一种用于在复杂基质中检测活性蓖麻毒素的金/量子点纳米探针及其应用

摘要

本发明公开了一种用于在复杂基质中检测活性蓖麻毒素的金/量子点纳米探针及其应用。所述金/量子点纳米探针是利用脱氧核糖核苷酸单链(ssODN)修饰的金纳米微粒和量子点通过碱基配对杂交的方式形成脱氧核糖核苷酸双链，将金纳米微粒和量子点组装为核‑卫星结构的纳米探针。本发明用金/量子点纳米探针用于检测活性蓖麻毒素，检测限为7.46ng/mL，准确度高，可靠性好，而且无须大型设备和复杂操作。为进一步消除假阳性，本发明还提供了一种利用磁性微球富集复杂样品中蓖麻毒素的方法。在不需要知道具体活性蓖麻毒素浓度的情况下，本发明提供的金/量子点纳米探针通过荧光的淬灭(Quenched)和激活(Switch ON)，可以做到裸眼可视化的检测。

说明书

技术领域

本发明涉及一种天然毒素的检测方法，具体涉及一种活性蓖麻毒素的快速、可视化的 简便检测方法，以及用于该方法的金/量子点纳米探针。

背景技术

蓖麻毒素(ricin)是一种高致命的天然毒素，属Ⅱ型核糖体失活蛋白，相对分子质量约为64,000Da，由A、B两条多肽链通过一个二硫键相连而成，具有极高的细胞毒性 (其毒性是有机磷神经性毒剂VX的385倍、氰化物的6000倍、肉毒毒素的10000倍)， 可通过吸入、口服或静脉注射途径致使机体严重中毒。蓖麻毒素广泛存在于植物蓖麻的种 子中，具有提取容易、性质稳定、施毒简便等特点，目前尚缺乏对其有效的预防或治疗手 段，因此频频被用于暗杀和恐怖袭击活动。因为其特性，在《禁止化学和生物武器公约》 的控制清单1中，蓖麻毒素是唯一的蛋白质类毒素。已有的食品和环境样本中蓖麻毒素的 检测方法包括免疫检测法(酶联免疫分析和胶体金免疫检测试纸)和质谱检测法，前者虽然 灵敏度较高，但存在较高假阳性率；后者能够实现蓖麻毒素的确证和定量分析，但对仪器 设备高度依赖，不适合应急保障现场的快速检测。而且，以上技术均不能确定样品中的毒 素是否仍具有生物活性。与化学战剂只需要进行快速的定性、定量分析不同的是，在对这 一类生化战剂的实际监测过程中，一旦染毒样品被确定含有蓖麻毒素，人们最终关心的问 题是其是否具有生物活性(毒性)，是否会对人员健康造成威胁。2009年，由德国Robert Koch研究所主办的第一届蓖麻毒素国际联试总结报告明确指出：如何检测活性蓖麻毒素 是亟需解决的难点问题。

在蓖麻毒素的活性分析研究中，早期主要采用基于动物实验测定LD50以及细胞毒性 实验测定IC50的方法，这些方法繁琐耗时、条件苛刻，无法完成实际样品中残留毒素的活性检测，故目前仅用作表征毒素活性的常规方法。随着人们对蓖麻毒素认识的不断深入，近年发展了一些新型活性分析方法。蓖麻毒素的致毒机理可以概括为：具有凝集素活性的毒素B链含有两个半乳糖残基结合位点，可同细胞表面含半乳糖残基的糖蛋白或糖知结合，促进毒素分子内陷进入细胞，链间二硫键经还原游离出A活性链，A链发挥N-糖苷酶活 性致使核糖体60S亚单位的28S rRNA的特定部位腺嘌呤水解，导致核糖体失活，继而抑 制蛋白质合成引发细胞死亡。基于这一机理，一些报道试图通过对蓖麻毒素A链糖苷酶活 性检测实现活性鉴定，其基本思路为：通过在体外条件下将蓖麻毒素与核糖体RNA或具有 特定结构的寡核苷酸底物(RNA或DNA)孵育，利用质谱定量测定脱嘌呤反应释放出腺嘌呤 的量，或将腺嘌呤经酶等作用经多步衍生后进行放射性标记、比色或荧光检测，实现对蓖 麻毒素活性的间接评价。这些方法均能够较好地应用于毒素的活性分析，且定量准确、灵 敏度高，但由于方法存在仪器昂贵、步骤繁琐、技术性强等局限性，难以适用于战争及突 发事件等特殊环境下对活性毒素的现场快速侦检。

Tang等(ACS Appl.Mater.Interfaces.2016,8,2449-2455)公开了一种基于利用ricin与连接在表面增强拉曼散射(SERS)基底上的特异性寡核苷酸底物poly-21dA间脱嘌呤反应构建传感体系。poly-21dA自身的拉曼信号很强可作为拉曼报告原件，同时又作为SERS检测的特异性反应元件。基于ricin浓度和SERS强度二者良好的线性相关性，可实 现对ricin的高灵敏度检测。该方法可以实现对自来水，果汁，稀释的血清样品中活性蓖 麻毒素的快速表面增强拉曼检测，但是无法应用于食品等更为复杂的基质中低灵敏度的活 性毒素检测，在基质适用性和灵敏度上仍有较大的提高空间。

