗原的抗体的B淋巴细胞，从而能够有效的分离出表达抗体的基因，并通过体外重组的方法来大规模生产单克隆抗体，是免疫学以及单克隆抗体开发领域一个方兴未艾的领域。而由于兔单克隆抗体存在着特异性好、亲和力高、多样化程度好等诸多优点，并且利用传统的杂交瘤方法来开发兔单克隆抗体存在着专利壁垒，因此利用分离单个B淋巴细胞的方法来开发兔单克隆抗体显得尤为重要。而目前对于兔单个B淋巴细胞的筛选存在着以下难点：

1、对于增强免疫之后，能够表达抗体的B淋巴细胞在脾脏中富集的时间点把握不准。

2、B淋巴细胞只有在特定的阶段才能够在膜表面产生能和抗原特异性结合的IgG分子；如果过早，在B淋巴细胞表面表达的是IgM分子，如果过晚，B淋巴细胞将基本分化成为浆细胞。因此，对于如何筛选到膜表位表达IgG分子的B淋巴细胞是技术难点。

3、目前，针对于兔B淋巴细胞表面CD分子的抗体工具种类较少，进一步增加了分选出特定阶段B淋巴细胞的难度。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术在分离兔B淋巴细胞上的不足，提供一种快速并能够高纯度的从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法。

为实现上述目的，本发明所提供的从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法，该方法的步骤如下：

1)利用以生物标记的非B细胞淋巴细胞表面标志物抗体对脾脏细胞进行负筛选，再利用亲和素磁珠与磁性分离原理去除非B细胞，以提高脾脏细胞中B淋巴细胞相对丰度；

2)利用荧光标记的IgM多克隆抗体和预标记筛选用抗原，对步骤1得到的脾脏细胞进行进一步负筛选，以流式细胞技术去表面不表达IgG分子的B细胞，保留与预标记筛选抗原结合的目标淋巴细胞；

3)利用7-AAD进行分选，去除死细胞；

4)用流式细胞仪，进行单细胞的筛选，得到目标淋巴细胞。

其中，所述预标记筛选抗原为与小分子荧光染料偶联的普通抗原。

上述方案中，所述预标记筛选抗原为与包含亲和素的小分子荧光染料偶联且经生物素标记的普通抗原。

优选地，所述预标记筛选抗原的制备方法包括以下步骤：采用滴加方式进行偶联反应，分多次将包含亲和素的小分子荧光染料滴加到经生物素标记普通抗原中进行偶联，每次滴加后孵育使其偶联充分；其中包含亲和素的小分子荧光染料的用量为经生物素标记普通抗原的5倍以上。

优选地，所述预标记筛选抗原的制备方法还包括以下步骤：在包含亲和素的小分子荧光染料和经生物素标记普通抗原偶联完成后，根据偶联产物的大小，选择合适的分子筛离心管，除去未偶联的底物。

可选地，所述步骤1)为：以生物素标记的CD4单克隆抗体、CD8单克隆抗体和CD14单克隆抗体对脾脏细胞进行负筛选，再利用亲和素磁珠与磁性分离原理去除T淋巴细胞和单核细胞得到CD4、CD8和CD14阴性的脾脏细胞，提高B淋巴细胞的相对丰度。

可选地，所述步骤2)中荧光标记的IgM多克隆抗体为FITC标记的IgM多克隆抗体。

本发明原理：

1、通过长链生物素偶联抗原物质，并进一步结合小分子的荧光素，来实现对抗原物质的荧光素标记；同时，该标记不影响抗原和抗体之间的结合；

2、利用磁珠分选的方法，并利用淋巴细胞(包括T淋巴细胞和naive B淋巴细胞)表面的标志物(如CD4、CD18以及CD20分子等)，并通过相应的生物素标记抗体来对所获得的脾脏细胞进行负筛选，从而提高筛选的纯度；