为了解决这一问题，本发明人的另一篇文献(Anal.Chem.2017,89,12209-12216)公开了一种活性蓖麻毒素的快速检测方法，该方法是将磁性样品前处理技术与金纳米探针结合。通过金纳米探针(AuNPs)聚集后引起SERS效应，检测活性蓖麻毒素在纳米界面上对底物序列的脱嘌呤反应引起其特征峰的显著变化来实现传感。制备表面修饰有特异性ssDNA底物序列的AuNPs，再利用硫酸盐对纳米颗粒的聚集作用将AuNPs沉积在Si片上， 由于纳米颗粒间距离拉近或者团聚将引起表面ssDNA出现灵敏的SERS增强信号。将具有 拉曼活性的“内标分子”和底物序列共同修饰在AuNPs表面，以内标分子的特征拉曼信号 校正用于定量的ssDNA特征峰，实现活性靶分子的定量分析。但拉曼信号的检测仍费时费 力，对设备和操作人员的要求较高。

发明内容

为解决上述现有技术中存在的问题，本发明对如何快速检测复杂基质中活性蓖麻毒素 进行了研究和改进，并消除一般方法中经常出现的假阳性问题；进一步地，在实际应用中， 针对突发情况能够无需借助大型复杂的设备，在现场即可简便地对蓖麻毒素进行检测，理 想的情况是提供一种可视化的快速检测蓖麻毒素的方法。

为便于理解和篇幅的考虑，本发明使用了如下的简写来表示特定的技术含义：

为解决上述技术问题，本发明的第一个目的在于：

一种用于检测活性蓖麻毒素的金/量子点纳米探针，由含有脱氧核糖核苷酸单链的连 接链P1修饰的金纳米微粒(P1-AuNPs)、含有脱氧核糖核苷酸单链的连接链P2修饰的量子 点(P2-QDs)和脱氧核糖核苷酸单链P3组成，P1、P2和P3通过碱基配对杂交形成脱氧核糖 核苷酸双链，将金纳米微粒和量子点连接起来，金纳米微粒为核，量子点环绕在金纳米微 粒的核周围，组装为核-卫星结构。

具体而言，所述连接链P1、P2独立地含有15～33个，优选18～30个脱氧核糖核苷酸单元，P3含有30～48个，优选33～42个脱氧核糖核苷酸单元，P3两端为与P1、P2配 对杂交的脱氧核糖核苷酸序列，中间为含有9～21个，优选12～15个碱基为腺嘌呤(A) 的脱氧核糖核苷酸序列。

进一步地，P1的5’端为巯基，与金纳米微粒AuNPs表面连接得到P1改性的金纳米微粒(P1-AuNPs)，3’端为脱氧核糖核苷酸序列L1；P2的3’端为氨基，与量子点QDs 连接得到P2改性的量子点(P2-QDs)，5’端为脱氧核糖核苷酸序列L2；P1和P2各自通过 序列L1、L2与P3两端的脱氧核糖核苷酸序列序列L1’和L2’配对杂交形成双链结构将 AuNPs和QDs连接起来。

进一步地，连接链P1的结构简式为5’-SH-亚烷基-poly(dT_n1)-L1-3’,连接链P2的结构简式为5’-L2-poly(dT_n2)-亚烷基-NH₂-3’，连接链P3的结构简式为3’>n3)-L2’-5’，其中，亚烷基的碳原子数为4-12的整数，优选为6-9的整>n1)、poly(dT_n2)为一定数量的碱基为胸腺嘧啶(T)的脱氧核糖核苷酸序列，n1>n3)为一定数量碱基为腺嘌呤(A)的脱氧核糖核苷酸链，n3是碱基为腺嘌呤(A)的脱>

在本发明优选的技术方案中，L1中碱基为腺嘌呤(A)的脱氧核糖核苷酸和碱基为胸腺 嘧啶(T)的脱氧核糖核苷酸交替排列形成…ATATATAT…的序列。

在本发明优选的技术方案中，P3一端的L1’序列和P1的L1序列配对杂交外，还与P2的L2的一部分配对杂交。

本发明所说的碱基配对杂交的规律是本领域所公知的，即腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T)互 补配对，鸟嘌呤(G)与胞嘧啶(C)互补配对。

在本发明的优选实施例中，P1、P2和P3分别具有表1所示的结构：

表1

表1中P1下划线部分和P3下划线部分的碱基配对杂交形成双链结构，P2粗体部分和>

本发明通过对连接链P1、P2、P3结构的特殊设计，使得彼此之间的配对杂交反应后， P3上的9～21个碱基为腺嘌呤(A)连续排列的脱氧核糖核苷酸序列，即poly(dA_n3)形成一个环状的柔性结构，使得AuNPs和QDs彼此靠近。由于强偶极-金属相互作用(纳米表面>n3)序列以及P1和P2>

以下借助图1和图2对本发明金/量子点纳米探针及其检测蓖麻毒素原理做进一步阐 述：

图1是AuNPs/QDs纳米探针上脱氧核糖核苷酸链形成双链结构将AuNPs和QDs连接起 来的示意图。

P1为5’-SH-C₆H₁₂-TTT>ATA TAT ATA-3’，即P1(a)；

P2为即P2(a)；

P3为即P3(a)；

P1下划线部分和P3下划线部分的碱基配对杂交形成双链结构，P2粗体部分和P3粗体部分的碱基配对杂交形成双链结构。从图1中可以看出，P3上靠3’一端的序列，即TAT>ATA>，既和P1上的ATA>序列配对杂交，也和P2上的5’-配对 杂交。这样的配对杂交方式使P1、P2和P3形成的双链结构形成直线，进而迫使P3上的 poly(dA_n3)形成柔软的环状结构。从而使得AuNPs和QDs彼此靠近，发生了荧光淬灭。

图2是活性蓖麻毒素加入后，AuNPs/QDs荧光由淬灭状态(quenched)转为激活(switch ON)状态的示意图。由于其特异的脱嘌呤反应活性，活性蓖麻毒素会在AuNPs/QDs的双链 结构中切下数个腺嘌呤(A)，尤其是P3上的poly(dA_n3)，使得双链结构发生解离，AuNPs>

基于上述原理，本发明的第二个目的在于提供了一种用金/量子点纳米探针检测样品 中活性蓖麻毒素的方法：

(L1)将金/量子点纳米探针溶液和各已知浓度的活性蓖麻毒素充分反应后，测试这些 溶液的荧光强度，绘制活性蓖麻毒素浓度的对数和样品中575nm处的荧光强度(I₅₇₅)的标准>

(L2)将金/量子点纳米探针加入样品溶液中充分反应后，监测溶液中575nm的荧光强 度，根据(L1)步骤的标准曲线即可计算得出样品中活性蓖麻毒素的浓度。

具体是通过以下技术方案实现的：

将活性蓖麻毒素加入到金/量子点纳米探针(AuNPs/QDs)溶液中1小时后，通过监测溶 液中575nm的荧光强度即可得知活性蓖麻毒素的浓度。

首先建立活性蓖麻毒素浓度(ng/mL)和样品中575nm处的荧光强度(I₅₇₅)的标准曲线。>

I₅₇₅＝X·lgC-Y

其中，I₅₇₅表示AuNPs/QDs溶液在575nm的特征峰荧光强度，C为活性蓖麻毒素的浓度，>

也可以通过荧光是否被激活(switch ON)定性地判断样品中是否存在蓖麻毒素。比如 在待测样品中加入AuNPs/QDs，2小时后，在暗处用紫外光手电筒对样品进行照射，如果 样品溶液发出橘黄色的光，说明样品中存在一定浓度的活性蓖麻毒素。这是因为样品中存 在活性蓖麻毒素，加入AuNPs/QDs纳米探针后，QDs的荧光会被重新激活，此时用紫外光照射，产生光致发光现象，产生肉眼可见的光。因此，借助本发明提供的AuNP/QD纳米探 针，可以无需借助其他设备，只需紫外光手电筒就能做到现场、快速、可视化地检测样品 中是否存在蓖麻毒素。

因此，借助本发明的金/量子点纳米探针，通过对样品中荧光强度的测试可以定量地 检测活性蓖麻毒素的浓度，也可以通过荧光是否被激活(switch ON)定性地判断样品中是 否存在蓖麻毒素。基于上述原理，本发明建立了一种定量/半定量/定性检测活性蓖麻毒素 的方法，可以根据现场的实际需求和设备条件，灵活选择检测方式，极大地丰富了活性蓖 麻毒素的检测手段和灵活性。本发明提供的金/纳米探针从准确性，灵敏性，抗污性，检测限，都体现出非常优异的效果，并且对设备和操作人员的要求低，检测时间快，无需质 谱等大型设备，可以做到在现场，准确快速地检测蓖麻毒素。

但是发现带正电的干扰蛋白在高浓度下(5μg/mL)，仍会由于与带负电荷的AuNPs/QDs 发生强静电相互作用发生聚集体，进而影响检测的准确性。因此，在本发明的优选技术方 案中，在使用AuNPs/QDs纳米探针检测前，首先采用特定的活性蓖麻毒素捕获剂，即 MB@P(C-H)-mAbricin，对活性蓖麻毒素捕获后，在磁铁作用下富集后，再经过洗脱，得到 纯化后的活性蓖麻毒素溶液再使用本发明的AuNPs/QDs进行检测，极大地提升了监测的准 确性，很好地扩展了AuNPs/QDs在复杂样品中检测活性蓖麻毒素的应用。图3是蓖麻毒素 富集的示意图。

因此，本发明的第三个目的在于提供一种特异性富集活性蓖麻毒素的方法：

(一)、制备蓖麻毒素捕获剂磁性微球(MB@P(C-H)-mAbricin)：1)制备磁性微球NH₂-MBs，>2修饰的SiO₂包覆Fe₃O₄的步骤，2)通过可逆加成-断裂链转移聚合反应(RAFT)>2-MBs上，得到MB@P(C-H)，其>2包覆的Fe₃O₄胺改性的磁性微球，C为3-((3-甲基丙烯酸氨基丙基)二甲基铵)->

(二)、通过蓖麻毒素捕获剂磁性微球(MB@P(C-H)-mAbricin)对样品中的蓖麻毒素进 行特异性吸附，吸附时间为20min～1h，再用磁铁将磁性微球富集在容器底部，将上清液倒出后，再加入洗脱剂进行洗脱，吸附在磁性微球上的蓖麻毒素重新被释放出来，完成对活性蓖麻毒素的富集。