3、结合流式细胞筛选技术，利用FITC标记的羊抗兔IgM抗体再进一步除去表面表达IgM分子的B淋巴细胞，再利用荧光素标记的抗原物质，进行抗原特异性筛选，以获得高纯度的表面表达IgG分子的抗原特异性B淋巴细胞；

4、同时利用流式细胞筛选技术，来完成对脾脏细胞的高通量筛选和保证筛选所获得细胞的单克隆性。

本发明完全摒弃了利用传统的杂交瘤方法来获取兔单克隆抗体，无需进行有限稀释来进行亚克隆，将兔单克隆抗体开发的时间从原来的6～8周，缩短到了1周；并完全解决了兔杂交瘤细胞的不稳定性等问题。和现有技术的磁珠法分离抗原特异性细胞相比较，因为增加了更多的细胞表面标记物抗体，能够进一步提高所筛选获得抗原特异性细胞的阳性比率；同时，由于引进了7-AAD进行活细胞筛选，以保证最终获得B淋巴细胞的活力；而且，流式细胞术保证了所筛选获得B淋巴细胞的单克隆性，减少了后期在分子克隆上的复杂度。

本发明的有益效果：利用采用多重淋巴细胞表面标记物抗体的负筛选，以及快捷的荧光标记抗原物质方法的建立和利用荧光标记抗原物质来进行高特异性的筛选，从而实现对单个抗原特异性B淋巴细胞的高通量、快速筛选，并且使最终获得抗体特异性B淋巴细胞的阳性率从传统杂交瘤方法的不足5％，提高至30％。所以，该方案不但能够极大程度缩短单克隆抗体开发的时间，而且能够大大提高所获得单克隆抗体的数量。

附图说明

图1为本发明试验例的原理图。

图2为未去除游离荧光素偶联亲和素的荧光标记抗原的流式细胞分析质控图

图3为去除游离荧光素的荧光标记抗原的流式细胞分析质控图。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细描述。以下实施例是在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

1、抗原物质的预标记：

1.1如抗原物质为蛋白，用购自美国Pierce公司的长链生物素，按照厂家推荐的标准流程进行偶联，偶联完成后透析出去未标记的生物素；如抗原物质为多肽或小分子化合物，则在合成的时候即预偶联好生物素分子。本实施例中的抗原为人C反应蛋白(CRP)(购自Fitzgerald Industries International)

1.2用小分子荧光染料偶联已经生物素标记的抗原，在本实施例中采用Cy5偶联的亲和素对抗原物质进行偶联；根据抗原物质的大小，计算所需Cy5偶联亲和素的量，建议用量为Cy5偶联亲和素和生物素偶联抗原的摩尔比例大于五比一，采取逐步滴加的方式进行偶联反应，即用1×PBS缓冲液将包含重量为50μg生物素偶联抗原的液体体积调整为100微升，每次滴加1/5总量的所需的Cy5偶联亲和素后，孵育10分钟，然后再滴加1/5的Cy5偶联亲和素，如此重复五次。

1.3偶联完成后，根据Cy5偶联亲和素和生物素标记抗原的分子量，来选择合适大小的分子筛离心管，除去未偶联的Cy5偶联亲和素和生物素标记抗原；如生物素标记抗原的大小为30KD，Cy5偶联亲和素的分子量大小约为55KD，则采用50KD的分子筛离心管除去多余的未标记物质。

1.4标记完成后的抗原分子，可以储存在4度待用；储存期为4-6周。

2、在处死经免疫后的兔子3～6天前，从兔子的耳缘静脉处，通过静脉注射的方法注射400微克抗原(注：此处使用的抗原可以为蛋白质、经偶联的多肽以及小分子化合物等任何抗原，本实施例为前述CRP看抗原)，不加任何佐剂。

3、处死兔子，收集脾脏，并按照相关的标准流程分离脾脏细胞。

4、取5×10⁷脾脏细胞，400g离心3分钟后；用1毫升1×PBS+2％FBS缓冲液重悬脾脏细胞，然后400g离心3分钟，弃上清；重复上述步骤一次，然后用100微升1×PBS+2％FBS缓冲液重悬脾脏细胞，再加入生物素标记的鼠抗兔CD4单克隆抗体(购自Bio-Rad)、鼠抗兔CD8单克隆抗体(购自Bio-Rad)和鼠抗兔CD14单克隆抗体各1微克(购自Novus>