在实际检测中，可以先通过蓖麻毒素捕获剂磁性微球对样品中的蓖麻毒素进行特异性 吸附，再用磁铁将磁性微球富集在容器底部，将上清液倒出后，再加入洗脱剂进行洗脱， 吸附在磁性微球上的蓖麻毒素重新被释放出来。在进行检测可以排除复杂样品中各种无机 离子、有机物、蛋白质及其残基等物质的干扰。通过单体3-((3-甲基丙烯酸氨基丙基)二 甲基铵)-丙酸盐(CBMAA)优异的抗污能力，避免了复杂样品中的杂质吸附在高分子刷表面， 又通过蓖麻毒素单克隆抗体对活性蓖麻毒素的特异性吸附，完成了对复杂样品中活性蓖麻 毒素的富集，提纯过程，进而达成对痕量蓖麻毒素的检测目的，并且减少了后续检测中杂 质可能导致的假阳性结果。

本发明达到的有益效果：

借助AuNPs/QDs的荧光淬灭-激活的过程，对活性蓖麻毒素进行检测。无需大型设备， 只需对样品的荧光强度进行监测即可得知活性蓖麻毒素的浓度。经过试验证明，本发明提 供的方法灵敏，可靠，用时短，且无需借助大型仪器。而且，在一些特殊场合，不需要知道蓖麻毒素的具体浓度，而只需要判断是否存在蓖麻毒素，本发明提供了一种现场即可检测的可视化方法，只需要一个紫外光手电筒，检测样品是否为荧光激活(Switch ON)状态即可得知是否存在蓖麻毒素，对蓖麻毒素的快速裸眼检测提供了一种有效方法。

附图说明

图1是AuNPs/QDs纳米探针上脱氧核糖核苷酸链形成双链结构将AuNPs和QDs连接起 来的示意图。

图2是活性蓖麻毒素加入后，AuNPs/QDs荧光由淬灭状态(quenched)转为激活(switch ON)状态的示意图。

图3是蓖麻毒素富集的示意图。图3(A)是蓖麻毒素捕获剂磁性微球 MB@P(C-H)-mAbricin的合成过程；图3(B)是MB@P(C-H)-mAbricin对蓖麻毒素进行富集后 再洗脱的示意图。

图4是MB@P(C-H)的透射电镜图(TEM)。

图5为P(C-H)对MB修饰前后的傅立叶变换红外(FT-IR)光谱法所得的红外光谱图。

图6是P1-AuPNs、P2-QDs和P3不同摩尔比例的荧光强度背景信号和对蓖麻毒素的信 号响应的对比。

图7是P1-AuNPs、P2-QDs以及AuNPs/QDs纳米探针的透射电镜图(TEM)。

图8为P1-AuNPs和AuNP/QDs的表面增强拉曼光谱。

图9为P2-QDs、P1-AuPNs和P2-QDs混合物，以及AuPNs/QDs的荧光光谱。

图10为在AuNP/QDs加入不同浓度蓖麻毒素20min后的TEM图，图10(A)为加入30ng/mL蓖麻毒素，图10(B)为加入80ng/mL蓖麻毒素。

图11是在加入不同浓度(0-100ng/mL)活性蓖麻毒素后，AuNPs/QDs纳米探针缓冲溶液 的荧光光谱。

图12是活性蓖麻毒素浓度(ng/mL)的以10为底的对数值和AuNPs/QDs在575nm特征峰荧光强度的关系图。

图13是AuNPs/QDs纳米探针溶液中加入20ng/mL活性蓖麻毒素以及500ng/m干扰物2h后再575nm处的荧光强度对比图。

图14是AuNPs/QDs纳米探针储存4个月后和现制AuNPs/QDs纳米探针检测活性蓖麻毒素的对比图。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明，实施例在以本发明技术方案为前提下 进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述实 施例。

下述实施例中所用方法和试剂如无特别说明均为常规方法和常规试剂。

脱氧核糖核苷酸单链(ssODN)购自上海Sangon生物科技有限公司，并通过高效液相色 谱纯化。本发明使用的ssODN列出如下：

SDS-PAGE测试纯度超过95％的完整蓖麻毒素从蓖麻子中按照如下标准程序提取(Tang, J.；Xie,J.；Shao,N.；Yan,Y.Electrophoresis,2006,27,1303-1311.)。水溶性核 -壳量子点(ZnS包覆的CdSe，用巯基乙酸修饰)购自武汉Jayuan量子点有限公司。蓖麻毒 素β单克隆抗体(mAbricin)CP37,CP75购自Thermo科技公司。双(对磺酸苯基)苯基膦脱水 二甲盐(BSPP)购自Sigma-Aldrich公司。去离子水用Milli-Q净水系统纯化，并在整个实 验中使用。磺基-NHS购自Thermo Scientific公司。

本发明所使用的仪器如下所示：

纳米粒子形态通过投射电子显微镜观察，(TEM,JEM-2000EX,日本)。

FT-IR光谱使用Bruker Vertex 70测试。

XRD图使用日本Rigaku智能实验室产品，测试条件，Cu Kα辐射，

Zeta电位以及流体动力学尺寸通过Malvern Nanosizer测定，购自英国Malvern仪器有限公司。

磁性微球的磁力学性质通过物理性质测量系统(PPMS，低温，12特斯拉)。

紫外-可见吸收光谱使用Shimadzu 3600。

荧光光谱使用Shimadzu RF-5301PC测试。

实施例1蓖麻毒素捕获剂磁性微球(MB@P(C-H)-mAbricin)的制备与表征

3-((3-甲基丙烯酸氨基丙基)二甲基铵)-丙酸盐(CBMAA)的合成

合成方法可以参考文献(Banerjee,I.,Pangule,R.C.,Kane,R.S.,Adv Mater2011, 23,690-718)，具体步骤如下：在圆底烧瓶中，将19.4gDMAPMA溶于100mL无水THF中，在搅拌，0℃下滴加溶有11.5g丙内酯的无水THF溶液，在氩气气氛下反应1h，接着放置 于4℃冰箱中反应24h。所得白色沉淀经过过滤，无水THF洗涤，真空干燥得到17gCBMAA, 产率60％，产物结构经过¹HNMR鉴定。合成式如下：

丙基-4-(三甲氧基硅基)苄基-硫代碳酸酯(carbonotrithioate)(CTA)的合成

RAFT反应引发剂，丙基-4-(三甲氧基硅基)苄基-硫代碳酸酯(carbonotrithioate)(CTA)的合成可以参考文献(Qu,Z.,Hu,F.,Chen,K.,Duan,Z., Gu,H.,Xu,H.,J.Colloid and Interface Sci.2013,398,82-87.)的方法。具体步 骤如下：将6.6mmol 1-丙硫醇加入搅拌的15mL的6.6mmolK₃PO₄无水丙酮悬浮液中，继续>1HNMR鉴定。

磁性微球MB@P(C-H)的制备

共聚物刷接枝的微球(MB@P(C-H))通过RAFT聚合反应得到。为了得到引发剂CTA改性 的Fe₃O₄@SiO₂(MBs)，将50mg>

为了得到CBMAA和HEMA的共聚物，即P(C-H)高分子刷，进而接枝到磁性微球(MB)上，0.1g上述备用CTA-MB，20mgAIBN，1.0mLHEMA和0.3gCBMAA溶于10mL 1:1(v/v)的 脱气水/甲醇混合溶剂。用氮气鼓泡30分钟后，密封反应容器并在80℃下加热。反应5小 时后，稀释产物并用DMF洗涤3次得到MB@P(C-H)。

图4(A)是MB@P(C-H)的透射电镜图(TEM)，图4(B)是局部放大图。从图中可以看出Fe₃O₄的核直径约为120nm，外层SiO₂层厚度约为10nm，高分子刷P(C-H)厚度约为15-20nm。通过动态光散射(DLS)测试，磁性微球MB@P(C-H)流体动力学直径为182nm，DPI为0.24。>

为了进一步验证高分子刷P(C-H)确实接枝到了磁性微球上，图5为P(C-H)对MB修饰前 后的傅立叶变换红外(FT-IR)光谱法所得的红外光谱图，从图中可以看出，MB@P(C-H)和 P(C-H)有着类似的FT-IR图谱。从图中可以看出，MB@P(C-H)和P(C-H)均有着1100cm^-1的Si-O>2的存在；在MB@P(C-H)，在3405cm^-1处有一宽的吸收峰，这是羟基的拉伸振动导致；在2940-2990cm^-1处有数个吸收带，表明有烷基的存在；1653cm^-1和1585>-1处的吸收峰为氨基；羧基的拉伸振动吸收峰在1721cm^-1处；C-O的对称拉伸峰带位于1386cm^-1。这些峰的存在均证实了高分子刷P(C-H)成功接枝在了磁性微球MB上面。MB@P(C-H)>

蓖麻毒素捕获剂磁性微球(MB@P(C-H)-mAbricin)的制备

蓖麻毒素捕获剂磁性微球(MB@P(C-H)-mAbricin)，是通过蓖麻毒素单克隆抗体(mAbricin)和MB@P(C-H)共价连接得到。通过经典的EDC催化的氨基-羧基偶联反应将蓖麻毒素单克隆抗体(mAbricin)和MB@P(C-H)上共价连接。具体步骤是MB@P(C-H)先通过N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐(磺基-NHS)(10mg/mL)和EDC(20mg/mL)在1.0mL的10mM 2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)缓冲液中活化，30分钟后，除去上清液，加入分散在10mM PBS溶液中的10mgmAbricin(CP37或CP75)。室温反应5小时，然后用0.5％甘氨酸淬灭反应后在4℃下静置 过夜得到MB@P(C-H)-mAbricin。

实施例2蓖麻毒素捕获剂磁性微球(MB@P(C-H)-mAbricin))对蓖麻毒素的捕获能力

一系列标准蓖麻毒素从10-50μg/mL加入到1.0mL，50mg/mL的蓖麻毒素捕获剂磁性微球溶液中。孵育2小时后，上清液的蓖麻毒素的平衡浓度通过BCA蛋白浓度检测法测定，此外，蓖麻毒素与蓖麻毒素磁性吸收剂之间的结合动力学通过将50mg的 MB@P(C-H)-mAbricin与50μg蓖麻毒素的1.0mLPBS缓冲溶液混合测定。在20至120分钟 的孵育时间，上清液的蓖麻毒素浓度通过BCA蛋白质法测定得到。平衡吸附量(Q)通过以 下方程式计算得到：