5、400g离心3分钟后，用1毫升1×PBS+2％FBS缓冲液重悬脾脏细胞，然后再400g离心3分钟，弃上清；重复上述步骤一次，然后用100微升1×PBS+2％FBS缓冲液重悬脾脏细胞，再加入10微升亲和素偶联的磁性纳米微球(购自美天旖MiltenyiBiotec)。

6、孵育10分钟后，加入1×PBS+2％FBS缓冲液至终体积为500微升，然后用美天旖的磁性分离柱进行分离；收集穿过液，即为CD4/CD8/CD14阴性的脾脏细胞，并计数。

7、400g离心3分钟后，按照0.5X 10⁷细胞每100微升的密度，用1X>

8、在4度孵育20分钟后，400g离心3分钟；然后加入1毫升1×PBS+2％FBS缓冲液洗涤细胞后，再400g离心3分钟。重复该步骤一次，然后仍旧按照0.5×10⁷每100微升的密度用1×PBS缓冲液重悬细胞，并加入1微升7-AAD用于活细胞筛选。

9、用流式细胞仪，进行单细胞的筛选。所选择的细胞群为：7-AAD阴性(活细胞)、FITC-IgM阴性和抗原阳性。

试验例

1、为了验证本专利在对于抗原荧光素标记方法的改进，在荧光强度方面优于其他传统的方法，我们特设计了一下试验方法来进行验证(原理见图1)。

本例中采用的是CRP蛋白抗原，与前面实施例1一致。

我们先将参照抗体(可以识别抗原的已知抗体)化学偶联到Protein A包被的纳米微球(直径2-4微米)上，以模仿体内表面表达抗体的B细胞；然后将偶联有参照抗体的纳米微球，与有不同工艺荧光素预标记的抗原蛋白孵育，再利用流式细胞术进行分析，以评估不同工艺标记抗原蛋白的效果。

2、预标记和非预标记的比较：非预标记即不按本发明方法对抗原进行预标记，而将生物素标记的抗原、荧光素偶联亲和素同含有B淋巴细胞的悬液或偶联有参照抗体的纳米微球(评估实验时)进行孵育，孵育时间为20分钟；预标记的方法即利用上述方法所预标记有荧光基团的抗原蛋白，同含有B淋巴细胞的悬液或偶联有参照抗体的纳米微球(评估实验时)进行孵育，孵育时间同样为20分钟。最终将孵育后样品通过流式细胞仪进行分析，结果如图2。

从结果可以明显看到，利用预标记方法制备的抗原蛋白，和偶联有参照抗体的纳米微球孵育后，经流式细胞仪分析，其荧光强度明显高于非预标记方法的抗原蛋白。

3、对于预标记的抗原蛋白，我们又做了进一步的改进，即利用分子筛离心管来分离未标记上荧光和预标记上荧光素的抗原蛋白。从原理上面来说，任何生物或化学反应，都是一个动态过程，也就是说荧光素偶联亲和素和亲和素标记抗原之间的结合存在一个动态平衡，在某一时间内，反应体系中必定存在已标记有荧光素和没有标记上荧光素的抗原蛋白；而未标记上荧光素的抗原蛋白，势必对最后的检测存在影响，因为它同样可以结合到相应的抗体上，而并没有可检测到的荧光信号。为了证明这一理论的正确性，和我们对于此方法改进的有效性，我们同样用上面所述的方法来进行验证，结果如图3。

从结果可以明显看到，预标记抗原经分子筛离心管离心处理除去未标记有荧光素的抗原蛋白，和偶联有参照抗体的纳米微球孵育后，经流式细胞仪分析，其荧光强度明显高于未经分子筛离心管离心处理预标记抗原蛋白。