Q＝(C₀-C_e)·V·m^-1·10³(mg/g)

C₀(μg/mL)表示初始在PBS中蓖麻毒素浓度，C_e(μg/mL)表示上清液中蓖麻毒素的平衡浓度，V(mL)是样品溶液的体积，m(g)是MB@P(C-H)-mAbricin的质量。

经过测试，每克MB@P(C-H)-mAbricin中单克隆抗体mAbricin的量为28mg，而每克氨基改性的磁性微球NH₂-MB上仅有6.2mg的单克隆抗体mAbricin。说明了高分子刷P(C-H)对磁性微球捕获剂的影响。磁性微球捕获剂MB@P(C-H)-mAbricin在20min可以达到饱和>

表2

从表2中可以看出，本发明提供的捕获剂MB@P(C-H)-mAbricin在各种复杂、污染基质中均能够高效捕获蓖麻毒素，通过LC-MS/MS测量蓖麻毒素浓度，回收率可以达到72.0％-86.0％(5ng/mL)，以及77.0％-92％(50ng/mL)。而与MB@P(ConA/Gal)比较，本发明的捕获剂MB@P(C-H)-mAbricin由于高分子刷P(C-H)的抗污能力，以及蓖麻毒素单克隆抗体mAbricin的引入双重作用，即使在复杂基质中也对蓖麻毒素有较好的捕获能力，进而 达成对痕量蓖麻毒素的检测目的。

实施例3金/量子点纳米探针(AuNPs/QDs)的组装和表征

本实施例所用脱氧核糖核苷酸单链(ssODN)分别为表1中的P1(a),P2(a),P3(a)。

球形金纳米粒子(AuNPs)通过种子生长法得到，方法可以参考文献(Bastús,N.G.,Comenge,J.,Puntes,V.,Langmuir 2011,27,11098–11105),直径约为60nm。AuNPs凝胶经过6次生长后的浓度为1.9×10¹¹(NP/mL)。为了稳定金纳米粒子，在搅拌下将15mg的BSPP加>

使用EDC/磺基-NHS交联方法制备P2修饰的量子点(P2-QDs)，具体步骤是首先利用超 浓缩技术纯化商购量子点，然后用超纯水稀释至1.0μM。通过磺基-NHS(0.1mg/mL)和EDC(0.1mg/mL)在1.0mL的1.0mM MES缓冲液中活化量子点。反应30分钟后，将 P2(a)(0.1mmol/L，100μL)加入到上述活化量子点溶液，并加入0.1M的NaHCO₃将pH调节>

AuNP/QDs纳米探针的组装是在缓冲液中进行，所述缓冲液为10mM PBS,pH为7.4，5mM MgCl₂，0.01％吐温20。通常，P(a)1-AuNPs和P2(a)-QDs和P3(a)按照摩尔比1:50:200混合。碱基的配对杂交反应在80℃下进行10分钟，之后在37℃下进行2小时，制得荧光>

对P1-AuPNs、P2-QDs和P3不同摩尔比例的荧光强度背景信号和对蓖麻毒素的信号响 应进行了测试，P1-AuPNs、P2-QDs和P3的摩尔比例分别为1:50:100、1:50:150、1:50:200以及1:50:250，检测结果见图6，综合考虑检测的灵敏度和信号/噪音比，P1-AuPNs、P2-QDs和P3的摩尔比为1:50:200。

对所制得的AuNPS/QDs纳米探针进行表征。图7是P1-AuNPs、P2-QDs以及AuNPs/QDs纳 米探针的透射电镜图(TEM)。图7(A)是P1-AuNPs的TEM图，显示出直径约60nm的球状结构。未经过P1改性的AuNPs的Zeta电位和流体动力学直径分别为-17.8mV以及63nm，P1改 性后的AuNPs的Zeta电位和流体动力学直径分别为-26.5mV和68nm。图7(B)是P2-QDs的TEM图，其为平均直径6nm的球形结构。未经过P2改性的QDs的Zeta电位和流体动力学直径分 别为-23.7mV以及10nm，P2改性后的QDs的Zeta电位和流体动力学直径分别为-25.4mV和14nm。AuNPs/QDs的zeta电位为-24.6mV,流体动力学直径增加至96.3nm。图7(C)为 AuPNs/QDs的核-卫星结构的TEM图，图中可以看出，脱氧核糖核苷酸单链(ssODN)P1、P2 和P3上的碱基配对杂交后形成脱氧核糖核苷酸双链(dsODN)，将AuNPs和QDs组装成核-卫星 结构。图8为P1-AuNPs和AuNP/QDs的表面增强拉曼光谱，1037cm^-1的峰表明C-N键的摇>-1的峰表明C-N键的伸缩吸收,1468cm^-1的峰表明COO^-的拉伸，上述SERS峰>

实施例4使用AuNPs/QDs纳米探针检测活性蓖麻毒素

AuNP/QD纳米探针(0.5OD)和各浓度的活性蓖麻毒素(0、10、15、20、30、40、60、 80、100ng/mL)在乙酸铵缓冲溶液(200μL,5mmol/L，pH 4.0)中，于96孔板中反应。 在38℃下孵育2小时，测试这些溶液的荧光强度。为监控活性蓖麻毒素与AuNP/QD纳米探 针(0.5OD)之间脱嘌呤反应动力学，对上述溶液每20分钟检测一次荧光值，直到荧光强度 稳定为止。

图10(A)为AuNPs/QDs纳米探针缓冲溶液中加入30ng/mL火星蓖麻毒素后的TEM图，图10(B)为AuNPs/QDs纳米探针缓冲溶液中加入80ng/mL火星蓖麻毒素后的TEM图，图中 圈里的微粒为解离下来的QDs。图10表明，当活性蓖麻毒素浓度逐渐增大时，越来越多的 QDs与AuNPs之间发生了解离，进而QDs由于远离了AuNPs而不再被淬灭。考虑到活性蓖 麻毒素的特异性脱嘌呤反应和反应时间和活性蓖麻毒素浓度都有关系，在监测中，选择2h 作为反应时间，于是荧光强度就只与蓖麻毒素的浓度相关。

图11是在加入0、10、15、20、30、40、60、80、100ng/mL活性蓖麻毒素后， AuNPs/QDs纳米探针缓冲溶液的荧光光谱。从图中可以看出，加入的活性蓖麻毒素浓度逐 渐增大，AuNPs/QDs在575nm特征峰荧光强度逐渐下降。图12是活性蓖麻毒素浓度的以 10为底的对数值和AuNPs/QDs在575nm特征峰荧光强度的关系图，得到一个Langmuir型 的图。当活性蓖麻毒素的浓度超出100ng/mL时，该曲线显示出非线性，这可能是因为 在更高活性蓖麻毒素浓度下，探针的吸附达到了饱和；活性蓖麻毒素的浓度在10-100ng/mL 时，该曲线显示出很好的线性关系。通过该曲线，可以得到以下的公式：

I₅₇₅＝634.8·lgC-594.7(R²＝0.995)

其中I₅₇₅表示AuNPs/QDs在575nm的特征峰荧光强度，C为活性蓖麻毒素的浓度，单位>

为了检测本发明方法的抗干扰性，对AuNPs/QDs在各干扰物中的575nm荧光特征峰强 度进行了测试。图13是AuNPs/QDs纳米探针溶液中加入20ng/mL活性蓖麻毒素以及500ng/m 干扰物2h后再575nm处的荧光强度对比图。可以看出，一般的有机物质即使在较高浓度 (500ng/mL)下也不会对对AuNPs/QDs产生荧光的激活作用，而活性蓖麻毒素在20ng/mL， 即可对本发明提供的AuNPs/QDs探针产生强烈的激活(switch ON)作用，使的AuNPs/QDs 在575nm出的荧光强度显著提高，显示出非常优异的抗干扰能力。

也可以通过荧光是否被激活(switch ON)定性地判断样品中是否存在蓖麻毒素。比 如在待测样品中加入本发明的AuNPs/QDs纳米探针，稳定一段时间后，在暗处用紫外光手 电筒对样品进行照射，如果样品溶液发出橘黄色的光，说明样品中存在一定浓度的活性蓖 麻毒素。这是因为样品中存在活性蓖麻毒素，加入AuNPs/QDs纳米探针后，QDs的荧光会被重新激活，此时用紫外光照射，产生光致发光现象，产生肉眼可见的光。而且本发明提 供的AuNPs/QDs纳米探针具有很强的抗干扰能力，较高浓度的常见有机杂质也不对 AuNPs/QDs纳米探针产生激活作用。因此，借助本发明提供的AuNP/QD纳米探针，可以无 需借助其他设备，只需紫外光手电筒就能做到现场、快速、可视化地检测样品中是否存在 蓖麻毒素。

实施例5在各种复杂基质中选择性检测蓖麻毒素

样品的制备

使用各种复杂的食物和生物样品进行检测，以评估所述检测方法的可靠性。样品包括 生菜，鸡肉，面包，鲜牛奶，咖啡以及人体血浆。本发明的粗制食品和生物样品分别由稀 释的人血清、橙汁、咖啡、鲜奶和三明治制成。具体方法是将固体样品称重并用PBS缓冲溶液稀释，PBS缓冲溶液与固体样品体积质量比为1.0mL/g，均质化5min后再1200rpm 转速下离心2分钟以除去大体积残余物。人血清用PBS缓冲溶液稀释5倍。这些样品中均 被注入特定浓度的蓖麻毒素。

蓖麻毒素的富集

5mg MB@P(C-H)-mAbricin直接和上述1.0mL添加蓖麻毒素的样品溶液加入试管，持 续搅拌混合1小时。通过磁铁对磁性微球的吸附，捕获蓖麻毒素的磁性微球富集于试管底 部，将上清液倒出，用PBST和PBS缓冲液洗涤后，在25℃，经过100μL三氟乙酸(TFA)/ 去离子水/乙醇(1:50:49,v/v/v)洗脱液洗脱30分钟，再加入0.9mL醋酸铵缓冲溶液(5 mmol/L,pH 4.0)，磁性微球捕获的蓖麻毒素重新释放出来。

蓖麻毒素的检测

通过AuNP/QD纳米探针按照实施例4的方法对样品中活性蓖麻毒素进行检测。为验证 本发明AuNP/QD纳米探针检测活性蓖麻毒素的可靠性，还用LC-MS/MS测定蓖麻毒素作为比较。检测见过图表3所示。

表3

从表3中可以看出，本发明提供的AuNPs/QDs纳米探针检测活性蓖麻毒素，体现出优 异的准确性和灵敏性。基于本发明的AuNPs/QDs纳米探针的方法和LC-MS/MS的方法所得结果基本一致，表明了本发明提供的检测方法的可靠性。摄取蓖麻毒素致死量LD50估计 为3mg/kg，对于35kg的儿童来说，摄入蓖麻毒素的致死量为105mg。以饮料为例，致命 的口服摄入蓖麻毒素浓度约为0.4mg/mL，本发明提供的AuNPs/QDs纳米探针提供的检测方 法的检测线，远远低于一般情况对人体摄入的致死量。而在高浓度的活性蓖麻毒素样品中， 只需要对AuNPs/QDs探针加入样品后在575nm的荧光强度进行测试，即可进行定量和半定 量的活性蓖麻毒素浓度的检测。在不需要清楚知道蓖麻毒素浓度的情况下，而只是对是否 存在蓖麻毒素的定性判断中，本发明提供了一种更为简单的方法，即将处理后的样品溶液 加入到AuNPs/QDs纳米探针溶液中，如果样品中存在活性蓖麻毒素，会发生特异的脱嘌呤 反应，会将AuNPs/QDs连接链上的腺嘌呤切割下来，从而使双链的连接链变得松散，进而 QDs从AuNPs解离下来，QDs的荧光不再被淬灭，此时用紫外光手电筒对样品溶液直接进 行照射，由于光致发光，如果样品中存在蓖麻毒素，即会发出肉眼可见的光，做到无需大 型设备的可视化检测。

实施例6 AuNPs/QDs纳米探针的储存稳定性测试

为进一步检测制得AuNPs/QDs纳米探针储存一顿时间后，是否还能具有对活性蓖麻毒 素的检测作用，进行了本实施例。把AuNPs/QDs纳米探针在PBS缓冲液，4℃储存1个月和4个月后，按照实施例4的方法检测不同浓度活性蓖麻毒素样品在575nm处的荧光强度，得到图14。AuNPs/QDs纳米探针储存4个月后，活性蓖麻毒素浓度C(ng/mL)和575nm处荧 光强度的的线性关系式为：

I₅₇₅＝628.4·lgC-586.5(R²＝0.993)

从图14中可以看出，AuNPs/QDs纳米探针储存1个月后，曲线基本和储存钱重合；储存4个月后，曲线稍有偏离，但仍能满足对活性蓖麻毒素检测的要求。

实施例7各种检测活性蓖麻毒素方法的比较

表4列出了一些常见的活性蓖麻毒素检测方法，本发明所提供的方法，借助AuNPs/QDs 的荧光淬灭-激活的过程，对活性蓖麻毒素进行检测。无需大型设备，只需对样品的荧光 强度进行监测即可得知活性蓖麻毒素的浓度。经过试验证明，本发明提供的方法灵敏，可 靠，用时短，且无需借助大型仪器。而且，在一些特殊场合，不需要知道蓖麻毒素的具体浓度，而只需要判断是否存在蓖麻毒素，本发明提供了一种现场即可检测的可视化方法，只需要一个紫外光手电筒，检测样品是否为荧光激活(Switch ON)状态即可得知是否存在蓖麻毒素，对蓖麻毒素的快速裸眼检测提供了一种有效方法。

表4

Ref.1：Sun,J.,Wang,C.,Shao,B.,Wang,Z.,Xue,D.,Liu,Y.,Qi,K.,Yang, Y.；Niu,Y.Anal.Chem.,2017,89,12209-12216.

Ref.2:Sturm,M.B.,Schramm,V.L.,Anal.Chem.,2009,81,2847-2853.

Ref.3:Bevilacqua,V.H.,Nilles,J.M.,Rice,J.S.,Connell,T.R.,Schenning,A.M.,Reilly,L.M.,Durst,H.D.,Anal.Chem.,2010,82,798-800.

Ref.4:Kalb,S.R.,Barr,J.R.,Anal.Chem.2009,81,2037–2042.

Ref.5:Tang,J.,Sun,J.,Liu,R.,Zhang,Z.,Liu,J.,Xie,J.,ACS AppliedMaterials&Interfaces,2016,8,2449-2455.

Ref.6:Wang,D.,Baudys,J.,Barr,J.R.,Kalb,S.R.,Anal.Chem.,2016,88, 6867-6872.

以上具体实施方式只是对本发明内容的示意性说明，不代表本发明内容的限制。本领 域技术人员可以想到的是本发明中具体结构可以有其它的变化形式。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京市疾病预防控制中心

<120> 一种用于在复杂基质中检测活性蓖麻毒素的金/量子点纳米探针及其应用

<130> 11

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列 （Artificial Sequence）

<400> 1

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<210> 2

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 2

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<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 3

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<210> 4

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<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 4

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<210> 5

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<213> 人工序列（Artificial Sequence）

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<210> 6

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<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 6

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<210> 7

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<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

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<210> 8

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<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 8

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<210> 9

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<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 9

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